Регуляция экспрессии генов коровой части острова патогенности бактерий рода Yersinia транскрипционным регулятором YbtA тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Анисимов, Роман Львович

• Анисимов, Роман Львович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Анисимов, Роман Львович

1 ВВЕДЕНИЕ.-6

СПИСОКСОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ .-8

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.- 9

1. Утилизация железа.- 9

1.1. Значение железа для бактерий.- 9

1.2. Сидерофоры.- 9

1.2.1. Характеристика сидерофоров.-9

1.2.2. История открытия сидерофоров.- 10

2. Утилизация железа в бактериях рода Yersinia.-112.1. Особенности строения энтеробактерий.- 11

2.2. Род Yersinia.- 122.3. Системы утилизации железа в Y. enterocolitica. 13

2.4. Транслокация сидерофоров через клеточные мембраны.- 14 2.5. Депонирование железа.-152.6. Железо как регулятор.- 15

2.7. Йерсиниабактин.- 16

2.8. Остров патогенности (High Pathogenicity Island, HPI).- 173. YhtA.-193.1. Семейство AraC/XilS.- 193.2. YbtA, известные на сегодняшний день факты и предположения.-20

3.2.1. Биохимическая характеристика YbtA.-20

3.2.2. YbtA-регулируемые промоторы.- 22

3.2.3. ERIC элемент промотораybtA Y. enterocolitica.-24

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .-261. Материалы.- 26

1.1. Оборудование.- 26 v 1.2. Химикалии и ферменты.- 27

2. Бактерии, плазмнды и п ран меры.-27 2.1. Бактерии.-272.2. Праймеры.-2811 2.3. Плазм иды.-29

3. Бактериальные спелы и антибиотики, использованные в работе.-303.1. Бактериальные среды.- 30

3.2. Антибиотики.-31

4. Работа с бактериями.-314.1. Условия роста.-31

4.2. Трансформация клеток.- 33

4.3. Хранение культур.- 32

5. Использованные стандартные молекулярно-бнологнческнс и биохимические методы.- 32

5.1. Полимсразная Цепная Реакция (ПЦР).-32

5.2. Выделение и очистка ДНК.-325.2.1. Выделение хромосомальной ДНК.-32

5.2.2. Выделение плазмид.- 32

5.2.3. Выделение ПЦР-фрагментов.- 32

5.3. Выделение РНК и реакция удлинения праймера.- 33

5.3.1. Выделение РНК.-335.3.2. Реакция удлинения праймера.-33

5.4. Измерение концентрации белков и нуклеиновых кислот.- 33

5.4.1. Измерение концентрации ДНК и РНК.-33 •

5.4.2. Измерение концентрации белка.- 34

5.5. Энзиматическая модификация ДНК.- 34

5.5.1. Сайт-специфическая рестрикция.-34

5.5.2. Лигация.-345.6. Электрофоретический анализ ДНК и белков.-34

5.6.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.-34

5.6.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.-35

6. Конструирование экспресснонной плазмнды pF.T3c - YbtA.- 35

7. Очистка YbtA.-367.1. Экспрессия YbtA в Е. coli.-36

7.2. Хроматографическая очистка YbtA.-37

8. Конструирование репортерных плазмид для нзучення экспрессии YbtA - контролируемых генов и реакции удлннення праймера.... - 38

8.1. Конструирование репортерных плазмид, несущих оригинальные промоторы генов HPI. - 38

8.2. Внесение делеций в промоторы репортерных плазмид.- 40

9. ПЦР - амплификация промоторных фрагментов для EMSA и DNasel футпрннтннга.- 41

10. Очистка йепенннабактина.- 42

10.1. Биосинтез и очистка йерсиниабактина.-42, 10.2. Анализ йерсиниабактина.-42

11. Аналнз изменения злектрофоретнческой подвижности (Гель-шифт).- 43

12. Определение флуоресценции CFP при репортерном анализе.- 43

13. Р.Маче I футпринтинг.

14. Выравнивание защищенных областей.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. УЫА-зависнмые промоторы НР1.

1.1. Точки начала транскрипции УЫА-зависимых промоторов НР1.

1.2. -10 и -35 последовательности УЫА-зависимых промоторов НР1.

