Структурно-функциональная организация регуляторной области гена уридинфосфорилазы E. coli и Salmonella typhimurium тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Домакова, Елена Владимировна

• Домакова, Елена Владимировна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Домакова, Елена Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10 Глава 1. Общая характеристика транскрипционного

цикла прокариот

1.1. РНК-полимераза и структурные элементы промотора

1.2. Модуляция активности промотора 15 Глава 2. Взаимодействие элементов негативного и позитивного контроля в регуляции экспрессии бактериальных оперонов

2.1.Феномен катаболитной репрессии '

2.2. Генетический контроль катаболитной репрессии у Е. соН

2.3. Активирующий транскрипцию комплекс сАМР-СЯР

2.4. Классификация СЯР-зависимых промоторов

2.4.1. Лактозный оперон

2.4.2. Галактозный оперон

2.4.3.Мальтозный оперон

2.5. Множественные операторные участки и образование петлевых структур в ДНК

2.6. Общая характеристика гистоноподобных белков

2.7.ДНК-связывающий белок И Б и его роль в

регуляции транскрипции

2.8. ДНК-связывающий белок 1НГ и его функции в клетке

2.9. Влияние суперспирализации ДНК на активацию транскрипции

2.10. Заключение

Глава 3.Особенности структурно-функциональной организации и регуляции генов катаболизма нуклеозидов

3.1. Структурно-функциональная организация белка CytR

3.2. Структура и регуляция экспрессии генов deo- оперона

3.3. Регуляция экспрессии гена tsx 64 3.4 Регуляция экспрессии гена nupG 65 3.5. Регуляции экспрессии гена cdd 66 3>.6. Регуляции экспрессии гена udp 67 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Глава. 4.Роль межгенной области metE-udp в регуляции экспрессии гена udp Escherichia coli

4.1. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности межгенной области metE-udp

4.2. Компьютерный анализ нуклеотидной

последовательности регуляторной области гена udp

4.3. Экспрессия гена udp в штаммах, дефектных по белкам

IHF и FIS

4.4. Зависимость экспрессии гена udp от размера регуляторной области

4.5. Особенности экспрессии гена udp у промоторных мутантов udpP264 и udpPl 98 Глава.5.Мутационный анализ основного сайта связывания белка CytR в регуляторной области гена udp Escherichia coli

5.1.Влияние нуклеотидных замен в пентамере TGCAA

на экспрессию гена udp

5.2. Влияние полученных мутаций на способность промотора к титрованию белка-репрессора CytR 107 Глава 6. Анализ структуры и регуляции udpP промотора

y S.typhimurium 110 6.1. Анализ структурной организации регуляторной области

гена udp S. typhimurium 111 6.2 Изучение регуляции udp промотора S. typhimurium

в системе in vivo

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональная организация регуляторной области гена уридинфосфорилазы E. coli и Salmonella typhimurium»

ВВЕДЕНИЕ

Изучение механизмов регуляции экспрессии генов является одним из важнейших направлений молекулярной генетики. Долгое время считалось общепризнанным, что бактериальные регуляторные белки содержат всю необходимую структурную информацию, обеспечивающую распознавание и связывание со специфическими последовательностями-мишенями в молекуле ДНК, в то время как регуляция с участием мультибелковых комплексов характерна исключительно для эукариотических генов. К настоящему времени выяснилось, что механизм регуляции, основанный на белок-белковых взаимодействиях не является исключительной прерогативой эукариот и довольно широко используется и в прокариотических системах. К таким системам относятся гены, контролирующие транспорт и катаболизм нуклеозндов у E.coli, экспрессия которых находится под негативным контролем белка-репрессора CytR, а также регулируется позитивно с участием активирующего транскрипцию комплекса циклический аденозинмонофосфат (сАМР) - белок-рецептор цАМФ (CRP) [57].

Ген udp является одним из 9 генов, принадлежащих к CytR-регулону и кодирует синтез фермента уридинфосфорилазы. Промоторные области большинства генов катаболизма нуклеозидов, включая udp, охарактеризованы на уровне определения их нуклеотидной последовательности. Показано, что по крайней мере четыре промотора (deoP2, cddP, udpP, nupGP) имеют общий план строения и содержат два тандемно расположенных сайта связыания для белка CRP, между которыми

расположен сайт узнавания для белка-репрессора CytR [164]. Получены убедительные доказательства, что кооперативное связывание белков CytR и CRP с промотором обеспечивается за счет их прямого белок-белкового взаимодействия [152].

Несмотря на сходство в общей конфигурации CytR-регулируемых промоторов, характер взаимодействия

регуляторных белков CytR и CRP с различными промоторами может сильно варьировать. Так, уже в первых работах по клонированию гена udp были получены данные, свидетельствующие о том, что регуляция экспрессии гена udp носит более сложный характер по сравнению с регуляцией промоторов cddP и deoP2: у конструкций, содержащих "канонический" CytR-регулируемый udpP промотор (участок размером 125 пн относительно старта транскрипции), тем не менее наблюдался частичный выход экспрессии гена udp из-под контроля белка-репрессора CytR и комплекса цАМФ-CRP [2]. На основании этих данных можно было предположить, что нуклеотидная последовательность, предшествующая

каноническому промотору гена udp содержит дополнительные регулятор]ibie сайты, влияющие на уровень его экспрессии. Действительно, как выяснилось в ходе данной работы, участок хромосомы, расположенный между геном metE и каноническим промотором гена udp, содержит дополнительные сайты связывания для белков CytR и CRP. Делеционный и

мутационный анализ этих сайтов позволил выявить новое необычное свойство белка CytR менять свою функцию на противоположную и выступать в роли не только репрессора, но и активатора транскрипции. При этом выяснилось, что негативное или позитивное действие белка CytR на транскрипцию

определяется конфигурацией регуляторной области и зависит от количества и взаимного расположения на ней сайтов связывания белка CytR.

Следует отметить, что совсем недавно появились литературные данные, согласно которым белковый комплекс цАМФ-CRP /CytR вовлечен в регуляцию экспрессии гена гроН,

кодирующего синтез сигма-фактора (а32), ответственного за

в

контроль генов теплового шока [75]. Таким образом, функция комплекса cAMP-CRP /CytR в клетке не ограничивается его участием в регуляции генов транспорта и катаболизма нуклеозидов, а по всей видимости имеет более плейотропный характер. Для изучения функциональной роли комплекса сАМР-CRif/CytR в метаболизме клетки и оценки его универсальности могут быть использованы и другие подходы, например, поиск и сравнительный анализ гомологичных компонентов этой регуляторной системы у других микроорганизмов. Настоящая работа может рассматриваться как первая попытка реализации такого подхода с привлечением в качестве нового объекта для изучения механизма CytR-регуляции бактерий вида Salmonella typhimurium — наиболее близкого к E.coli представителю семейства Enterobacteriaceae. Цель и задачи исследования.

Основная цель работы состояла в изучении особенностей структурно-функциональной организации регуляторной области гена udp E.coli и S.typhimurium и выявлении механизма регуляции гена udp с участием белка-репрессора CytR и комплекса сАМР-CRP. В соответствии с этим в работе ставились следующие задачи:

/

I

1. Уточнение нуклеотидной последовательности межгенной области melE-udp E.coli размером 956 пн, включающей регуляторную область гена udp.

2. Получение коллекции делеционных вариантов фрагмента 956 пн, укороченных с 5'-конца, т.е. включающих промоторную область гена udp и отличающихся различной протяженностью относительно старта транскрипции.

: 3. Проведение сайт-направленного мутагенеза пентамерного мотива 5'-TGCAA-3', который согласно данным in vitro является левой частью основного сайта связывания белка CytR в регуляторной области гена udp.

4. Клонирование и определение нуклеотидной последовательности регуляторной области гена udp S. typhimurium.

5. Выявление общих закономерностей структурно-функциональной организации промотора гена udp у E.coli. и S. typhimurium

Научная новизна и практическая значимость.

Уточнена нуклеотидная последовательность межгеннного участка metE-udp размером 956 пн. На этом фрагменте был обнаружен ряд делеций, вставок и нуклеотидных замен, которые отличаются от недавно опубликованной полной нуклеотидной последовательноси E.coli [15]. Кроме того, были идентифицированы три дополнительных потенциальных промотора с координатами сайтов инициации транскрипции -192 (PI), -392 (Р2), -636 (РЗ), один дополнительный CRP сайт с координатами от -320 до -305. При поиске потенциальных сайтов связывания для белка CytR был использован в качестве консенсуса модифицированный CytR-мотив, в результате нами

обнаружено 9 дополнительных сайтов связывания для белка CytR, которые отличаются от предполагаемого консенсуса заменами не более, чем в 5 пн. Анализ регуляторной области гена udp выявил наличие трех потенциальных сайтов связывания для белка IHF и 11 потенциальных сайтов для белка FIS.

Проведен делеционный анализ промотор-проксимальной области гена uJp и показано, что по мере укорочения регуляторной области гена udp происходит увеличение уровня экспрессии промотора udpP как в условиях его репрессии (cytR+) так и дерепрессии (cytR-). Показано, что негативное действие белка CytR на экспрессию промотора udpP реализуется до тех пор, пока в регуляторной области присутствует интактный сайт CRP2.

Впервые проведен систематический мутационный анализ сайта связывания белка CytR и показано, что все мутации затрагивающие пентамер TGCAA обусловливают частичный выход экспрессии гена udp из-под контроля белка-репрессора. Установлено, что нуклеотидная пара G/C в положении -67 имеет особо важное значение для связывания белка CytR с промотором. Показано, что все отобранные мутантные промоторы характеризуются сниженной способностью к титрованию репрессора CytR в системе in vivo.

Впервые осуществлено клонирование промотора гена udp S.typhimurium и определена его нуклеотидная последовательность. Выявлена большая гомология промоторной области гена udp E.coli и S.typhimurium. Некоторые из найденных отличий нуклеотидной последовательности, затрагивают основные сайты связывания для регуляторных белков CytR и CRP.

Впервые изучена гетерологичная экспрессия гена udp в клетках E.coli и S.typhimurium. Полученные результаты показывают, что белок-репрессор CytR S.typhimurium имеет большее сродство к промотору гена udp E.coli, чем к своему собственному.

. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

Регуляция экспрессии генов является одной из ключевых проблем современной молекулярной генетики. В последнее время наметился существенный прогресс в расшифровке структурной организации и регуляции генетического материала у эукариот. Тем не менее, основной моделью для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе регуляции процессов транскрипции и трансляции, продолжают оставаться прокар и оти ческ и е системы, среди которых ведущее место занимают бактерии двух близкородственных видов: Escherichia coli и Salmonella typhimurium, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae.

В настоящем обзоре мы ограничимся рассмотрением работ, посвященных исследованию регуляторных механизмов, которые управляют активностью бактериальных генов и действуют на уровне инициации их транскрипции. В первой главе обзора кратко изложены основные этапы транскрипционого цикла прокариот. Во второй главе основное внимание будет уделено рассмотрению регуляторных механизмов, с помощью которых различные регуляторные белки влияют на процесс инициации транскрипции. Наконец, третья глава посвящена анализу особенностей регуляции генов, вовлеченных в катаболизм нуклеозидов у E.coli.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Домакова, Елена Владимировна

Выводы.

1. Уточнена нуклеотидная последовательность фрагмента хромосомы E.coli К-12 размером 1080 пн расположенного между структурными генами metE и udp и включающего промоторную область гена udp. Анализ нуклеотидной последовательности этой области выявил присутствие в ее составе дополнительных сайтов связывания для белков CytR и CRP, а также для' полифункциональЦых белков HIF и FIS.

2. Получен набор делеционных вариантов с укороченной регуляторной областью гена udp. Установлено, что уровень CytR-регуляции гена udp зависит от количества сайтов связывания для белка CytR, в частности сайтов Rö, Rs, R4, R3 и R2.

3. Обнаружена амбивалентность действия белка CytR на транскрипцию гена udp. Показано, что белок CytR может менять функцию репрессора на противоположную - активатора транскрипции в зависимости от конфигурации промотора, например, при делегировании сайта CRP2 в промоторе дикого типа, либо при появлении в результате дупликации дополнительного сайта CRP1 в случае мутанта udpPl.

4. Проведен сайт-направленный мутагенез пентамерного мотива 5'-TGCAA-3', который является левой частью основного сайта связывания белка CytR в регуляторной области гена udp. Показано, что у большинства отобранных мутантов нуклеотидные замены приводят не просто к выходу промотора из-под контроля белка-репрессора CytR, а обусловливают качественное изменение реакции промотора на присутствие или отсутствие этого регуляторного белка.

5. Клонирована и определена нуклеотидная последовательность регуляторной области гена udp S.typhimurium. Обнаружены два сайта связывания для белка CRP с координатами центров симметрии в положениях -41.5 (CRP1) и -93.5 (CRP2) относительно старта транскрипции В спейсерной области между сайтами CRP1 и CRP2 локализован основной сайт связывания для белка CytR. Таким образом, по общему плану строения промоторы генов и dp S.typhimurium и E.coli полностью идентичны. Выявлено неравномерное распределение гомологичных участков в пределах регуляторной области гена udp E.coli и S.typhimurium: большинство замен локализованы в "нейтральных" в отношении регуляции участках промотора, тогда как в сайтах связывания регуляторных белков CytR и CRP обнаружены лишь единичные нуклеотидные замены. 6. Показано, что в клетках E.coli наблюдается частичный выход промотора гена udp S.typhimurium из-под контроля белка-репрессора CytR, тогда как в клетках S.typhimurium промотор гена udp E.coli подвержен более строгой негативной регуляции под действием белка CytR, чем свой собственный.

2.10. Заключение.

Таким образом, совокупность представленных выше данных, свидетельствует о том, что несмотря на существование принципиально общей схемы инициации транскрипции у прокариот и похожий план строения функционально важных участков а70-зависимых промоторов (консенсусные -10 и -35 области), на процесс инициации транскрипции помимо специфических белков-регуляторов может оказывать влияние множество других факторов. А именно, таких как суперспирализация ДНК, конформация промотора, способность регуляторной области образовывать петлевые структуры и т.д. Важную роль в регуляции активности промоторов играют межбелковые взаимодействия, которые реализуются через контакты различных регуляторных белков между собой и с РНК-полимеразой. Таким образом, уровень экспрессии гена или оперона определяется особенностями структуры его регуляторной области и прилегающего к ней, иногда довольно протяженного участка хромосомы, а также совокупностью белковых факторов, способных связываться с этими районами ДНК.

Из приведенного выше краткого описания механизмов регуляции отдельных бактериальных оперонов видно, что каждый из них характеризуется своими индивидуальными особенностями. Поэтому детальное исследование особенностей регуляции каждой из модельных систем вносит существенный вклад в понимание общих закономерностей регуляции транскрипции. Не являются исключением в этом отношении и гены, контролирующие катаболизм нуклеозидов у E.coli, которые образуют так называемый CytR регулон. Так, генетические исследования на модели этих генов позволили выявить совершенно новые свойства комплекса cAMP-CRP в регуляции транскрипции, а также показать, что белок CytR, действующий в комплексе с белком CRP проявляет необычные для бактериальных регуляторных белков свойства универсального модулятора транскрипции.

Особенности регуляции генов катаболизма нуклеозидов будут рассмотрены в следующей главе.

Глава 3. Особенности структурно-функциональной организации и регуляции генов катаболизма нуклеозидов.

CytR-регулон включает 9 генов, которые кодируют белки, вовлеченные в транспорт и катаболизм нуклеозидов.

Транскрипция этих генов находится под контролем трех регуляторных белков. Комплекс циклический аденозинмонофосфат (сАМР) белок-рецептор cAMP (CRP) активирует транскрипцию, влияя на связывание РНК-полимеразы с промотором [57,77,100]. Два белка DeoR и CytR репрессируют транскрипцию. Классический бактериальный репрессор DeoR действует автономно. Он кооперативно связывается по крайней мере с двумя операторными участками, расположенными на расстоянии 500 пн, образуя петлеобразные структуры ДНК между связавшимися репрессорами [152,153]. Второй репрессор — CytR, связываясь кооперативно с cAMP-CRP комплесом образует репрессионный комплекс, вокруг которого специфическим образом закручивается ДИК [65,111,112,149]. К CytR-регулону принадлежат все 9 генов катаболизма нуклеозидов, тогда как в состав DeoR-регулона входят гены б/

К настоящему времени осуществлено клонирование и определена нуклеотидная последовательность большинства структурных генов CytR-регулона, включая их регуляторные области. Промоторные области всех генов катаболизма и транспорта нуклеозидов имеют похожую конфигурацию, хотя каждый из промоторов характеризуется определенными индивидуальными особенностями (Рис.8).

Классификация CytR-регулируемых промоторов, проведенная на основе взаимного расположения и количества сайтов связывания для белков CRP и CytR, позволила выделить три класса промоторов (Рис.8):

1. В наиболее простом случае репрессионный комплекс формируется из одной пары молекул CRP и CytR белков.

CRP-1

CRP-1 liiaiivi Ж. deо Po j CRP-2~

-03,5uöp-P

JcRF-2 -03,5 nupG-P -70 crp-1

1 CRP-1 i

-40,5

CRP-1

SST 1СДР-1

61,5 41,5 -42,5

CRP-2

CRP-2 1 1 i

-02,Б -65 cdd-P •' -01,5 [CRP-2 1

CRP-1

CRP-0 -40,5

CRP-3

CRP-1

CRP-1

-83,5

Isx-Pa

LiiE^AJa-üJ

-61.5 -41,5 -40,5

CRP-21 • 1 cRp-2|. ШМ

CRP-1

-73,5 oytX-rot

CRP-2

-4B,5 rotP4

CRP-0

-20,5 cylX-P CRP-2 j

-155,5

-125

CRP-1

CRP-1

102,5 1 1 r 1 n 1 n ж 1 1 rotP2 -60

Рис.8. Общий план строения CytR-регулируемых промоторов. Сайты CRP, активирующие транскрипцию показаны сверху, а сайты CRP, участвующие в фондировании репрессионного комплекса в комплексе с белком CytR.

Примером репрессионного комплекса такой конфигурации является промотор гена cytR, контролирующего синтез белка-репрессора CytR. В промоторе cytP сайт связывания белка CRP расположен в положении -64.5 относительно старта транскрипции, : а сайт связывания белка CytR — в положении -42.5 (Рис.8) [111].

2. Второй класс промоторов содержит два тандемно расположенных сайта связывания для белка CRP: CRP1 и CRP2, между которыми локализован сайт узнавания для белка CytR (промоторы генов deoP2 и udpP) (Рис.8). У обоих промоторов сайт CRP2, локализованный в положении -93.5 обнаруживает более высокое сродство к белку CRP, чем сайт CRP1, который находится в положении -40.5 в случае промотора deoP2 и в положении -41.5 в случае промотора udpP. Белок CRP взаимодействует с CRP3 только после насыщения сайта CRP2. Расстояние 52-53 пн между CRP-сайтами является оптимальным для кооперативного взаимодействия CRP и CytR белков. Таким образом, репрессионный комплекс состоит из двух молекул белка CRP и одной молекулы CytR [149,112,22].

3. Промоторы nupG-P, cddP и tsxP2 характеризуются более сложной конфигурацией и включают три функциональных CRP сайта. Для полной активации этих промоторов необходимо, чтобы белок CRP связался с двумя CRP-сайтами, расположенными в строго определенной конфигурации. Во всех трех промоторах, при одновременном связывании белка CRP и белка-репрессора CytR с промотором происходит перемещение комплекса cAMP-CRP на альтернативный сайт связывания. В nupG-P и cddP сайты CRP в активирующем транскрипцию комплексе разделены 50 пн. Однако, присутствие белка-репрессора CytR приводит к перемещению cAMP-CRP комплекса на альтернативный более слабый CRP сайт [65,110]. В активации транскрипции промотора tsxP2 участвует только CRP1 сайт (расположенный в положении -40.5), который обладает высоким сродством к активирующему транскрипцию комплексу. Операторный сайт CytR репрессора частично перекрывается с CRP1 сайтом, поэтому в образование репрессионного комплекса включается слабый CRP2 сайт, расположенный в положении -73.5 и псевдо-сайт для CRP (CRP0) в положении -20.5.

