Регуляция экспрессии генов биосинтеза биотина в Methylobacillus flagellatum тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Васин, Виталий Михайлович

• Васин, Виталий Михайлович
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Васин, Виталий Михайлович

Оглавление

Введение

Обзор литературы

1 Классификация метилотрофных бактерий. Генетика

метилотрофов.

2. Гены биосинтеза биотина у М

3. Роль биотина в метаболизме

4. Биосинтез биотина у различных микроорганизмов

5. Продукция биотина

6. Количественное определение биотина

Материалы и методы

1. Штаммы бактерий, фаги и плазмиды, использованные в работе

2. Методы работы с бактериями и фагами

3. Манипуляции с ДНК и РНК

4. Анализ внутриклеточных белков. 28 Результаты и обсуждение

1. Уточнение нуклеотидной последовательности генов Ыо¥, ЫоН,

ЫоС, ЫоХУ и ЫоА, определение нуклеотидной последовательности областей, прилегающих к Ыо-кластеру и её анализ.

1.1 Определение нуклеотидной последовательности

1.2 Анализ нуклеотидной последовательности

2 Локализация старта ¿/оВ-гена

3 Анализ суммарной РНК

4. Локализация промотора и сайта оператора, используя

плазмиды с рекомбинантными bioB-lacZ- генами.

5. Определение точки начала транскрипции Ыо-оперона

6. Изучение условий репрессии А?"о-оперона в штаммах с

интегрированными в хромосому bioB-lacZ- конструкциями.

7. Экспрессия генов биосинтеза биотина у М. flagellatum MFK1

Заключение.

8. Продукция биотина при экспрессии ¿/о-генов в составе

искусственных векторов в Е. coli и М. flagellatum.

8.1 Экспрессия bioB-гена М. flagellatum в Е. coli

8.2 Конструирование вектора для координированной

экспрессии всех Ыо-генов М flagellatum в Е. coli.

8.3 Конструирование векторов для экспрессии bio-генов в М

flagellatum.

8.4 Продукция биотина при экспрессии ¿/о-генов в составе

искусственных векторов в М. flagellatum. Выводы

Список литературы

Список сокращений

ВКПМ - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов

а.к. - аминокислоты

п.н. - пара нуклеотидов

т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

DEPC - диэтилпирокарбонат

KDa - килодальтон

IPTG - изопропил-Р-О-тиогалакгозид

ORF - открытая рамка считывания

PAAG - полиакриламидный гель

PCR - полимеразная реакция амплификации

SD - последовательность Шайна-Дельгарно

SDS - додецилсульфат натрия

X-Gal - 5-бром-4-хлор-3-индолил-Р-0-галактозид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регуляция экспрессии генов биосинтеза биотина в Methylobacillus flagellatum»

Введение

В работе рассмотрена организация и особенности экспрессии генов биосинтеза биотина в метилотрофной бактерии Methylobacillus flagellatum.

Метилотрофы представляют собой таксономически неоднородную группу микроорганизмов, способных использовать восстановленные формы одноуглеродных соединений в качестве источника углерода и энергии.

Бактерии, утилизирующие С1-соединения, обладают рядом преимуществ по сравнению с гетеротрофами. Главным образом это - способность расти на простых средах, используя относительно дешевые и доступные субстраты (например, метанол), удовлетворительные ростовые характеристики и качество биомассы (для кормовых целей). Интерес могут представлять следующие процессы с использованием метилотрофов: крупнотоннажная наработка биомассы; получение метаболитов (органических кислот, витаминов, аминокислот, пигментов, полисахаридов и т.д.); использование некоторых уникальных ферментов метилотрофов в биотрансформации и очистке сточных вод; применение метилотрофов в качестве хозяев для экспрессии гетерологичных генов [111].

Выбор объекта данного исследования обусловлен следующими факторами. По сравнению с другими метилобактериями, Methylobacillus flagellatum имеет некоторые преимущества: повышенный температурный оптимум роста, использование энергетически наиболее выгодного пути ассимиляции С1-соединений, биохимическая изученность, отсутствие фагов, разработанные генетические методы работы вплоть до успешной экспрессии гетерологичных генов и получения г ее А- мутантов.

Реализация описанных процессов требует всестороннего, в том числе генетического изучения метилотрофов.

Молекулярно-генетическая информация об облигатных метилотрофах в настоящее время весьма ограничена, в связи с этим представляет интерес сравнение функционирования некоторых клеточных процессов у метилобактерий и других микроорганизмов. В качестве модельной системы изучали регуляцию экспрессии генов биосинтеза биотина.

Наиболее полно данная группа генов изучена в Е. coli, показано, что в биосинтез биотина вовлечены 6 генов, 5 из них (bioA, bioB, bioF, bioC и bioD) организованы в оперон и их транскрипция регулируется биотином.

Большой интерес представляет и сам биотин. Производят его, как известно, химическим синтезом. Этот синтез сложен и сопровождается образованием стереоизомерных продуктов. Получение биотина микробиологическим способом явно предпочтительнее. Однако на сегодня из-за недостаточно высокого уровня синтетической активности, микроорганизмы не используются для получения биотина. При этом работы направленные на создание штаммов продуцентов биотина продолжаются.

Таким образом, изучение ¿ш-генов и их регуляции в М. flagellatum важно для создания возможных штаммов-продуцентов биотина на основе клонированных генов данной метилотрофной бактерии.

Данная работа, в части, связанной с изучением организации 6/о-оперона, является развитием работы проводимой в лаборатории генетики метилотрофов, в ходе которой были клонированы гены биосинтеза биотина М. flagellatum, определена нуклеотидная последовательность 6/оВ-гена, а также частично нуклеотидная последовательность остальных i/ü-генов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение организации, а также регуляции экспрессии биотинового оперона М. flagellatum. Для осуществления поставленной цели решали следующие задачи.

Определение полной нуклеотидной последовательности всех Ыо-генов М. flagellatum и прилегающих к ним областей. Анализ последовательности.

Локализация сигналов транскрипции и трансляции Ьго-оперона.

Установление факта регуляции транскрипции бш-оперона.

Локализация сайта связывания с возможным репрессором.

Определение условий репрессии биотинового оперона.

Конструирование векторов для эффективной экспрессии bio-генов в М. flagellatum и Е. coli.

Научная новизна и практическая значимость

Показана организация генов биосинтеза биотина у метилотрофной бактерии М. flagellatum, определена нуклеотидная последовательность ¿/о-генов, изучены основы механизма регуляции транскрипции этих генов. Изученный механизм регуляции транскрипции Ыо-оперона во многом отличается по сравнению с Е. coli. Созданы вектора для эффективной экспрессии генов биосинтеза биотина в широком спектре Грамм-отрицательных бактерий.

Структура и объём работы

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, выводы и список литературы (162 наименований) и содержит 21 рисунок и 12 таблиц. Объём работы - 85 страниц.

Апробация работы

Результаты исследования были цредставлены на: 6-ом европейском конгрессе по биотехнологии (Флоренция, Италия, 1993) и 7-ом Международном симпозиуме "Микробный рост на С-1 соединениях" (Варвик, Англия, 1993), а также на семинаре Секции генетики микроорганизмов Ученого Совета при ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (1998).

Обзор литературы.

1. Классификация метилотрофных бактерий. Генетика метилотрофов.

К метилотрофам относятся организмы, способные использовать в качестве источников углерода и энергии соединения, содержащие один или более атомов углерода, не связанных углерод-углеродной связью, ассимилирующие углерод путём фиксации формальдегида [113]. К этой группе относят также автотрофные организмы, способные использовать в качестве источника углерода и энергии С-1 соединения и ассимилирующие СО2 [113]. Метилотрофные бактерии представляют обширную и гетерогенную по составу группу микроорганизмов. Их можно классифицировать по нескольким принципам: 1) спектру субстратов, пригодных для роста; 2) способности расти на метане; 3) пути ассимиляции С-1 соединений.