Обсуждение.

2. Взаимодействие УЫА с промоторамн-мншенями.

2.1. Выделение УЫА.

2.2. Взаимодействие УЫА с промоторами - мишенями.

2.2.1. Комплексы УЫА-ДНК, формируемые промоторами НР1.

2.2.2. Специфические УЫА - связывающие участки.

Обсуждение.

3. Участие йеренннабактнна в регуляции УЫА-завнснмых промоторов.

3.1. Выделение йерсиниабактина.

3.2. Влияние йерсиниабактина в среде на активность УЫА-зависимых промоторов.

3.3. Оценка влияния йерсиниабактина на взаимодействия УЫА и ДНК.

3.4. Оценка возможности связывания УЫА и УЫ-Ре комплекса.

Обсуждение.

4. ЕШС-элемент промоторов ¡грб и уЫЛ У. еп(егосо1Шса.

4. Влияние ЕШС-элемента на экспрессию с промоторов ¡грб иуЫА.

Обсуждение.

5. Функция сайтов связывания УЫА 1381.1382 и 1^3 в регуляции промоторов уЫЛ и ¡грб.

5.1. Участие сайтов связывания УЫА в формировании комплексов с промоторами грб иуЬ1А.

5.2. Влияние делеций сайтов связывания УЫА на транскрипционную активность промоторов грб и уЫА.

Обсуждение.

6. Влияние компонентов системы утилизации железа на работу дивергентных промоторов уЫА и щб.

6.1. Экспрессия промоторов в мутантах дефективных по различным компонентам системы утилизации железа.

Обсуждение.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция экспрессии генов коровой части острова патогенности бактерий рода Yersinia транскрипционным регулятором YbtA»

Патогенные микроорганизмы в среде организма хозяина сталкиваются с условиями недостатка железа, которое находится в комплексах с железосвязывающими белками, такими как трансферрин и лактоферрин. Как часть неспецифической иммунной защиты, доступность свободного железа может быть ещё более уменьшена осуществляемым лактоферрином транспортом железа в клетки печени (Bullen J.J. et al., 1987; Bullen J.J. et al., 1987). Чтобы выживать при железо дефицитных условиях, микроорганизмы используют различные механизмы утилизации железа. Один из них -производство низкомолекулярных хелаторов с высоким сродством к re также известных как сидерофоры. Таким образом, биосинтез сидерофора может быть расценен как важный фактор вирулентности (de Almeida et al, 1993; Rakin et ai, 1999a). Это особенно верно для рода Yersinia, поскольку только члены высокопатогенной группы (Brubaker, 1991; Carter, 1975; Perry et al., 1997) содержат кластер генов, обеспечивающих систему синтеза сидерофора йерсиниабактина и его утилизации. Этот кластер был назван Островом патогенности (High Pathogenicity Island, HPI) (Carniel et al., 1996; Gehring et al., 1998; Rakin et al., 1999b). Предположительно, основную роль в регуляции экспрессии генов острова играет транскрипционный регулятор YbtA, AraC/XilS - подобный белок, кодируемый геном в составе этого же острова (Bearden et al, 1997). Как было показано в экспериментах с мутантами, YbtA активирует экспрессию биосинтетических и транспортных генов HPI, но в то же время репрессирует свой собственный ген.

Изучение регуляторных механизмов является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии. Однако, несмотря на важное медицинское значение изучения системы утилизации железа у Yersinia, она до сих пор является «черным ящиком» и реальные молекулярные механизмы ее регулирования неизвестны. С 1996 года, когда была указана необходимость прямых экспериментов (Fetherston et al., 1996), не было опубликовано никаких работ, посвященных исследованию регуляции экспрессии генов HPI.

Целью настоящей работы являлось изучение регуляции генов Острова Патогенности. В основные задачи входило: поиск \ЫА-связывающих последовательностей, выяснение возможности влияния предположенных ранее эффекторов на взаимодействие "УЫА и промоторов острова, объяснение механизма УЫА-зависимой репрессии и активации различных генов.

Научная новнзна работы. Впервые были охарактеризованы YbtA-регулируемые промоторы HPI, выделен гомогенный YbtA и определены сайты связывания YbtA. Кроме того, была предложена модель, позволяющая объяснить способность YbtA быть как активатором транскрипции, так и репрессором.

