Регулируемая клеточная смерть, вызываемая протеазой 3C вируса гепатита A человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Комиссаров, Алексей Александрович

• Комиссаров, Алексей Александрович
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Комиссаров, Алексей Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ПРОТЕАЗЫ КАК ИНДУКТОРЫ И

МЕДИАТОРЫ РЕГУЛИРУЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ 11

1.1 Каспазы 11

1.2 Кальпаины 18

1.3 Гранзимы 21

1.4 Катепсины 25

1.5 Бактериальные протеазы 27

1.6 Вирусные протеазы 31

1.7 Заключение 35

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 38

2.1 Реактивы и материалы 38

2.2 Линии клеток и бактериальные штаммы 38

2.3 Плазмиды и синтетические олигонуклеотиды 39

2.4 Общие методы 40

2.4.1 Манипуляции с нуклеиновыми кислотами 40

2.4.2 Создание плазмидных экспрессионных конструкций 41

2.4.3 Манипуляции с белками 44

2.4.4 Работа с бактериями и эукариотическими клетками 45

2.5 Получение антител, специфичных к протеазе 3С вируса гепатита

А человека 47

2.6 Оценка цитотоксического действия 3Cpro в зависимости от

уровня экспрессии ее гена 47

2.7 Исследование эффекта свидетеля, сопровождающего гибель

клеток вследствие экспрессии 3Cpro 48

2.8 Обработка и анализ полученных данных 48

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 49

3.1 Характеристика клеточной гибели, вызываемой протеазой 3С

вируса гепатита А человека 49

3.1.1 Экспрессия и оценка цитотоксического действия 3Сpro с помощью системы Tet-Off 49

3.1.2 Экспрессирующие 3Cpro клетки характеризуются нарушением функционирования митохондрий 52

3.1.3 Гибель клеток, экспрессирующих 3Cpro, сопровождается конденсацией хроматина и не зависит от каспаз, кальпаинов и катепсинов 52

3.1.4 Вакуолизация и гибель экспрессирующих ЗСрго клеток происходит не по механизму некроптоза 54

3.1.5 Вакуоли экспрессирующих ЗСрго клеток имеют неописанные ранее характеристики 54

3.1.6 Разработка экспериментальной системы для конститутивной экспрессии ЗСрго и оценки цитотоксического действия фермента 56

3.1.7 Гибель клеток, трансфицированных конструкцией рС1-3С, сопровождается цитоплазматической вакуолизацией 58

3.1.8 Гибель трансфицированных конструкцией рС1-3С клеток

не зависит от активности каспаз 60

3.1.9 Некростатин-1 не оказывает влияния на выживаемость

клеток, трансфицированных конструкцией рС1-3С 61

3.1.10 Вызываемая ЗСрго клеточная гибель может быть отнесена

к одному из четырех известных типов РКС 62

3.1.11 Гибнущие вследствие действия ЗСрго клетки приобретают некротическую морфологию 63

3.1.12 Индуцируемая ЗСрго клеточная гибель не является разновидностью партанатоса или МРТ-ассоциированной

РКС 64

3.1.13 Массовая деградация лизосом не является причиной

гибели клеток при экспрессии ЗСрго 66

3.1.14 Индуцируемая ЗСрго гибель развивается по пути ферроптоза 68

3.2 Характеристика эффекта свидетеля, сопровождающего гибель

клеток при экспрессии протеазы 3С вируса гепатита А человека 71

3.2.1 Ассоциированный с экспрессией ЗСрго эффект свидетеля не зависит от межклеточных контактов и связан с действием цитотоксических факторов, находящихся в

среде 71

3.2.2 Цитотоксическое действие факторов, обуславливающих эффект свидетеля при экспрессии ЗСрго, распространяется

на клетки грызунов 73

3.2.3 Гибель трансфицированных конструкцией рС1-ЗС клеток и эффект свидетеля проявляются при одинаковом уровне экспрессии ЗСрго 74

3.2.4 Цитотоксические факторы, обуславливающие эффект свидетеля при экспрессии ЗСрго, индуцируют гибель

клеток по пути ферроптоза 75

3.2.5 Цитотоксические факторы, обуславливающие гибель экспрессирующих ЗСрго клеток, имеют узкий диапазон молекулярной массы 77

3.3 Оценка перспектив использования комбинации 3Cpro и суицидальной системы FCU1/5-ФЦ для генной терапии онкологических заболеваний 79

3.3.1 Создание моно- и бицистронных конструкций, обеспечивающих индивидуальную и совместную экспрессию 3Cpro и FCU1 82

3.3.2 Клетки, экспрессирующие FCU1 в составе моно- и бицистронных конструкций, приобретают чувствительность к 5-ФЦ 84

3.3.3 Совместная экспрессия 3Cpro и FCU1 приводит к суммированию цитотоксических эффектов данных ферментов 85

3.4 Заключение 88 ВЫВОДЫ 90 БЛАГОДАРНОСТИ 91 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 92 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

В многоклеточном организме поддержание численности популяций клеток обеспечивается за счет сочетания процессов пролиферации, дифференцировки и регулируемой смерти. Регулируемая клеточная смерть (РКС) играет незаменимую роль, как в процессе эмбриогенеза, так и при функционировании организма во взрослом состоянии [1]. В связи с этим, нарушения РКС сопровождают или являются причиной целого ряда патологий. Так, например, невосприимчивость клеток к естественным сигналам инициации смерти является одним из факторов злокачественной трансформации клеток, а также способствует прогрессии вирусных инфекций, в то время как аберрантная индукция гибели клеток является причиной омертвления тканей, нейродегенеративных и аутоиммунных заболеваний [1-3]. Таким образом, изучение механизмов РКС представляет интерес с фундаментальной точки зрения, поскольку дает представление об одном из ключевых физиологических процессов. В то же время, детальное понимание этих механизмов позволяет разрабатывать подходы к ингибированию или, наоборот, индукции клеточной гибели для лечения различных патологических состояний, связанных с нарушениями РКС.

Молекулярные механизмы клеточной смерти активно исследуются более 50 лет и к настоящему времени известно более десятка типов РКС, которые различаются инициирующими стимулами, ключевыми белковыми медиаторами, а также морфологией, которую приобретают клетки в процессе и после гибели [4-6]. Некоторые типы являются универсальными и достаточно подробно изучены; другие проявляются только в особых случаях и охарактеризованы менее полно. К тому же, периодически появляются сообщения об открытии новых механизмов клеточной гибели.

Способностью индуцировать РКС обладает широкий спектр молекул, в частности, ряд протеолитических ферментов вирусов. Известно, что вирусные протеазы являются многофункциональными ферментами. Помимо основной функции, заключающейся в процессинге пробелков вируса с целью продукции их зрелых форм, вирусные протеазы выполняют и другие важные функции. Например, они действуют на ряд белков клеточного аппарата экспрессии генов, тем самым подавляя процессы транскрипции и трансляции собственных генов клетки-хозяина и переключая их на обеспечение жизненного цикла вируса, а также гидролизуют рецепторы и ключевые белковые медиаторы сигнальных путей, вовлеченных в развитие реакций иммунного ответа, тем самым препятствуя запуску противовирусных защитных процессов (подробно рассмотрено в [7]). Расщепляя клеточные белки и, тем самым, нарушая нормальное функционирование зараженной клетки, вирусные протеазы зачастую вызывают ее гибель.

В настоящее время накоплено достаточно большое количество данных о способности протеаз ЗС вирусов семейства Пеогпаутёав (пикорнавирусов) вызывать РКС [8-11]. При этом информации о цитотоксической активности протеазы ЗС вируса гепатита А человека (ЗСрго), также относящегося к семейству пикорнавирусов, до недавнего времени не существовало. Известно, что З Срго является единственным протеолитическим ферментом, закодированным в вирусном геноме, и гидролизует клеточные белки [12-15], функции которых аналогичны субстратам охарактеризованных пикорнавирусных протеаз ЗС [16, 17]. Эти данные указывают на потенциальную цитотоксичность данного фермента. Ранее в рамках проекта, направленного на поиск новых протеаз, способных выступать в качестве индукторов клеточной гибели, в нашей Лаборатории было впервые обнаружено, что ЗСрго обладает цитотоксической активностью в клетках человека [18]. Также было показано, что клетки, гибнущие вследствие действия ЗСрго, приобретают ранее неописанную морфологию. Полученные результаты позволили предположить, что данная гибель либо происходит по новому неизученному пути, либо является вариантом РКС известного типа, но развивающегося по ранее неизвестному механизму. Таким образом, изучение механизма вызываемой ЗСрго клеточной гибели представляет интерес с фундаментальной точки зрения. Кроме того, ЗСрго может рассматриваться в качестве потенциального цитотоксического агента для применения в генной терапии заболеваний, связанных с нарушением индукции и развития различных путей РКС.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Регулируемая клеточная смерть, вызываемая протеазой 3C вируса гепатита A человека»

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы являлась характеристика индуцируемой З Срго регулируемой клеточной смерти и изучение возможности практического применения вирусной протеазы.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать морфологические и биохимические характеристики клеточной гибели, вызываемой ЗСрго.

2. Отнести исследуемую клеточную гибель к одному из известных типов РКС или показать, что смерть клеток происходит по ранее неизученному механизму.

3. Оценить перспективы использования протеазы ЗС вируса гепатита А человека в генной терапии онкологических заболеваний.

Научная новизна и практическая значимость исследования

В настоящей работе впервые подробно охарактеризована клеточная гибель, вызываемая 3Срго, и показано, что гибель клеток происходит по пути ферроптоза. В настоящее время это единственный известный случай, когда индуктором РКС данного типа является протеаза. Полученные данные могут указывать на наличие у вирусного фермента ранее неописанной

функции, которая, в свою очередь, может отражать ранее неизвестный аспект взаимодействия вируса с клеткой-хозяином. Кроме того, в рамках данной работы впервые обнаружен и описан эффект свидетеля, сопровождающий гибель клеток вследствие экспрессии 3Cpro. Показано, что данный эффект вызывается факторами, характеризующимися молекулярной массой от 3,5 до 5 кДа и способными индуцировать ферроптоз в клетках млекопитающих.

Способность 3Cpro индуцировать ферроптоз, в совокупности с наличием эффекта свидетеля, позволяет рассматривать вирусный фермент в качестве потенциального терапевтического агента для применения в генной терапии онкологических заболеваний. В результате настоящей работы были получены оригинальные данные, демонстрирующие, что комбинирование 3Cpro с суицидальной системой, основанной на использовании фермента FCU1 и пролекарства 5-фторцитозина, в составе бицистронной конструкции приводит к суммированию цитотоксических эффектов обоих компонентов. На примере данной комбинации показано, что для создания генотерапевтических противоопухолевых препаратов может использоваться подход, основанный на комбинировании цитотоксических агентов, индуцирующих разные типы РКС, в составе би- и мультицистронных экспрессионных конструкций с использованием последовательностей, кодирующих вирусные 2Л-пептиды.

Кроме того, предложенная в настоящей работе экспериментальная система, позволяющая оценивать эффективность функционирования комбинаций различных цитотоксических агентов в составе бицистронных конструкций, представляет собой удобный инструмент для тестирования новых комбинаций.

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием широкого спектра современных методов молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция в реальном времени, иммуноблоттинг, проточная цитофлуориметрия, конфокальная микроскопия, а также клонирование генов, создание генетических экспрессионных конструкций, культивирование и трансфекция линий клеток млекопитающих.

Положения, выносимые на защиту

1. Гибель клеток при экспрессии гена 3Cpro обусловлена протеолитической активностью вирусного фермента. Характеристики данной гибели указывают на то, что она развивается по пути ферроптоза.

2. Индуцированная ЗСрго клеточная смерть сопровождается эффектом свидетеля, который опосредован действием факторов, характеризующихся молекулярной массой от 3,5 до 5 кДа.

3. Цитотоксические факторы, обуславливающие эффект свидетеля при экспрессии 3Cpro, индуцируют гибель клеток по пути ферроптоза.

4. Разработана и протестирована экспериментальная система, позволяющая проводить оценку эффективности функционирования комбинаций цитотоксических агентов в составе бицистронных конструкций.

5. Комбинирование 3Cpro с суицидальной системой FCU1/5-фторцитозин в составе бицистронной конструкции приводит к суммированию цитотоксических эффектов обоих компонентов.

Степень достоверности и апробация результатов

Все результаты настоящего исследования были воспроизведены в нескольких независимых экспериментах, включающих в себя повторности и соответствующие контроли. Обнаруженные в ходе работы цитотоксические эффекты, в том числе эффект свидетеля, были воспроизведены и охарактеризованы на нескольких линиях клеток. По теме настоящей работы опубликованы 1 статья в отечественном и 4 статьи в международных рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК, а также 6 тезисов стендовых докладов на всероссийских и международных научных конференциях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых изданиях

1. Komissarov A.A., Kostrov S.V., Demidyuk I.V. In vitro assay for the evaluation of cytotoxic effects provided by a combination of suicide and killer genes in a bicistronic vector. // Methods Mol Biol. - 2019. - V. 1895. - P. 135-147.

2. Komissarov A., Demidyuk I., Safina D., Roschina M., Shubin A., Lunina N., Karaseva M., Kostrov S. Cytotoxic effect of co-expression of human hepatitis A virus 3C protease and bifunctional suicide protein FCU1 genes in a bicistronic vector. // Mol Biol Rep. - 2017. - V. 44. - N. 4. - P. 323-332.