По питательным потребностям метилотрофные бактерии делятся на обли-гатные метилотрофы, способные расти только на одноуглеродных субстратах и факультативные метилотрофы, способные утилизировать как С-1, так и полиуглеродные субстраты. В свою очередь, облигатные метилотрофные бактерии подразделяются в соответствии со способностью утилизировать метан [113].

Существует две специфические последовательности реакций позволяющие ассимилировать С-1 соединения - это сериновый цикл и рибулозомонофосфатный цикл. Третья последовательность реакций не является специфичной для метилотрофов, и представляет собой рибулозобисфосфатный цикл.

В соответствии с приведённой классификацией М. Аа^е11а1ит относится к облигатным метилотрофам, которые неспособны утилизировать метан. М. flagellatum потребляет только метиламин и метанол в качестве источника углерода и энергии. При этом он использует для ассимиляции С-1 соединений

рибулозомонофосфатный цикл в его КДФГА/ТА варианте (с участием 2-кето-З- --. дезокси-6-фосфоглюконат-альдолазы и трансальдолазы) [110].

Основное внимание в генетике метилотрофов было уделено генам ответственным за метаболизм С-1 соединений. В первую очередь это гены окисления метанола, а также гены ферментов участвующих в ассимиляции одноуглеродных субстратов.

Сообщалось, что клонированы и секвенированы гены окисления метанола из факультативного метилотрофа Methylobacterium extroques AMI, четыре из них организованы в оперон moxFJGI, первый ген тохF кодирует 66 KDa субъединицу метанолдегидрогеназы [112]. Аналогичные гены клонированы и из облигатной метилотрофной бактерии Hyphomicrobium methylovorum GM2, здесь обнаружен кластер генов mxaFJGIRSA, первый также соответствует альфа-субъединице метанолдегидрогеназы [134]. Из того же микроорганизма клонированы гены, кодирующие ферменты серинового цикла ассимиляции формальдегида, такие как серинглиоксилатаминотрансфераза [123], серингидросиметилтрансфераза [127] и гидроксипируватредуктаза [139]. Ген малил-КоА-лиазы, относящийся к тому же циклу реакций, клонирован из факультативного метилотрофа Methylobacterium extroques AMI [108].

Сообщалось о клонировании гена iso-1, относящегося к электрон-транспортной цепи окисления метанола / метиламина из штамма облигатного метилотрофа Methylomonas sp. J, показано, что экспрессия гена регулируется комплексной системой регуляции контролирующей окисление метанола или метиламина [133].

Несколько работ опубликовано по генам биосинтеза аминокислот в метилотрофах. А именно, генам гомосериндегидрогеназы (horn) и треонинсинтазы

(thr) из Грамм-отрицательного облигатного метилотрофа Methylobacillus glycogenes [128,129].

Большая работа по изучению М. flagellatum была проведена в лаборатории генетики метилотрофных бактерий института ГНИИ генетика. Получена обширная коллекция мутантов по генам С-1 метаболизма, биосинтеза аминокислот и витаминов, г ее А' мутантов. Построена генетическая карта микроорганизма [131]. Клонированы и охарактеризованы гены утилизации метиламина (таи) [120], биосинтеза треанина (horn и thr) [126] и PQQ (pqqDGC) [121], гесА-ген [122]. Ни в одном из описанных случаев регуляции генной экспрессии не было обнаружено. Кроме того, были клонированы гены биосинтеза биотина М. flagellatum [2].

2. Гены биосинтеза биотина у М. flagellatum

В лаборатории генетики метилотрофных бактерий института ГНИИ Генетика была получена представительная коллекция мутантов по генам биосинтеза биотина, мутанты охарактеризованы, идентифицированы и картированы на хромосомной карте [2]. Все данные мутанты обладают одной интересной особенностью, они растут в присутствии биотина, концентрация которого в тысячу раз превышает аналогичную концентрацию для bio' мутантов Е. coli.

Клонированы 6 генов биосинтеза биотина М. flagellatum, из них гены bio А, ЫоВ, bioY\ bioR и bioD кодируют белки, способные функционально замещать соответствующие активности в мутантах Е. coli Bio'. Ген ЫоС М. flagellatum не комплементирует соответствующую мутацию в Е. coli, однако гомология аминокислотных последовательностей генов двух бактерий достигает 50 % [2]. Кроме того, полностью определена нуклеотидная последовательность гена bioB и частично - генов bioD, bioV, bioll bio А и bioC. Структурная организация белка BioB

аналогична организации соответствующих белков других бактерий, а его аминокислотная последовательность проявляет значительную гомологию (64% для Е. соИ) с этими белками [2].

Установлено, что гены ¿/оВРНСО организованы в оперон, для них показан полярный эффект, транскрипция ещё одного гена Ъ юА [2] осуществляется независимо.

Полностью нуклеотидная последовательность Ыо-генов определена в данной работе, проведён её анализ, выявлены особенности экспрессии генов.

3. Роль биотина в метаболизме.

В настоящее время хорошо известно, что биотин как компонент ферментов, участвующих в реакциях карбоксилирования, необходим для нормальной жизнедеятельности всех живых существ, независимо от сложности их организации.

Роль биотина как катализатора реакций карбоксилирования определяет его участие в синтезе широкого круга соединений, в частности в биогенезе С4-соедине-ний, в том числе аспарагина, глюконеогенезе, синтезе высших жирных кислот из ацетата, синтезе разных классов липидов, синтезе пуринов и нуклеиновых кислот.

Таким образом, различные стороны метаболизма клетки оказываются прямо или косвенно зависящими от биотина. Одна из важных функций, на которую опосредованно влияет биотин, и которая, в свою очередь, определяет течение многих процессов обмена - это проницаемость клеточной стенки и мембран. Это влияние связывают [1] с его участием в синтезе липидов. Влияя на проницаемость и зависящие от нее процессы экскреции и поглощения многих соединений, биотин оказывается фактором, регулирующим целый ряд биосинтетических процессов.

Примером этому может служить процесс синтеза аминокислот, в частности глутаминовой кислоты.

4. Биосинтез биотина у различных микроорганизмов.

Биотин синтезируется широким спектром микроорганизмов и растений, в тоже время некоторые организмы неспособны его синтезировать, и нуждаются в нём. Большинство работ по изучению биосинтеза биотина было выполнено, используя микроорганизмы. Впервые и наиболее детально процесс биосинтеза биотина был изучен в Е. соИ (Рисунок 1). Была определена следующая последовательность реакций: пимелил-КоА 7-кето-8-аминопеларгоновая

кислота (КАПК) —> 7,8-диамино-пеларгоновая кислота (ДАПК)—> дети-биотин -» биотин [30,]. Три фермента вовлечены в процесс биосинтеза, это -КАПК синтаза (Ыо¥) [56,96,81], ДАПК аминотрансфераза (ЫоА) [96] и детибиотин-синтаза (ЫоВ) [40, 5, 4]. Три соответствующие реакции

продемонстрированы с участием

В. sphaericus Е. coli

Пимелиновая Неизвестный

к-та предшественник

КоА bioC, bioH

Г Jf^

О II

II С- SCoA пимелил-КоА

СН2(СН2)4СООН

Алании— bioF

ПЛФ

h2n о 1 II 7-кето-8-

НС—с 1 1 аминопелар-гоновая

Н3С СН2(СН2)4СООН кислота

SAM - ЫоА

ПЛФ

h2n nh2 1 1

1 1 HC—С 1 1 Диамино-пеларгоновая

Н3С СН2(СН2)4СООН кислота

НСОз" - ßioD

АТФ,Mg"

О

/ \

HN NH | I

1 1 НС—с Детибиотин

1 1 Н3С СН2(СН2)4СООН

донор- BioB

серы

О

/ \

^ РШ 1 1

1 1 НС-С Биотин

1 1 Н2С СН(СН2)4СООН

\ /

S

Рисунок 1. Биосинтез биотина.

