Развитие новых подходов, основанных на масс-спектрометрии ДАРТ и её сочетании с другими методами, для изучения состава и контроля качества лекарственных средств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Чернецова, Елена Сергеевна

• Чернецова, Елена Сергеевна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Чернецова, Елена Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................6

ГЛАВА 1. Обзор литературы.....................................................18

1.1. Контроль качества лекарственных средств и фармацевтический анализ: состояние

вопроса.....................................................................18

1.2. Ионизация ДАРТ для масс-спектрометрии..................................22

1.2.1. История возникновения и терминология масс-спектрометрии ДАРТ.......22

1.2.2. Предполагаемые механизмы ионизации ДАРТ............................24

1.2.3. Параметры, влияющие на состав и интенсивность сигналов в масс-спектрах ДАРТ. 29

1.2.3.1. Особенности образца............................................31

1.2.3.2. Особенности ввода проб.........................................37

1.2.3.3. Особенности конструкции и настроек источника ДАРТ..............54

1.2.4. Сопоставление с другими методами ионизации для масс-спектрометрии в

нормальных условиях.......................................................67

1.3. Анализ лекарственных средств, биоматериалов и прочих объектов методом масс-

спектрометрии ДАРТ.........................................................72

1.3.1. Анализ синтетических лекарственных средств.........................74

1.3.2. Анализ фармакогностических объектов и биоматериалов................81

1.3.3. Анализ прочих объектов.............................................85

1.4. Перспективные для фармацевтической химии и фармакогнозии направления развития

масс-спектрометрии ДАРТ.....................................................90

1.5. Обоснование выбора объектов исследования...............................98

1.6. Выводы к обзору литературы............................................101

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования.......................................103

2.1. Оборудование..........................................................103

2.2. Объекты анализа, реактивы, вспомогательные вещества...................109

2.3. Условия пробоподготовки и анализа образцов............................141

3

ГЛАВА 3. Оценка и развитие масс-спектрометрии ДАРТ для фармацевтического анализа .................................................................................148

3.1. Закономерности влияния различных условий на состав масс-спектров ДАРТ....148

3.1.1. Состав масс-спектров при сочетании источника ДАРТ с времяпролетным масс-

спектрометром «AccuTOF»......................................................148

3.1.2. Состав масс-спектров при сочетании источника ДАРТ с другими масс-

анализаторами................................................................153

3.1.2.1. Влияние скорости потока гелия.....................................154

3.1.2.2. Влияние давления в вакуумном интерфейсе масс-спектрометра.........155

3.1.2.3. Влияние добавления неона в гелий на состав масс-спектров..........160

3.1.2.4. Влияние температуры и состава атмосферы в области ионизации.......164

3.1.2.5. Влияние параметров керамической трубки вакуумного интерфейса......168

3.1.2.6. Влияние напряжений на входном капилляре масс-спектрометра.........170

3.1.3. Обобщение закономерностей образования масс-спектров и обоснование выбора

критериев для оптимизации условий анализа .................................. 171

3.2. Развитие способов подготовки и ввода проб для масс-спектрометрии ДАРТ....173

3.2.1. Разработка способов визуализации для сканирования образцов............173

3.2.1.1. Визуализация offline..............................................174

3.2.1.2. Визуализация online...............................................177

3.2.2. Развитие способов ввода на некоторых подложках........................181

3.2.2.1. Ограничения прямого анализа некоторых матриц......................182

3.2.2.2. Развитие способов ввода для анализа жидких образцов...............183

3.2.3. Развитие сочетаний масс-спектрометрии ДАРТ и планарной хроматографии..188

3.2.3.1. Оценка возможности сканирования ТСХ-пластин.......................190

3.2.3.2. Оценка возможности оптимизации аналитического сигнала ТСХ-МС......195

3.3. Заключение о возможности использования масс-спектрометрии ДАРТ в решении задач

фармацевтической химии и фармакогнозии........................................199