Научно-практнческое значение работы. Изучение регуляторных механизмов лежит в основе молекулярной биологии, поэтому результаты данной работы имеют фундаментальное значение, расширяя познания в этой области. Показано, что кроме ранее предположенной пары нуклеотидных повторов RS1 и RS2 в каждом промоторе, был идентифицирован дополнительный сайт связывания YbtA RS3 в дивергентно транскрибируемом промоторе ybtA/irp6. На основании экспериментов с репортерными плазмидами было установлено, что повтор RS3 играет ключевую роль в репрессии промотора ybtA. Сравнивая ybtA/irp6 промоторы Y. enterocolitica и Y. pest is, было обнаружено, что 125 нуклеотидная вставка ERIC-элемента в RS2 последовательности промотора У. enterocolitica ybtA/irp6 увеличивает экспрессию уЫА. Кроме того, было продемонстрировано существование возможных дополнительных регуляторных механизмов, универсальных для всех промоторов системы утилизации йерсиниабактина.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ ч

Amp Ампицилин п.о. Пары оснований

CAS Хромазурол S

Cm Хлорамфеникол

DNasel Дезоксирибонуклеаза I

DTT Дитиотриэтол

EMSA Анализ изменения электрофоретической подвижности

ERIC Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus

FBS Сайт связывания регулятора Fur

HPI Остров патогенности

IPTG Изопропил-|Ы>-тиогалактопиранозид

Kan Канамицин

LB Среда Luria-Bertani

Nal Налидиксин

OD Оптическая плотность

PBP Периплазматический связывающий белок

PBS Изотонический фосфатный буфер

ПЦР Полимеразная цепная реакция

RS Повторяющаяся последовательность

RNAP РНК - полимераза

Sm Стрептомицин

TAE Трис-ацетатный буфер

TFA Трифторуксусная кислота

Ybt йерсиниабактин

Yen Y. enlerocolitica

Yps Y. pest is ш

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Утилизация железа

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Анисимов, Роман Львович

ВЫВОДЫ.

1). Доказано, что сайтами связывания транскрипционного регулятора YbtA являются последовательности RS1 и RS2, присутствующие в промоторах генов коровой части HPI и перекрывающиеся с -35 элементом промоторов генов, активируемых YbtA.

2). В области дивергентных перекрывающихся промоторов ybtA/irp6 выявлен дополнительный YbtA-связывающий участок RS3. Взаимодействие с ним репрессора YbtA блокирует связывание РНК-полимеразы с элементом -10 промоторов уЫА и irp6.

3). Не обнаружено прямого влияния йерсиниабактина на взаимодействие YbtA с промоторами HPI. Поэтому участие йерсиниабактина в регуляции взаимодействия YbtA с промоторами может быть опосредовано через продукты его деградации.

4). Показано, что ERIC-элемент может увеличивать экспрессию генов, входя в состав их mRNA. Возможно, это предохраняет mRNA от деградации за счет образования петельных структур.

5). Показано, что компоненты системы транспорта йерсиниабактина FyuA, Irp6 и Irp7, участвуют в регуляции экспрессии генов HPI.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе изучена структурная организация промоторов генов острова патогенности (HPI) йерсиний и механизм регуляции экспрессии этих генов транскрипционным регулятором YbtA. Кроме того, было определено влияние вставки в промотор ERIC-элемента, и был проведен поиск возможных дополнительных регулирующих механизмов внутри этой системы, влияющих на экспрессию генов HPI.

Результаты проведенных исследований указывают на то, что YbtA активирует транскрипцию генов HPI, связываясь с парными последовательностями (RS) с общей консенсусной последовательностью ACCCGwwwCGGGT (где w - А или Т) в промоторах JyuA, irp2 и irp6. Последовательность RSI в этих промоторах перекрывается с регионом -35, являющимся местом посадки RNAP, что указывает на принадлежность YbtA ко 2-му классу экспрессионных регуляторов.