3. Комиссаров А.А., Карасева М.А., Сафина Д.Р., Рощина М.П., Беднова О.П., Казаков А. А., Демкин В.В., Демидюк И.В. Сравнительная оценка эффективности экспрессии трансгена в составе модельных генетических конструкций разной структуры. // Мол Ген Микробиол Вирусол. - 2016. - V. 3. - P. 115-120.

4. Shubin A.V., Demidyuk I.V., Komissarov A.A., Rafieva L.M., Kostrov S.V. Cytoplasmic vacuolization in cell death and survival. // Oncotarget. - 2016. - V. 7. - N. 34. - P. 5586355889. (Обзор)

5. Shubin A.V., Demidyuk I.V., Lunina N.A., Komissarov A.A., Roschina M.P., Leonova O.G., Kostrov S.V. Protease 3C of hepatitis A virus induces vacuolization of lysosomal/endosomal organelles and caspase-independent cell death. // BMC Cell Biol. - 2015. - V. 16. - P. 4.

Тезисы докладов:

1. Карасева М.А., Комиссаров А.А., Демидюк И.В., Сафина Д.Р., Рощина М.П., Лунина Н.А., Костров С.В. Цитотоксическое действие протеазы 3С вируса гепатита А человека и гибридного белка FCU1 при коэкспрессии в составе бицистронного вектора. // Материалы объединённого научного форума: международная научная конференция по биоорганической химии «XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» и VIII Российский симпозиум «Белки и пептиды», 18-22 сентября 2017 г, Москва, с. 159.

2. Комиссаров А.А., Демидюк И.В., Сафина Д.Р., Рощина М.П., Шубин А.В., Лунина Н.А., Карасева М.А., Костров С.В. Оценка перспектив использования для противораковой генной терапии комбинации генов протеазы 3С вируса гепатита А человека и гибридного белка FCU1. // Успехи молекулярной онкологии: Материалы II Всероссийской конференции по молекулярной онкологии, 6-8 декабря 2016 года, Москва, с. 77-78.

3. Карасева М.А., Комиссаров А.А. Цитотоксическое действие комбинации протеазы 3С вируса гепатита А человека и гибридного белка FCU1. // Материалы VII Международной школы молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и биология живых систем», 14 -18 ноября 2016 г, с. 36.

4. Shubin A.V., Lunina N.A., Roshina M.P., Komissarov A.A., Demidyuk I.V., Kostrov S.V. Cytotoxic effect of human hepatitis A 3C protease is accompanied by cytoplasmic vacuolization. // FEBS J. 2013. V. 280 (Suppl. 1). P. 366.

5. Комиссаров А.А. Конструирование системы для оценки уровня экспрессии трансгена. // Сборник аннотаций работ X Курчатовской молодежной научной школы, 23-26 октября 2012, Москва, с. 75.

6. Шубин А.В., Комиссаров А.А., Рощина М.П., Лунина Н.А. Протеаза 3С вируса гепатита А человека вызывает каспазонезависимую гибель клеток. // Тезисы докладов и стендовых сообщений V Международной школы молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома», 3-7 декабря 2012, Звенигород, с. 71.

Личный вклад автора

Автор принимал активное участие в планировании экспериментов и самостоятельно выполнил основную часть экспериментальной работы: им были сконструированы векторы для экспрессии генов активной и мутантной 3Cpro; осуществлена трансфекция клеток человека; с помощью методов проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии проанализированы характеристики клеток, гибнущих вследствие экспрессии 3Cpro или сопутствующего эффекта

свидетеля; проанализированы цитотоксические эффекты, развивающиеся в трансфицированных культурах при добавлении ингибиторов разных типов РКС, а также при комбинировании ЗСрго с суицидальной системой FCU1/5-ФЦ. Также автором были выполнена обработка и оценка полученных результатов, подготовлен иллюстративный материал, проведен исчерпывающий анализ данных литературы по тематике работы и подготовлены материалы работы к публикации. Имена сотрудников, участвовавших в экспериментах, указаны в соответствующих опубликованных работах.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 11З страницах, включает в себя З таблицы, 29 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, благодарности, список сокращений и список литературы (409 источника).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ПРОТЕАЗЫ КАК ИНДУКТОРЫ И МЕДИАТОРЫ РЕГУЛИРУЕМОЙ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ

Протеолитические ферменты, или протеазы - группа белков, катализирующих гидролиз пептидной связи. Предполагается, что первые протеазы появились на самых ранних этапах эволюции для катаболизма белков с целью продукции свободных аминокислот в примитивных живых организмах [19]. В связи с этим долгое время исследования функций протеаз были сфокусированы на их роли в качестве утилизаторов белков. Однако на сегодняшний день накоплено большое количество информации, демонстрирующей вовлеченность протеаз в регуляцию различных процессов. Так, например, протеазы регулируют стабильность, локализацию и активность ряда белков и пептидов, влияют на процессы репликации и транскрипции, стимулируют пролиферацию и дифференцировку клеток, участвуют в процессах формирования и регенерации тканей, иммунного ответа, ангиогенеза, коагуляции крови и многих других [20, 21]. В связи с активным участием протеаз в большом количестве важных для организма процессах, нарушения функционирования данных ферментов нередко приводят к возникновению различных заболеваний, в том числе онкологических, нейродегенративных и аутоиммунных, а мутации в генах протеолитических ферментов могут стать причиной наследственных заболеваний [22, 23]. Кроме того, протеазы вовлечены в инфекционные процессы, поскольку часто являются ключевыми регуляторами жизненного цикла вирусов и факторами патогенности бактерий [24]. В связи с этим изучение протеаз и их функций в живых организмах представляет собой активно развивающееся направление современной молекулярной биологии.

Одним из важнейших физиологических процессов, в регуляции которого протеазы играют ключевую роль, является регулируемая клеточная смерть (РКС). Молекулярные механизмы РКС исследуются более 50 лет [4, 5, 25] и к настоящему времени идентифицированы протеазы, вовлеченные в процесс гибели клеток. В данном обзоре обобщена имеющаяся на сегодняшний день информация об участии протеаз в индукции и развитии гибели клеток млекопитающих, в первую очередь - человека.

1.1 Каспазы

В 1977 году было обнаружено, что в ходе нормального развития нематоды Caenorhabditis elegans происходит гибель значительного количества соматических клеток, причем эта гибель происходит не хаотично, а зависит от направления и стадии дифференцировки клеток [26]. Это открытие положило начало исследованиям, направленным на изучение молекулярного механизма РКС в С. elegans. В ходе этих работ было показано, что в регулируемой гибели клеток у нематод ключевую роль играют три белка, среди которых CED-3

(от англ. cell death protein 3). Было установлено, что CED-3 - цистеиновая протеаза, которая по своей структуре высоко гомологична интерлейкин-^-конвертирующему ферменту (interleukin-1ß-converting enzyme, ICE) млекопитающих [27, 28], а в последствии было показано, что индивидуальная экспрессия ICE в клетках мышей вызывает в них РКС [29]. Эти результаты послужили импульсом к активному поиску и в дальнейшем привели к открытию группы цистеиновых протеаз млекопитающих, участвующих в регулируемой гибели клеток. В 1996 году для обозначения данных ферментов был введен термин «каспазы» [30].

Первым представителем каспаз стал фермент ICE, который был переименован в каспазу-1. В настоящее время известно 18 каспаз, из которых в геноме плацентарных млекопитающих обнаружено 15, и еще 3 - в геноме сумчатых [31, 32]. Каспазы являются высокоспецифичными ферментами, поскольку узнают в субстратах последовательность из как минимум 4 аминокислотных остатков (в положениях P4-P3-P2-P1) и гидролизуют пептидную связь строго после Asp в P1, откуда и происходит название семейства - cysteine-aspartic proteases, caspases [33]. Обычно каспазы разделяют на две подгруппы - «воспалительные» и «апоптотические». К первым относятся каспаза-1, -4, -5, -11 и -12, которые, главным образом, регулируют процессинг цитокинов в воспалительных процессах при различных инфекциях; в подгруппу апоптотических каспаз входят каспаза-2, -3, -6, -7, -8, -9 и -10, которые, как следует из названия, играют ключевую роль в регуляции такого типа РКС как апоптоз [34]. Однако эта классификация не совсем корректна, поскольку слишком упрощает реальную ситуацию. Так, например, известно, что каспаза-7 может активироваться каспазой-1 и принимать участие в развитии воспалительных процессов (подробно рассмотрено в [35]), а некоторые воспалительные каспазы способны индуцировать в клетках апоптоз [29, 36]. К тому же, каспаза-14 не может быть отнесена ни к одной из этих подгрупп, поскольку ее функция связана с регуляцией дифференцировки кератиноцитов [37, 38].

В связи с этим каспазы удобнее классифицировать в зависимости от их строения, которое напрямую связанно с их ролью в сигнальном каскаде регулируемых ими процессов. Все каспазы синтезируются в виде неактивных предшественников - прокаспаз, которые состоят из продомена, а также большого (p20) и малого (p10) каталитических доменов [32, 33, 39]. Каспазы-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10, -11 и -12 называют инициаторными, поскольку они первыми активируются в ответ на индуцирующий стимул. Инициаторные каспазы характеризуются длинным продоменом, который содержит один из двух мотивов для белок-белковых взаимодействий: DED (от англ. «death effector domain») или CARD (от англ. «caspase recruitment domain»). Несмотря на различие в функциях, активация всех инициаторных каспаз происходит по схожему механизму. Наиболее подробно данный механизм изучен на примере апоптоза.

Апоптоз является первым отрытым и наиболее хорошо изученным типом РКС. Характерными признаками апоптотической гибели являются: значительное сокращение объема клетки, конденсация хроматина, расщепление геномной ДНК на олигонуклеосомальные фрагменты, экспонирование фосфатидилсерина на внешний слой цитоплазматической мембраны, а также распад клетки на характерные структуры, т.н. «апоптотические тельца», которые поглощаются фагоцитами и соседними клетками [40-42]. При этом цитоплазматическая мембрана в течение длительного времени сохраняет свою целостность и содержимое клетки практически никогда не «вытекает» в межклеточное пространство, поэтому при апоптозе не происходит воспаления и повреждения окружающих тканей. По-видимому, именно эти свойства апоптотической гибели привели к тому, что данный тип РКС является наиболее распространенным и часто используемым живыми организмами. В процессе апоптотической гибели клетка осуществляет процесс контролируемого и рационального «самодемонтажа», причем без постоянного участия других систем организма, за исключением, разве что, иммунной системы в лице фагоцитов, утилизирующих апоптотические тельца на конечной стадии. В связи с этим, апоптоз позволяет локально элиминировать большое количество клеток, не причиняя при этом вреда всему остальному организму.

Апоптоз может запускаться в ответ на внешние или внутренние стимулы и поэтому классифицируется как внешний или внутренний.

Внешний путь апоптоза запускается при связывании внеклеточных лигандов с т.н. «рецепторами смерти» (рисунок 1). Данные рецепторы относятся к суперсемейству факторов некроза опухоли (tumor necrosis factor, TNF) и включают в себя белки TNF receptor-1 (TNFR1), CD95 (также называемый Fas или APO-1), death receptor 3 (DR3), TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor-1 (TRAIL-R1; также называемый DR4), TRAIL-R2 (также называемый DR5) и, наконец, DR6 [43]. Связывание лиганда с рецептором смерти вызывает конформационные изменения в структуре рецептора, в результате чего на его участке, экспонированном в цитоплазму, собирается индуцирующий гибель сигнальный комплекс (death-inducing signaling complex, DISC) [44, 45]. В состав DISC входят различные белки, в том числе т.н. «адапторные белки», которые за счет взаимодействия с мотивами продоменов проскапазы-2, -8 и -10 привлекают и удерживают данные прокаспазы в DISC. Например, адапторный белок FADD содержит в своей структуре на С-конце мотивы, взаимодействующие с цитоплазматическими участками активированных рецепторов смерти (в частности Fas), а на N-конце DED мотивы, которые взаимодействуют с DED мотивами продоменов прокаспазы-8 и -10 [46].

Запуск внутреннего пути апоптоза главным образом происходит в случаях, когда ключевые процессы жизнедеятельности клетки нарушаются в такой мере, что клетка больше не в состоянии справиться с этими нарушениями (рисунок 1). Это такие процессы как разрушение

Рисунок 1 - Каскад молекулярных превращений при апоптозе. Внешний путь: связывание лиганда с рецептором смерти вызывает конформационные изменения в структуре рецептора, в результате чего на его участке, экспонированном в цитоплазму, собирается комплекс DISC (death-inducing signaling complex). В состав данного комплекса входят адапторные белки, в частности, FADD, роль которого заключается в привлечении в комплекс молекул прокаспазы-8. Внутри DISC в результате димеризации и ограниченного автопротеолиза происходит активация каспазы-8. Внутренний путь: белки семейства BCL-2, содержащие только ВН3-домены (BH3-only proteins, BH3-белки), являются ключевыми сенсорами нарушений жизненно важных клеточных процессов. При возникновении данных нарушений происходит активация BH3-белков, главные функции которых заключаются в ингибировании анти-апоптотических и, наоборот, активации про-апоптотических белков, также являющихся представителями семейства BCL-2. К последним относятся белки Bax и Bak, которые, будучи активированными, транслоцируются из цитоплазмы в мембрану митохондрий, где они олигомеризуются и формируют поры, тем самым вызывая пермеабилизацию внешней мембраны митохондрий (ПВММ). ПВММ приводит к высвобождению в цитоплазму ряда локализованных в межмембранном пространстве митохондрий белков, среди которых цитохром С (цитС). В цитоплазме цитС связывается с адапторным белком Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1), в результате чего происходит конформационное изменение последнего, приводящее к его олигомеризации и, тем самым, к формированию комплекса, называемого апоптосомой. Apaf-1 привлекает в апоптосому молекулы прокаспазы-9, которые в данном комплексе димеризуются и после ограниченного автопротеолиза активируются. Эффекторная стадия: активированные каспазы-8 и -9, называемые инициаторными, процессируют ряд клеточных белков. В число субстратов инициаторных каспаз в первую очередь входят другие каспазы, называемые эффекторными. Каспазы-8 и -9 процессируют и активируют каспазу-3 и -7, а каспаза-6 активируется путем процессинга предшественника каспазой-3; кроме того, активированные эффекторные каспазы способны самостоятельно процессировать свои предшественники, тем самым образуя положительную петлю обратной связи в процессе активации. Эффекторные каспазы получили свое название благодаря тому, что именно они за счет процессинга чрезвычайно широкого спектра клеточных белков запускают ряд молекулярных процессов, в конечном итоге приводящих к реализации апоптоза. Стоит отметить, что внешний путь апоптоза, аналогично внутреннему, часто сопровождается ПВММ, поскольку в число субстратов каспазы-8 входит белок Bid - Bffi-белок, процессированный вариант которого активирует Bax и Bak (красная стрелка). Для создания иллюстрации были использованы элементы открытой библиотеки изображений Servier Medical Art (http://www.servier.com).