очищенных ферментов. Так 7-кето-8-аминопеларгоновая кислота синтезируется из пимелил-КоА с участием L-аланина и пиридоксальфосфата (ПЛФ). В следующей реакции аминогруппа с Б-аденозил-Ь-метионина (SAM) переносится на КАПК с образованием 7,8-диамино-пеларгоновой кислоты, ПЛФ также участвует в этой реакции. В свою очередь детибиотин синтезируется в присутствии бикарбоната и йонов Mg++ из ДАПК, реакция сопровождается гидролизом АТФ.

Ещё два гена вовлечены в биосинтез пимелил-КоА у Е. coli это - bioH и bioC [30], их функция остаётся до сих пор не выясненной. В тоже время, для В. sphaericus было показано [82], что пимелил-КоА образуется непосредственно из пимелиновой кислоты и КоА, реакция полностью охарактеризована. Таким же образом эта реакция протекает и у высших растений, что было показано на примере Lavandula vera L [7].

Детальный механизм последней реакции с участием биотинсинтазы, продукта гена ЫоВ, неизвестен. Эта реакция не была продемонстрирована в системе с участием очищенных ферментов.

Проводились работы по изучению данной реакции, используя бесклеточные экстракты Е. coli с клонированным геном биотинсинтазы. Сообщалось [47], что необходимыми факторами кроме детибиотина являются: фруктоза-1,6-бисфосфат, Fe++, Б-аденозил-Ьметионин, NADPH и КС1. Кроме того, показано [48], что кроме биотинсинтазы в реакции участвует флаводоксин и как минимум, ещё один белковый фактор

В другой работе отмечалось, что скорость реакции зависит от концентрации детибиотина, цистеина, 8-аденозил-1-метионина и аспарагина. Используя HPLC анализ реакционной смеси был обнаружен промежуточный продукт несущий 14С атом от меченого 14С-детибиотина и 33S - от 358-цистина. При его образовании

использовалась одна молекула S-аденозил-Ь-метионина, вторая молекула SAM была необходима при образовании биотина из данного интермедиата. Таким образом, две молекулы SAM необходимы для образования одной молекулы биотина [3]. В работе Guianvarc'h D. [42] также доказано, что для гомолитического разрыва двух С-Н связей детибиотина должны быть использованы два эквивалента S-аденозил-!-метионина.

Регуляция биосинтеза биотина

Как известно, биосинтез биотина регулируется на уровне экспрессии генов. Показано, что экспрессия бю-генов у Е. coli полностью репрессирована при добавлении 5 нг/мл биотина в среду [24]. В то же время синтез КАПК синтазы у В. sphaericus и ДАПК синтазы у Brevibacterium divaricatum репрессирован на уровне 100 нг/мл биотина [55]. Кроме того, показано, что реакции биосинтеза биотина в клетках В. sphaericus полностью репрессируются 1 мкг/мл биотина [55]. Интересно, что у В. megaterium в то время как детибиотинсинтаза репрессирована при добавлении 0.25 мкг/мл биотина, пимелил-КоА-синтаза остаётся дерепресси-рованной даже при 1 мкг/мл биотина в среде [56].

Механизм регуляции экспрессии bio-тенов наиболее подробно изучен в случае Е. coli. Здесь пять генов организованы в оперон, причём ген bio К ориентирован дивергентно относительно других генов 6/oBFCD [30]. Сайт оператора расположен между генами bioA и bioB и контролирует транскрипцию с двух соответствующих промоторов РА и Рв- Сайт представляет собой 40-нуклеотидную полиндромную последовательность, в которой симметричны друг другу по 18 нуклеотидов с каждой стороны от центра симметрии [11]. Описаны мутанты с заменой нуклеотидов в данном сайте, которые обладают конститутивной

транскрипции Ыо-генов [11]. Транскрипция последнего гена bioR осуществляется независимо.

Репрессором является продукт гена ЫгА, мультифункциональный аллостерический фермент. Он катализирует синтез биотинил-5-АМФ из биотина и АТФ, с последующим переносом биотина от аденилата на лизиновый остаток ВССР (biotin carboxyl carrier protein), субъединицу ацетил-КоА-карбоксилазы. Между тем биотинил-5-АМФ является положительным аллостерическим эффектором связывания репрессора с ДНК [19, 3]. В работах по изучению термодинамики и кинетики реакций, в которые вовлечены элементы регуляторного механизма, было обнаружено, что как апо- так и голорепрессор существует в виде мономера [3]. С другой стороны из стехиометрии процесса связывания видно, что две молекулы голорепрессора связываются с оператором. Причём два мономера кооперативно связываются с двумя симметричными полу- сайтами оператора соответственно.

Из множества работ, посвященных различным аспектам регуляции генов биосинтеза биотина у Е. coli выделяется одна [64]. В ней предлагается дополнительная система регуляции транскрипции генов 6/oBFCD на уровне биотин зависимой ранней терминации транскрипции в начале гена bioB [64]. В опытах с мини-клетками, в присутствии биотина (50 мМ) был обнаружен РНК-транскрипт длинной 96 нуклеотидов, который гибридизовался с зондами к началу ЫоВ-гена. Был предложен вероятный сайт ответственный за терминацию, он также содержит инвертированный повтор, однако, не такой выраженный как в случае оператора транскрипции [11, 94]. В последующих работах эта тема не получила развития.

Сходная организация генов биосинтеза биотина наблюдается и у других бактерий Enterobacieriaceae, таких как Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens и Erwinia herbicola [94]. У С. freundii и S. typhimurium в сайте

оператора всего две замены относительно оператора Е. coli, при этом репрессор Е. coli узнаёт соответствующие сайты, практически, с той же эффективностью [94].

Гены биосинтеза биотина Bacillus sphaericus организованы в два кластера WoDAYB и ЫоХWF. Каждому из них предшествует одинаковая последовательность, локализованная внутри участка с инвертированным повтором. Транскрипция этих генов координировано регулируется биотином [66, 41]. Показано, что гены bio А, bioB, bioD и bioF комплементируют соответствующие мутации в Е. coli, а комбинация генов bioW и bioF достаточна для комплементации bioC' и bioK мутантов Е. coli. Функция генов bioX и bioY осталась неизвестной [41].

1 т.п.н. I_I

н В

Nc

Bg

J L

фв

bioA Ь/оВ bioF bio С bio D

В SpBlME

Заключение диссертации по теме «Генетика», Васин, Виталий Михайлович

Выводы

1. Уточнена нуклеотидная последовательность кластера ¿го-генов, и bio А -гена М. ßagellatum, определена нуклеотидная последовательность прилегающих к кластеру областей. Таким образом, получена полная нуклеотидная последовательность фрагментов хромосомы: фрагмента (6.2 т.п.н.) с генами ¿/oBFHCD и фрагмента (1.7 т.п.н.) с геном bio А. Проведён анализ полученной последовательности.

2. Показано, что транскрипция ¿/о-оперона может осуществляться с двух промоторов. Промоторы локализованы. Эффективность транскрипции с промотора Рыо2 как минимум в 20 раз выше по сравнению с промотором Рьы

3. Установлено, что транскрипция с промотора Ры02 регулируется биотином.

4. Локализован сайт связывания с репрессором.

5. Определены условия репрессии ¿го-оперона. В присутствии 2 мг/л биотина эффективность транскрипции ö/о-генов снижается в 10 раз.

6. Сконструированы плазмиды для эффективной экспрессии генов биосинтеза биотина в М. flagellatum ив Е. coli.

Заключение.