Еще более сложная регуляция характерна для дивергентного промотора cytX-rot, который включает cytX промотор и три (Р2, РЗ и РЗ) из четырех rot промоторов. Репрессия cytX-rot зависит от совместного действия CytR и CRP белков (Рис.8) [105]. В образовании репрессионного комплекса в cytX-rot участвуют два сайта CRP: один с высоким сродством к CRP (CRP-1) и один с низким сродством (CRP-2), расстояние между которыми составляет 53 пн. Все три rot промотора содержат сайт связывания для белка CRP и активируются комплексом сАМР-CRP. Расстояние от старта инициации транскрипции до CRP сайтов у этих промоторов различно: центр CRP1 локализован на расстоянии 42.5 пн от rotP2 старта инициации транскрипции, а CRP-2 на расстоянии 60.5 пн от rotPS и 41.5 от rotP3, соответственно, относительно старта инициации транскрипции. cytX промотор, который транскрибируется в противоположном направлении по сравнению с rot по всей видимости негативно контролируется CRP и CytR. Два сайта связывания CRP с координатами -29.5 и -79.5 относительно старта транскрипции cytX-P промотора не могут поддерживать cAMP-CRP активацию (Рис.8).

3.1. Структурно-функциональная организация белка CytR

CytR репрессор кодируется геном cytR. Промотор этого гена cytP слабо активируется комплексом cAMP-CRP и подвержен авторегуляции продуктом собственного гена [77]. Биохимический анализ показал, что cAMP-CRP связывается с одним сайтом в положении -64.5 относительно старта инициации транскрипции и индуцирует изгибание ДНК. Сайт связывания белка CytR расположен в -42.5 положении (Рис.8). CytR и cAMP-CRP кооперативно связываются с cytP, образуя нуклеопротеиновый комплекс, в котором белки напрямую взаимодействуют друг с другом [111]. Таким образом, система регуляции гена cytR имеет сходные черты с системой регуляции структурных генов катаболизма нуклеозидов.

Активная форма белка CytR представляет собой димер, который взаимодействует с ДНК через "спираль-поворот-спираль" мотив ДНК -связывающего домена. Аминокислотные замены в этой области CytR нарушают его репрессирующую функцию [162]. Белок репрессор CytR принадлежит к Lac-Gal семейству ДНК-связывающих белков [112,10,168]. CytR белок состоит из N-терминального ДНК связывающегося домена и С-концевого домена. Особенность, которая отличает CytR от других белков этого класса, состоит в том, что для связывания с ДНК ему необходим прямой белок-белковый контакт с комплексом cAMP-CRP.

В системе in vitro были получены прямые доказательства, что очищенный белок CytR очень слабо взаимодействует с операторным сайтом. Однако в присутствии комплекса сАМР

CRP сродство CytR к этому участку увеличивается в 100-1 ООО раз [65,112,111]- Следовательно, CytR-реирессия реализуется как-путем прямого контакта с ДНК, так и путем взаимодействия с комплексом cAMP-CRP. Все эти данные указывают на то, что репрессия белком CytR основана на белок-ДР1К и белок-белковых взаимодействиях, и выявляет новую функцию CRP белка, где он выступает в роли как активатора транскрипции, так и ко-репрессора — своеобразного "адаптера", обеспечивающего эффективное связывание CytR-penpeccopa с промотором. На основании приведенных результатов была предложена модель регуляции транскрипции генов катаболизма и транспорта нуклеозидов, в которой белки CytR и CRP посредством кооперативных белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий образуют нуклеопротеиновый комплекс в виде "сэндвича", где CytR белок располагается между двумя связанными с ДНК комплексами cAMP-CRP (Рис.9) [95,152].

Рис.9. Модель взаимодействия белков CytR и CRP в регуляторной области генов катаболизма нуклеозидов. "N" обозначает N-конец белка CRP.

Кооперативное связывание белка CytR и комплекса сАМР-CRP подтверждают опыты выполненные в системе in vitro в присутствии индуктора CytR регулона — цитидина. Данные полученные методом футпринт анализа показывают, что присутствие индуктора в среде не влияет на независимое связывание CytR с ДНК. Скорее всего индуктор нарушает белок-белковые взаимодействия между CytR и комплексом cAMP-CRP, что приводит к активации транскрипции, возможно через влияние на топологию ДНК или через прямое взаимодействие с РНК-полимеразой.

В отличие от классических репрессоров CytR проявляет необычную вариабельность при узнавании оператора. Так, количество витков 'спирали ДНК, а также расстояние между CRP и CyfiR мишенями в различных промоторах неодинаково, кроме того CytR оператор расположен не симметрично по отношению к фланкирующим CRP-мишеням (Рис.8). Для того чтобы объяснить эти данные было сделано предположение, что ДНК-связывающий домен белка CytR "спираль-поворот-спираль" соединен с основным доменом белка гибким линкером, что позволяет осуществлять взаимодействие с операторными полусайтами разделенными различными по протяженности спейсерными участками и контактировать с CRP сайтами на различном расстоянии от оператора.

Как было показано в ранних работах, несовершенный повтор 5'-TGCAA-3' или вырожденная версия этой последовательности присутствует во всех CytR регулируемых промоторах в виде прямых или инвертированных повторов. Расстояние между повторами варьирует в пределах 2-3 пн в большинстве промотров, 11 пн в nupG-P и 5 пн в udpP промоторе [121,110,65]. Однако в одной из последних работ Perini с соавт. [113], был предложен модифицированный консенсусный мотив для связывания белка CytR. В отличие от постулируемого ранее пентамера, этот мотив образует палиндромную структуру, состоящую из двух гексамеров, разделенных 2-5 пн: TTGCAA-N<2-5)-TTGCAA. При использовании в качестве консенсуса этого модифицированного CytR мотива в регуляторной области генов ccdP, deoP2, udpP, tsxP, nupG-P, deoPl и cytR были идентифицированы дополнительные сайты связывания для белка CytR, которые отличаются от предполагаемого консенсуса заменами не более, чем на 5 пн [113].

Наиболее детально характер взаимодействия между позитивной и негативной регуляцией экспрессии генов катаболизма нуклеозидов изучен на модели ¿/

3.2. Структура и регуляция экспрессии генов ¿/ся-онерона. ео-оперон E.coli состоит из четырех тесно сцепленных структурных генов deoC, deoA, deoB и deoD, кодирующих ферменты: дезоксирибоальдолазу, тимидинфосфорилазу, фосфопентомутазу и пуриннуклеозидфосфорилазу [для обзора см. 57]. Транскрипция deo оперона инициируется с двух тандемно расположенных промоторов deoPl и deoP2, разделенных 600 пн. Оба промотора негативно регулируются белком репрессором DeoR. deoP2, кроме того, негативно регулируется CytR и активируется комплексом cAMP-CRP [161].

Изучение структуры регуляторной области deoP2 и deoPl в системе in vivo показало, что оба промотора содержат палиндром размером 16 пн, который частично перекрывается с блоком Прибнова и сайтами инициации транскрипции Р1 и Р2 [161]. Эти палиндромы практически полностью (за исключением одной пары нуклеотидов) идентичны по первичной структуре. Присутствие этих общих элементов в структуре промоторов deoP2 и deoPl, а также изучение полученных конститутивных мутантов, показало, что эти палиндромы являются операторными сайтами репрессора DeoR [28]. Кроме того, при анализе первичной структуры ДНК был обнаружен на расстоянии 279 пн (относительно старта инициации транскрипции deoPl) третий сайт связывания DeoR-палиндром размером 16 пн гомологичный ранее изученным сайтам. Было показано, что для полной DeoR-репрессии любого из промоторов deo оперона Р2 и PI необходимо присутствие всех I трех операторных байтов [163]. Роль тандейных CRP мишеней наиболее интенсивно изучалась на промоторе deoP2. Как отмечалось выше, deoP2 негативно регулируется не только белком- репрессором DeoR, но и CytR и активируется комплексом cAMP-CRP. Регуляторная область deoP2 включает два сайта связывания cAMP-CRP с координатами -40 пн (CRP1) и -93 пн (CRP2) относительно старта инициации транскрипции промотора deoP2. Для обеспечения высокой экспрессии deoP2 необходимы оба CRP сайта. Однако, их функциональная значимость, по-видимому, различна. В отсутствии CytR репрессора комплекс cAMP-CRP связывается с двумя тандемными CRP мишенями. Анализ in vitro показал, что для активации транскрипции с deoP2 промотора достаточно одного CRP сайта. Мутантные промоторы в которых сайт CRP2 был делетирован, инактивирован путем точковых мутаций или перевёрнут относительно основной ориентации, показывали снижение активности промотора в присутствии cAMP-CRP. В делеционных мутантах по CRP1 сайту активности вообще не наблюдалась. Следовательно, сайт CRP1 необходим для активации транскрипции, однако, для полной активации дополнительно требуется неповрежденный и точно расположенный CRP2 сайт [151].

В репрессии deoP2 промотора участвуют оба сайта CRP. Исследования проведенные в системе in vitro, показали, что белок репрессор CytR связывается с последовательностью ДНК в -70 области, расположенной между двумя CRP сайтами deoP2, причем, для взаимодействия белка-репрессора с оператором необходимо чтобы активирующий транскрипцию комплекс был связан с двумя CRP сайтами [100]. Делеция сайта CRP2 полностью устраняет CytR регуляцию, которая может быть восстановлена либо путем увеличения концентрации CytR в клетке, либо путем конструироваия гибридной регуляторной области с искусственно синтезированным CRP2 сайтом, расположенным на строго определенном расстоянии от CRP1. Методом футпринт анализа серии deoP2 производных с уменьшенным расстоянием между CRP сайтами, было показано, что изменение расстояния между CRP1 и CRP2 существенно не влияет на связывание комплекса с AM Р-CRP, но почти полностью устраняет связывание CytR с ДИК [151]. Точковые мутации в любом из двух CRP связывающих сайтов приводят к частичной потере CytR репрессии. Следовательно, для эффективной CytR регуляции необходимы оба CRP сайта, причем, важным фактором для CytR регуляции является расстояние между CRP сайтами [163,153,150].

При изучении регуляции deoP2 промотора deo-oперона и была предложена изложенная выше модель негативного контроля, основанная не на прямом взаимодействии CytR белка с операторным участком ДНК, а предполагающая белок-белковые взаимодействия CytR и CRP и последующее кооперативное связывание этого белкового комплекса с ДНК. В соответствии с этой моделью белки CytR и CRP образуют нуклеопротеиновый комплекс в виде "сэндвича", где CytR белок расположен между i двумя связанными с ДНК комплексами cAMP-CRP (Рис.9) [111,150].