цитоскелета, необратимое повреждение геномной ДНК, чрезмерное накопление в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) агрегатов денатурированных белков, окислительный стресс вследствие продукции активных форм кислорода (АФК) и многие другие. В клетке существуют разнообразные механизмы, отслеживающие возникновение перечисленных выше событий. Ключевыми регуляторами внутреннего апоптоза являются белки семейства BCL-2 [47, 48]. Представители данного семейства имеют в своей структуре характерные домены, которые обозначаются как BH1, BH2, BH3 и BH4. Белки, содержащие только BH3-домены (BH3-only proteins, BH3-белки), являются ключевыми сенсорами нарушений жизненно важных клеточных процессов [49-51]. При возникновении данных нарушений происходит активация Bffi-белков, главные функции которых заключаются в ингибировании анти-апоптотических и, наоборот, активации про-апоптотических белков, также являющихся представителями семейства BCL-2. К последним относятся белки Bax и Bak [52, 53], которые, будучи активированными, транслоцируются из цитоплазмы в мембрану митохондрий, где они олигомеризуются и формируют поры [54], тем самым вызывая пермеабилизацию внешней мембраны митохондрий (ПВММ) [55-58]. ПВММ приводит к высвобождению в цитоплазму ряда локализованных в межмембранном пространстве митохондрий белков, среди которых цитохром С (цитС) [59]. В цитоплазме цитС связывается с адапторным белком Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1), в результате чего происходит конформационное изменение последнего, приводящее к его олигомеризации и, тем самым, к формированию комплекса, называемого апоптосомой [60]. В апоптосоме, CARD мотивы на N-конце молекул Apaf-1 взаимодействуют с CARD мотивами продоменов прокаспаз-9, тем самым привлекая и удерживая молекулы последних в комплексе.

Внутри DISC и апоптосомы происходит конформационное изменение и димеризация инициаторных каспаз, что приводит к формированию активного центра данных ферментов (рисунок 1). При этом оказывается, что протеолитическое расщепление, приводящее к отделению продомена, а также p20 и p 10 доменов, служит лишь для стабилизации димера и не является обязательным условием активации инициаторных каспаз (подробно рассмотрено в [61]). Активированные инициаторные каспазы в составе соответствующего комплекса (в DISC или в апоптосоме) осуществляют ограниченный протеолиз различных белков, тем самым передавая инициирующий апоптоз сигнал дальше по каскаду. В число субстратов инициаторных каспаз в первую очередь входят другие каспазы, называемые эффекторными [34, 39, 62]. Это каспазы-3, -6 и -7, которые играют ключевую роль в процессе апоптоза, о чем свидетельствуют результаты исследований, в которых показано, что делеция генов данных каспаз в клетках мышей приводит к возникновению в них устойчивости к апоптозу, причем как внешнему, так и внутреннему [63]. В отличие от инициаторных, эффекторные каспазы

характеризуются коротким продоменом, который не содержит в своей структуре специфичных для каспаз мотивов [32, 33, 39]. Молекулы прокаспазы-3, -6 и -7 находятся в цитоплазме в виде димеров. При активации они подвергаются ограниченному протеолизу, в результате которого происходит удаление продомена и разделение p20 и p10 доменов на соответствующие субъединицы. Таким образом, каталитически активные эффекторные каспазы представляют собой тетрамеры, состоящие из двух p20 и двух p10 субъединиц [32, 33, 39]. Инициаторные каспазы процессируют и активируют каспазу-3 и -7, а каспаза-6 активируется путем процессинга предшественника каспазой-3; кроме того, активированные эффекторные каспазы способны самостоятельно процессировать свои предшественники, тем самым образуя положительную петлю обратной связи в процессе активации [34, 39, 62]. Эффекторные каспазы получили свое название благодаря тому, что именно они за счет процессинга чрезвычайно широкого спектра клеточных белков [64-66] запускают ряд молекулярных процессов, в конечном итоге приводящих к реализации апоптоза. Субстраты эффекторных каспаз в основном вырождены, хотя при этом каждая из них действует и на собственные специфичные субстраты [67, 68].

Помимо активации эффекторных, у инициаторных каспаз есть ряд других функций. Например, внешний путь апоптоза часто сопровождается ПВММ, поскольку в число ключевых субстратов каспазы-8 входит белок Bid - Bffi-белок, процессированный вариант которого активирует Bax и Bak [69, 70] (рисунок 1). Кроме того, активированная каспаза-8 расщепляет и инактивирует киназы RIP1 и RIP3 [71-73]. Если этого не происходит, например, вследствие мутаций в гене каспазы-8, то при индукции РКС в некоторых случаях вместо апоптоза развивается гибель по пути некроптоза [74, 75], ключевыми медиаторами которого являются RIP1 и RIP3 киназы. В отличие от апоптоза, гибель клеток по пути некроптоза не сопровождается фрагментацией ДНК и контролируемым распадом клетки. Вместо этого происходит массовая пермеабилизация цитоплазматической мембраны и мембран всех органелл, что вызывает набухание клетки за счет притока воды с последующим высвобождением во внеклеточное пространство содержимого цитоплазмы [75, 76]. Вследствие этого, гибель по пути некроптоза в организме сопровождается интенсивным воспалением.

В отличие от рассмотренных выше ферментов, главная функция каспазы-1, -4, -5, -11 и -12 заключается не в индукции и развитии РКС, а в регуляции реакций иммунного ответа. Среди данных белков наиболее подробно изучена каспаза-1. Механизм ее активации напоминает механизм активации инициаторных каспаз, участвующих в апоптозе: в ответ на стимул в цитоплазме происходит формирование мультибелкового комплекса, называемого инфламмасомой, в котором молекулы прокаспазы-1 удерживаются за счет взаимодействия между CARD мотивами в их продоменах и в составе специфичных адапторных белков [34, 77,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Комиссаров, Алексей Александрович, 2019 год

Источник

Характеристика

pHAV3'

pBI-EGFP pBI-EGFP/3C

pBI-EGFP/3Cmut pCI

pEGFP-N1 pCI-EGFP pCI-3C pCI-3Cmut

индуцируемой 3Cpro клеточной гибели

плазмида, содержащая в своем составе фрагмент генома вируса гепатита А человека (штамм HAS-15), в том числе ген протеазы 3С

совместимый с системой Tet-Off вектор, позволяющий экспрессировать целевой ген и репортерный ген зеленого флуоресцентного белка EGFP под контролем регулируемого двунаправленного промотора

конструкция, обеспечивающая одновременную Tet-off регулируемую экспрессию генов EGFP и протеазы 3С вируса гепатита А человека (ЗСрго)

конструкция, обеспечивающая одновременную Tet-off регулируемую экспрессию генов EGFP и мутантной протеазы 3С вируса гепатита А человека (3Cmut), лишенной протеолитической активности путем замены Cys172 на Ala в каталитическом центре

вектор, обеспечивающий экспрессию целевого гена под управлением конститутивного промотора ранних генов цитомегаловируса человека

вектор, позволяющий экспрессировать под управлением конститутивного промотора гены EGFP и целевого белка

конструкция, обеспечивающая экспрессию гена EGFP под управлением конститутивного промотора

конструкция, обеспечивающая экспрессию гена 3С под управлением конститутивного промотора

конструкция, обеспечивающая экспрессию гена 3Cmut под управлением конститутивного промотора

ЛСФГЧ ИБХ РАН* [311]

ОойесИ

Сконструирована в данной работе

Сконструирована в данной работе

Promega ОойесИ

Сконструирована в данной работе Сконструирована в данной работе Сконструирована в данной работе

Оценка цитотоксического действия комбинации 3Cpro и системы FCUl/5-ФЦ

pCMV-RFP-P2A-EGFP-pGL3

pFCUl p3C

pFCU1-3C

pFCU1-3Cmut

pCtrl

бицистронная конструкция, обеспечивающая одновременную экспрессию флуоресцентных белков ЮТ и БОРР

моноцистронная конструкция, обеспечивающая экспрессию гена гибридного белка дрожжевых цитозиндезаминазы и фосфорибозил трансферазы (РСШ)

моноцистронная конструкция, обеспечивающая экспрессию гена ЗСрго

бицистронная конструкция, обеспечивающая одновременную экспрессию генов РСи1 и ЗС

бицистронная конструкция, обеспечивающая одновременную экспрессию генов РСи1 и ЗСти!

контрольный вектор, не содержащий в своем составе экспрессируемых генов

ЛСФГЧ ИБХ РАН*

[312]

ЛСФГЧ ИБХ РАН*

[313].

Сконструирована в данной работе

Сконструирована в данной работе

Сконструирована в данной работе

Сконструирована в данной работе

Получение антител, специфичных к 3Cpro

вектор, обеспечивающий экспрессию в бактериях целевого гена под управление промотора фага T7

конструкция, обеспечивающая экспрессию в бактериях рекомбинатной протеазы 3С с заменами Cys24^Ser и Cys172^Ala, удалением C-концевого остатка Gln, а также с шестью His на C-конце (His6)

pET23c

pET-3Cmut-H6

Novagen

Сконструирована в данной работе

* Плазмиды любезно предоставлены сотрудниками Лаборатории структуры и функции генов человека Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.

2.4 Общие методы

2.4.1 Манипуляции с нуклеиновыми кислотами

Выделение суммарной РНК из трансфицированных клеток осуществляли с помощью реагента ExtractRNA (Евроген) согласно рекомендациям производителя. Полученные после

выделения препараты обрабатывали 10 ед. ДНКазы I в течение 1 ч при 37 °С с последующей инактивацией фермента в течение 30 мин при 65 °С, после чего хранили при -70 °С.

Обратную транскрипцию препаратов РНК выполняли с помощью набора First strand cDNA synthesis kit (Fermentas) согласно рекомендациям производителя. Полученные препараты кДНК хранили при -20 °С.

Выделение плазмидной ДНК из бактериальных культур проводили с помощью набора Plasmid Miniprep (Евроген) согласно рекомендациям производителя. Полученные препараты инкубировали 30 мин при 65 °С, после чего хранили при -20 °С.

Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 и автоматического секвенатора 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems) в Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Ферментативный гидролиз и лигирование фрагментов ДНК проводили согласно рекомендациям производителей ферментов в соответствующих реакционных буферах.

Электрофорез ДНК проводили в 1,5% горизонтальном агарозном геле при напряжённости электрического поля 5-10 В/см, используя 89 мМ трис-боратный буфер, содержащий 2 мМ ЭДТА, рН 7,6. Для окрашивания ДНК агарозный гель выдерживали 5 мин в растворе бромистого этидия (10 мкг/мл). В качестве маркера молекулярной массы использовали 1 мкг смеси синтетических олигонуклеотидов 1 Kb DNA Ladder (СибЭнзим).

Выделение ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью набора Cleanup Standard (Евроген) согласно рекомендациям производителя.

Полимеразную цепную реакцию проводили c помощью амплификатора T100 (Bio-Rad). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 20 мМ Tris-HCl, 10 мМ KCl, 10 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgSO4, 0,1% Triton X-100, pH 8,8, по 0,3 мМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 100 нг ДНК-матрицы, по 10 пмоль каждого из праймеров, а также 1 ед Pfu-полимеразы. Программа реакции: 4 мин при 95 °С; 25 циклов - 30 сек при 95 °С, 1 мин при 60 °С, 1-2 мин при 72 °С; 10 мин при 72 °С.

2.4.2 Создание плазмидных экспрессионных конструкций

Для создания конструкции pBI-EGFP/3C был получен фрагмент ДНК, содержащий сайт EcoRV, ген 3Cpro и сайт NheI, методом ПЦР с использованием праймеров Bi3Cf и Bi3Cr, а также плазмиды pHAV3' в качестве матрицы. Полученный фрагмент был очищен, обработан ферментами EcoRV и NheI, после чего лигирован в вектор pBI-EGFP, предварительно обработанный теми же ферментами.