Пять генов биосинтеза биотина bioB, bio¥, bioH, bioC и bioD организованы в оперон. Транскрипция ещё одного гена bio А происходит независимо.

В данной работе показано, что основным промотором является последовательность с координатами 423-452 (Рисунок 4), при этом транскрипция начинается с цитозина или тимина в позиции 457 и 458. Транскрипция регулируется биотином - при изменении концентрации биотина в культуральной среде с 0 до 2 мкг/мл, эффективность транскрипции падает в 10 раз. Оператор локализован на участке последовательности в пределах 660 пар оснований, и отнесён от начала гена bioB, как минимум на 220 нуклеотидов. В отличие от аналогичных последовательностей у Е. coli и Bacillus subtilis, этот участок не содержит каких-либо инвертированных повторов. Учитывая, что в Е. coli репрессор (продукт гена birA) связывается с ДНК непосредственно в области инвертированного повтора, схема регуляции транскрипции bio-оперона в М. flagellatum может существенно отличаться от известной в Е. coli.

Показано, что помимо основного существует ещё один промотор, он локализован между сайтами Pstl и Sph\ на участке ДНК в 200 нуклеотидов. Исходя из анализа данной последовательности, таким промотором, может быть последовательность на расстоянии 50 п.н. от начала 6/оВ-гена. Эффективность этого промотора в 20 раз ниже по сравнению с основным промотором, кроме того, транскрипция с этого промотора не регулируется биотином. Роль инвертированного повтора в начале гена bioB полностью не изучена, однако остаётся вероятным его участие в процессе возможной ранней терминации транскрипции. На рисунке 14 показана вторичная структура первых 900 пар нуклеотидов мРНК bio-оперона. На данном участке последовательности образуется характерная "шпилька".

А \ С .G С

С ^с-II' А

U' , G *

GCC

А — г. Ж с О- U

Рисунок 14. Вторичная структура первых 900 пар нуклеотидов мРНК bio-оперона. Стрелкой показан старт транскрипции. Увеличена вторичная структура участка с инвертированным повтором в начале гена bioB. Структура рассчитана с помощью программы RNAdraw V1.1Ь2 [158], http://mango.mef.ki.se/Ëole/madraw/rnadraw.html. и С

С G

А С G

8. Продукция биотина при экспрессии éio-генов в составе искусственных векторов в Е. coli и М. ßagellatum.

8.1 Экспрессия bioB-геня M.flagellatum в Е. coli.

Учитывая полученные данные об организации генов биосинтеза биотина в М. flagellatum, определяли зависимость продукции биотина в клетке от уровня экспрессии ¿го-генов. В качестве модельной системы была выбрана регулируемая экспрессия bio-генов М. flagellatum в Е. coli. Для начала, был выбран ген bioB, этот ген является первым в кластере è/о-генов М. flagellatum, . а его продукт биотинсинтаза - последним ферментом в цепи биосинтеза биотина. Отмечалось, также, что именно эта стадия является лимитирующей в биосинтезе биотина. Была поставлена задача, оценить влияние эффективности транскрипции è/oB-гена на продукцию биотина.

Согласно данным в таблице 9 была сконструирована плазмида на основе вектора pUCBM21 - pLBIOB, ген bioB на этой плазмиде находится под контролем lac промотора. Таким образом, экспрессия гена bioB на плазмиде pLBIOB может регулироваться добавлением в культуральную среду IPTG (изопропил-ß-D-тиогалактопиранозид).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Васин, Виталий Михайлович, 1998 год

Список литературы

Биосинтез и продукция биотина

1. Ленинджер А. Основы биохимии. Пер. с англ. М.: Мир, 1985.

2. Серебрийский И. Г. Клонирование, изучение структуры генов биосинтеза

биотина Methylobacillus flagellatum. Дисс... к.б.н. М., ВНИИгенетика, 1993.

3. Abbott J., Beckett D.: Cooperative binding of the Escherichia coli repressor of

biotin biosynthesis to the biotin operator sequence. Biochemistry 1993 Sep 21 ;32(37) :9649-9656

4. Alexeev D., Baxter RL., Smekal O., Sawyer L.: Substrate binding and

carboxylation by dethiobiotin synthetase-^ kinetic and X-ray study. Structure 1995 Nov 15;3(11):1207-1215

5. Alexeev D., Bury S. M., Boys C. W., Turner M. A., Sawyer L., Ramsey A. J.,

Baxter H. C., Baxter R. L.: Sequence and crystallization of Escherichia coli dethiobiotin synthetase, the penultimate enzyme of biotin biosynthesis. J Mol Biol 1994 Jan 14;235(2):774-776

Baldet P., Alban C., Douce R.: Biotin synthesis in higher plants: purification and characterization of bioB gene product equivalent from Arabidopsis thaliana overexpressed in Escherichia coli and its subcellular localization in pea leaf cells. FEBS Lett 1997 Dec 15;419(2-3):206-210

7. Baldet P., Gerbling H., Axiotis S., Douce R.: Biotin biosynthesis in higher plant

cells. Identification of intermediates. Eur J Biochem 1993 Oct l;217(l):479-485

8. Barker D. F. & Campbell A. M.: Genetic and biochemical characterisation of the

birA gene and its product: evidence for a direct role of biotin holoenzyme synthetase in repression of the biotin operon in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology, 1981,146, 469-492

9. Barker D. F. & Campbell A. M.: The birA gene of Escherichia coli encodes a

biotin holoenzyme synthetase. Journal of Molecular Biology, 1981, 146, 451-467

10. Barker D. F. & Campbell A. M.: Use of the bio-lac fusion strains to study

regulation of biotin biosynthesis in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 1980 , 143, 789-800

11. Barker D. F., Kuhn J. & Campbell A.M.: Sequence and properties of operator

mutations in the bio operon on Escherichia coli. Gene, 1981, 13, 89-102.

12- Bower S., Perkins J. B., Yocum R. R., Howitt C. L., Rahaim P., Pero J.:Cloning., sequencing., and characterization of the Bacillus subtilis biotin biosynthetic operon. J Bacteriol 1996 Jul;178(14):4122-4130

13. Bower S., Perkins J., Yocum RR., Serror P., Sorokin A., Rahaim P., Howitt C. L.,

Prasad N., Ehrlich SD., Pero J.: Cloning and characterization of the Bacillus subtilis birA gene encoding a repressor of the biotin operon. J Bacteriol 1995 May;177(9):2572-2575

14. Bowman W. C., Demoll E.: Biosynthesis of Biotin from Dethiobiotin by the Biotin

Auxotroph Lactobacillus Plantarum. Journal of Bacteriology 175: 23 (DEC 1993) 7702-7704

15. Brown, S.W., Speck D„ Sabatie, J., Gloeckler R., O'Regan M., Viret., J.F.,

Lemoine Y., Ohsawa I., Kisou T., Hayakawa, K., & Komogawa K.: The production of biotin by recombinant strains of Escherichia coli. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 1991, 50,115-121

16. Campbell, A.M.,, Chang,R., Barker, D. & Keiner, G.: Biotin-regulatory (bir)

mutations of Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 1980, 142, 10251028

17. Campbell, A.M., del Campillo-Campbell, A.M., & Chang,R.: A mutant of E.coli

that requires high concentrations of biotin. Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,1972, 69, 676-680

18. Cleary,P. & Campbell, A.M.,: Deletion and complementation analysys of the

biotin gene cluster of Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 1972,112, 830-839.