3.4. Выводы к главе 3.........................................................203

ГЛАВА 4. Контроль качества синтетических лекарственных препаратов и субстанций, основанный на масс-спектрометрии ДАРТ............................................204

4.1. Быстрый скрининг для идентификации компонентов лекарственных средств методом масс-спектрометрии ДАРТ.......................................................204

4

4.1.1. Идентификация компонентов азотсодержащих органических субстанций....204

4.1.2. Идентификация компонентов твердых лекарственных форм (таблетки, капсулы) .. 209

4.1.3. Идентификация компонентов других лекарственных форм (мази, суппозитории,

капли).....................................................................214

4.2. Быстрая оценка содержания действующего вещества в лекарственных средствах в

отсутствие образцов сравнения...............................................222

4.2.1. Оценка содержания действующих веществ лекарственных средств с использованием

автоматического элементного анализа........................................222

4.2.1.1. Определение степени чистоты азотсодержащих субстанций...........224

4.2.1.2. Определение содержания действующего вещества в твердых лекарственных

формах...................................................................227

4.2.1.3. Определение содержания действующего вещества в жидких лекарственных

формах...................................................................232

4.2.1.4. Особенности скрининга лекарственных средств на фальсификаты методом

автоматического элементного анализа после проведения скрининга методом масс-спектрометрии ДАРТ..................................................234

4.2.2. Оценка содержания действующего вещества в лекарственных средствах

с использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса...............235

4.3. Методология быстрого скрининга лекарственных препаратов и субстанций, основанная

на масс-спектрометрии ДАРТ..................................................239

4.5. Выводы к главе 4.......................................................241

ГЛАВА 5. Анализ природных лекарственных средств, основанный на масс-спектрометрии

ДАРТ...........................................................................242

5.1. Изучение состава фармакогностических объектов животного происхождения -прополиса и мёда............................................................243

5.1.1. Изучение фенольных компонентов прополиса............................243

5.1.1.1. Быстрая предварительная идентификация фенольных соединений-маркеров

методом масс-спектрометрии ДАРТ высокого разрешения......................243

5.1.1.2. Подтверждение состава фенольных соединений методом ТСХ-МС с ионизацией

ДАРТ и ионизацией электрораспылением.....................................250

5.1.1.3. Классификация образцов методами хемометрики при сочетании данных ТСХ и

масс-спектрометрии ДАРТ низкого разрешения...............................252

5

5.1.2. Скрининг мёда на 5-гидроксиметилфурфурол.......................261

5.1.2.1. Оценка возможности использования масс-спектрометрии ДАРТ для быстрого

скрининга пчелиного меда на 5-гидроксиметилфурфурол.................262

5.1.2.2. Быстрый скрининг пчелиного мёда на 5-гидроксиметилфурфурол методом

высокоэффективной тонкослойной хроматографии........................264

5.2. Изучение состава фармакогностических объектов растительного происхождения -

зеленых и ферментированных листьев бадана толстолистного................268

5.2.1. Идентификация ряда фенольных компонентов методом масс-спектрометрии ДАРТ

высокого разрешения...................................................268

5.2.2. Идентификация ряда летучих и среднелетучих компонентов методом масс-

спектрометрии ДАРТ высокого разрешения в сочетании с ГХ-МС...........275

5.3. Методология анализа лекарственных средств, основанная на масс-спектрометрии ДАРТ

и ее сочетании с другими методами (ТСХ, ГХ-МС, ЯМР)....................284

5.4. Выводы к главе 5..................................................287

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...............................................................288

ВЫВОДЫ...................................................................290

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.................................292