Для создания конструкции pBI-EGFP/3Cmut был использован метод ПЦР с перекрыванием праймеров. Для этого используя в качестве матрицы плазмиду pHAV3', было получено два фрагмента ДНК. Первый фрагмент был создан с помощью праймеров Ы3СГ и Ы3Ст-г, второй - с помощью праймеров Bi3Cm-f и Bi3Cr. Праймеры Ы3Ст-Г и Ы3Ст-г комплементарны друг другу и несут в своем составе мутацию ТОТ^ОСТ, соответствующую замене Cys172^■Ala, приводящей к анактивации вирусного фермента [314]. Чтобы иметь возможность отличить ген ЗСтШ; от исходного гена ЗСрго, в праймеры Bi3Cm-f и Bi3Cm-r был также введен сайт рестрикции SmaI путем замены двух нуклеотидов (CCTGGA^CCCООО) таким образом, чтобы не произошло изменения аминокислотной последовательности. Полученные таким образом фрагменты далее были очищены, а затем отожжены вместе и объединены в единую гибридную молекулу ДНК с помощью РШ-полимеразы без использования праймеров. Полученная таким образом ДНК далее была аплифицирована, используя праймеры Ы3СГ и Ы3Сг, очищена, обработана ферментами БсоЮУ и КЬе1, после чего лигирована в вектор pBI-EGFP, предварительно обработанный теми же ферментами.

Для получения плазмиды pCI-EGFP фрагмент ДНК, содержащий ген усиленного зеленого флуоресцентного белка EGFP, был вырезан из конструкции pEGFP-N1 путем обработки ферментами Крп1 и N01!, после чего очищен, а затем лигирован в состав вектора рС1, предварительно обработанного теми же ферментами.

Для создания конструкции pCI-3C был получен фрагмент ДНК, содержащий сайт БсоЫ, ген ЗСрго и сайт Крп1, методом ПЦР с использованием праймеров 3С-&Г и ЗС-геу, а также плазмиды рВ1-БОРР/3С в качестве матрицы. Полученный фрагмент был очищен, обработан ферментами БсоЫ и Крп1, после чего лигирован в вектор рС1, предварительно обработанный теми же ферментами. Плазмида рС1-3Сти была сконструирована тем же способом, за исключением того, что в качестве источника гена ЗСти использовался вектор рВ1-БОРР/3Сти1.

Для создания конструкции pFCU1-3C было получено два фрагмента ДНК методом ПЦР. Первый фрагмент был амплифицирован из плазмиды рРСШ, любезно предоставленной сотрудниками Лаборатории структуры и функции генов человека (ЛСФГЧ) ИБХ РАН [313], с использованием праймеров РСИ_Г и РСИ-2Л_г. Данный фрагмент содержал сайт НтёШ, ген РСИ1, а также половину последовательности, кодирующей Р2Л-пептид вируса Тешена свиней. Второй фрагмент был амплифицирован из плазмиды рВ1-БОРР/3С с помощью праймеров 2Л-3С_Г и 3С_г и содержал вторую половину последовательности Р2Л-пептида, ген ЗСрго и сайт RigI. Оба фрагмента были очищены, обработаны ферментами НтёШ или RigI, фосфорилированы, а затем лигированы в состав предварительно обработанного двумя указанными ферментами вектора рСМУ-ЮРР-Р2Л-БОРР-рОЬ3 [312], любезно

предоставленного сотрудниками ЛСФГЧ ИБХ РАН. Плазмида pFCU1-3Cmut была сконструирована тем же способом, за исключением того, что в качестве источника гена 3Cmut использовался вектор pBI-EGFP/3Cmut.

Для создания плазмиды p3C был использован метод ПЦР с перекрыванием праймеров. Используя pFCU1-3C в качестве матрицы, было получено два фрагмента ДНК. Первый фрагмент содержал сайт PstI и последовательность химерного интрона (Int) и был получен с помощью праймеров Int_f и Int_r. Второй фрагмент содержал короткий участок последовательности Int, ген 3 Cpro, сигнал полиаденилирования вируса SV40, а также сайт HpaI, и был получен с использованием праймеров 3C_2_f и 3C_2_r. Полученные фрагменты были очищены, а затем отожжены вместе и объединены в единую гибридную молекулу ДНК с помощью Pfu-полимеразы без использования праймеров. Полученная таким образом ДНК далее была аплифицирована, используя праймеры Int_f и 3C_2_r, очищена, обработана ферментам PstI и HpaI, после чего лигирована в состав плазмиды pFCU1-3C, предварительно обработанной теми же ферментами.

Для создания плазмиды pCtrl с помощью ПЦР был получен фрагмент ДНК, содержащий сайт PstI, последовательность Int, а также сайт ApaI. Для этого использовались праймеры Int_f и Int_2_r, а также плазмида pFCU1-3C в качестве матрицы. Полученный фрагмент, после очистки, был обработан ферментами PstI и ApaI, а затем лигирован в состав плазмиды pFCU1-3C, предварительно обработанной теми же ферментами.

Для получения плазмиды pET-3Cmut-H6 был использован метод ПЦР с перекрыванием праймеров. Данная конструкция обеспечивает экспрессию в клетках E. coli рекомбинатной протеазы 3С с заменами Cys24^Ser и Cys172^Ala, удалением C-концевого остатка Gln, а также с шестью His на C-конце (His6). Для создания конструкции с помощью ПЦР было получена два фрагмента ДНК, используя плазмиду pBI-EGFP/3Cmut в качестве матрицы. Первый фрагмент содержал сайт NdeI и часть гена 3Cmut с мутацией Cys24^Ser и был получен с помощью праймеров 3C-Nde и 3Cmut_r. Второй фрагмент, содержащий остальную часть гена 3Cmut с мутацией Cys172^Ala, последовательность His6, а также сайт HindIII, был получен с помощью праймеров 3Cmut_f и 3C-Hind. Полученные фрагменты были очищены, а затем отожжены вместе и объединены в единую гибридную молекулу ДНК с помощью Pfu-полимеразы без использования праймеров. Полученная таким образом ДНК далее была аплифицирована, используя праймеры 3C-Nde и 3C-Hind, очищена, обработана ферментами NdeI и HindIII, после чего лигирована в состав плазмиды pET23c, предварительно обработанной теми же ферментами.

Структура генов в составе всех полученных конструкций была подтверждена секвенированием.

2.4.3 Манипуляции с белками

Электрофорез белков проводили в вертикальном 12,5% полиакриламидном геле в соответствии с Laemmli [315] если не указано иначе. В качестве маркеров молекулярных масс использовали бета-галактозидазу (116 kDa), бычий сывороточный альбумин (66,2 kDa), овальбумин (45,О kDa), лактатдегидрогеназу (З5,О kDa), РНКазу Bsp98I (25,0 kDa), бета-лактоглобулин (18,4 kDa) и лизоцим (14,4 kDa) (ThermoFisher Scientific).

Иммуноблоттинг проводили, используя лизаты клеток. Для этого клетки центрифугировали 5-1О мин при 300g, после чего осадок ресуспензировали до концентрации 10 000-20 ООО клеток/мкл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с добавлением коктейля ингибиторов протеаз (О,ОО1% по объему) (Sigma). К полученной суспензии, содержащей 100 000-500 ООО клеток, добавляли равный объем буфера для нанесения образцов (125 мМ трис-HCl, 5 мМ ЭДТА, 2% SDS, 5% глицерин, 5% ß-меркаптоэтанол, О,О1% бромфеноловый синий, pH 8.О), полученную смесь инкубировали 5 мин при 96 °С, после чего вносили в лунки полиакриламидного геля 12% TGX Stain-Free для проведения электрофореза. После фореза белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad) с помощью прибора Trans-Blot Turbo (Bio-Rad). Белки на мембране визуализировали с помощью системы Stain-free (BioRad) и прибора ChemiDoc MP (Bio-Rad). Далее мембраны блокировали путем инкубации в течение 18-24 ч в 5% растворе обезжиренного молока (Bio-Rad) с добавлением О,1% Tween 2О, а затем инкубировали с первичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре. После двукратной отмывки 25О мл ФСБ, содержащего О,1% Tween 2О, мембраны инкубировали с вторичными антителами (1 мг/мл), конъюгированными с пероксидазой хрена, в течение ЗО мин при комнатной температуре. Иммуноположительные полосы визуализировали с помощью субстрата Clarity Western ECL (Bio-Rad) в соответствии с рекомендациями производителя. Хемилюминесцентный сигнал детектировали с помощью прибора ChemiDoc MP. Для иммуноокрашивания 3Cpro и 3Cmut в качестве первичных антител использовали разбавленную в ЗОО раз сыворотку крови кроликов, иммунизированных рекомбинатной 3Cmut, а в качестве вторичных - конъюгированные с пероксидазой хрена антитела овцы, специфичные к иммуноглобулинам кролика (ИМТЕК). Для иммуноокрашивания FCU1 в качестве первичных использовали антитела овцы, специфичные к дрожжевой цитозиндезаминазе (AbD Serotec), в разведении 1:5ОО, а в качестве вторичных - конъюгированные с пероксидазой хрена антитела кролика, специфичные к иммуноглобулинам овцы (ИМТЕК).

Нормализацию на общее количества белка выполняли в соответствии с рекомендациями производителя системы Stain-Free [31б]. Кратко, с помощью программы Image Lab (Bio-Rad) для каждой дорожки нитроцеллюлозной мембраны, визуализированной с помощью ChemiDoc MP, была посчитана суммарная интенсивность флуоресценции окрашенных системой Stain-Free

белков. Полученные значения были использованы для нормализации хемилюминесцентных сигналов иммуноположительных полос, а также в качестве контроля белковой нагрузки треков.

2.4.4 Работа с бактериями и эукариотическими клетками

Выращивание бактериальных культур осуществляли при 37 °С в питательной среде Luria-Bertani (LB, 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, pH 7,5) при интенсивном перемешивании или на твердой среде L-агар (LB с добавлением 15 г/л агара). Для селекции в среду добавляли 200 мкг/мл ампициллина или 50 мкг/мл канамицина.

Введение ДНК в клетки Escherichia coli выполняли методом электропорации с помощью электропоратора MicroPulser 165-2100 (Bio-Rad) согласно рекомендациям производителя в кюветах с зазором между электродами равным 0,2 см. Селекцию и дальнейшее культивирование клонов трансформированных клеток проводили на твердой среде L-агар, содержащей соответствующий антибиотик.

Клетки млекопитающих культивировали в 96, 48 или 6-луночных планшетах (SPL), POC-ячейках (PeCon), а также в культуральных флаконах с площадью поверхности 25 и 75 см2 (Corning) при 37 °С в атмосфере 5% CO2 в питательной среде DMEM/F12 с добавлением 10% ЭСКТ и 0,3 мг/мл глутамина. Для культивирования клеток, модифицированных системой TetOff, в питательную среду дополнительно добавляли G418 до концентрации 0,2 мг/мл. Подсчет клеток в суспензии осуществляли с помощью автоматического счетчика Countess II FL (Thermo Fisher Scientific).

Трансфекцию эукариотических клеток плазмидной ДНК проводили с использованием трансфицирующих агентов Lipofectamine 2000 (для линии A549) или Turbofect (для линий HEK293 и HeLa). Клетки культивировали в 6, 48 или 96-луночных планшетах, а также в POC-ячейках в течение 24 ч до достижения клетками 80-90% конфлюэнтности. Комплексы плазмидной ДНК с трансфицирующими агентами готовили в бессывороточной среде Opti-MEM согласно протоколу производителя, а затем добавляли к клеткам. В случае агента Lipofectamine 2000 через 4 ч после трансфекции (п.т.) производили замену среду. Далее трансфицированные клетки инкубировали в течение 9-168 ч со сменой среды каждые 48 ч.

Оценку жизнеспособности клеток осуществляли в 96-лучночных планшетах. Для этого удаляли среду и вносили по 100 мкл ФСБ в лунку, после чего в каждую лунку добавляли по 20 мкл ФСБ с 2 мг/мл MTS и 50 мкг/мл феназинметасульфата. После 1 часа инкубации при 37 °С в атмосфере 5% CO2 в лунках измеряли значение оптической плотности среды при 490 нм (А490) с помощью пробора Infinite M200 PRO (Tecan). Для каждой клеточной линии значения А490, полученные для трансфицированных клеток, нормировали на значения для нетрансфицированных клеток.

Иммуноокрашивание белка AIF проводили в клетках, выращенных в черном 96-луночном планшете с прозрачным дном (PerkinElmer). Через 18 часов п.т. из лунок отбирали среду, затем клетки промывали ФСБ и фиксировали метанолом в течение ЗО минут на льду. Фиксированные клетки дважды промывали ФСБ, после чего инкубировали ЗО мин в блокирующем буфере (ФСБ, 5% ЭСКТ, О,25% Triton X^), а затем инкубировали в течение 2О ч при 4 °С в блокирующем буфере, содержащем антитела IgG козы, специфичные к белку AIF человека (Santa Cruz Biotechnology), в разведении 1:2ОО. После этого клетки дважды промывали ФСБ и инкубировали в блокирующем буфере, содержащем специфичные к иммуноглобулинам IgG козы антитела осла, конъюгированные с красителем Alexa Fluor 5б8 (ThermoFisher Scientific), в разведении 1:4ОО в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем клетки дважды промывали ФСБ, добавляли ФСБ, содержащий 2 мкг/мл красителя Hoechst 33342, и после 5 минут инкубации анализировали с методом флуоресцентной микроскопии.

Анализ клеток методом флуоресцентной микроскопии проводили в POC-ячейках или в черном 96-луночном планшете с прозрачным дном с помощью конфокального микроскопа Axiovert 1ОО LSM510 META (Carl Zeiss) в центре коллективного пользования Института молекулярной генетики РАН. Изображения получали с помощью объективов EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27, EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC M27 и EC Plan-ApoChromat 63x/0.75 Oil Korr (Carl Zeiss). Для регистрации флуоресценции белков и красителей были использованы следующие конфигурации оптической системы (приведены значения в нм в формате «длина волны возбуждающего излучения/диапазон длин волн эмиссии»): 4О5/45О-48О для Hoechst 33342; 488/505-53О для EGFP; 54З/56О-615 для родамина 123 и AlexaFluor 568; 543/580-68О для реагента FLICA.