Несмотря на зависимость уровня экспрессии генов под контролем промоторов fyuA, irp2 и irp6 от присутствия в окружающей среде сидерофора йерсиниабактина (Ybt) и железа, не было обнаружено заметного изменения в связывании YbtA и YbtA -регулируемых промоторов даже в присутствии многократно превышающих количеств Ybt или комплекса Ybt-Fe. Так же, в экспериментах с радиоактивным железом не было найдено никаких подтверждений того, что YbtA способен связывать комплекс Ybt-Fe или Fe. Возможно, взаимодействие YbtA и ДНК происходит независимо от присутствия эффектора, которым может являться какой-либо из продуктов деградации Ybt, но эффектор меняет структуру YbtA таким образом, что делает возможным взаимодействие с RNAP.

Подобно некоторым AraC-подобным белкам, в том числе самому АгаС и ближайшему гомологу PchR, YbtA так же репрессирует собственную экспрессию (Fetherston, Bearden, and Perry, 1996). Нами была предпринята попытка объяснить, каким образом YbtA может являться как активатором, так и репрессором.

Было обнаружено, что промоторы уЫА и irp6 дивергентны и сильно перекрываются в участках связывания RNAP, и, по-видимому, регуляторная последовательность RS1 и RS2 может быть общей для обоих промоторов. Эксперименты по выявлению YbtA-связывающих участков с помощью футпринтинга показали, что для пары промоторов ybtA/irp6 участок, закрытый YbtA по протяженности приблизительно вдвое превышает аналогичные участки в промоторах irp2 и fyuA, что предполагало присоединение вдвое большего числа молекул YbtA. Результаты гель-шифта подтвердили это предположение, продемонстрировав наличие двух смещённых полос для промоторов ybtA/irp6 вместо одной для irp2 и fyuA. Компьютерный анализ нуклеотидной последовательности промоторов ybtA/irp6 выявил последовательность RS3, которая, несмотря на малое соответствие консенсусной последовательности, могла быть участком связывания, определяющим присоединение дополнительных молекул YbtA, закрывающих -10 и -35 последовательности промотора ybt А.

В ходе экспериментов с промоторами, несущими делеции RSI, RS2 и RS3, было выявлено, что присоединение YbtA определяется преимущественно последовательностью RS1 и что для образования второй смещенной полосы необходимо присутствие всех 3-х последовательностей. Репортерный анализ показал, что для активации промотора irpö и репрессии промотора ybtA обязательно присутствие обеих последовательностей RS1 и RS2, но последовательность RS3 необходима только для репрессии ybtA.

Па основании этих данных была предложена модель регуляции дивергентных промоторов ybtA/irpö, подразумевающая существование в условиях недостатка железа в клетке равновесия между тремя возможными состояниями промоторов:

I) Свободного, при котором идёт транскрипция с промотора ybtA;

II) Определяемого последовательностями RS1 и RS2 комплекса промоторов и YbtA, при котором активируется транскрипция с промотора irpö;

III) Блокирующего транскрипцию в обоих направлениях комплекса промоторов и двойного количества молекул YbtA, для образования которого кроме RS1 и RS2 необходима последовательность RS3.

Сравнение дивергентных перекрывающихся промоторов ybtA/irpö Y. enterocolitica и Y. pestis выявило, что ERIC-элемент увеличивает экспрессию ybtA, что предположительно связано с его вхождением в состав mRNA ybtA и увеличением его стабильности за счёт образования петельных структур. ERIC-элемент не изменяет экспрессию irpö, хотя и частично перекрывается с сайтами связывания регулятора экспрессии YbtA.

Ранее было показано, что мутации генов, кодирующих компоненты системы утилизации железа, оказывают различное влияние на активацию одного из промоторов HPI, fyuA (Brem et al., 2001), сходного по структуре с другим промотором HPI, irp2. Следующим этапом в этом направлении, который был выполнен в настоящей работе, являлось определеЕше влияния этих мутаций на дивергентные перекрывающиеся промоторы ybtA и irpö. Было обнаружено, что, несмотря на различную зависимость активности этих промоторов от YbtA и йерсиниабактина, делеция генов irpö и irp7 приводила к увеличению экспрессии, а делеция/уиА - к значительной репрессии обеих промоторов. В настоящее время имеющиеся данные не позволяют объяснить описанный эффект делений. Возможно, он связан с присутствием в системе утилизации железа йерсиний дополнительных регуляторных механизмов, изучение которых является важной научно-практической задачей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Анисимов, Роман Львович, 2005 год

1. Adams,C.C., Stern,D.B. (1990) Control of mRNA stability in chloroplasts by 3' inverted repeats: effects of stem and loop mutations on degradation of psbA mRNA in vitro Nucleic Acids Res 18: 6003-6010.