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................295

ПРИЛОЖЕНИЯ...............................................................348

ОФС.1.2.1.0024.15 «Автоматический элементный анализ»...................349

Фрагмент ОФС.1.2.1.1.0008.15 «Масс-спектрометрия»......................353

Акты, подтверждающие внедрение результатов диссертационного исследования

в образовательную деятельность.........................................354

Акты, подтверждающие внедрение результатов диссертационного исследования

в практическую деятельность............................................357

Масс-спектры ДАРТ твердых лекарственных форм, не вошедшие в основной текст

диссертации............................................................362

6

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Развитие новых подходов, основанных на масс-спектрометрии ДАРТ и её сочетании с другими методами, для изучения состава и контроля качества лекарственных средств»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Неотъемлемой частью задачи по охране здоровья человека, приоритетной в политике большинства стран, является обеспечение надлежащего качества лекарственных средств (ЛС). Для этого при разработке ЛС и на всех этапах их жизненного цикла требуется проведение химического анализа, в том числе для изучения состава и контроля сырья, определения подлинности, контроля производства, оценки качества полученного лекарственного средства, изучения его стабильности, стандартизации лекарственных форм (ЛФ) и их контроля. Целью анализа при этом может быть как получение сведений о еЭмнсжеенном компоненте (например, при определении содержания действующего вещества - или «активного фармацевтического ингредиента» - в таблетированных ЛФ), так и многокомпонентным анализ для выявления заданных или неизвестных компонентов в объекте (например, поиск биомаркеров, метаболитов, токсикантов или уточнение происхождения природного сырья за счет обнаружения его ключевых компонентов). Есть потребность в разработке универсальных, экспрессных подходов в фармацевтическом анализе, обеспечивающих высокую скорость единичных анализов и их информативность, достаточную для решения каждой отдельной задачи.

Нежелательно высокие затраты времени при использовании многих аналитических методик в фармации обусловлены необходимостью проведения длительных манипуляций с образцами сравнения, часто включая их анализ отдельно от исследуемых образцов. Согласно Государственной фармакопее РФ, содержание действующего вещества в ЛС чаще всего определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) после проведения предварительной экстракции, титриметрией или другими аналитическими методами, требующими использования специальных условий для селективного определения конкретных аналитов и образцов сравнения. Более детальный анализ может включать определение примесей - например, летучих остаточных растворителей. Наиболее сложен и трудоемок поиск неизвестных компонентов при исследованиях состава таких сложных объектов, как, например, фармакогностические объекты растительного или животного происхождения или другие биопробы. Методы масс-спектрометрии (МС) очень привлекательны с точки зрения информативности, но одним из ограничений наиболее распространенного в фармацевтическом анализе метода ВЭЖХ-МС помимо его стоимости является длительность анализа, а также в ряде случаев и невысокая стабильность результатов во времени, что важно, например, при оценке биоэквивалентности дженериковых препаратов.

7

Актуальна разработка новых подходов к анализу таких объектов, как фармацевтические субстанции, таблетки, капсулы, мази, суппозитории, природные ЛС и другие пробы биологического происхождения. Интерес представляет не только контроль заданных аналитов, но и идентификация неизвестных компонентов, а также рассмотрение сигналов соединений-маркеров в качестве «отпечатков пальцев» для классификации и исследования состава объектов

Одним из новых способов ионизации для масс-спектрометрии является «прямой анализ в режиме реального времени» (direct analysis in real time, DART, ДАРТ), появившийся в 2005 году и представляющий интерес для применения в фармацевтической химии и фармакогнозии. На наш взгляд, масс-спектрометрия ДАРТ является многообещающим методом для организации скрининга, для которого не будет требоваться полномасштабная валидация, с целью сокращения выборок лекарственных препаратов и субстанций перед их анализом другими методами.