Цитометрические исследования клеток выполняли с помощью проточного цитофлуориметра BD Accuri C6 (BD Biosciences). Клетки в 48 или 96-луночных планшетах инкубировали 2О мин при 37 °С в атмосфере 5% CO2 в питательной среде, содержащей 5О мкМ FITC-VAD-fmk, 5О нМ Mito и/или 7,5 мкМ AOr, после чего выдерживали при 37 °С в растворе Версена до полной потери клетками распластанности (1О-2О мин). Полученную клеточную суспензию с концентрацией 1ОО-1ООО клеток/мл анализировали на приборе. Если было необходимо, в суспензию добавляли PI до концентрации О,З мкМ. Для регистрации флуоресцентного сигнала были использованы следующие конфигурации оптической системы (приведены значения в нм в формате «длина волны возбуждающего излучения/диапазон длин волн эмиссии»): 488/518-548 для EGFP и FITC-VAD-fmk; 488/600-62О для PI; 488/662-687 для AOr; 640/670-75О для Mito. Для каждого образца было проанализировано 1О ООО событий, которые по параметрам прямого и бокового светорассеяния соответствовали отдельным клеткам.

2.5 Получение антител, специфичных к протеазе 3С вируса гепатита А человека

Клетки E. coli штамма BL-21 (DE3), трансформированные плазмидой pET-3Cmut-H6, выращивали в 200 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, при 37 °C при постоянном перемешивании до значения оптической плотности при 600 нм (А600) равного 0,40,6. Далее в среду добавляли изопропил^-О-тиогалактопиранозид до концентрации 0,5 мМ, после чего клетки культивировали при 16 °C в течение 17-20 ч. После этого суспензию клеток центрифугировали 30 мин при 4000g, осадок ресуспензировали в 5 мл буфера для хроматографии (50 мМ Tris-HCl, 300 мМ NaCl, pH 8,0) и обрабатывали ультразвуком в течение 20 с (1 с импульса/1 с паузы). После центрифугирования в течение 15 мин при 10 000g, супернатант наносили на колонку, содержащую Ni-NTA агарозу, предварительно уравновешенную буфером для хроматографии. Далее колонку промывали тем же буфером, но содержащим 20 мМ имидазол. Элюцию протеазы 3С проводили с использованием буфера, содержащего 100 мМ имидазола. Фракции элюата, содержащие 3Cmut согласно данным электрофоретического анализа, объединяли и концентрировали на мембране Ultracel 10 kDa (Millipore). Полученный образец наносили на колонку Superdex 75 HR 10/30 (GE Healthcare), уравновешенную буфером для хроматографии. Элюцию проводили тем же буфером при скорости потока 0,35 мл/мин. Фракции, содержащие электрофоретически гомогенную 3Cmut, объединяли и передавали в НПО "БиоТест Системы" для иммунизации кроликов в соответствии со стандартным протоколом производителя.

2.6 Оценка цитотоксического действия 3Cpro в зависимости от уровня экспрессии ее

гена

Клетки HEK293 культивировали в 96-луночном планшете до достижения 80-90% конфлюэнтности, после чего трансфицировали с помощью агента TurboFect. Для приготовления трансфекционной смеси (ТС) к 20 мкл среды Opti-MEM добавляли 200 нг ДНК и 0,4 мкл TurboFect, полученную смесь инкубировали 20 мин при комнатной температуре, а затем вносили в лунку 96-леночного планшета. Через 24 ч п.т. метаболическую активность клеток анализировали с помощью реагента MTS. Чтобы обеспечить разный уровень экспрессии гена 3Cpro, при трансфекции в ТС вносили разное количество конструкции pCI-3C, при этом выдерживая постоянным общее количество ДНК в ТС, равное 200 нг, за счет добавления плазмиды pUC19 (New England Biolabs). Используя ген EGFP в качестве репортера, с помощью методов ПЦР в реальном времени и проточной цитометрии нами было показано в отдельном исследовании, что данный подход позволяет варьировать как количество целевого трансгена, доставляемого в клетки, так и уровень его экспрессии [317].

2.7 Исследование эффекта свидетеля, сопровождающего гибель клеток вследствие

экспрессии 3Cpro

Клетки HEK293 культивировали в 96- или 6-луночном планшете до достижения 8О-90% конфлюэнтности, после чего трансфицировали конструкцией pCi-3C с помощью агента TurboFect согласно рекомендациям производителя. Через 24 ч п.т. ростовую среду, собирали и центрифугировали 1О мин при 400g. Полученный супернатант, обозначенный в настоящей работе как среда 29З/ЗС, отбирали и хранили при -20 °С.

Для оценки цитотоксического действия среды 29З/ЗС, клетки HEK293, HeLa и A549 культивировали в 96-луночном планшете до достижения 8О-9О% конфлюэнтности, после чего заменяли ростовую среду на 29З/ЗС, и через 24 ч после замены оценивали метаболическую активность клеток с помощью реагента MTS.

2.8 Обработка и анализ полученных данных

Статистическую обработку экспериментальных данных выполняли с помощью программ MS Excel 2007 (Microsoft Corporation), Statistica 6.0 (StatSoft) и SigmaPlot 1О.О (Systat Software Inc.). Изображения агарозных и полиакриламидных гелей, а также нитроцеллюлозных мембран, обрабатывали и анализировали с помощью программы Image Lab (Bio-Rad). Изображения, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, обрабатывали и анализировали с помощью программ LSM Image Examiner и AxioVision 40 (Carl Zeiss). Данные, полученные с помощью метода проточной цитометрии, анализировали с использованием программ Accuri C6 software (BD Biosciences) и FlowJo (LLC).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Характеристика клеточной гибели, вызываемой протеазой 3С вируса гепатита А

человека

Протеазы 3С играют важную роль в жизненном цикле пикорнавирусов. Помимо основной функции, заключающейся в процессинге вирусных пробелков для продукции их зрелых форм, протеазы 3С выполняют также ряд побочных функций за счет гидролиза собственных белков клетки. В частности, данные протеазы переключают аппарат экспрессии преимущественно на репликацию вируса, а также блокируют запуск противовирусных иммунных реакций. Все это нарушает нормальное функционирование клетки-хозяина и зачастую приводит к ее гибели на поздних стадиях инфекции, что облегчает высвобождение вирусных частиц во внешнюю среду.

Известно, что протеаза 3С вируса гепатита А человека (ЗСрго) является единственным протеолитическим ферментом, закодированным в вирусном геноме, и способна нарушать процессы транскрипции и трансляции в клетке. Ранее нами было впервые показано, что ЗСрго обладает цитотоксической активностью при экспрессии в клетках человека. Также было обнаружено, что клетки, гибнущие вследствие действия ЗСрго, приобретают ранее неописанную морфологию. Полученные результаты позволяют предположить, что данная гибель либо происходит по новому неизученному механизму, либо является вариантом РКС известного типа, но развивающегося по ранее неизвестному пути.

Поэтому в рамках настоящей работы мы изучили и охарактеризовали с морфологической и биохимической точек зрений клеточную гибель, индуцируемую при транзиентной экспрессии гена ЗСрго в клетках человека.

3.1.1 Экспрессия и оценка цитотоксического действия 3Сpro с помощью системы

Tet-Off

Принимая во внимание потенциальную цитотоксичность ЗСрго, для регуляции экспрессии вирусного фермента была использована экспериментальная модель, основанная на применении клеток линий А549 и Са1и-1, модифицированных коммерческой системой Те^оГГ (далее в тексте обозначены как А5494е1 и Са1и-Ие1;, соответственно). Данная система обеспечивает подавление экспрессии целевого гена при наличии в среде тетрациклина или доксициклина [318]. Чтобы иметь возможность визуализировать в трансфицированной культуре клетки, экспрессирующие ЗСрго, нами были получены генетические конструкции на базе вектора рВ1-БОБР, совместимого с системой Те1;-оГ:Г. Наличие в данном векторе специфического двунаправленного промотора позволяет полученным конструкциям обеспечивать в эукариотических клетках одновременную экспрессию целевого гена, а также репортерного гена зеленого флуоресцентного белка БОБР. Благодаря способности БОБР флуоресцировать в

зеленом спектре при облучении светом с длиной волны 488 нм, в трансфицированной культуре можно легко идентифицировать клетки, в которых происходит экспрессия и гена интереса.

На базе pBI-EGFP были получены две экспрессионные конструкции (рисунок 3А), в состав которых был клонирован ген нативной 3Cpro (pBI-EGFP/3C) или мутантной протеазы 3С (3Cmut), лишенной протеолитической активности путем замены аминокислотного остатка Cys172 на Ala в каталитическом центре фермента (pBI-EGFP/3Cmut). Данные конструкции были введены в клетки линий A549-tet и Calu-1-tet с помощью коммерческого трансфицирующего агента Lipofectamine 2000 (ThermoFisher Scientific), после чего экспрессия генов 3Cpro и 3Cmut на уровне мРНК была подтверждена с помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (рисунок 3Б). Также нами было показано, что наличие в культуральной среде доксициклина в концентрации 10-20 мкг/мл обеспечивает эффективное подавление экспрессии репортерного и целевого генов (данные не приведены).

Чтобы оценить цитотоксический эффект, обусловленный экспрессией 3Cpro, были проанализированы изменение во времени количества и морфология EGFP-экспрессирующих клеток в трансфицированных культурах. Клетки A549-tet и Calu-1-tet, трансфицированные исходным вектором pBI-EGFP, характеризовались типичной для данных клеточных линий морфологией (рисунок 4В), а доля клеток, демонстрирующих зеленую флуоресценцию, постепенно увеличивалась и к концу эксперимента (144 ч после трансфекции) достигало 2530 % (рисунок 4A, Б, прерывистые линии). При трансфекции же клеток конструкцией pBI-EGFP/3C доля зеленых клеток сначала увеличивалась, достигая максимума к 48 ч после трансфекции (п.т.), а затем снижалась, и к 96 часу п.т. в трансфицированных культурах наблюдались лишь единичные EGFP-экспрессирующие клетки (рисунок 4A, Б, сплошные линии). При этом во всех временных точках значительная доля клеток, демонстрирующих зеленую флуоресценцию, характеризовалась измененной морфологией: клетки либо теряли адгезию к подложке и приобретали округлую форму (рисунок 4Г), либо оставались

SV40 р(Л)

pBI-EGFP/ЗС

D-C

EGFP Pbi-1 ЗСрго

pBI-EGFP/3Cmut

P-Klbn р(Л)

SV40 р(А) EGFP

Phi-I

3Cmut ß-glbn р(А)

А

A549-tet Calu-1-tct

■■■ ■■■

■■■■■

3C/3Cmut мРНК

GAPDH мРНК

Рисунок 3 - Структура конструкций рБ1-ЕОРР/3С и рБ1-ЕОБР/3Сши1 и анализ экспрессии целевых генов. (А) Схема строения экспрессионных кассет используемых конструкций: РЫ-1 - двунаправленный тетрациклин-чувствительный промотор; 3Срго/3Сши1 - ген нативной/мутантной протеазы 3С вируса гепатита А человека (звездочкой обозначена мутация, соответствующая аминокислотной замене Су8172-Л1а); ЕОБР - ген усиленного зеленого флуоресцентного белка; р-g1bn р(Л) - сигнал полиаденилирования мРНК гена р-глобина человека; SV40 р(А) - сигнал полиаденилирования мРНК поздних генов вируса SV40. (Б) Анализ экспрессии целевых генов с помощью ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) через 48 часов после трансфекции клеток Л549-и Са1и-14е1 векторами рБ1-ЕОРР (Контроль), рВ1-ЕОБР/3С (ЕОБР-ЗС) и рВЬЕОБР/ЗСши! (ЕОРР-3Сши1). При постановке ОТ-ПЦР ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ОЛРОИ) был использован в качестве референсного.

Нормальная морфология

Округлившиеся клетки

Вакуоли зированные клетки

Рисунок 4 - Цитотоксическое действие 3Cpro в трансфицированных культурах. Клетки трансфицировали конструкциями pBI-EGFP (серые точки, прерывистая линия) или pBI-EGFP/3C (черные точки, сплошная линия), после чего каждые 24 ч анализировали количество клеток, демонстрирующих зеленую флуоресценцию (А и Б), а также их морфологию (В, Г, Д). Результаты представлены как среднее значение двух независимых экспериментов с тремя повторами в каждом, планками обозначено стандартное отклонение. EGFP+ - EGFP-экспрессирующие клетки.

распластанными, но демонстрировали интенсивную цитоплазматическую вакуолизацию (рисунок 4Д). В первом случае морфология клеток весьма напоминает апоптотическую. Что же касается цитоплазматической вакуолизации, то данная морфология не является обычной для данных клеточных линий, однако встречается in vivo и in vitro при инфекции вирусом гепатита А человека или при транзиентной экспрессии некоторых его белков [319-323]. При анализе клеточных культур, трансфицированных конструкцией pBI-EGFP/3C, с помощью флуоресцентной микроскопии и цейтраферной съёмки (см. Additional file 1: Supplemental video в [324]) было обнаружено, что в цитоплазме EGFP-позитивных клеток сначала формируются многочисленные вакуоли, которые сохраняются в течение длительного времени. Однако затем, незадолго до открепления вакуолизированной клетки от субстрата, вакуоли относительно быстро исчезают, а клетка приобретает округлую форму и, в конечном счете, теряет зеленую флуоресценцию. В то же время, при трансфекции клеток конструкцией pBI-EGFP/3Cmut аналогичного цитотоксического эффекта не наблюдалось, а морфология и доля EGFP-позитивных клеток были такими же, как в культурах, трансфицированных вектором pBI-EGFP

(данные не приведены). Это указывает на то, что цитотоксический эффект 3Cpro напрямую зависит от протеолитической активности вирусного фермента.

Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что индивидуальная экспрессия 3Cpro в системе Tet-Off индуцирует гибель клеток человека. При этом гибель значительной доли клеток сопровождается интенсивной цитоплазматической вакуолизацией, однако, в конечном счете, все экспрессирующие 3Cpro клетки открепляются от субстрата и приобретают морфологию, напоминающую апоптотическую. Также в результате эксперимента было установлено, что в используемой нами экспрессионной системе индуцируемая 3Cpro клеточная смерть развивается в течение достаточно длительного времени, поэтому регуляция экспрессии вирусного фермента не требуется. В связи с этим все последующие эксперименты осуществлялись без использования доксициклина.

3.1.2 Экспрессирующие 3Cpro клетки характеризуются нарушением

функционирования митохондрий

Мы проанализировали некоторые биохимические характеристики трансфицированных клеток A549-tet и Calu-1-tet. С использованием красителя родамина 123, который селективно накапливается в матриксе метаболически активных митохондрий [325], было показано, что митохондрии клеток, трансфицированных вектором pBI-EGFP, в течение всего периода наблюдения (72 ч п.т.) характеризовались нормальным размером и наличием трансмембранного потенциала (рисунок 5А). При трансфекции конструкцией pBI-EGFP/3C, через 48 ч п.т. в большинстве EGFP-экспрессирующих клеток обнаруживалось «разбухание» митохондрий при сохранении трансмембранного потенциала (рисунок 5Б). К 72 ч п.т. практические все зеленые клетки характеризовались разбуханием митохондрий и менее интенсивным окрашиванием родамином 123 (рисунок 5В), что свидетельствует о снижении в них трансмембранного потенциала. Полученные результаты указывают на постепенное нарушение функционирования митохондриального компартмента в 3Cpro-экспрессирующих клетках.

3.1.3 Гибель клеток, экспрессирующих 3Cpro, сопровождается конденсацией

хроматина и не зависит от каспаз, кальпаинов и катепсинов

При окрашивании ядер трансфицированных клеток A549-tet и Calu-1-tet с помощью красителя Hoechst 33342, который способен проходить через мембраны и интеркалировать в ДНК [326], было обнаружено, что через 72 ч п.т. среди EGFP-позитивных клеток практически все округлившиеся и большинство вакуолизированных клеток характеризуются четко выраженной конденсацией хроматина и имеют деформированные и/или фрагментированные ядра (рисунок 6 А, В, белые и зеленые стрелки). Приобретение клетками округлой формы, снижение трансмембранного потенциала митохондрий и конденсация хроматина являются

Совм ЕСГР Род123 Совм ЕСРР Род123

Рисунок 5 - Исследование состояния митохондрий в ЗСрго-экспрессирующих клетках с помощью красителя родамина 123. (А) Клетки А549-1й и Са1и-Ые1 через 48 ч п.т. конструкцией рЫ-БвРР; (Б) и (В) клетки А549-и Са1и-Ые1 через 48 и 72 ч п.т., соответственно, конструкцией рЫ-БвРР/ЗС. Род123 - канал флуоресценции родамина 123; БОБР - канал флуоресценции БОБР; Совм - совмещение каналов БОБР и Род123.

характерными признаками апоптотической гибели, которая в подавляющем большинстве случаев сопровождается активацией каспаз [4]. Однако, используя реагент БЫСЛ, представляющий собой конъюгированный с флуоресцентным красителем ингибитор каспаз, способный проникать через цитоплазматическую мембрану и ковалентно связываться с активным центром данных протеаз, было показано, что в культурах, трансфицированных конструкцией рВ1-БОБР/3С, активация каспаз происходила только в единичных БОБР-экспрессирующих клетках (рисунок 6А, Б, Г, красные стрелки). Известно, что в некоторых случаях роль каспаз при апоптозе могут выполнять другие клеточные цистеиновые протеазы, в частности, катепсины и кальпаины (см. раздел Обзор литературы). Чтобы проверить вовлеченность данных ферментов в развитие индуцируемой ЗСрго клеточной гибели, клетки Л5494е1 и Са1и-Ые1;, трансфицированные вектором рВ1-БОБР или конструкциями рВ1-БОБР/3С и рВ1-БОБР/3Сши1;, культивировали в присутствии 2-БЛ-Гшк и 2-УЛВ-1шк - необратимых ингибиторов цистеиновых протеаз. В результате эксперимента было установлено, что данные ингибиторы не оказывают влияния ни на выживаемость клеток (рисунок 7А), ни на цитоплазматическую вакуолизацию (рисунок 7Б). Это указывает на то, что каспазы, кальпаины и катепсины не вовлечены в развитие индуцируемой ЗСрго клеточной гибели.

А \

✓ ✓

Ч

\ /

/ ✓

V

V ✓

t /

Рисунок 6 - Исследование состояния хроматина и активации каспаз в 3Cpro-экспрессирующих клетках. Клетки Calu-1-tet, трансфицированные конструкцией pBI-EGFP/3C, через 72 ч п.т. были окрашены с помощью красителя Hoechst 33342 и флуоресцентного ингибитора каспаз FLICA. Стрелками указаны: голубыми - EGFP-экспрессирующие клетки с нормальной морфологией; белыми и зелеными -вакуолизированные и округлившиеся, соответственно, EGFP-экспрессирующие клетки с конденсированным хроматином без активации каспаз; красными - EGFP-экспрессирующие клетки с активированными каспазами; желтыми - клетки, демонстрирующие конденсацию хроматина и активацию каспаз, но не экспрессирующие EGFP. Каналы флуоресценции: А -совмещенный; Б - EGFP, В - Hoechst 33342, Г - FLICA.

3.1.4 Вакуолизация и гибель экспрессирующих 3Срго клеток происходит не по механизму некроптоза

Цитоплазматическая вакуолизация может наблюдаться при гибели клеток по пути некроптоза - каспазо-независимого типа РКС [327], в котором ключевую роль играют RIP1 и RIP3 киназы [328]. В связи с этим ингибирование RIP1 и RIP3 киназ при некроптозе, например, селективным ингибитором некростатином-1, предотвращает клеточную гибель. Поэтому мы проанализировали влияние данного ингибитора RIP-киназ на выживаемость и вакуолизацию клеток A549-tet и Calu-1-tet, трансфицированных конструкцией pBI-EGFP/3C. В результате эксперимента было показано, что культивирование трансфицированных клеток в присутствии 50 мкМ некростатина-1 не приводило к блокированию клеточной гибели и исчезновению вакуолей в цитоплазме 3Cpro-экспрессирующих клеток (рисунок 7А, Б). Эти данные указывают на то, что индуцируемая ЗСрго клеточная гибель развивается не по пути некроптоза.

3.1.5 Вакуоли экспрессирующих 3Срго клеток имеют неописанные ранее характеристики

Суммируя полученные на данном этапе результаты, можно сказать, что индуцируемая 3Cpro клеточная смерть является каспазо-независимой и, по-видимому, не является разновидностью ни апоптоза, ни некроптоза. В противоположность полученных нами данных, до недавнего времени, когда цитотоксическое действие протеаз 3С пикорнавирусов было охарактеризовано, данные ферменты вызывали гибель клеток по пути классического каспазо-зависимого апоптоза [8-10], и только в начале 2018 года была опубликована работа, в которой

А А549-1е1 Са1и-Ые1

рВ1 ЕвЕР рВ1 ЕСЕР/ЗСтШ рВ1 ЕСЕР/ЗС рВ1 ЕвЕР рВ1 ЕСЕР/ЗСтШ рВ1 ЕвЕР/ЗС

Б А549 ^ + рВТ-ЕОРР/ЗС Са1и-1Ш + рВ1-ЕСРР/ЗС

Рисунок 7 - Влияние ингибиторов различных ферментов на индуцируемую ЗСрго клеточную гибель. Клетки А5494е1 и Са1и-14е1 трансфицировали указанными конструкциями, а затем культивировали с указанными ингибиторами. Через 72 ч п.т. с помощью флуоресцентной микроскопии анализировали количество (А) и морфологию (Б) клеток, экспрессирующих БОБР. Контроль - клетки без ингибиторов.

показано, что экспрессия протеазы 3С риновируса вызывает каспазо-независимую смерть клеток, сопровождающуюся некротической морфологией и не зависящей от активности RIP киназ [11]. При этом цитоплазматической вакуолизации, аналогичной обнаруженной нами, в опубликованных работах не наблюдалось.

Мы провели подробный анализ происхождения и свойств цитоплазматических вакуолей, образующихся при экспрессии 3Cpro. Данные результаты были получены совместно с Андреем Владимировичем Шубиным и подробно представлены в его диссертационной работе, а также в совместной статье [324]. Было показано, что вакуоли имеют неописанные ранее характеристики и формируются за счет атипичного слияния нескольких видов органелл эндосомально-лизосомального компартмента. Вероятно, данный феномен отражает ранее не известные аспекты взаимодействия вируса гепатита А человека с клеткой. Кроме того, нами было обнаружено, что вакуоли сопровождают клеточную гибель, но не являются необходимыми для ее развития.

Таким образом, 3Cpro, в отличие от большинства других протеаз 3С пикорнавирусов, индуцирует каспазо-независимую клеточную гибель, которая сопровождается морфологией, ранее не встречающейся в случае известных типов РКС. Вероятно, это может указывать на наличие у данного вирусного фермента новой ранее неизвестной функции. С другой стороны, наблюдаемая морфология может отражать тот факт, что индуцируемая 3Cpro гибель клеток либо является новым вариантом РКС известного типа, либо происходит по новому ранее не охарактеризованному пути. В этой связи изучение механизма данной клеточной смерти позволит получить новые данные, которые будут способствовать расширению наших представлений о механизмах РКС и функциях вирусных протеаз.

3.1.6 Разработка экспериментальной системы для конститутивной экспрессии

3Cpro и оценки цитотоксического действия фермента

На следующем этапе работы мы провели характеристику индуцируемой 3Cpro клеточной гибели с целью установить ее принадлежность к какому-либо из известных типов РКС. Для этого нами было принято решение разработать новую экспериментальную систему и отказаться от системы Tet-Off по нескольким причинам. Во-первых, нами было показано, что индуцируемая 3Cpro клеточная гибель развивается в течение достаточно длительного времени, а подавление экспрессии целевого гена в первые часы после трансфекции лишь сдвигает во времени проявление цитотоксического эффекта, в связи с чем регулировать экспрессию 3Cpro не требуется. Во-вторых, данная экспериментальная система обеспечивает экспрессию целевого гена только в Tet-Off-модифицированных клеточных линиях, что значительно усложняет процесс исследования и ограничивает выбор линий клеток для работы. И, наконец, в-третьих,

постоянное присутствие в клетках репортерного флуоресцентного белка затрудняет применение флуоресцентных методов исследований, поскольку требует постоянной компенсации флуоресцентного сигнала и, главное, не позволяет использовать для исследования не только сам EGFP, но и ряд красителей, имеющих схожий спектр эмиссии.

Новая экспериментальная система основана на использовании коммерческого плазмидного вектора pCI (Promega, США). В состав экспрессионной кассеты данного вектора входят конститутивный промотор ранних генов цитомегаловируса человека, химерный интрон и сигнал полиаденилирования вируса SV40, которые вместе обеспечивают высокий уровень экспрессии трансгена в эукариотических клетках. На базе плазмиды pCI были получены две экспрессионные конструкции: pCI-3C, которая содержит в своем составе ген активной 3Cpro, и pCI-3Cmut, которая несет ген инактивированного вирусного фермента 3Cmut (рисунок 8А). С использованием коммерческих трансфицирующих агентов TurboFect и Lipofectamine 2000 конструкции pCI-3C и pCI-3Cmut были введены в клетки линий НЕК293, HeLa и A549. Методом иммуноблотинга было показано, что через 15 ч п.т. полученные векторы обеспечивают в клетках всех линий накопление продуктов экспрессии соответствующих генов (рисунок 8Б). При этом было отмечено, что в случае клеток линии HEK293 продукция 3Cpro была выше по сравнению с другими клеточными линиями.

Нами было проанализировано развитие во времени опосредованного экспрессией 3Cpro цитотоксического эффекта. Для этого клетки трех линий были трансфицированы конструкциями pCI-3C и pCI-3Cmut и, начиная с 9 ч п.т., через каждые 3 ч анализировали

CMV enh/prom Int ЗСрго SV40 р(А)

CMV enh/prom Int 3Cmut SV40 р(А)

К+ К- ЗС 3Cmut К+ К- ЗС 3Cmut К- ЗС 3Cmut К+

Рисунок 8 - Структура конструкций pCI-3C и pCI-3Cmut и анализ экспрессии целевых генов. (А) Строение экспрессионных кассет созданных конструкций: CMV enh/prom - энхансер и промотор ранних генов цитомегаловируса человека; Int - химерный интрон генов b-глобина/иммуноглобулина G человека; 3Cpro/3Cmut - ген интактной/мутантной протеазы 3С вируса гепатита А человека (звездочкой обозначена мутация, соответствующая аминокислотной замене Cys172-Ala); SV40 p(A) - сигнал полиаденилирования мРНК поздних генов вируса SV40. (Б) Накопление 3Cpro и 3Cmut в клетках человека. Клетки HEK293, HeLa и A549 трансфицировали конструкциями pCI-3C (3С) или pCI-3Cmut (3Cmut), а через 24 ч п.т. в лизатах клеток методом иммуноблоттинга анализировали накопление продуктов экспрессии соответствующих генов с помощью специфичных к 3Cpro антител. K- - лизат нетрансфицированных клеток; К+ - рекомбинантная 3Cmut (1 нг). На каждую дорожку нанесены лизаты, приготовленные из одинакового количества клеток: 200 000 для HEK293, 500 000 для HeLa и A549.