19. Cronan J. E. Jr: Expression of the biotin biosynthetic operon of Escherichia coli is

regulated by the rate of protein biotination. J Biol Chem 1988 Jul 25;263(21): 10332-10336

20. DeMoll E., White R. H., Shive W.: Determination of the metabolic origins of the

sulfur and 3'-nitrogen atoms in biotin of Escherichia coli by mass spectrometry. Biochemistry 1984 Jari 31;23(3):558-562

21. Demoll,E., & Shieve,W.: The origin of sulfur in biotin. Biochem.

Biophys.Res.Commun., 1983, 110, 243-249

22. Duin E. C., Lafferty M. E., Crouse B. R., Allen R. M., Sanyal I., Flint D. H.,

Johnson M. K.P; [2Fe-2S] to [4Fe-4S] cluster conversion in Escherichia coli biotin synthase. Biochemistry 1997 Sep 30;36(39): 11811-11820

23. Eisenberg M. A.: Mode of action of alpha-dehydrobiotin, a biotin analogue. J

Bacteriol 1975 Jul;123(l):248-254

24. Eisenberg, M.A. & Star ,C.: Synthesis of 7-oxo-8-aminopelargonic acid, a biotin

vitamer, in cell-free extxtracts of Escherichia coli biotin auxotrophs. Journal of Bacteriology, 1968, 96, 1291-1297

25. Eisenberg, M.A. & Stoner, G.L.: 7,8-Diaminopelargonic acid aminotransferase.

Methods of Enzymology, 1979, 62,342-347

26. Eisenberg, M.A. & Stoner, G.L.: Biosynthesis of 7,8-diaminopelargonic acid, a

biotin intermediate, from 7-keto-8-aminopelargonic acid and S-adenosyl-L-methionine. Journal of Bacteriology, 1971, 108, 1135-1140.

27. Eisenberg, M.A., Prakash, O. & Hsiung,S-C.: Purification and properties of the

biotin repressor - a Afunctional protein. Journal of Biological Chemistry, 1982,257, 15167-15173

28. Eisenberg, M.A.: Biosynthesis of biotin and lipoic acid. In Neidhart, F.C.,

Ingraham, J.L., Low, K.B., Magasanik, B., Schaechter, M. & Umbarger, M.E.(Eds.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology, American Society of Microbiology. New York, NY, 1987, 544-550

29. Eisenberg, M.A.: Mode of action of biotin antimetabolites, actihiazic acid and

methildethiobiotin. Antimicrob.Agents Chemother, 1982, 21,5-10

30. Eisenberg, M.A.: Regulation of the biotin operon in E.coli. part IV. Biotin

synthesys and metobolism, biotin as molekular probe. Annals of the New York Academy of Science, 1985, 447, 335-349

31. Eisenburg M. A., Mee B., Prakash O., Eisenburg M. R.: Properties of alpha-

dehydrobiotin-resistant mutants of Escherichia coli K-12. J Bacteriol 1975 Apr;122(l):66-72

32. Fisher, E.,: System for biotin synthesis. US Patent WO 87 /01391

33. Florentin D., Bui B. T., Marquet A., Ohshiro T., Izumi Y.: On the mechanism of

biotin synthase of Bacillus sphaericus. C R Acad Sei III 1994 Jun;317(6):485-488

34. Frappier, F. & Marquet, A.: On the biosynthesis of biotin in Achromobacter

IVSW. A reinvestigation. Biochem. Biophys. Res.Commun., 1981, 103, 1288-1293

35. Frappier, F., Guillerm, G., & Marquet, A.: On the mechanism of the conversion of

dethiobiotin to biotin in Escherichia coli. Discussion of the occurence of an intermediate hydroxilation. Biochem. Biophys. Res.Commun., 1979, 91, 521-527

I

36. Frappier, F., Jouany, M., Marquet, A., Olescar, A. & Tabet, J.C.: On the

mechanism of the conversion of dethiobiotin to biotin in E.coli studies with deuterated precursors, using MS-MS techniques. Journal of Organ. Chemistry, 1982, 47, 2257-2261.

37. Fujisawa A., Abe T., Ohsawa I., Kamogawa K., Izumi Y.: Bioconversion of

Dethiobiotin to Biotin by a Cell-Free System of a bioYB Transformant of Bacillus-SphaericusFEMS Microbiology Letters 110: 1 (JUN 1 1993)1-4

38. Fujisawa A., Abe T., Hara N., Ohori M., Shiozaki S., Izumi Y.: Biotin production

by bioB transformants of a B. sphaericus mutant resistant to TTFA, an electron transport inhibitor. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 58:6(1994) 1018-1022

39. Fujisawa A., Abe T., Ohsawa I., Shiozaki S., Kamogawa K., Izumi Y.:

Bioconversion of Dethiobiotin into Biotin by Resting Cells and Protoplasts of Bacillus sphaericus bioB Transformant. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 57: 5 (MAY 1993) 740-744

40. Gibson K., Lorimer G., Rendina A., Taylor W., Cohen G., Gatenby A., Payne W.,

Roe D. C., Lockett B. A., Nudelman A., et al: Dethiobiotin synthetase: the carbonylation of 7., 8-diaminonanoic acid proceeds regiospecifically via the N7-carbamate. Biochemistry 1995 Sep 5;34(35): 10976-10984

41. Gloeckler R., Ohsawa I., Speck D., LeDoux C., Bernard S., Zinsius M., Villeval

D., Kisou T., Komogawa K., Lemoine U.: Cloning and characterization of the Bacillus sphaericus genes controlling the bioconversion of pimelate into dethiobiotin; Gene 1990, $7, 63-70.

42. Guianvarc'h D., Florentin D., Tse Sum Bui B.s Nunzi F., Marquet A.: Biotin

synthase., a new member of the family of enzymes which uses S-adenosylmethionine as a source of deoxyadenosyl radical. Biochem Biophys Res Commun 1997 Nov 7;240(1):246

43. Hanka L. J., Martin D. G., Reineke L. M.: Two new antimetabolites of biotin:

alpha-methyldethiobiotin and alpha-methylbiotin. Antimicrob Agents Chemother 1972 Feb;l(2):135-138

44. Hatakeyama K., Hohama K., Vertes A. A., Kobayashi M., Kurusu Y., Yukawa H.

Genomic organization of the biotin biosynthetic genes of coryneform bacteria: cloning and sequencing of the bioA-bioD genes from Brevibacterium flavum. DNA Seq 1993;4(3):177-184

45. Hatakeyama K., Kohama K., Vertes A. A., Kobayashi M., Kurusu Y., Yukawa H.:

Analysis of the biotin biosynthesis pathway in coryneform bacteria: cloning and sequencing of the bioB gene from Brevibacterium flavum. DNA Seq 1993;4(2):87-93

46. Huang W., Lindqvist Y., Schneider G., Gibson KJ., Flint D., Lorimer G.: Crystal

structure of an ATP-dependent carboxylase., dethiobiotin synthetase., at 1.65 A resolution. Structure 1994 May 15;2(5):407-414

47. Ifuku O., Kishimoto J., Haze S., Yanagi M. & Fukushima S.: Conversion of

dethiobiotin to bionin in cell-free extracts of E. coli. Biosci Biotechnol Biochem 1992;56(11):1780-1785

48. Ifuku O., Koga N., Haze S., Kishimoto J. & Wachi Y.:Flavodoxin is required for

conversion of dethiobiotin in E. coli. 1994, Eur. J. Biochem. 224, 173-178

49. Ifuku O., Koga N., Haze S., Kishimoto J., Arai T., Wachi Y.: Molecular analysis

of growth inhibition caused by overexpression of the biotin operon in Escherichia coli. Biosci Biotechnol Biochem 1995 Feb;59(2): 184-189

50. Ifuku O., Miyaoka H., Koga N., Kishimoto J., Haze S.. Wachi Y., Kajiwara M.:

Origin of carbon atoms of biotin. 13C-NMR studies on biotin biosynthesis in Escherichia coli. Eur J Biochem 1994 Mar 1;220(2):585-591

51. Ifuku O., Haze S., Kishimoto J., Koga N., Yanagi M., Fukushima S.: Sequencing

Analysis of Mutation Points in the Biotin Operon of Biotin-Overproducing Escherichia coli Mutants. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 57: 5 (MAY 1993) Page(s) 760-765

52. Iwahara, S., Takasawa, S., Tochikura, T. & Ogata, K.: Studies on biosynthesis of

biotin by microorganisms. PartIV Conversation of dethiobiotin to biotin by various kinds of microorganisms. Agricultural and Biological Chemistry, 1966, 30, 385-393.