2. Amabile-Cuevas,C.F., Demple,B. (1991) Molecular characterization of the soxRS genes of Escherichia coli: two genes control a superoxide stress regulon Nucleic Acids Res 19: 4479-4484.

3. Barnard,A., Wolfe,A., and Busby,S. (2004) Regulation at complex bacterial promoters: how bacteria use different promoter organizations to produce different regulatory outcomes Curr.OpinMicrobioL 7: 102-108.

4. Baumler,A.J., Hantke,K. (1992a) A lipoprotein of Yersinia enterocolitica facilitates ferrioxamine uptake in Escherichia coli J.BacterioL 174: 1029-1035.

5. Baumler,A.J., Hantke,K. (1992b) Ferrioxamine uptake in Yersinia enterocolitica: characterization of the receptor protein FoxA MoLMicrobioL 6: 1309-1321.

6. Baumler,A.J., R.Koebnik, I.Stojiljkovic, J.Heesemann, V.Braun, and K.Hantke. (1993) Survey on newly characterized iron uptake systems of Yersinia enterocolitica. ZentralbLBakterioL 278: 416424.

7. Bayer,M.E., Thurow,H., and Bayer,M.H. (1979) Penetration of the polysaccharide capsule of Escherichia coli (Bil61/42) by bacteriophage K29 Virology 94: 95-118.

8. Bearden,S.W., Fetherston,J.D., and Perry,R.D. (1997) Genetic organization of the yersiniabactin biosynthetic region and construction of avirulent mutants in Yersinia pestis InfecLlmmun. 65: 1659-1668.

9. Bearden,S.W., Staggs,T.M., and Perry,R.D. (1998) An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11 J.BacterioL 180: 1135-1147.

10. Beck,v.B., Hayman,G.T., and Farrand,S.K. (1992) Opine catabolism and conjugal transfer of the nopaline Ti plasmid pTiC58 are coordinately regulated by a single repressor Proc.Natl.Acad.ScL U.S.A 89: 643-647.

11. Blattner,F.R., Burland,V., Plunkett,G., III, Sofia,H.J., and Daniels,D.L. (1993) Analysis of the Escherichia coli genome. IV. DNA sequence of the region from 89.2 to 92.8 minutes Nucleic Acids Res 21: 5408-5417.

12. Boos,W., J.M.Lucht. (1996) Periplasmic binding protein-dependent ABC transporters. In Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology. F.C.Neidhardt (ed). Washington, D.C: American Society for Microbiology., pp. 1175-1209.

13. Braun,V., Hantke,K., and Koster,W. (1998) Bacterial iron transport: mechanisms, genetics, and regulation Met Ions. Biol Syst. 35: 67-145.

14. Brem,D., Pelludat,C., Rakin,A., Jacobi,C.A., and Heesemann,J. (2001) Functional analysis of yersiniabactin transport genes of Yersinia enterocolitica Microbiology 147: 1115-1127.

15. Brenner,D.J. (1979) Speciation in Yersinia ContribMicrobioLlmmunoL 5: 33-43.

16. Brickman.T.J., Melntosh,M.A. (1992) Overexpression and purification of ferric enterobactin esterase from Escherichia coli. Demonstration of enzymatic hydrolysis of enterobactin and its iron complex J.BioLChenu 267: 12350-12355.

17. Brot,N., Goodwin,J., and Fales,H. (1966) In vivo and in vitro formation of 2,3-dihydroxybenzoylserine by Escherichia coli K12 Biochem.Biophys.Res Commun. 25: 454-461.

18. Brown,N.L., Stoyanov,J.V., Kidd,S.P., and Hobman,J.L. (2003) The MerR family of transcriptional regulators FEMS MicrobioLRev. 27: 145-163.