метаболическую активность клеток с помощью реагента MTS. В результате было установлено, что экспрессия гена 3Cmut не оказывает цитотоксического эффекта, поскольку жизнеспособность нетрансфицированных клеток и трансфицированных конструкцией pCI-3Cmut (рисунок 9, белые столбцы) была одинаковой вплоть до последней временной точки эксперимента (24 ч). В то же время, доля метаболически активных клеток в культурах, трансфицированных конструкцией pCI-3C, снижалась уже через 15 ч п.т., а к 18 ч п.т. достигало минимального значения (приблизительно 25% для НЕК293 и менее 5% для HeLa и A549) и далее не изменялась (рисунок 9, серые столбцы). Таким образом, в новой экспериментальной системе цитотоксический эффект при экспрессии 3Cpro также зависит от протеолитической активности вирусного фермента, но начинает проявляться раньше, чем в случае Tet-Off системы. По-видимому, это связано с более высоким уровнем экспрессии целевого гена в составе векторе pCI, по сравнению с уровнем экспрессии, обеспечиваемом Tet-off совместимым вектором pBI-EGFP [329].

3.1.7 Гибель клеток, трансфицированных конструкцией рС1-3С, сопровождается цитоплазматической вакуолизацией

На следующем этапе была исследована морфология клеток, гибнущих под действием 3Cpro. Для этого клетки НЕК293, HeLa и A549 были трансфицированы конструкциями pCI-3C и pCI-3Cmut совместно с pCI-EGFP в соотношении 1:1 по массе. Последняя конструкция обеспечивает в клетках экспрессию зеленого флуоресцентного белка EGFP, который в данном

120

^е 110

* 100

о 90

£ 80

! 70

В

со £ 50

£

X 40

§ 30

20

10

0

i 100

90

5? 80

О

11 70

60

м

50

и

=е 40

к 30

§

20

10

0

□ рС1-ЗСти1 ОрС1-ЗС

й

т

Т

т

12 15 18 21 Время после трансфекции, ч

□ рС1-ЗСт1^ ЕрС1-ЗС Г±1

пЬ

12 15 18 21 Время после трансфекции, ч

т

24

24

100

90

80

70

* 60 X

1 50

ш

I 40

£ 30 | 20 10 о

ае о т

ПрС[-ЗСтиг ОрС1-ЗС

№

т

гй

12 15 18 21 Время после трансфекции, ч

24

Рисунок 9 - Развитие во времени цитотоксического эффекта, обусловленного экспрессией 3Cpro. Клетки линий Ж093 (А), HeLa (Б) и A549 (В) трансфицировали конструкциями pCI-3C (серые столбцы) или pCI-3Cmut (белые столбцы). Через указанные промежутки времени п.т. анализировали метаболическую активность клеток в трансфицированных культурах при помощи реагента ЫХ8. Полученные значения нормировали на значения для нетрансфицированных клеток. Результаты представлены как среднее значение двух независимых экспериментов с тремя повторами в каждом, планками обозначено стандартное отклонение.

эксперименте служил для контрастирования цитоплазмы. Каждые 24 ч п.т. морфология клеток анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. В контрольных культурах, трансфицированных конструкциями рС1-3СшШ; и рС1-ЕОЕР, цитоплазматическая вакуолизация не наблюдалась, а клетки оставались прикрепленными к подложке и демонстрировали зеленую флуоресценцию вплоть до конца эксперимента (72 ч п.т.) во всех клеточных линиях (рисунок 10А, данные приведены только для НЕК293). При котрансфекции конструкциями рС1-3С и рС1-ЕОБР уже через 24 ч п.т. в культурах НЕК293 значительная доля клеток демонстрировала зеленую флуоресценцию, однако клетки теряли распластанность, приобретали округлую форму, а также характеризовались наличием цитоплазматической вакуолизации (рисунок 10Б). Через 48 ч п.т. в культурах почти не осталось клеток, прикрепленных к подложке и обладающих зеленой флуоресценцией. В случае линий НеЬа и А549 уже через 24 ч п.т. в культурах, трансфицированных конструкцией рС1-3С, подавляющее большинство клеток погибло, а зеленую флуоресценцию демонстрировали только единичные клетки, в которых, при этом, не удавалось обнаружить цитоплазматическую вакуолизацию (данные не приведены). На основании этих результатов, однако, нельзя утверждать об отсутствии цитоплазматической вакуолизации в клетках НеЬа и А549, поскольку вакуоли видны только при контрастировании цитоплазмы. По-видимому, клетки данных линий значительно чувствительнее к индуцируемой 3Срго клеточной гибели, чем клетки НЕК293. Можно предположить, что эти клетки гибнут при значительно меньшей концентрации 3Срго в цитоплазме, и, следовательно, в них не успевает накопиться достаточное для визуализации количество БОБР. В пользу того, что клетки линии НЕК293 более устойчивы к цитотоксическому действию протеазы 3С, может говорить тот факт,

Рисунок 10 - Вакуолизация клеток, экспрессирующих ЗСрго. Клетки НЕК293 трансфицировали конструкциями рС1-3СшШ (А) или рС1-3С (Б) совместно с рС1-ЕвРР в соотношении 1:1 по массе трансфицируемой ДНК. Через 24 ч п.т. морфология клеток в трансфицированных культурах анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии.

что по сравнению с другими линиями в них детектируется большее как количество 3 Cpro (рисунок 8Б), так и доля живых клеток (рисунок 9).

Таким образом, несмотря на различия в результатах, полученных для разных линий клеток, можно заключить, что гибель трансфицированных конструкцией pCI-3C клеток сопровождается цитоплазматической вакуолизацией, похожей на обнаруженную нами ранее при использовании экспрессионной системы Tet-Off.

3.1.8 Гибель трансфицированных конструкцией рС1-3С клеток не зависит от

активности каспаз

Вовлеченность каспаз в развитие индуцируемой 3Cpro клеточной смерти была проанализирована с использованием пан-каспазного ингибитора z-VAD-fmk. Клетки линий НЕК293, HeLa и А549 были трансфицированы конструкциями pCI-3C и pCI-3Cmut в отсутствии и в присутствии в среде 50 мкМ z-VAD-fmk. Через 24 ч п.т. была проанализирована метаболическая активность трансфицированных клеток с помощью реагента MTS. В результате было показано, что z-VAD-fmk не отменяет гибель клеток, экспрессирующих 3Cpro (рисунок 11 А). При этом z-VAD-fmk эффективно блокировал гибель нетрансфицированных клеток, экспонированных действию индукторов каспазо-зависимого апоптоза (рисунок 11Б).

В дополнение к этому эксперименту, клетки трех используемых линий через 18 ч п.т. конструкциями pCI-3C и pCI-3Cmut были проинкубированы с ингибитором VAD-fmk, конъюгированным с флуоресцентным красителем FITC (FITC-VAD-fmk), а затем

Рисунок 11 - Влияние пан-каспазного ингибитора z-VAD-fmk на гибель клеток. (А) Клетки линий НЕК293, HeLa и А549 трансфицировали конструкциями pCI-3Cmut (3Сши1), pCI-3C (3С), а также pCI-3C в присутствии 50 мкМ z-VAD-fmk (3С + zVAD). Через 24 ч п.т. была проанализирована метаболическая активность трансфицированных клеток с помощью реагента MTS. (Б) Влияние индукторов каспазо-зависимого апоптоза (1 мкМ стауроспорин для клеток HeLa, 50 нг/мл ТОТа и 2 мкг/мл циклогексимид для клеток НЕК293 и А549) на выживаемость клеток при индивидуальном действии (Индуктор), или совместно с 50 мкМ z-VAD-fmk (Индуктор + zVAD). Метаболическую активность клеток анализировали с помощью реагента МГ£ через 24 ч после добавления индукторов и z-VAD-fmk.

Полученные значения нормированы на значения для нетрансфицированных клеток или клеток без добавления индукторов. Результаты представлены как среднее значение двух независимых экспериментов с тремя повторами в каждом, планками обозначено стандартное отклонение. ¿к - статистически достоверное различие (тест Манна -Уитни, п = 6, р < 0,05).

проанализированы с помощью метода проточной цитометрии. В результате эксперимента было показано, что при индукции клеточной гибели 1 мкМ стауроспорином в культуре большая доля клеток демонстрирует значительное увеличение флуоресценции в диапазоне изучения FITC, что указывает на активацию в данных клетках каспаз (рисунок 12, Стауроспорин). При этом доля клеток, демонстрирующих флуоресценцию по FITC, была одинаковой в культурах, трансфицированных pCI-3C и pCI-3Cmut (рисунок 12, 3Cpro и 3Cmut, соответственно), и значительно не отличалась от нетрансфицированных клеток (рисунок 12, Контроль).

Таким образом, результаты этого и предыдущего эксперимента позволяют сделать вывод, что каспазы не вовлечены в процесс гибели клеток, трансфицированных вектором pCI-3C.

3.1.9 Некростатин-1 не оказывает влияния на выживаемость клеток,

трансфицированных конструкцией pCI-3C

Чтобы установить, происходит ли гибель клеток, трансфицированых конструкцией pCI-3C, по пути некроптоза, мы оценили влияние ингибитора данного типа РКС на выживаемость клеток. Для этого клетки линий HEK293, HeLa и A549, трансфицированные конструкцией pCI-3C, культивировали в присутствии 50 мкМ некростатина-1, после чего метаболическую активность трансфицированных клеток анализировали с помощью реагента MTS. В результате было обнаружено, что некростатин-1 не оказывает влияния на выживаемость экспрессирующих 3Cpro клеток (рисунок 13), что указывает на то, что их гибель происходит не по механизму некроптоза.

Таким образом, обобщая полученные на данном этапе результаты, можно утверждать, что

Флуоресценция FITC

Рисунок 12 - Анализ активации каспаз в клетках, экспрессирующих 3Cpro и 3Cmut. Нетрансфицированные клетки HeLa (Контроль), клетки через 18 ч после трансфекции векторами pCI-3Cmut (3Cmut) и pCI-3C (3Cpro), а также после 18 ч культивирования в присутствии 1 мкМ стауроспорина (Стауроспорин) были проинкубированы с FITC-VAD-fmk, после чего флуоресценция клеток в диапазоне излучения FITC была проанализирована методом проточной цитометрии. На основании полученных данных была определена доля клеток, в которых детектировалась активация каспаз (FITC ).

Рисунок 13 - Влияние некростатина-1, ингибитора RIPK1 и RIPK3 киназ, на гибель трансфицированных клеток. Клетки линий HEK293, HeLa и A549 трансфицировали конструкциями pCI-3Cmut (3Cmut), pCI-3C (3C), а также pCI-3C в присутствии 50 мкМ некростатина-1 (3С + Некр-1). Через 18 ч п.т. анализировали метаболическую активность трансфицированных клеток с помощью реагента MTS. Полученные значения нормировали на значения для нетрансфицированных клеток. Результаты представлены как среднее значение двух независимых экспериментов с тремя повторами в каждом, планками обозначено стандартное отклонение.

в новой экспериментальной системе экспрессия ЗСрго, аналогично экспрессии вирусного фермента в системе Tet-Off/pBI-EGFP, индуцирует в клетках каспазо-независимую гибель, которая, при этом, сопровождается цитоплазматической вакуолизацией и не является разновидностью

некроптоза. На следующем этапе работы с помощью предложенной экспериментальной системы мы изучили, можно ли отнести индуцируемую при экспрессии ЗСрго клеточную гибель к одному из известных типов РКС.

3.1.10 Вызываемая ЗСрго клеточная гибель может быть отнесена к одному из

четырех известных типов РКС

На основании полученных результатов уже на данном этапе работы можно исключить принадлежность исследуемой клеточной смерти к ряду известных РКС.

Так, индуцируемая ЗСрго клеточная гибель не является нетозом, поскольку данный тип РКС специфичен для клеток кроветворной системы (главным образом, нейтрофилов) [330], а используемые в настоящей работе линии клеток к данной системе не принадлежат.

Как нами было показано ранее, вакуоли, образующиеся при экспрессии ЗСрго в клетках человека, не являются аутофагосомами, и, тем более, не являются необходимыми для развития клеточной гибели, а лишь сопровождают ее [324]. Таким образом, индуцируемая ЗСрго клеточная гибель не является разновидностью аутофагической РКС.

Принимая во внимание полученные ранее результаты, можно утверждать, что каспазы не вовлечены в развитие индуцируемой ЗСрго клеточной гибели (Рисунки 6, 7, 11, 12). Это позволяет исключить принадлежность данной гибели к ряду каспазо-зависимых типов РКС, а именно - апоптозу и пироптозу.

Наконец, поскольку ингибирование ЫР-киназ не оказывает какого-либо влияния на прогрессию исследуемой нами клеточной гибели (Рисунки 7, 13), она не является разновидностью некроптоза.