Важность упомянутого выше инвертированного повтора 5'-TGCAA-3' для специфического связывания CytR подтверждают эксперименты с нуклеотидными заменами в этом участке. Было охарактеризовано 5 deoP2 производных с толковыми мутациями в CytR связывающем сайте (A-G в -65, Т-А в -68, A-G в -73, G-A в -75). В этих мутантах белок CytR проявлял пониженное сродство связывания с ДНК в системе in vitro, и наблюдалась четкая корреляция между уменьшением CytR-регуляции in vivo и ослаблением связывания CytR in vitro [121].

Однако, в другой работе при изучении того же deoP2 промотора были получены совершенно противоположные результаты. С целью выяснения роли CytR-ДНК взаимодействий в репрессориом механизме, вся интактная спейсерная область между CRP1 и CRP2 сайтами была замещена на синтетическую. Такая замена не устранила CytR-зависимой регуляции. В то же время, мутантные формы белка CytR, несмотря на делецию в ДНК-связывающем домене, обнаруживали способны репрессировать транскрипцию in vivo и взаимодействовать с deoP2 промотором in vitro [153]. Представленные данные свидетельствуют о том, что белок-белковые взаимодействия между CytR и CRP играют ключевую роль в точном определении сайта связывания CytR, тогда как CytR-ДНК взаимодействия, вероятно, служат для стабилизации нуклеопротеидного комплекса. Таким образом, имеющиеся данные не позволяют сделать окончательных выводов о важности взаимодействия белка CytR с ДНК в регуляции. I

3.3. Регуляция экспрессии гена tsx.

Ген tsx кодирует небольшой белок внешней мембраны (Tsx), который служит рецептором для колицина К и некоторых бактериофагов (таких как Т6), и кроме того играет важную роль в переносе рибо- и дезоксирибонуклеозидов через внешнюю мембрану. Экспрессия гена tsx подвержена двойному негативному контролю с участием белков DeoR и CytR, а также позитивному контролю комплексом cAMP-CRP [21]. Показано, что для гена tsx, в отличие от deo-оперона, белок DeoR является значительно более слабым репрессором по сравнению с белком CytR. Максимальный уровень дерепрессии наблюдается в клетках deoR cytR. В отличие от ¿/ео-оперона, где взаимодействие белков DeoR и CytR проявляет свойство кооперативное™, в регуляторной области гена tsx влияние этих белков носит скорее аддитивный характер.

Ген tsx экспрессируется с двух различно регулируемых промоторов tsxPl и tsxP2. Довольно слабый промотор tsxPl негативно регулируется DeoR репрессором, тогда как другой, более сильный промотор tsxP2 подвержен как негативному контролю репрессором CytR, так и активации посредством комплекса cAMP-CRP. В регуляторной области tsxP2 находятся два сайта связывания для cAMP-CRP, расположенных на расстоянии -73.5 пн и -40.5 пн относительно старта инициации транскрипции промотора tsxP2. Для CytR регуляции промотора deoP2 необходимо, чтобы расстояние между CRP сайтами составляло 53 пн, тогда как тандемные сайты для cAMP- CRP в tsxP2 расположены на расстоянии 33 пн. Важной отличительной чертой регуляторной области гена tsx является расположение операторного участка бежа-репрессора CytR, который перекрывается с сайтом CRP1 [20,42].

3.4. Регуляция экспрессии гена nupG.

Ген nupG кодирует мембранный белок, который активирует транспорт нуклеозидов через внутреннюю мембрану. Экспрессия гена nupG негативно регулируется белками DeoR и CytR и активируется комплексом cAMP-CRP. Регуляторная область nupG-P включает один сайт для белка CytR и 4 сайта связывания CRP. В присутствии cAMP-CRP связывание белка-репрессора с оператором увеличивается более чем в 3000 раз. Футпринт анализ показал, что в отсутствии CytR компплекс cAM P-CRP связывается с тремя мишенями расположенных в -95.5 (CRP2), -43.5 (CRP1) и +56.5 (CRPe) относительно старта инициации транскрипции. I

Примем CRP2 сайт обладает большим сродством к cAMP-CRP, и вероятно, играет основную роль в активации транскрипции, поскольку, делегирование последовательности выше -80 области уменьшает cAMP-CRP регуляцию более, чем в 10 раз. Сайты CRP1 и CRPe значительно слабее. Месторасположение CRP1 сайта -42.5 пн позволяет отнести nupG-P к классу 2 ^/-подобных промоторов. Важность сайта CRPe, расположенного в кодирующей области Tma nupG пока неизвестна.

Консенсусный инвертированный повтор для связывания белка репрессора в регуляторной области промотора nupG-P разделен не 2-3 пн, а 11 пн. Использование метода торможения в геле и футпринт анализ показали, что полный репрессионный комплекс включает белок CytR расположенный между двумя cAMP-CRP комплексами. cAMP-CRP связывается с CRP2 сайтом, а другой альтернативный CRP- связывающий сайт, CRP0 (в -40.5 положении), становится функциональным при перемещении на 2 пн комплекса cAMP-CRP в CRP1 сайте. Таким образом, при связывании CytR с оператором происходит изменение взаимодействия комплекса cAMP-CRP с CRP1 сайтом [110]. Похожий механизм регуляции наблюдается в регуляторной области гена edd.

3.5. Регуляции экспрессии гена edd.

Ген edd кодирует синтез фермента цитидиндезаминазы. Экспрессия гена edd, как и других CytR-регулируемых промоторов, активируется комплексом cAMP-CRP и негативно регулируется белком-репрессором CytR. Структура регуляторной области cddP промотора несколько отличается от промоторной области deoP2. Промспорная область cddP содержит три сайта связывания для cAMP-CRP: CRP1, CRP2 и CRP3 ( в -41.5., -91.5 и -93.5 соответственно относительно старта инициации транскрипции). Для активации транскрипции необходимо взаимодействие cAMP-CRP с CRP1 и CRP2 сайтами [65]. Репрессия гена edd происходит путем связывания белка репрессора с операторным сайтом и образования нуклеопротеинового комплекса, состоящего из белка CytR, расположенного между двумя cAMP-CRP комплексами, которые связаны с CRP1 и CRP3 сайтами. Таким образом, в репрессионном комплексе cAMP-CRP перемещается на 2 пн с сайта CRP2 на сайт CRP3 [65,80], также как и при образовании репрессионного комплекса в nupG-P. Следует отметить, что промотор cddP более строго регулируется белком репрессором по сравнению с промотором deoP2, так, в отсутствии белка-репрессора CytR активность cddP увеличивается в 100 раз, deoP2 только в 6 раз.

В отличие от промотора гена deoP2, у которого при делетировании CRP2 сайта CytR регуляция снимается полностью [151]., делегирование CRP2/CRP3 сайтов cddP приводит к снижению CytR регуляции от 100 до 7 раз [65].

Изучение взаимодействия РНК-полимеразы, cAMP-CRP и белка репрессора CytR в системе in vivo и in vitro, позволили предложить конкурентную модель связывания РНК-полимеразы и CytR с комплексом cAMP-CRP. Согласно данным in vitro, для образования репрессионного комплекса необходимо присутствие всех трех белков. Добавление индуктора CytR-белка — цитидина нарушает образование CytR/cAMP-CRP комплекса, но не влияет на комплекс PHK/cAMP-CRP [112,100]. Эта модель также предполагает, что! переход от CytR репрессии к cAMP-CRP активации происходит при участии переключающего механизма в котором cAMP-CRP переходит от белок-белкового взаимодействия с CytR к белок-белковому взаимодействию с РНК-полимеразой [80].

Кроме того, в регуляторной области cddP и deoP2 были идентифицированы UP элементы, которые согласно литературным данным (см. Литературный обзор) могут влиять на экспрессию генов [127]. Различные мутации или делеции, модифицирующие UP- последовательность промоторов deoP2 и cddP приводят к снижению его активности .

До сих пор остаётся неясным, как различные элементы промотора взаимодействуют с РНК-полимеразой, в частности, действуют ли они на разные этапы процесса инициации транскрипции, или их действие является куммулятивным.

3.6. Регуляции экспрессии гена udp.

Ген udp, контролирующий синтез фермента уридинфосфорилазы, расположен на 85,5 мин. хромосомной карты- E.coli. Мутации в структурной части гена udp фенотипически проявляются в неспособности бактерий использовать уридин в качестве источника углерода [99]. В результате систематических исследований, проводимых в лаборатории биохимической генетики на модели гена udp, была выяснена его структурно-функциональная организация и регуляция. Было показано, что регуляция экспрессии гена udp находится под контролем комплекса cAMP-CRP (элемента позитивной регуляции) и белка репрессора CytR (негативная регуляция) [5,4]. Эксперименты по изучению регуляции гена udp в системе in vivo позволили установить, что экспрессия гена udp подвержена строгой катаболитной репрессии, о чем свидетельствует практически полное подавление активности у р и д и н ф о с ф о р и лазы на фоне мутаций по аденилатциклазе (ген су а) или мутации по белку-рецептору CRP {сгр) [6]. Разработка простых и эффективных методов селекции по структурной и регуляториой областям гена udp сделала его черезвычайно удобной моделью для изучения взаимодействия белка CytR и комплекса cAMP-CRP. Некоторые свойства промоторных мутаций по гену udp послужили первым указанием на необычный характер взаимодействия белков CytR и CRP в регуляториой области этого гена [99].

Механизм CytR/CRP зависимой регуляции транскрипции во многом прояснился после идентификации специфических мутаций в локусе сгр, устраняющих негативное действие белка CytR на экспрессию промоторов генов катаболизма нуклеозидов [5]. Анализ природы этих мутаций позволил выдвинуть новую концепцию негативного контроля, согласно которой главную роль в регуляции экспрессии генов катаболизма нуклеозидов играет кооперативное взаимодействие между гетерологичными белками CytR и CRP в промоторных участках этих генов [150].