53. Izumi Y., Fukuda H., Tani Y., Ogata K.: Action of 5-(2-thienyl)valeric acid as a biotin antagonist. Biochim Biophys Acta 1977 Sep 29;499(2):315-317 Y., Kano, Y., Inagaki, K., Kawase, N., Tani, Y., & Yamada, H., Characterisation of biotin biosynthetic enzymes of Bacillus sphaericus: a destiobiotin producing bacterium Agricultural and Biological Chemistry, 1981,45, 1983-1989

Y., Sato, K., & Ogata, K.: Distribution of 7-keto-8-aminopelargonic acid synthetasa in bacteria and the control mechanism of the enzyme activity. Agricultural and Biological Chemistry, 1973, 37, 1335-1340 Y., Tani, Y., & Yamada, H., Biotin biosynthesis in microorganisms. Bull. Inst. Chem.Res.Kyoto Univ., 1980, 58, 434-447

E., Moreau F., Florentin D., Marquet A.: Synthesis and biochemical properties of Z- and E-4., 5-dehydrodethiobiotin. Bioorg Med Chem 1996 Jul;4(7):1065-1075

58. Ketner, G. & Campbell, A.M.,: Operator and promoter mutations affecting

divirgent transcription in the bio gene cluster in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology, 1975, 96,13-27

59. Kitahara T., Hotta K., Yoshida M., Okami Y.: Biological studies of

amiclenomycin. J Antibiot (Tokyo) 1975 Mar;28(3):215-221

60. Koga N., Kishimoto J., Haze S., Ifuku O.: Analysis of the bioH gene of E. coli and

its effect on biotin productivity. J. Ferm. Bioengin. 81 (6): 482-487, 1996.

61. Levy-Schil S. at al: Biotin biosynthetic pathway in recombinant strains of E. coli

overexpressing bio-genes: evidence for a limiting step upstream from KAPA. Appl. Microbiol (1993) 38: 755-762

54. Izumi,

55. Izumi,

56. Izumi,

57. Jestin

62. Lin K. C., Shiuan D.: Dnasei Footprinting Studies of Escherichia Coli Biotin

Repressor-Operator Interactions. Journal of Biochemistry (NOV 1993) 5 114:670-676

63. Mejean A., Bui B. T., Florentin D., Ploux O., Izumi Y., Marquet A.: Highly

purified biotin synthase can transform dethiobiotin into biotin in the absence of any other protein, in the presence of photoreduced deazaflavin. Biochem Biophys Res Commun 1995 Dec 26;217(3):1231-1237

64. Nath S. K.: Attenuation of transcription of biotin genes in Escherichia coli. Can J

Microbiol 1988 Dec;34(12): 1288-1296

65. Ogata, K., Tochikura, T., Iwahara, S., Ikushima, K., Takasawa, S., Nishimura, A.

& Kikushi,K.: Studies on biosynthesis of biotin by microorganisms. Identification of biotin-vitamers accumulated by various microorganisms. Agricultural and Biological Chemistry, 1965, 29, 895-901.

66. Ohsawa I., Speck D., Kisou T., Hayakawa, K., Zinsius M., Gloeckler R., Lemoine

Y. & Komogawa K.; Cloning of the Bacillus sphaericus biotin synthesis gene and expression in E. coli and Bacilli; Gene 1989, 80, 39-48.

67. Ohsugi, M., & Ishikawa, Y.: Biosynthesis of biotin-vitamers from oleic acid by

Cryptococcus neoformans. Agricultural and Biological Chemistry, 1975, 39, 559-567

68. Ohsugi, M., Inone, Y., Kuki, M., Imai, K., & Deguchi, H.: Biosynthesis of biotin-

vitamers from pelargonic acid by Pseudomonas sp. strain 393. Agricultural and Biological Chemistry, 1983, 47, 2725-2730

69. O'Regan M., Gloeckler R., Bernard S., LeDoux C., Ohsawa I., Lemoine Y.:

Nucleotide sequence of the bioH gene of Escherichia coli; Nucleic Acids Res. 1989,17, 8004-8004. 1-5793

70. Otsuka A.J., Buoncristiani M.R., Howard P.K., Flamm J., Johnson O.; The

Escherichia coli biotin biosynthetic enzyme sequences predicted; J. Biol. Chem. 1988, 263,19577- 19585.

71. Otsuka, A., & Abelson,J.: The regulatory region of the biotin operon in

Escherichia coli. Nature, 1978, 276, 689-694

72. Pai C. H., Yau H. C.: Chromosomal location of mutations affecting the regulation

of biotin synthesis in Escherichia coli. Can J Microbiol 1975 Jul;21(7):l 116-1120

73. Pai J.: Genetics of biotin biosynthesis in Bacillus subtilis. Bacteriol 1975

Jan;121(l):l-8 CH

74. Pai, C.H. & McLaughlin, G.E.: Uptake of pimelic acid in Escherichia coli and

Pseudomonas denitrificans. CJM, 1969, 15, 809-810

75. Pai, C.H.: Genetics of biotin synthesis in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology,

1975,121, 1-8

76. Pai,C.H.: Mutants of Escherichia coli with derepressed level of biotin biosynthetic

enzymes. Journal of Bacteriology, 1972,112,1280-1287

77. Piffeteau A., Dufour M. N„ Zamboni M., Gaudry M., Marquet A.: Mechanism of

the antibiotic action of alpha-dehydrobiotin. Biochemistry 1980 Jun 24;19(13):3069-3073

78. Piffeteau A., Zamboni M., Gaudry M.: Biotin transport by a biotin-deficient strain

of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 1982 May 21;688(l):29-36

79. Pittard J. and F.Gibson. The regulation of biosynthesis of aromatic amino acids

and vitamins. In B.L.Horecker and E.R.Stardtman (eds.). Current topics in cellular regulation, vol.2. 1970, Acad. Press Inc. New York, p.29-63.

80. Ploux O., Marquet A.: Mechanistic studies on the 8-amino-7-oxopelargonate

synthase., a pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzyme involved in biotin biosynthesis. Eur J Biochem 1996 Feb 15;236(l):301-308

81. Ploux O., Marquet A.: The 8-amino-7-oxopelargonate synthase from Bacillus

sphaericus. Purification and preliminary characterization of the cloned enzyme overproduced in Escherichia coli. Biochem J 1992 Apr 15;283( Pt 2):327-331

82. Ploux O., Soularue P., Marquet A., Gloeckler R., Lemoine Y.: Investigation of the

first step of biotin biosynthesis in Bacillus sphaericus. Purification and characterization of the pimeloyl-CoA synthase, and uptake of pimelate. Biochem J 1992 Nov 1;287( Pt 3):685-690

83. Prakash, O. & Eisenberg, M.A.: Biotinyl-5'-adenylate - corepressor role in the

regulation of the biotin genes of Escherichia coli K -12. Proc.Natl.Acad.Sci.USA ,1979, 76, 5463 -5487

84. Rolfe. B., & Eisenberg, M.A.: Genetic and biochemical analysis of the biotin loci

of Escherichia coli K-12. Journal of Bacteriology, 1968, 96, 515-524

85. Sakurai N., Imai Y. J., Masuda M., Komatsubara S., Tosa T.: Molecular Breeding

of a Biotin- Serratia marcescens Strain. Applied and Environmental Microbiology 59: 10 (OCT 1993) Page(s) 3225-3232

86. Sakurai N., Imai Y. J., Masuda M., Komatsubara S., Tosa T.: Improvement of a d-

biotin-hyperproducing recombinant strain of S. macescens. J. Biotech. 36:1 (1994)63-73.