19. Brubaker,R.R. (1991) Factors promoting acute and chronic diseases caused by yersiniae ClinMicrobioLRev. 4: 309-324.

20. Buck,D., Guest,J.R. (1989) Overexpression and site-directed mutagenesis of the succinyl-CoA synthetase of Escherichia coli and nucleotide sequence of a gene (g30) that is adjacent to the sue operon BiochenuJ. 260: 737-747.

21. Bullen J. J., G riffiths E (1987) Iron and infection Willey.

22. Carniel,E., Guilvout,I., and Prentice,M. (1996) Characterization of a large chromosomal "high-pathogenicity island" in biotype IB Yersinia enterocolitica J.BacterioL 178: 6743-6751.

23. Carniel,E., Guiyoule,A., Guilvout,I., and Mercereau-Puijalon,0. (1992) Molecular cloning, iron-regulation and mutagenesis of the irp2 gene encoding HMWP2, a protein specific for the highly pathogenic Yersinia MoLMicrobioL 6: 379-388.

24. Carniel,E., Mazigh,D., and Mollaret,H.H. (1987) Correlation between the presence of two high molecular weight iron-regulated proteins and the virulence of Yersiniae ContribMicrobioLlmmunoL 9: 259-265.

25. Carra,J.H., Schleif,R.F. (1993) Variation of half-site organization and DNA looping by AraC protein EMBOJ. 12: 35-44.

26. Carter,P.B. (1975) Pathogenecity of Yersinia enterocolitica for mice InfecLlmmun. 11: 164-170.

27. Chambers,C.E., Mclntyre.D.D., Mouck,M., and Sokol.P.A. (1996) Physical and structural characterization ofyersiniophore, a siderophore produced by clinical isolates of Yersinia enterocolitica Biometals 9: 157-167.

28. Chang,A.C., Cohen,S.N. (1978) Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid J.BacterioL 134: 1141-1156.

29. Chao,L., Vargas,C., Spear,B.B., and Cox,E.C. (1983) Transposable elements as mutator genes in evolution Nature 303: 633-635.

30. Chugani,S.A., Parsek,M.R., and Chakrabarty,A.M. (1998) Transcriptional repression mediated by LysR-type regulator CatR bound at multiple binding sites J.BacterioL 180: 2367-2372.

31. Cohen,S.P., Hachler,H., and Levy,S.B. (1993) Genetic and functional analysis of the multiple antibiotic resistance (mar) locus in Escherichia coli J.BacterioL 175: 1484-1492.

32. Costerton,J.W., Ingram,J.M., and Cheng,K.J. (1974) Structure and function of the cell envelope of gram-negative bacteria BacterioLRev. 38: 87-110.

33. Cox,C.D., Rinehart,K.L., Jr., Moore,M.L., and Cook,J-C., Jr. (1981) Pyochelin: novel structure of an iron-chclating growth promoter for Pseudomonas aeruginosa Proc.Natl.AcadScLU.S.A 78: 4256-4260.

34. Dehoux,P., Cossart,P. (1995) Homologies between salmolysin and some bacterial regulatory proteins MoLMicrobioL 15: 591.

35. Doolittle,W.F., Sapienza,C. (1980) Selfish genes, the phenotype paradigm and genome evolution Nature 284: 601-603.

36. Dove,S.L., Darst,S.A., and Hochschild,A. (2003) Region 4 of sigma as a target for transcription regulation MoLMicrobioL 48: 863-874.

37. Drechsel H (1995) Structure elucidation of yersiniabactin, a siderophore from highly virulent Yersinia strains. Liebigs Ann: 1727-1733.

38. Earhart,C.F. (1996) Uptake and metabolism of iron and molybdenum. In Escherichia coliand Salmonella: Cellular and molecular biology. F.C.Neidhardt (ed). Washington, D.C: American Society for Microbiology., pp. 1075-1090.

39. Escolar,L., Perez-Martin,J., and de,L., V (1999) Opening the iron box: transcriptional metalloregulation by the Fur protein J.BacterioL 181: 6223-6229.

40. Fetherston,J.D., Bearden,S.W., and Perry,R.D. (1996) YbtA, an AraC-type regulator of the Yersinia pestis pesticin/yersiniabactin receptor MoLMicrobioL 22: 315-325.