Согласно полученным in vitго данным [22], регуляторная область гена udp содержит два тандемно расположенных сайта связывания белка CRP: CRP1 и CRP2 с координатами -41.5 и -93.5, соответственно, относительно старта транскрипции. Функциональная значимость каждого из этих сайтов не одинакова. CRP2 сайт обладает большим сродством к комплексу cAMP-CRP (как и deoP2), чем сайт CRP1 [22]. В спейсерной области между сайтами CRP3 и CRP2 расположен несовершенный инвертированный повтор 5'-TGCAA-N(5)-TTGCA-3', который согласно полученным in vitro данным является основным сайтом связывания для белка CytR [22]. В отличие от deoP2 и cddP расстояние между инвертированными повторами в сайте связывания белка peripeccopa гена udp 5 пн. Данные футпринт анализа не выявили прямого связывания CytR с ДНК в отсутствии cAMP-CRP. Полный репрессионный комплекс образуется при связывании cAMP-CRP с CRP1 и CRP2 сайтами, причем сАМР-CRP взаимодействует с CRP1 только в комплексе с белком-репрессором CytR.

Для изучения регуляции гена udpP была получена серия промоторных мутантов, содержащих различные нуклеотидные замены, делеции и дупликации в регуляторной области гена udpP. Важность строго определенного размера спейсерного участка между CRP сайтами в активации гена udpP была продемонстрирована на основании анализа мутантов, содержащих делеции одного нуклеотида (мутанты udpPlS, udp305, udp320 и udp232) в спейсерной области.

Особый интерес представляли мутации, которые приводят к конститутивной, но CytR-зависимой экспрессии udpP. У этих мутантов обнаруживался более высокий уровень экспрессии гена udp в геноме бактерий cytR-, чем в . cytR+ (особенно при росте на среде с глюкозой, когда внутриклеточное содержание cAMP-CRP лимитировано). К таким мутантам относится udpPl, содержащий дупликацию 41 пн, включающую сайта CRP1. Механизм регуляции при котором CytR репрессор активирует экспрессию гена udp оставался неясным. В связи с этим, представляло интерес провести более детальное изучения феномена CytR-зависимой активации транскрипции гена udp. I

Несмотря на ; отмеченное сходство в общей конфигурации CytR-регулируемых промоторов, были получены данные, свидетельствующие о том, что регуляция экспрессии гена udp носит более сложный характер по сравнению с регуляцией промоторов deoP2 и cddP. Так в опытах по клонированию гена udp бьшо обнаружено, что у конструкций, содержащих промоторный .участок udp размером 125 пн относительно старта транскрипции (т.е. включающих "канонический" промотор с сайтами связывания для белков CRP и CytR), тем не менее наблюдается частичный выход экспрессии гена udp из-под контроля белка-репрессора CytR и комплекса cAMP-CRP [2]. На основании этих данных было сделано предположение, что участок хромосомы, расположенный перед -125 нуклеотидом промоторной области гена udp, может содержать дополнительные сайты связывания для белков, контролирующих его экспрессию.

Кроме того, как отмечалось выше, согласно данным in vitro пентамерный мотив TGCAA с координатами -68 и -64, относительно старта транскрипции, является левой частью основного сайта связывания белка CytR. Для выяснения функциональной значимости этого пентамера в регуляции гена udp представляло интерес провести сайт-направленный мутагенез этой последовательности.

Таким образом, многие аспекты регуляции гена udp оставались неясными и требовали более детального исследования.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе и их генетическая характеристика представлены в Таблице 1. ДНК бактериофага М13шр19 является коммерческим препаратом фирмы 'ТегтеМаз'ХЛитва). Плазмида р1ЕЬ250 получена от П.Валентина-Хансёна (Дания).

Вектор р!ЕЬ250 является укороченным вариантом плазмиды Ш [86], в которой гены, ответственные за когшйность плазмиды (сорл и сорВ) находятся под контролем промотора фага лямбда Ря, (регулируемого термолабильным репрессором с1857. При выращивании бактерий, несущих плазмиду р!ЕЬ250 на низкой температуре (30° С) копийность плазмиды составляет 1 -2 копии на .клетку, тогда как при 42° С достигает 1000 копий на клетку [86]. Кроме того, вектор р1ЕЪ250 содержит структурный ген la.cZ лишенный собственного промотора, но несущий 8В последовательность. Непосредственно перед БО последовательностью находится полилинкер, позволяющий осуществлять клонирование фрагментов ДНК по уникальным сайтам рестрикции для эндонуклеаз ЕсоШ, ^таI и ВатШ. Поэтому клонирование в эту полилинкерную область любых промоторных участков позволяет исследовать их регуляцию путем определения активности (3-галактозидазы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Домакова, Елена Владимировна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алхимова Р.А., Миронов А.С., Суходолен В.В., 1981. Регуляция активности гена уридинфосфорилазы E.coli. I. Картирование мутаций структурного гена и определение направления транскрипции. Генетика, т. 17, № 10, с. 1730-1736

2. Брикун И.А., Миронов А.С., Суходолец В.В., Хургес Е.М. 1989. Клонирование гена уридинфосфорилазы (uclp) E.coli и его экспрессия в составе рекомбинантных плазмид. Генетика. Т.25. №10. с.1717-1724.

3. Миллер Дж. 1979. Эксперименты в молекулярной генетике. Мир.

4. Миронов А.С. 1982. Регуляция активности гена уридинфосфорилазы у E.coli À'-72. Генетика, т. 18, с. 939-946.

5. Миронов А.С., Нечаева Г.Д., Суходолец В.В 1989. Взаимодействие элементов негативной (CylR) и позитивной (cAMP-CRP) регуляции в промоторной области уридинфосфорилазного (udp) гена E.coli К-12. Генетика, т.25. с.438-477.

6. Миронов А.С., Суходолец В.В., Алхимова Р.А. 1978. Влияние мутаций по аденилатциклазе (суа) и белку-репрессору циклического аденозинмонофосфата (сгр) на выражение генов катаболизма нуклеозидов у E.coli К-12. Генетика, т. 14. с. 103110.

7. Adhya, S. 1989. Multipartite genetic control elements: communication by DNA loop. Annu. Rev.Genet, 23: 227-250.

8. Adhya,S., and S.Garges. 1990. Positive control. J.Biol.Chem. 265: 10797-10800.

9. Altin-Mees, M. A., Short, J. M. 1989. pBluescript II: gene mapping vectors. Nucl. Acids Res. 17: 9494.

¡

10.Amouyal, M., Mortensen, L., Buc, H., and Hammer, K. 1989. Singl and double loop formation when deoR repressor binds to its natural operator sites. Cell. 58: 545-551.

11.Beckwith, J. R. 1970. Lac: the genetic system, p.5-26. In J. R. Beckwith, and D. Zipser (ed.), Lac Operon. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.

12.Bertin, P., P. Lejeune, C. Laurent- Winter, and A. Danchin. 1990. Mutations in bglY, the structural gene for the DNA-binding protein HI , affect expression of several E.coli genes. Biochimie. 72: 889-891.

13. Bert ra nd - B u rggra f. E., S. Hurst el. M. Daune, and M.Schnarr. 1987. Promoter properties and negative regulation of the uvrA gene by the LexA repressor and its amino-terminal DNA binding domain. J.Mol. Biol. 193: 293-302.

H.Birnboim, H. C, Doly, J. 1979. A rapide alkaline extraction procedure for screening recombinant plasm id DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523.

15.Blattner F.R., Plunkett III G., Bloch C.A., Perna N.T., Burland V., Riley M-, Collado-Vides J., Glasner J.D., Rode C.K., Mayhew G.,F., Gregor J., Davis N.W., Kirkpatrick H.A., Goeden M.A., Rose D.J., Mau B. and Shao Y. 1997. The complete genome seguence of Escherichia coli K-12. Science V.277(5331): 1453-1462.

16.Borowiec, J. A., L. Zhang, S. Sasse-Dwight, and J. D. Gralla. 1987. DNA supercoiling promotes formation of a bent repression loop in lac DNA J.Mol.Biol. 196: 101-111.

17.Botsford, J. L. 1981. Cyclic nucleotides in prokaryotes. Microbiol. Rev. 45: 620-642.

18.Botsford J., L., and Harman J., G.1992. Cyclic AMP in prokaryotes. Microbiological. Rev. 56:1. p. 100-122.

19.Brahms, J. G., O. Dargouge, S. Brahms, Y. Ohara, and V. Vagner. 1985. Activation and inhibition of transcription by supercoiling. J. Mol. Biol. 181:455-465.

20.Bremer, E., Gerlach, P., and Middendorf, A. 1988. Double negative and positive control of tsx expression in E.coli. J. Bacter. 108: 170175.

21.Bremer, E., Middendorf, A., Martinussen, J., and Valentin-Hansen, P. 1990. Analysis of the tsx gene, which encodes a nucleoside-spjecific channel-forming protein (Tsx) in the outer membrane of E.coli. Gene. 96: 59-65.

22.Brikun, I., Suziedelis, K., Stemmann, O., Zhong, R., Alikhanian, L., Lmkova, E., Mironov, A., and Berg, D. E. 1996. Analysis of CRP-cjytR interactions at the E.coli udp promoter. J.Bacteriol. 178: 16141622.

23.Bujard, H., M. Brunner, U. Deuschle, W. Kammerer, and R. Knaus. 1987. Structure function relationship of E.coli promoters, p.95-103. In W.S. Reznikoff, R. R. Burgess, J. E. Dahlberg, C. A. Gross, M. T. Record, Jr., and M. P. Wickens, (ed.), RNA polymerase and the regulation of transcription. Elsevier, New York.

24.Busby, S., Ebright, H. 1994. Promoter structure, promoter recognition, and transcription activation in prokaryotes. Cell. 79: p.743-746.

25.Carl, O. P., Robert, T. S. 1984. Protein-DNA recognition. Ann. Rev. Biochem. 53: 293-321.

26.Choy, H. E., and S. Adhya. 1992. Control of gal transcriptional through DNA looping: inhibition of the initial transcribing complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 11264-11268.

/ I

I

27.CoIiado-Vides, J., B. Magsanik, and J.D. Gralla. 1991. Control site location and transcriptional regulation in E.coli. Microbiol. Rev. 55: 371-394.

28.Dandanell, G., Valentin-Hansen, P., Love-Larsen, J. E., and Hammer, K. 1987. Long-range cooperativity between gene regulatory sequence in a prokaryote. Nature. 325: 823-826.

29.D'Ari, R., Jaffe, A., Bouloc, P., Robin, A. 1988. Cyclic AMP and

i cell division in Escherichia coli. J.Bacteriol. 170: 65-70.