Таким образом, по остаточному принципу индуцируемая 3Cpro клеточная гибель потенциально может являться разновидностью одного из 4-х типов РКС: партанатоса, лизосомальной РКС, ферроптоза или клеточной гибели, ассоциированной с формированием митохондриальных проницаемых мембранных (mitochondrial permeability transition, MPT) пор [5, 6]. Чтобы установить принадлежность исследуемой клеточной гибели к данным типам РКС, мы проанализировали морфологические и биохимические характеристики гибнущих клеток, а также оценили вовлеченность специфических белков в процесс смерти клеток, в соответствии с рекомендациями Номенклатурного комитета по клеточной гибели (NCCD) [5, 6].

3.1.11 Гибнущие вследствие действия 3Cpro клетки приобретают некротическую

морфологию

В первую очередь мы исследовали морфологию гибнущих клеток с точки зрения функциональной активности митохондрий и целостности цитоплазматической мембраны. Для этого клетки линий HEK293, HeLa и A549 были трансфицированы конструкциями pCI-3C и pCI-3Cmut, после чего через разные времена п.т. была исследована метаболическая активность митохондрий и целостность цитоплазматической мембраны трансфицированных клеток с помощью метода проточной цитометрии (рисунок 14В). Метаболическая активность митохондрий оценивалась с использованием красителя MitoProbe, который свободно проникает в клетки и накапливается в митохондриях благодаря наличию в них трансмембранного потенциала, в результате чего жизнеспособные клетки приобретают интенсивную флуоресценцию в соответствующем канале (рисунок 14В, Mito). Целостность цитоплазматической мембраны оценивалась по окрашиванию клеток интеркалирующим в нуклеиновые кислоты красителем иодидом пропидия (рисунок 14В, PI), который не проникает в клетки с неповрежденной мембраной. В ходе эксперимента для всех использованных клеточных линий были получены схожие результаты. Для иллюстрации на рисунке 14 представлены результаты для линии A549. Было показано, что при экспрессии неактивного фермента 3Cmut во всех временных точках в культурах клеток подавляющее большинство составляет популяция, характеризующаяся наличием и активности митохондрий, и целостности цитоплазматической мембраны, что позволяет классифицировать клетки данной популяции как «живые» (рисунок 14А, Живые). При экспрессии активной 3Cpro в трансфицированной культуре с течением времени происходило постепенное уменьшение доли живых клеток (рисунок 14Б, Живые) и пропорциональное увеличение доли клеток, характеризующихся утратой функциональной активности митохондрий и целостности мембраны, тем самым демонстрирующих некротическую морфологию (рисунок 14Б, Некр). При этом доля других

А 120

3 _ 100

I ю 80

3

и о Я S

X 3 :— и и 60

ч и

а -

з

ч:

40 20 0

~ 120 £ loo

4J

оП so

н "

° Е9

I г бо

н аг " =

-

э х

пживые □Неакт. мит jCmut иНекр ЕПовр.мемб

i-h

г^г-

—ШШ7Ш 1 я

В

о 10

12 15 18

Время после трансфекции, ч

Живые 1 45,7 •'-«ём^Гг Повр. мемб 3,2

: Неакт. мнт 8,6 Lfn-f"."*i" гнМг—1— Некр 38,5 1 ГШ .......г........1 1 II1

10

10

PI

10

10

ЗСрго

□Живые _?Некр_

□ Неакт. мит и Повр. мемб

п

'А Я

3

П

40 20

0

Рисунок 14 - Характеристика активности митохондрий и целостности мембраны клеток, экспрессирующих 3Cpro, с помощью метода проточной цитометрии. Клетки А549 трансфицировали конструкциями pCI-3Cmut (A) или pCI-3C (Б), после чего в указанные времена после трансфекции клетки обрабатывали митохондриальным красителем MitoProbe (Mito) в присутствии в среде иодида пропидия (PI). Результаты представлены как среднее значение трех повторов, планками обозначено стандартное отклонение. Репрезентативная картина окрашивания клеток с помощью Mito и PI через 15 ч после трансфекции конструкцией pCI-3C (В): Живые - клетки, характеризующиеся наличием активности митохондрий и целостности мембраны; Повр. мемб - клетки, характеризующиеся нарушением целостности мембраны при сохранении активности митохондрий; Неакт. мит - клетки, характеризующиеся потерей активности митохондрий при сохранении целостности мембраны; Некр - некротические клетки, характеризующиеся утратой как активности митохондрий, так и целостности мембраны.

12 15 18

Время после трансфекции, ч

популяций, главным образом, характеризующейся утратой активности митохондрий при

сохранении целостности цитоплазматической мембраны (рисунок 14Б, Накт. мит),

значительно не изменяется. Таким образом, экспрессия 3Cpro индуцирует в клетках гибель, в

результате которой клетки приобретают некротическую морфологию.

3.1.12 Индуцируемая 3Cpro клеточная гибель не является разновидностью партанатоса или MPT-ассоциированной РКС

Некротическая морфология, похожая на обнаруженную нами в предыдущем эксперименте, характерна для всех четырех из исследуемых типов РКС. Два из них -партанатос и MPT-ассоциированная гибель - можно отличить благодаря общему признаку. Партанатос представляет собой тип клеточной гибели, ключевым событием которой является гиперактивация фермента поли-АДФ-рибозы полимеразы 1 (PARP1) в ответ на значительное повреждение геномной ДНК [331]. Второй тип РКС связан с формированием в мембране митохондрий специфических MPT пор, которые делают данные органеллы проницаемыми для низкомолекулярных веществ и, тем самым, нарушают их функционирование [332]. Эти два типа РКС обладают общей чертой: при их развитии происходит транслокация апоптоз-индуцирующего фактора (AIF) из митохондрий, его обычного места локализации, сначала в цитоплазму, а затем в ядро [332, 333]. Попадая в ядро, нуклеаза AIF вызывает конденсацию

хроматина и осуществляет расщепление геномной ДНК на крупные фрагменты размером приблизительно 50 т.п.н. [334]. С использованием интеркалирующего красителя Hoechst 33342 и специфичных к AIF антител, а также метода флуоресцентной микроскопии, мы проанализировали морфологию ядер и локализацию AIF через 18 ч п.т. клеток линий HEK293, HeLa и A549 конструкциями pCI-3C и pCI-3Cmut. В качестве положительного контроля использовались клетки, в которых был индуцирован апоптоз (путем инкубации клеток с 1 мкМ стауроспорином для HeLa, или 50 нг/мл TNFa и 2 мкг/мл циклогексимида для HEK293 и А549), поскольку при апоптозе также происходит транслокация AIF в ядро. В ходе эксперимента для всех использованных клеточных линий были получены схожие результаты. Для иллюстрации на рисунке 15 представлены результаты для линии HeLa. Было обнаружено, что в отличие от ядер апоптотических клеток (рисунок 15, Апоптоз), которые характеризовались значительным сокращением объема ядра и интенсивной конденсацией хроматина, ядра экспрессирующих 3Cpro клеток характеризовались лишь частичной конденсацией хроматина и сохраняли свой исходный размер (рисунок 15, 3Cpro). При этом внешне они напоминали ядра, in vitro обработанные нуклеазой [335]. Кроме того, в трансфицированных конструкцией pCI-3C культурах часто обнаруживались клетки, ядра которых очень слабо или сосем не окрашивались Hoechst 33342 (рисунок 15, 3Cpro, белые стрелки). Особенно часто такие ядра наблюдались в клетках линии A549 (данные не приведены). По-видимому, это указывает на то, что индуцированная 3Cpro клеточная гибель сопровождается деградацией геномной ДНК. Что касается AIF, то в экспрессирующих 3Cpro и 3Cmut клетках данная нуклеаза была локализована в митохондриях (рисунок 15, 3Cpro и 3Cmut), в то время как в апоптотических клетках AIF был распределен по цитоплазме и ко-локализовался с ДНК (рисунок 15, Апоптоз). Таким образом, полученные данные указывают на то, что индуцированная 3Cpro клеточная гибель не сопровождается специфической транслокацией белка AIF из митохондрий в цитоплазму и ядро.

Далее мы исследовали влияние ингибиторов PARP1 и циклофилина D (ЦфнБ) - ключевых белковых медиаторов партанатоса и MPT-ассоциированной гибели, соответственно, - на развитие индуцируемой 3Cpro клеточной гибели. Для этого клетки линий HEK293, HeLa и A549 трансфицировались конструкциями pCI-3C и pCI-3Cmut, после чего культивировались в присутствии 10 мкМ PJ34 (ингибитора PARP1 [336]) или 10 мкМ циклоспорина А (ингибитора ЦфнD [337]), а через 18 ч п.т. была проанализирована метаболическая активность трансфицированных клеток с помощью реагента MTS (рисунок 16). Так было показано, что используемые ингибиторы не оказывают влияния на выживаемость клеток, экспрессирующих 3Cpro (рисунок 16, 3C+PJ34 и 3C+CsA). В совокупности результаты этого и предыдущего эксперимента указывают на то, что исследуемая клеточная гибель не является разновидностью партанатоса или MPT-ассоциированной РКС.

AIF Hoechst Совмещенный

Апоптоз

ЗСрго

3Cmut

Рисунок 15 - Анализ морфологии ядер и локализации нуклеазы AIF в клетках, экспрессирующих 3Cpro, с помощью флуоресцентной микроскопии. Клетки HeLa через 18 ч п.т. конструкцией pCI-3C (3Cpro), pCI-3Cmut (3Cmut) или после 18 часов индукции апоптоза в присутствии 1 мкМ стауроспорина (Апоптоз) фиксировались, после чего ядра клеток обрабатывали красителем Hoechst 33342 (канал Hoechst), а белок AIF визуализировали с помощью специфичных антител (канал AIF), конъюгированных с флуоресцентным красителем AlexaFluor 568. Стрелками обозначены клетки, в которых ядра не окрашиваются красителем Hoechst 33342.

3.1.13 Массовая деградация лизосом не является причиной гибели клеток при экспрессии 3Cpro

Клеточная гибель, сопровождающаяся похожей некротической морфологией, может наблюдаться при массовой деградации лизосом (МДЛ). При МДЛ происходит нарушение целостности лизосом, что приводит к высвобождению в цитоплазму содержащихся в них протеаз, нуклеаз и других ферментов, которые нарушают функционирование различных клеточных систем и, в конечном счете, вызывают гибель клетки. В этом случае говорят о лизосомальном типе РКС [203].

67

Чтобы проанализировать функциональное состояние

лизосом клеток, экспрессирующих 3Cpro, мы использовали краситель акридиновый оранжевый (АОг). AOr способен свободно проникать в клетки, но при попадании в лизосомы, имеющие низкий pH, данный краситель протонируется и теряет способность проходить сквозь мембраны, что приводит к его накоплению в лизосомах. Также, при протонировании AOr приобретает способность

флуоресцировать в красном диапазоне при облучении синим светом, что позволяет оценивать закисленность лизосом по интенсивности флуоресцентного сигнала в канале AOr [338]. В ходе эксперимента клетки линий HEK293, HeLa и A549 были трансфицированы конструкциями pCI-3C и pCI-3Cmut и через разные времена п.т. окрашены красителями Mito и AOr, после чего проанализированы с помощью метода проточной цитометрии (рисунок 17). В ходе эксперимента для всех использованных клеточных линий были получены схожие результаты. Для иллюстрации на рисунке 17 представлены результаты для линии A549. Было показано, что при трансфекции клеток вектором pCI-3Cmut во всех временных точках подавляющее большинство клеток характеризовалось наличием как митохондриальной активности, так и закисленности лизосом, что характерно для живых клеток (рисунок 17А). При экспрессии же активной 3Cpro в трансфицированных культурах со временем происходило постепенное уменьшение доли живых клеток (рисунок 17Б, Живые) и пропорциональное увеличение доли клеток, в которых была утрачена и активность митохондрий, и закисленность лизосом, что указывает на некротическую морфологию (рисунок 17Б, Некр). При этом доля клеток, характеризующихся утратой только активности митохондрий (рисунок 17Б, Неакт. мит), либо утратой только закисленности лизосом (рисунок 17Б, Неакт. лиз), практически не изменялась. Таким образом, гибель клеток под действием 3Cpro сопровождается одновременной утратой активности митохондрий, и закисленности лизосом. Если к этому добавить результаты эксперимента с использованием PI (рисунок 14), то можно утверждать, что клеточная гибель при экспрессии 3Cpro

120

¿ 100

О I-

ш

80

ъ 60

□с

о el

40 20

□ 3Cmut ■ 3C+PJ34

□зс

H3C+CsA

НЕК293

HeLa

А549

Рисунок 16 - Влияние ингибиторов партанатоса и МРТ-ассоциированной РКС на гибель экспрессирующих ЗСрго клеток. Клетки линий НЕК293, НеЬа и А549 трансфицировались конструкциями рС1-3СтШ: (ЗСшШ:), рС1-3С (ЗС), а также рС1-3С в присутствии 10 мкМ Р134 (3С+Р134), ингибитора поли-АДФ-рибоза полимеразы 1, или 10 мкМ сба, ингибитора циклофилина Б. Через 18 ч п.т. метаболическую активность трансфицированных клеток анализировали с помощью реагента MTS. Полученные значения нормированы на значения для нетрансфицированных клеток. Результаты представлены как среднее значение двух независимых экспериментов с тремя повторами в каждом, планками обозначено стандартное отклонение.

120

§ IDO f *

fe я

с а

^ í"

я «

0 и

Н Т

1 =

я -

fct

£ ш

I *

'С й н

: и

0 о н г

1 =

я -

80 60 40 20 0

120 100 80 60 40 20 0

^^ пЖивые ОНеакт. лиз ■ Некр QНеакт. мит

РН

Т т

s тш вл шш

В

10

О 6 ,

■s ю

10

HeaKi. лнз 0.83

Живые 59.(1

'¿и./--.

Неакт. мит 4.51