41. Fetherston,J.D., Bertolino,V.J., and Perry,R.D. (1999) YbtP and YbtQ: two ABC transporters required for iron uptake in Yersinia pestis MoLMicrobioL 32: 289-299.

42. Fetherston,J.D., Lillard,J,W., Jr., and Perry,R.D. (1995) Analysis of the pesticin receptor from Yersinia pestis: role in iron-deficient growth and possible regulation by its siderophore J.BacterioL 177: 1824-1833.

43. Frederiksen, W. A study of some Yersinia pseudotuberculosis-Yike bacteria (Bacterium enterocoliticum and Pasteurella X). 108.1964. Proc. 14th. Scand. Congr. Path. Microbiol.

44. Furrer,J.L., Sanders,D.N., Hook-Barnard,I.G., and Mcintosh,M. A. (2002) Export of the siderophore enterobactin in Escherichia coli: involvement of a 43 kDa membrane exporter MoLMicrobioL 44:1225-1234.

45. Gallegos,M.T., Michan.C., and Ramos,J.L. (1993) The XylS/AraC family of regulators Nucleic Acids ReslU 807-810.

46. Gallegos,M.T., Schleif,R., Bairoch,A., Hofmann,K., and Ramos,J.L. (1997) Arac/XylS family of transcriptional regulators MicrobioLMoLBioLRev. 61: 393-410.

47. Gambino,L., Gracheck,S.J., and Miller,P.F. (1993) Overexpression of the MarA positive regulator is sufficient to confer multiple antibiotic resistance in Escherichia coli J.BacterioL 175: 2888-2894.

48. Garibaldi,J.A., Neilands,J.B. (1956) Formation of iron-binding compounds by micro-organisms Nature 177: 526-527.

49. Gehring,A.M., DeMoll,E., Fetherston,J.D., Mori,I., Mayhew,G.F., Blattner,F.R., Walsh,C.T., and Perry,R.D. (1998) Iron acquisition in plague: modular logic in enzymatic biogenesis of yersiniabactin by Yersinia pestis ChenuBioL 5: 573-586.

50. Gilbert,W. (1976) Starting and stopping sequences for the RNA polymerase. In RNA polymerase. Losick,R., Chamberlin,M. (eds). N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, pp. 193-205.

51. Gilson,E., Rousset,J.P., Clement,J.M., and Hofnung,M. (1986) A subfamily of E. coli palindromic units implicated in transcription termination? Ann InsLPasteur MicrobioL 137B: 259-270.

52. Gong,S., Bearden,S.W., Geoffroy,V.A., Fetherston,J.D., and Perry,R.D. (2001) Characterization of the Yersinia pestis Yfu ABC inorganic iron transport system InfecLlmmun. 69: 2829-2837.

53. Haag,H., Hantke,K., DrechseI,H., Stojiljkovic,I., Jung,G., and Zahner,H. (1993) Purification of yersiniabactin: a siderophore and possible virulence factor of Yersinia enterocolitica

54. J. Gen.MicrobioL 139 ( Pt 9): 2159-2165.

55. Hanamura,A., Aiba,H. (1991) Molecular mechanism of negative autoregulation of Escherichia coli crp gene Nucleic Acids Res 19: 4413-4419.

56. Hantke,K. (1981) Regulation of ferric iron transport in Escherichia coli K12: isolation of a constitutive mutant MoLGen.GeneL 182: 288-292.

57. Hantke,K. (2001) Iron and metal regulation in bacteria Curr.Opin.MicrobioL 4: 172-177.

58. Heesemann,J., Eggers,C., and Schroder,J. (1987) Serological diagnosis of yersiniosis by immunoblot technique using virulence-associated antigen of enteropathogenic Yersiniae Contrib.MicrobioLImmunoL 9: 285-289.

59. Heesemann,J., Laufs,R. (1983) Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid J.BacterioL 155: 761-767.

60. Heinrichs,D.E., Poole,K. (1993) Cloning and sequence analysis of a gene (pchR) encoding an AraC family activator of pyochelin and ferripyochelin receptor synthesis in Pseudomonas aeruginosa J.BacterioL 175: 5882-5889.