30.Dassa, E., and Hofnung, M. 1985. Sequence of gene malG in E.coli: homologies between internal membrane components from binding protein-dependent transport systems. EMBO J. 4: 2287-2293.

31.Dean, D. A., Reizer, J., Nikaido, H., and Saier, M.H., Jr. 1990. Regulation of maltose transport system of E.coli by the glucose-specific enzyme III of the PTS: Characterization of inducer exclusion-resistant mutants and reconstitution of inducer exclusion in proteol iposomes. J. Biol. Chem. 265: 21005-21010.

32.de Crombrugghe, B., Busby, S., Buc, H. 1984. Cyclic AMP receptor protein: role in transcription activation. Science. 224: 831-838.

33.de Crombrugghe, B., Busby, S., Buc, H.1984. In Biological Regulation and development, ed. R. F. Goldberger, K. R. Yamamoto, 3B: 129-167. Plenum.

34.Drlica, K., and J. Rouviere-Yaniv. 1987. Histone-like proteins of bacteria. Microbiol. Rev. 51: 301-319.

35.Emmer, M., de Crombrugghe, B., Pastan, I., Perlman, R. 1970.Cyclic AMP receptor protein of E. coli: its role in the synthesis of inducible enzymes.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66: 480-487.

36.Feuch, B. U., and Saier, M. H., Jr. 1980. Fine control of adenylate cyclase by the phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase

system in E.coli and Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 141: 603610.

37.Finkel, S. E., and R. C. Johnson. 1992. The Fis protein: it's not just for DNA inversion anymore. Mol. Microbiol. 6: 3257-3265.

38.Fisher, S.H., and Sonenshein, A.L. 1991. Control of carbon and nitrogen metabolism in Bacillus subtilis. Annu.Rev.Microbiol. 45: 107-135.

39.Flashner, Y., and J. D. Gralla. 1988. DNA dynamic flexibility and

i

prbtein recognition: differential stimulation by bacterial histone-like HO. Cell. 54:713-721.

40.Forsman, K., B. Sonden, M. Goransson, and B. E. Uhlin. 1992. Ajntirepression function in E.coli for the cAMP-CRP receptor protein transcriptional activator. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9,880-9884.

41.Friedman, D.I. 1988. Integration host factor: a protein for all reasons. Cell. 55: 545-554.

42.Gerlach, P., Sogaard- Andersen, L., Pedersen, H., Martinussen, M., Valentin-Hansen, P., and Bremer, E. 1991. The cyclic AMP (cAMP)-CRP receptor protein complex functions both as an activator and as a corepressor at the tsx-p2 promoter of E.coli. J. Bacteriol. 173:5419-5430.

43.Giladi, H., M. Gottesman, and A. B. Oppenheim. 1990. Integration host factor stimulates the phage lambda pL promoter. J. Mol. Biol. 213: 109-121.

44.Giladi, H., S. Koby, M. E. Gotesman, and A. Oppenheim. 1992. Supercoiling, IHF, and a dual promoter system, participate in the control of bacteriophage lambda pL promoter. J. Mol. Biol. 224: 937-948.

45.Gilbert, W., J. Majors, and A. Maxam. 1976. How proteins recognize DNA sequencer, p. 167-178. In V.Allfrey, E.K. F. Bautz, B. J. McCarthy, R. T. Schmike, and A. Tissieres (ed.), Organization and expression of chromosomes. Abakon Veriagsegesellschaft. Berlin.

46.Gille, H„ J. B. Egan, A. Roth, and W. Messer. 1991. The FIS protein binds and dends the origin of chromosomal DNA replication, oriC, of E.coli. Nucleic Acids Res. 19: 4167-4172.

47.Gilson, E., Rousset, J. P., Char bit. A., Perrin, D., and Hofnung. M. 1986. malM, a new gene of the maltose regulon in E.coli. J. Mol. Biol. 191: 303-311.

48.Goodman, S., and H. A. Nash. 1989. Functional replacement of protein-induced bend in a DNA recombination site. Nature protein-induced bend in a DNA recombination site. Nature (London) 341: 251-254.

49.Goodrich, J. A., McClure, W. R. 1991. Competing promoters in prokaryotic transcription. Trends Biochem. Sci. 16: 394-397.

50.Goodrich, J. A., and W. R. McClure. 1992. Regulation of open complex formation at the E.coli galactose operon promoters. Simultaneous interaction of RNA polymerase. Gal repressor and CRP/cAMP. J. Mol.Biol. 224: 15-29.

51.Goshima, N., Y. Inagaki, H. Otaki, H. Tanaka, N. Hayashi, F. Imamoto, and Y. Kano. 1992. Chimeric HU-IHF proteins that alter DNA binding ability. Gene. 118: 97-102.

52.Gosink, K. K., W. Ross, S. Leirmo, R. Osuna, S. E. Finkel, R. C. Johnson, and R. Gourse. 1993. DNA binding and bending are necessary but not sufficient for Fis-dependent activation of rrnBPl. J. Bacteriol. 175: 1580-1589.

53.Green, J. R., and E. P. Geiduscheck. 1985. Site-specific binding by a bacteriophage SPOl-encoded type II DNA-binding protein. EMBO J. 4: 1345-1349.

54.Gross,C.A., M.Lonetto, and R.Losick. 1992. Bacterial sigma factors, p. 129-176. In S. L. McKnight and Yamamoto (ed.), Transcriptional Regulation. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold

Spring Harbor, N.Y.

i

55.Gutierrez, C., and Raibaud, O. 1984. Point mutations that reduce thi expression oi'malP a positively controlled operon of E.coli. J. Mol. Biol. 177:69-86.

56.Haber, R., and S. Adhya. 1988. Interaction of spatially separated protein-DNA complexes for control of gene expression: operator conversions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9683-9687.

57. H ammer-Jespersen, K.1983. In Munch-Petersen. A. (ed.). Metabolism of nucleotides, nucleosides and nucleobases in microorganisms. Acad. Press. London, p.203-258.

58.Hawley, D.K., A.D.Johnson, and W.R. McClure. 1985. Functional and physical characterization of transcription initiation complexes in the bacteriophage A,Or region. J.Biol.Chem. 260: 8618-8626.

59.Helmann,J.D., and M.J.Chamberlin. 1988. Structure and function of bacterial sigma factors. Annu. Rev. Biochem. V.57. p.839-872.

60.Herber, M., Kolb, A., Buc, H. 1986. Overlapping promoters and their control in Escherichia coli: the gal case. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2807-2811.

61.Higgins, C. F., C. J. Dorman, D. A. Stirling, L. Waddell, I. R. Booth, G. May, and E. Bremer. 1988. A physiological role for DNA supercoiling in the osmotic regulation of gene expression in S.typhimurium and. E.coli. Cell. 52: 569-584.

62. Higgins, C. F. 1992. Protein H-NS (HIa), chromatin structure and gene expression. Nucleic Acids Mol. Biol. 6: 67-81.

63.Hodges-Garcia, Y., P. J. Hagerman, and D. E. Pettijohn. 1989. DNA ring closure mediated by protein HU. J. Biol. Chem. 264: 14621-14623.

64.Hofnung, M., Hatfield, D., and Schwartz, M. 1974. malB regulon in E.coli: characterization of new mutations. J. Bacterid. 117: 40-47. 87

65.Hoist B., Sogaard-Andersen L., Pedersen II., and Valentin-Hansen P. 1992. The cAMP-CRP/ CytR nucleoprotein complex in E.coli: two pairs of closely linked binding sites for the cAMP-CRP activator complex are involved in combinatorial regulation of the cdd promoter. EMBO J. 11: 3635-3643.

66.Huang, L., P. Tsui, and M. Freundlich. 1990. Integration host factor is a negative effector of in vivo and in vitro expression of ompC in E.coli. J. Bacteriol. 172: 5293-5298.

67.Hughes, P., Landoulsi, A., Kohiyama, M. 1988. A novel role for cAMP in the control of the activity of the E. coli chromosome replication initiator protein, DnaA. Cell. 55: 343-350.

68.Hulton , C. S. J., A. Seirafi, J. C. D. Hinton, J. N. Sidebotham, L. Waddel, G. Pavitt, T. Owen-Hughes, A. Spassky, H. Buc, and C. F. Higgins. 1990. Histone-like protein HI (H-NS), DNA supercoiling and gene expression in bacteria. Cell. 63: 631-642.

69.1 rani, M., Musso, R., Adhya, S. 1989. Cyclic-AMP-dependent switch in initiation of transcription from the two promoters of the Escherichia coli gal operon: identification and assay of 5'-triphosphate ends of mRNA by GTP:RNA guanyltransferase. J. Bacteriol. 171: 1623-1630.

70.Irani, M., L.Orosz, and S. Adhya. 1983. A control element within a structural gene: the gal operon of E.coli. Cell. 32: 783-788.

71 .Ishihama,A. 1992. Role of RNA polymerase a-subunit in transcription activation. Mol.Microbiol. 6: 3283-3288.

72.Johnson, G. C., and E. P. Geiduschek. 1977. Specificity of the weak binding between the phage SPOl transcription-inhibitory protein, TF1 and SPOl DNA. Biochemistry 16: 1473-1485.

73.Johnson, R. C., M. F. Bruist, and M. I. Simon. 1986. Host protein reguiriments for in vitro site-specific DNA inversion. Cell. 46: 531 -539.

74.Kahmann, R., F. Rudt, C. Koch, and G. Mertens. 1985. G inversion in bacteriophage Mu DNA is stimulated by a site within the invertase gene and a host factor. Cell. 41: 771-780.

75.Ka!iipolitis, Valentin-Hansen, 1998. Transcription of rpoPI, encoding the Escherichia coli heat-shock regulator a32, is negatively controlled by the cAM P-CRP/CytR nucleoprotein complex. Mol. Microbiol. Aug. 29:4 p. 1091-1099.

76.KeiIerman, O., and Szmelcmen, S. 1974. Active transport of maltose in E.coli. Eur. J. Biochem. 47: 139-149.

77.Ko!b, A., Busby, S., Boc, H., Garge, S., and Adhya, S. 1993. Transcriptional regulation by cAMP and its receptor protein. Annu. Rev. Biochem. 62: 749-795.