87. Sakurai N., Imai Y. J., Komatsubara S., Tosa T.: Integration of the mutated biotin

biosynthetic genes to the chromosome of a d-biotin-producing strain of S. macescens. J.Ferm.Bioengin. 77:6 (1994) 610-616

88. Sakurai N., Imai Y., Masuda M., Komatsubara S., Tosa T.: Construction of a

Biotin-Overproducing Strain of Serratia marcescens Applied and Environmental Microbiology 59: 9 (SEP 1993) 2857-2863

89. Salib, A.G., Frappier, F., Guillerm, G., & Marquet, A.: On the mechanism of the

conversion of dethiobiotin to biotin in Escherichia coli. Isolation of an intermediate in the biosynthesis biotin from dethiobiotin. Biochem. Biophys. Res.Commun., 1979, 88, 312-319.

90. Sanyal I., Cohen G., Flint D. H.:Buiotin synthase - Purif. Charact. As a [2Fe-2S]

Cluster Protein, and Invitro activity of the e. coli bioB gene product. Biochem.33: 12(1994)3625-3631.

91. Sanyal I., Lee S. L., Flint D. H.: Biosynthesis of pimeloyl-CoA,a biotin precursor

in E. coli, follows a modifned fatty acid synthesis. Pathway - C-13 Labeling Studies. J. Amer.Chem.Soc. 116:6 (1994) 2637-2638.

92. Shaw N. M., Birch 0. M., Tinschert A., Venetz V., Dietrich R., Savoy L.: A Biotin

synthase from Escherichia coli: isolation of an enzyme-generated intermediate and stoichiometry of S-adenosylmethionine use. Biochem J 1998 Mar 15;330( Pt 3):1079-1085

93. Shine, J. and Dalgarno, L.: Determinant of cistron specificity in bacterial

ribosomes. Nature, 1976, 254, 34 - 38.

94. Shiuan D. & Campbell A.: Transcriptional regulation and gene arrangment of E.

coli, C. Freundii and S. typhimurium biotin opérons. Gene, 67 (1988) 203211.

95. Shiuan D., Lin K. C., Campbell A.: Transcriptional analysis of the Escherichia coli

bio operon. Gene 1994 Jul 22;145(l):l-7

96. Stoner, G. L. & Eisenberg, M. A.: Biosynthesis of 7,8-diaminopelargonic acid, a

biotin intermediate, from 7-keto-8-aminopelargonic acid and S-adenosyl-L-methionine. The kinetics of reaction. Journal of Biological Chemistry, 1975,250, 4037-4043

97. Streaker ED., Beckett D.: A map of the biotin repressor-biotin operator interface:

binding of a winged helix-turn-helix protein dimer to a forty base-pair site. J Mol Biol 1998 May 15;278(4):787-800

98. Streaker ED., Beckett D.: Coupling of site-specific DNA binding to protein

dimerization in assembly of the biotin repressor-biotin operator complex. Biochemistry 1998 Mar 3; 37(9):3210-3219

99. Streit W. R., Phillips D. A.: A biotin-regulated locus., bioS., in a possible survival

operon of Rhizobium meliloti. Mol Plant Microbe Interact 1997 Sep;10(7):933-937

100. Szybalski, E.H. & Szybalski, W.: A physical map of the Escherichia coli bio

operon. Gene, 1982, 93-103

101. Wright, L.D., Valentik, K.A., Nepple, H.M., Cresson, E.L., & Skeggs, H.R.:

Affinity of avivin for biotin. Proc.Soc. Exptl.Biol.Med., 1950, 74, 273 -274

102. Xu Y., Beckett D.: Biotinyl-5'-adenylate synthesis catalyzed by Escherichia coli

repressor of biotin biosynthesis. Methods Enzymol 1997; 279:405-421

103. Xu Y., Beckett D.: Evidence for interdomain interaction in the Escherichia coli

repressor of biotin biosynthesis from studies of an N-terminal domain deletion mutant. Biochemistry 1996 Feb 13;35(6): 1783-1792

104. Xu Y., Beckett D.: Kinetics of biotinyl-5'-adenylate synthesis catalyzed by the

Escherichia coli repressor of biotin biosynthesis and the stability of the enzyme-product complex. Biochemistry 1994 Jun 14;33(23):7354-7360

105. Xu Y., Johnson C. R., Beckett D.: Thermodynamic analysis of small ligand

binding to the Escherichia coli repressor of biotin biosynthesis. Biochemistry 1996 Apr 30;35(17):5509-5517

106. Xu Y., Nenortas E., Beckett D.: Evidence for distinct ligand-bound conformational

states of the multifunctional Escherichia coli repressor of biotin biosynthesis. Biochemistry 1995 Dec 26;34(51): 16624-16631

107. Zhang S., Sanyal I., Bulboaca G. H., Rich A., Flint D. H.: The gene for biotin synthase from Saccharomyces cerevisiae: cloning., sequencing., and complementation of Escherichia coli strains lacking biotin synthase. Arch Biochem Biophys 1994 Feb 15;309(l):29-35

Метилотрофия

108. Гомельский M. В. Клонирование, изучение структуры и регуляции гена гесА

Methylobacillus flagellatum. Дисс... к.б.н. М., ВНИИгенетика, 1991.

109. Ерошин В. К. и Скрябин Г. К. Биотехнологическое получение белка. - В кн.:

Биотехнология. М.: Наука, 1984

110. Цыганков Ю. Д. Исследование облигатных метилотрофных бактерий:

генетический анализ и система молекулярного клонирования. Дисс... д.б.н. М., ВНИИгенетика, 1988.

111. Чистосердов А. Ю. Конструирование плазмидных векторов широкого круга

хозяев: клонирование генов человеческих интерферонов. Дисс... к.б.н. М., ВНИИгенетика, 1985.

112. Anderson DJ, et al.: Nucleotide sequence of the Methylobacterium extorquens

AMI moxF and moxJ genes involved in methanol oxidation. Gene. 1990 May 31; 90(1): 173-176.

113. Antony C.: The microbial metabolism of C-l compounds. 1982, Acad. Press,

London.

114. Baev MV, et al.: Regulation of ammonia assimilation in an obligate methylotroph

Methylobacillus flagellatum under steady-state and transient growth conditions. Antonie Van Leeuwenhoek. 1997 May; 71(4): 353-361

115. Byrom D.: Host-vector system for Methylophilus methylotrophus. In: Microbial

Growth on C-l Compounds (Crawford R.L., Hanson R.S., eds), 1984, 221223

116. Chistoserdova L, et al.: Identification and mutation of a gene required for glycerate

kinase activity from a facultative methylotroph, Methylobacterium extorquens AMI. J Bacterid. 1997 Aug; 179(15): 4946-4948.

117. Chistoserdova LV, et al.: Molecular characterization of a chromosomal region

involved in the oxidation of acetyl-CoA to glyoxylate in the isocitrate-lyase-negative methylotroph Methylobacterium extorquens AMI. Microbiology. 1996 Jun; 142( Pt 6): 1459-1468.

118. de Vries GE, et al.: Cloning, expression, and sequence analysis of the Bacillus

methanolicus CI methanol dehydrogenase gene. J Bacteriol. 1992 Aug; 174(16): 5346-5353.

119. Fulton GL, et al.: Molecular cloning of a malyl coenzyme A lyase gene from

Pseudomonas sp. strain AMI, a facultative methylotroph. J Bacteriol. 1984 Nov; 160(2): 718-723

120. Gak ER, et al.: Organization of methylamine utilization genes (mau) in

'Methylobacillus flagellatum ' KT and analysis of mau mutants. Microbiology. 1997 Jun; 143(Pt6): 1827-1835.