61. Heinrichs,D.E., Poole,K. (1996) PchR, a regulator of ferripyochelin receptor gene (fptA) expression in Pseudomonas aeruginosa, functions both as an activator and as a repressor J.BacterioL 178: 2586-2592.

62. Heldwein,E.E., Brennan,R.G. (2001) Crystal structure of the transcription activator BmrR bound to DNA and a drug Nature 409: 378-382.

63. Helmann,J.D., Ballard,B.T., and Walsh,C.T. (1990a) The MerR metalloregulatory protein binds mercuric ion as a tricoordinate, metal-bridged dimer Science 247: 946-948.

64. Helmann,J.D., Shewchuk,L.M., and Walsh,C.T. (1990b) Regulation or gene expression by mercury Adv.Inorg.Biochem. 8: 33-61.

65. Henikoff,S., Haughn,G.W., Calvo,J.M., and Wallace,J.C. (1988) A large family of bacterial activator proteins Proc.NaiLAcad.ScLU.S.A 85: 6602-6606.

66. Henikoff,S., Wallace,J.C., and Brown,J.P. (1990) Finding protein similarities with nucleotide sequence databases Methods EnzymoL 183: 111-132.

67. Higgins,C.F., Ames,G.F., Barnes,W.M., Clement,J.M., and Hofnung,M. (1982) A novel intercistronic regulatory element of prokaryotic operons Nature 298: 760-762.

68. Hulton,C.S., Higgins,C.F., and Sharp,P.M. (1991) ERIC sequences: a novel family of repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria MoLMicrobioL 5: 825-834.

69. Ito,T., Neilands,J.B. (1958) Products of "low-iron fermentation" with Bacillus subtilis: isolation, characterization, and synthesis. JAm.Chem.Soc 80: 4645-4647.

70. Jacobi, C. A. Analyse von Pathogenitdtsfaktoren von Yersinia enterocolitica mit den Reportergenen GFPund LuziJerase. PhD thesis, Universitat Wbrzburg, Germany. 1999.

71. Kerbarh,0., Ciulli,A., Howard,N.I., and Abell,C. (2005) Salicylate biosynthesis: overexpression, purification, and characterization of Irp9, a bifunctional salicylate synthase from Yersinia enterocolitica J.BacterioL 187: 5061-5066.

72. Knapp (1988) Die Gattung Yersinia Yersiniosen. In Lehrbuch der Medizinischen Mikrobiologie. H.Brandis, G.Pulverer (eds).

73. Koebnik,R., Hantke,K., and Braun,V. (1993) The TonB-dependent ferrichrome receptor FcuA of Yersinia enterocolitica: evidence against a strict co-evolution of receptor structure and substrate specificity MoLMicrobioL 7: 383-393.

74. Korth,H. (1970) 2,3-dihydroxybenzoic acid and its amino acid derivatives in the culture medium of Klebsiella oxytoca. Arch.MikrobioL 70: 297-302.

75. Kyrpides,N.C., Ouzounis,C.A. (1995) Nucleic acid-binding metabolic enzymes: living fossils of stereochemical interactions? J.MoLEvoL 40: 564-569.

76. Lankford,C.E. (1973) Bacterial assimilation of iron. CritRev.MicrobioL 2: 273-331.

77. Lauble,H., Georgalis,Y., and Heinemann,U. (1989) Studies on the domain structure of the Salmonella typhimurium AraC protein Eur.J.Biochem. 185: 319-325.

78. Lee,D.H., Schleif,R.F. (1989) In vivo DNA loops in araCBAD: size limits and helical repeat Proc.NatLAcad.SclU.S.A 86: 476-480.

79. Leffell,M.S., Spitznagel,J.K. (1975) Fate of human lactoferrin and myeloperoxidase in phagocytizing human neutrophils: effects of immunoglobulin G subclasses and immune complexes coated on latex beads InfecLlmmun. 12: 813-820.

80. Lindquist.S., Weston-Hafer,K., Schmidt,H., Pul,C., Korfmann,G., Erickson,J., Sanders,C., Martin,H.H., and Normark,S. (1993) AmpG, a signal transducer in chromosomal beta-lactamase induction MoLMicrobioL 9: 703-715.87.