78.Krause, H. M., and N. P. Higgins. 1986. Positive and negative regulation of a Mu operator by Mu repressor and E.coli integration host factor. J. Biol. Chem. 261: 3744-3752.

79.Kristinsen H.-H., Valentin-Hansen P. and Sogaard-Andersen L. 1996. CytR/cAMP-CRP nucleoprotein formation in E.coli: the CytR repressor binds it operator as a stable dimer in a ternary complex with cAMP-CRP. J. Mol. Biol. 260: 113-119.

80.Kristinsen H.-H., Valentin-Hansen P. and Sogaard-Andersen L. 1997. Design of CytR regulated, cAMP-CRP dependent Class II promoters in E.coli: RNA polymerase-promoter interactions modulate the efficiency of CytR repression. J.Mol.Biol. 266: 866876.

81.Kunkel, T. A. 1985. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 82: 488492.

82.Kumar, S. 1976. Properties of adenyl cyclase and cyclic adenosine 3',5'-monophosphate receptor protein-deficient mutants of Escherichia coli. J.Bacteriol. 125: 545-555.

83.Law, S. M., G. R. Bellomy, P. J. Schlax, and M. T. Jr. Record. 1993. In vivo thermodynamic analysis of repression with and without looping in lac constructs. Estimates of free and local lac repressor concentrations and of physical properties of a region of supercoiled plasmid in vivo. J.Mol. Biol. 230: 161-173.

84.Leirmo, S., and R. L. Course. 1991. Factor independent activation of E.coli rRNA transcription. I. Kinetic analysis of the roles of upstream activator region and supercoiling on transcription of the rrtiBPl promoter in vitro. J. Mol. Biol. 220: 555-568.

85.Levene, S. D., and D. M. Crothers. 1986. Topological distributions and torsional rigidity of DNA. A Monte Carlo study of DNA circles. J. Mol. Biol. 189: 73-83.

86.Love-Larsen, J. E., Gerdes, K., Light, J., Molin, S. 1984. Low-copy number plasmid-cloning vectors amplifiable by derepression of an inserted foreign promoter. Cene. 1984. 28: 45-54.

87.Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. 1951. Protein measurement withe Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.

I

I

I

88.Magasanik, B. 1970. Glucose effects: inducer exclusion and repression. In Bsckwith, J.R., and Ziper, D. (eds). The Lactose Operon. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory, p. 189-219.

89.Malan, T. P., McClure, W. R. 1984. Dual promoter control of the Escherichia coli lactose operon. Cell. 39: 173-184.

90.Mafan, T. P., A. Kolb, H. Buc, and W. R. McClure. 1984.

■ Mechanism of CRP-cAMP activation of lac operon transcription initiation activation of the PI promoter. J. Mol. Biol. 180: 881-909.

91 .Mandel. M., Higa, A. 1970. Calcium dependent bacteriophage DNA infection. J. Mol. Biol. 53: 154-162.

92.Martin, J.F., and Demain, A.L. 1980. Control of antibiotic biosynthesis. Microbiol. Rev. 44: 230-251.

93.McKay, D. B., Steitz, T. A. 1981. Structure of catabolite gene activator protein at 2.9 A resolution suggests binding to left-handed B-DNA. Nature. 290: 744-749.

94.McKay, D. B., Weber, I. T., Steitz, T. A. 1982. Structure of catabolite gene activator protein at 2.9-A resolution. Incorporation of amino acid sequence and interactions with cyclic AMP. J. BioLChem. 257: 9518-9524.

95.McKnight, S. L., Yamamoto, K.R. 1992. Transcriptional regulation. In 2 vol. New York etc.: Gold Spring Harbor Laboratory Press.

96.Meadow, N. D., Fox, D.K., and Roseman, S. 1990. The bacterial phosphoenolpyruvate: glucose phosphotransferase system. Annu. Rev. Biochem. 59: 497-542.

97.Menendez, M., Kolb, A., Buc, H. 1987.A new target for CRP action at the malT promoter. EMBO J. 6: 4227-4234.

98.Milton, H., and Saier, J.R. 1989. Protein phosphorylation and allosteric control of inducer exclusion and catabolite repression by the bacterial phosphoenolpyruvate: glucose phosphotransferase system. Microbiol. Rev. 53: 109-120,

99.Mironov, A. S., Sukhodolets, V. V. 1979. Promoter-like mutants with increased expression of the E.coli uridine phosphorylase structural gene. J. Bacterid. 137: 802.

100.Molegaard, N. E., P. B. Rasmussen, P. Valentin-Hansen, and Nielsen, P. E. 1993. Characterization of promoter recognition complexes formed by CRP and CytR for repression and by CRP and RNA polymerase for activation of transcription of the E.coli deoP2 promoter. J. Biol. Cliem. 268: 17471-17477.

101.Neidhardt, F. C., and (Eds.). 1996. Escherichia coli and Salmonella. ASM Press. Washington. DC 20005. p792-816.

102.Newlands, J. T., C. A. Josaitis, W. Ross, and R. Gourse. 1992. Both Fis-dependent and factor-independent upstream activation of the rrnB PI promoter are face of the helix dependent. Nucleic Acids Res. 20:719-726.

103.Nielsen, L. D., Monard, D., and Rickenberg, H.V. 1973. Cyclic 3'5'-adenosine monophosphate phosphodiesterase of E.coli. J. Bacteriol. 116: 857-866.

104.Nilsson, L., A. Vanet, E. Vijgenboom, and L. Bosch. 1990. The role of FIS in trans activation of stable RNA operons of E.coli. EMBO J. 9: 727-734.

105.Norregaard-Madsen, M., Myging, B., Pedersen, R., ValentinHansen, P., and Sogaard-Andersen, L. 1994. The gene encoding the periplasmic cyclophilin homologue, Pplase A, in E.coli, is expressed from four promoters, three of which are activated by the cAMP-

CRPcomplex and negatively regulated by the CytR repressor. Mol. Microbiol. 14:989-997. lG6.0chler, S., E. R. Eismann, H. Kramer, and B. Muller-Hill. 1990. The three operators of the /¿?coperon cooperate in repression. EMBO. J. 9: 973-979. 107.0suna, R., S. E. Finkel, and R.C. Johnson. 1991. Identification of two functional regions in FIS: the N-terminus is required to : promote His-mediated DNA inversion but not lambda excision.

EMBO J. 10: 1593-1603. 108.Owen-Hughes, T. A., G. D. Pavitt, D. S. Santos, J. M. Sidebotham, C. S. J. Hulton, J. C. D. Hinton, and C. F. Higgins. 1992. The chromatin associated protein H-NS interacts with curved DNA to influence DNA topology and gene expression. Cell. 71: 255-265.

109.Pastan, I., and Adhya, S. 1976. Cyclic adenosine 5'-

monophosphate in Escherichia coli. Bacteriol. Rev. 40: 527-551. 1 lO.Pedersen, H., Dall, J., Dandanell, G., and Valentin-Hansen, P. 1995. Gene-fegulatory modules in E. coli: nucleoprotein complexes formed by cAMP-CRP and CytR at the nupG promoter. Mol. Microbiol. 17: 843-853.

111.Pedersen H., Sogaard-Andersen L., Hoist B., Gerlach P., Bremer E., and Valentin-Hansen P. 1992. cAMP-CRP activator complex and the CytR repressor protein bind co-operatively to the cytRP promoter in E.coli and CytR antagonizes the cAMP-CRP-induced DNA bend. J. Mol. Biol. 227: 396-406.

112.Pedersen H., Sogaard-Andersen L., Hoist B., and Valentin-Hansen P. 1991. Heterologous cooperativity in E.coli. J. Biol. Chem. 266: 17804-17808.

/

113.Perini, L. T., Doherty, E. A.,Werner, E., and Senear, F. D. 1996. Multiple specific CytR binding sites at the E.coli deoP2 promoter mediate both cooperative and competitive interactions between CytR and cAMP receptor protein. J. Biol. Chem. 271: 33242-33255.

114.Perlman, R. L., Pastan, I. 1969. Pleiotropic deficiency of carbohydrate utilization in an adenyl cyclase deficient mutant of E.coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 37: 151- 157.

115.Pettijohn, D. E. 1988. Histone-like proteins and bacterial chromosome structure. J. Biol. Chem. 263: 12793-12796.

116.Postma, P. W., and Lengeler, J. W. 1985. Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phosphotransferase system of bacteria. Microbiol. Rev. 49: 232-269.

117.Ptashne, M. 1986. Gene regulation by proteins acting nearby and at a distans. Nature (London) 322: 697-701.

118.Pfahl, M., V. Guide, and S. Bourgeois. 1979. Second and third operator of the operon: an investigation of their role in regulatory mechanism. J. Mol. Biol. 127: 339-344.

119.Raibaud, O., Debarbouille, M., and Schwartz, M. 1983. Use of deletions created in vitro to map transcriptional regulatory signals in the malA regulon of E.coli. J. Mol. Biol. 163: 395-498.

120.Raibaud, O., Vidal-Ingigliardi, D., and Richet, E. 1989. A complex nucleoprotein structure involved in activation of transcription of two divergent E.coli promoters. J. Mol. Biol. 205: 471-485.

121.Rasmussen, P. B., Sogaard-Andersen, L., and Valentin-Hansen, P. 1993. Identification of the nucleotide sequence recognized by the cAMP-CRP dependent CytR repressor protein in the deoP2 promoter in E.coli. Nucleic. Acids Res. 21: 879-885.

122.Rasmusen, P. B., Hoist B., Valentin-Hansen P. 1996. Dual-function regulators: The cAMP receptor protein and the CytR

regulastor can act either to repress or to activate transcription depending on the cotext. Proc. Nastl. Acad. Sci. USA. 93:1015110155.

123.Reznikoff, W. S., R. B. Winter, and C. K. Hurley. 1974. The location of repressor binding sites of the lac operon. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71: 2314-2325.

124.Richard, H. E. 1993.Transcription activation at Class I CAP-

¡'i

dependent promoters. MicroReview. Molec. Microbiol. 8(5): 797702. !

125.Richet, E., Raibaud, O. 1989. MalT, the regulatory protein of the Escherichia coli maltose system, is an ATP-dependent transcriptional activator. EMBO J. 8: 981-987.

126.kichet, E., D. Vidal-Ingigliardi, and O. Raibaud. 1991. A new mechanism for coactivation of transcriptional activation: repositioning of an activator triggered by the binding of a second activator. Cell. 66: 1185-1195.