121. Gomelsky M, et al.: Identification and characterization of the pqqDGC gene

cluster involved in pyrroloquinoline quinone production in an obligate methylotroph Methylobacillus flagellatum. FEMS Microbiol Lett. 1996 Aug 1; 141(2-3): 169-176.

122. Gomelsky, M., Gak, E., A. Chistoserdov, A. Bolotin, & Y. D. Tsygankov.

Cloning, sequence and expression in Escherichia coli of the Methylobacillus flagellatum recA gene. Gene, 1990, 94: 69-75

123. Hagishita T, et al.: Cloning and expression of the gene for serine-glyoxylate

aminotransferase from an obligate methylotroph Hyphomicrobium methylovorum GM2. Eur J Biochem. 1996 Oct 1; 241(1): 1-5.

124. Holloway B.W. 1984. Genetics of methylotrophs, in Methylotrophs, Microbiology,

Biochemistry, and Genetics. (Hou, C., Ed.) pp. 87-106. CRC Press, Boca Raton, FL.

125. Lindstrom, M.E. and Stirling, D.I.: Methylotrophs: genetics and commercial

applications. Annu. Rev. Microbiol. 1990, 44, 27 - 58.

126. Lindstrom, M.E. and Tsygankov, Y.D.: Molecular genetics of methylotrophic

bacteria. In.: Biology of methylotrophy. Butterworth Publishers, in press.

127. Miyata A, et al.: Molecular cloning and expression of the gene for serine

hydroxymethyltransferase from an obligate methylotroph Hyphomicrobium methylovorum GM2. Eur J Biochem. 1993 Mar 15; 212(3): 745-750

128. Motoyama H, et al.: Cloning and nucleotide sequences of the homoserine

dehydrogenase genes (hom) and the threonine synthase genes (thrC) of the Gram-negative obligate methylotroph Methylobacillus glycogenes. Appl Environ Microbiol. 1994 Jan; 60(1): 111-119.

129. Motoyama H, et al.: Effects of the amplification of the genes coding for the L-

threonine biosynthetic enzymes on the L-threonine production from methanol by a gram-negative obligate methylotroph, Methylobacillus glycogenes. Appl Microbiol Biotechnol. 1994 Oct; 42(1): 67-72.

130. Muntyan MS, et al.: Two o-type oxidases in Methylobacillus flagellatum KT.

Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14; 204(1): 428-435.

131. Serebrijski I, et al: Refined genetic map of the obligate methylotroph

Methylobacillus flagellatum. Mol Gen Genet. 1998 Apr; 258(1-2): 133138.

132. Springer AL, et al.: Sequence and characterization of mxaB, a response regulator

involved in regulation of methanol oxidation, and of mxaW, a methanolregulated gene in Methylobacterium extorquens AMI. FEMS Microbiol Lett. 1998 Mar 1; 160(1): 119-124.

133. Taguchi K, et al.: Cloning and characterization of the azurin iso-1 gene, concerned

with the electron transport chain involved in methylamine/methanol oxidation in the obligate methylotroph Methylomonas sp. strain J. Biosci Biotechnol Biochem. 1998 May; 62(5): 870-874.

134. Tanaka Y, et al: Cloning and analysis of methanol oxidation genes in the

methylotroph Hyphomicrobium methylovorum GM2. FEMS Microbiol Lett. 1997 Sep 15; 154(2): 397-401.

135. Tsygankov Y. D., Kazakova S. & Serebrijski I. G.: Genetic mapping of the

obligate methylotroph Methylobacillus flagellatum: characteristics of prime plasmids and the chromosome map in the time units. 1990, Bacteriol. 1990, 172,2747-2754

136. Tsygankov Y.D., and S. M. Kazakova. Development of gene transfer systems in

Methylobacillus flagellatum KT: isolation of auxotrophic mutants. 1987, Arch. Microbiol. 149: 396-401.

137. Vries G.E. de. Molecular biology of bacterial methanol oxidation. FEMS

Microbiol. Rev. 1986, 39:235-258.

138. Vries, G.E. de, Kues, U. and Stahl, U.: Physiology and genetics of methylotrophic

bacteria. FEMS Microbiol. Rev., 1990, 75, 57 - 102.

139. Yoshida T, et al.: Cloning and expression of the gene for hydroxypyruvate

reductase (D-glycerate dehydrogenase from an obligate methylotroph Hyphomicrobium methylovorum GM2). Eur J Biochem. 1994 Aug 1; 223(3): 727-732.

Методы

140. Казакова С. M., Казанцева Д. И., Цыганков Ю. Д. Оптимизация условий

нитрозогуанидинового мутагенеза облигатного метилотрофа Methylomicrobium flagellatum КТ. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1986, 8,28 - 32.

141. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы

генетической инженерии. Пер. с англ.М.: Мир, 1984. 480с.

142. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике.Пер. с англ. М.: Мир.

1976. 440с.

143. Хеймс Б. и Хиггинс С. Под ред. Транскрипция и трансляция. Методы. . Пер.

с англ. М. :Мир. 1987. 400 с.

144. Covarrubiad, et al.,Gene, 17,79 (1982).

145. Gibson T.J.:Studies on the epstein-barr virus genom Ph.D. Thesis. Univ.of

Cambridge. England, 1984.

146. Gish, Warren and David J. States Identification of protein coding regions by

database similarity search. Nat. Genet. (1993). 3:266-72.

147. Jobanputra R. S. & Datta N.: Trimethoprim R factors in enterobacteria from

clinical speciments. J. Med.Microb., 1974, 7 169-177/

148. Kieny, M.P., Lathe, R. and Lecocq, J-P.: New versatile cloning and sequencing

vectors based on bacteriophage M13. Gene, 1983, 26, 91 - 99.

149. Laemmli, U.K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature, 1970,227, 680 - 685.

150. Maniatis Т. Fritsch E. F. And Sambrook J.:Molecular Cloning. Laboratory

Manual. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY, 1982.

151. Russell D. R. & Bennett G.N., Gene 20, 231 (1982).

152. Sanger, F., Nicken, S. and Coulson, A.R.: DNA sequencing with chain terminating

inhibitors. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1977, 74, 5463 - 5467.

153. Simon R., Priefer U. & Puhler, A.: A broad host range mobilisation system for in

vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in Gramm- bacteria. Biotechnology, 1983, 1,784 - 791.

154. SoberonX. Et al.,Gene (1980) 9, 287

155. Summers W. C.: A simple method of extraction of RNA from E. coli utilizing

DEPC Anal. Biochem., (1970) 33: 459-463

156. Yanisch-Perron, C., Vieira, J. and Messing, J.: Improved M13 phage cloning

vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 1985, 33, 103 - 119.

157. Lee P.T., Hsu A.Y., На H.T., Clarke C.F., J. Bacteriol. 179:1748-1754(1997).

158. Matzura O. and Wennborg A.: RNAdraw: an integrated program for RNA

secondary structure calculation and analysis under 32-bit Microsoft Windows, Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), Vol. 12 no.3 1996, 247-249

159. Миронов A.A., и др. Описание пакета программ DNA-SUN. М.,

ВНИИгенетика, 1991.

160. Alting-Mees MA, et al. pBluescript II: gene mapping vectors. Nucleic Acids Res.

1989 Nov 25;17(22):9494.

161. Casadaban M.J., Chou J., Cohen S.N. In vitro gene fusions that join an

enzymatically activeRT beta-galactosidase segment to amino-terminal fragments of exogenousRT proteins: Escherichia coli plasmid vectors for the detection and RT cloning of translational initiation signals. RL J. Bacteriol. 143:971-980(1980).

162. Марченко Г. Клонирование, изучение структуры генов биосинтеза треонина

Methylobacillus flagellatum. Дисс... к.б.н. М., ВНИИгенетика, 1993.