127.Ross, W., Gosink, K.K., Solomon, J., Igarashi, K., Zou, C., Ishihama, A., Severinov, K., and Gourse, R. L. 1993. A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the a subunit of RNA polymerase. Science. 262: 1407-1413.

128.Ross, W., J. T. Newlands, L. Rao, K. Gosink, A. Appleman, A. J. Bokal, M. Barlet, J. Salomon, C. A. Josaitis, I. Castano, and R. L. Gourse. 1992. Upstream activation of ribosomal RNA transcription in E.coli, p.23-25. In M. Salas and L. Rothman-Denes (ed.) Workshop on transcription initiation in prokaryotes. Instituto Juan March, Madrid.

129.Ross, W., J. F. Thompson, J. T. Newlands, and R.L. Gourse. 1990. E.coli FIS protein activates ribosomal RNA transcription in vitro and in vivo. EMBO J. 11: 3733-3742.

130.Rouiviere-Yaniv, J., and M. Yaniv. 1979. E.coli DNA binding protein HU forms nucleosome-like structure with circular double-stranded DNA. Cell. 17: 265-274.

131.Saier, M.H., Feucht, B.U., and McCaman, M.T. 1975. Regulation of intracellular adenosine cyclic 3':5'-monophosphate levels in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J.Biol. Chem. 250: 7593-7601.

132.Saier, M. H. Jr., 1991. A multiplicity of potential carbon catabolite repression mechanisms in prokaryotic and eukaryotic ' microorganisms. The new biologist. 3: 1137-1147.

133.Saier, M. H., Jr. 1993. Regulatory interactions involving the proteins of the phosphotransferase system in enteric bacteria. J.Cell. Biochem. 51: 62-68.

134.Saier, M. H., Chauvaux, S., Cook, G. M., Deutscher, J., Paulsen. I. T., Reizer, J., and Ye, J.-J. 1996. Catabolite repression and inducer control in Gram-positive bacteria. Microbiol. 142: 217-230.

135.Saier, M. H., Jr., and Reizer, J. 1994. The bacterial phosphotransferase system: new frontiers 30 years later. Mol. Microbiol. 13: 755-764.

136.Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: a laboratofy manual, 1st and 2nd ed. N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory.

137.Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 54635467.

138.Sasse-Dwight, S., and J. D. Gralla. 1988. Probing co-operative DNA-binding in vivo: the lac01:03 interaction. J. Mol. Biol. 202: 107-119

/

I

139.Sayre, M. H., and E. P. Geiduschek. 1988. TF1, the bacteriophage SPOl-encoded type II DNA-binding protein, is essential for viral multiplication. J. Virol. 62: 3455-3462.

140.Schlax, P. E., M.W.CappJr., and M.T.Record,Jr. 1995. Inhibition of transcription by lac repressor. J.Mol.Biol. 27: 331-350.

141 .Schleif, R. 1992. DNA looping. Annu. Rev. Biochem. 61: 199-223.

142.Schmidt, M. D. 1990. More then just "histone-like" proteins. Cell.

i 63:451-453.

143.Schwartz, M. 1987. In E.coli and S.typhimurium. Cellular and Molecular Biology, ed. F. C. Neidhardt, 2: 1482-1502. Washington, DC: Am. Soc. Microbiol, p. 1654.

144.Shimada, J., and H. Yamakawa. 1984. Ring-closure probabilities for twisted worm-like chaine. Application to DNA. Macromolecules. 17:689-698.

145.Shore, D., and R. L. Baldwin. 1983. Energetics of DNA twisting. I. Relation between twist and cyclization probability. J. Mol. Biol. 170: 957-981.

146.Shuman, H., and Silhavy, T., J. 1981. Identification of the malK gene product, a peripheral membrane component of the E.coli maltose transport system. J. Biol. Chem. 256: 560-562.

147.Siebenlist, U., R. B. Simpson, and W. Gilbert. 1980. E.coli RNA polymerase interacts homologously with two different promoters. Cell. 20:269-281.

148.Simpson, R. 1980. Interaction of the cAMP receptor protein with the lac promoter. Nucleic Acids Res. 8: 759-766.

149.Sogaard-Andersen, L., Martinussen, J., Mollegaard, N. E., Douthwaite, S. R., and Valentin-Hansen, P. 1990. The CytR repressor antagonizes cyclic AMP-cyclic AMP receptor protein

activation of the deoCP2 promoter of E.coli. J. Bacteriol. 172: 57065713.

150.Soogaard-Andersen, L., Mironov, A. S., Pedersen, H., Sukhodolets, V. V., and Valentin-Hansen, P. 1991. Single amino acid substitutions in the cAMP receptor protein specifically abolish regulation by the CytR repressor in E.coli. Proc. Nal. Acad. Sei.

USA 88: 4921-4925.

ij

151.Sogaard-Andersen, L., Mollegaard, N. E., Douthwaite, S. R., and Vilentin-Hansen,! P. 1990. Tandem DNA-buond cAMP-CRP complexes are required for transcriptional repression of the deoP2 promoter by the CytR repressor in E.coli. Mol. Microbiol. 4: 15951601.

152. Sogaard-Andersen L., Pedersen H., Holst B., Valentin-Hansen P. 1(991. A novel function of the cAMP-CRP complex in E.coli: cAMP-CRP functions as an adaptor for the CytR repressor in the cleo operon. Mol. Microbiol. 5: 969-975.

153.Sogaard-Andersen L., and Valentin-Hansen P. 1993. Proteinprotein interactions in gene regulation: the cAMP-CRP complex sets the specificity of a second DNA-binding protein, the CytR repressor. Cell 75: 557-566.

154.Spassky, A., S. Rimsky, H. Garreau, and H. Buc. 1984. Hla, an E.coli DNA-binding protein which accumulates in stationary phase, strongly compacts DNA in vitro. Nucleic Acids Res. 12: 5321-5340.

155.Tanaka, I., K. Applet, J. Dijkt, S. W. White, and K. S. Wilson. 1984. 3A resolution structure of a protein with histone-like properties in prokaryotes. Nature (London) 310: 376-381.

156.Thomsen et. al. 1999.Protein ligand interaction: Grafting of the uridine specific determinants from the CytR regulator of S. typhimurium to E.coli CytR. J.Mol.Biol. 288: 165-175.

157.Ueguchi, C., and T. Mizuno. 1993. The E.coli nucleoid protein HNS functions directly as a transcriptional repressor. EMBO J. 12: 1039-1046.

158.Ulman A., Danchin A. 1983. Role of cyclic AMP in bacteria -Adv. in Cyclic Nucl.Res. 15: 32.

159.Unden, G., Guest, J. R. 1984. Cyclic AMP and anaerobic gene expression in E.coli. FEBS Lett. 170: 321-325.

160.Ushida, C, and Aiba, H. 1990. Helical phase dependent action of CRP: effect of the distance between the CRP site and the -35 region on promoter activity.Nucl. Acids. Res. 18: 6325- 6330.

161. Valentin-Hansen, P. 1982. Tandem CRP sites in the deo operon of E.coli. EMBO 1.9: 1049-1054.

162. Valentin-Hansen, P., Holst, B., Sogaard-Andersen, L., Martinussen, J., N es vera, I., and Douthwaite, S. R. 1991. Design of cAMP-CRP activated promoters in E.coli. Mol.Microbiol. 5: 433437.

163.Valentin-Hansen, P., Love-Larsen, J. E., and Albrechtsen, B. 1986. DNA-protein recognition: demonstration of three genetically separated operator elements that are required for repression of the E.coli deoCABD promoters by the DeoR repressor. EMBO J. 5: 2015-2021.

164.Valentin-Hansen P., Sogaard-Andersen L., Pedersen H. 1996. A flexible partnership: the CytR anti-activator and the cAMP-CRP activator protein, comrades in transcription control. Mol. Microbiol. 20: 461-466.

165.Verbeek, H., L. Nilsson, G. Baliko, and L. Bosch. 1990. Potential binding sites of the trans-activator FIS are present upstream of all rRNA operons and of many but not all tRNA operons. Biochim. Biophys. Acta 1050: 302-306.

166.Vidal-Ingigliardi, D., and Raibaud, O. 1991. Three adjacent binding sites for cAMP receptor protein are involved in the activation of the divergent mcilEp-malKp promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 229-233.

167.Vidal-Ingigliardi, D., Richet, E., and Raibaud, O. 1991. Two MalT binding sites in direct repeat. J. Mol. Biol. 218: 323-334.

168.Weiclcert, M. J., and Adhya, S. 1992. A family of bacterial

regulators homologous to Gal and Lac repressors. J. Biol.Chem.

i

267: 15869-15874.

169.Weickert, M. J., and S. Adhya. 1993. The galactose regulon of E.coli. Mol. Microbiol. 10: 245-251.

170.Wilson, T. H., Yunker, P. L., and Hansen, C. L. 1990. Lactose transport mutants of E.coli resistant of inhibition by the phosphotransferase system. Biochem. Biophis. Acta. 1029: 113-116.

171.Yamada, PL, T. Yoshida, K. Tanaka, C, Sasakawa, and T. Mizuno. 1991. Molecular analysis of the E.coli hns gene encoding a DNA-binding protein, which preferentially recognizes curved DNA sequences. Mol. Gen. Genet. 230: 332-336.

172.Zacharias, M., H. U. Goringer, and R. Wagner. 1992. Analysis of the Fis-dependent and Fis-independent transcription activation mechanism of the E.coli ribosomal RNA PI promoter. Biochemistry. 31: 2621-2628.

173.Hawley, D. K., McClure, W. R. 1983. Compilation and analysis of E.coli promoter DNA sequences. Nucleic Acids Res. 15: 2237-2255.

174.Perez-Martin, J., RoJo, F., and de Lorenzo, V. 1994.promoters responsive to DNA bending: A common theme in procaryotic gene expression. Microbiol. Rev. 58:2 68-290

175.Moyle, H., Waldburger, C., Susskind, M. M. 1991. Hierarchies of base pair preferences in the P22 ant promoter. J. Bacteriol. 173: 1944-1950.

176.Gonzales-Gil, G., Bringmann, P., Kallmann, R. 1996. FIS is a regulatior of metabolism in E.coli. Mol. Microbiol. 22: 21-29.