Степень разработанности темы исследования. До начала наших исследований не было опубликовано ни одной работы, связанной с применением масс-спектрометрии ДАРТ (ДАРТ-МС) в фармацевтической химии, фармакогнозии или в других областях наук в России. Из имеющихся работ, опубликованных зарубежными авторами, было известно, что привлекательной особенностью ДАРТ является потенциальная возможность быстрого анализа без пробоподготовки. В связи с новизной метода его достоинства и ограничения на момент начала данного исследования были мало изучены, метод был недостаточно развит, а имеющихся отдельных публикаций о нем было недостаточно для обобщения и формирования выводов о возможностях применения данного метода для решения задач фармации. До начала нашего исследования практически все опубликованные данные были получены с использованием одной и той же модели масс-спектрометра. Отсутствовали достоверные данные о возможностях применения в фармацевтической химии и фармакогнозии сочетания ДАРТ с масс-анализатором на основе орбитальной ионной ловушки и c тонкослойной хроматографией (ТСХ), о достоинствах и ограничениях таких сочетаний, а также вариантах их реализации. Масс-спектры ДАРТ, по которым, как предполагалось, можно было бы проводить экспрессную идентификацию компонентов фармацевтических субстанций, были приведены в литературе полностью только для нескольких наркотических субстанций и антималярийных препаратов. При этом проводили качественный анализ и не рассматривали возможность проводить следующую стадию скрининга для быстрого определения содержания действующего вещества в отсутствие образцов сравнения - в чем, с нашей точки зрения, автоматический элементный анализ (АЭА) может хорошо дополнить метод масс-спектрометрии ДАРТ. Большой практический интерес представляла разработка новых подходов для решения различных задач

8

фармацевтического анализа, основанных на масс-спектрометрии ДАРТ - например, для определения подлинности ЛС и выявления фальсификатов, а также для получения новых данных о составе биопроб, в том числе природных ЛС.

Цель работы: развитие научных основ и создание системы новых подходов, основанных на масс-спектрометрии ДАРТ, для изучения состава и контроля качества ЛС.

Задачи, которые необходимо было решить для достижения поставленной цели:

1) обоснование путей повышения избирательности и чувствительности детектирования компонентов лекарственных средств методом масс-спектрометрии ДАРТ;

2) выявление критериев выбора условий для фармацевтического анализа методом масс-спектрометрии ДАРТ, изучение масс-спектров широкого круга соединений различных химических классов и параметров, влияющих на состав масс-спектров ДАРТ;

3) расширение возможностей масс-спектрометрии ДАРТ в обнаружении компонентов лекарственных средств и разработка новых подходов, включающих анализ образцов с твердых подложек, позволяющих оптимизировать отбор, хранение и транспортировку (био)проб, а также ои/ше- и о^%Ле-сочетания ТСХ с масс-спектрометрией ДАРТ;

4) разработка быстрого и универсального способа определения содержания действующего вещества в лекарственных препаратах и субстанциях при использовании АЭА как метода быстрого фармацевтического анализа, комплементарного масс-спектрометрии ДАРТ;

5) разработка методологии для быстрого обнаружения фальсифицированных лекарственных средств, основанной на масс-спектрометрии ДАРТ и АЭА;

6) разработка методологии фармацевтического анализа, основанной на масс-спектрометрии ДАРТ и ее сочетании с ТСХ, а также с другими методами анализа.

Научная новизна. На основании систематического исследования масс-спектров ДАРТ широкого круга используемых в фармацевтической практике соединений различных химических классов (алифатические и ароматические углеводороды, спирты, карбоновые кислоты, карбонилсодержащие соединения, аминокислоты, сахара, фенольные соединения, гетероциклические соединения) выявлены параметры, влияющие на избирательность и чувствительность анализа, и обоснован выбор критериев оптимизации его условий.

Обоснованы выбор и условия использования масс-спектрометрии ДАРТ для регистрации характеристичных сигналов и идентификации отдельных компонентов фармацевтических объектов, а также целесообразность и способы использования других методов, дополняющих масс-спектрометрию ДАРТ при решении задач фармацевтического анализа.

Разработаны новые способы снижения пределов обнаружения в масс-спектрометрии ДАРТ и использования подложек из различных материалов для обеспечения отбора проб на

9

месте контроля и транспортировки к анализатору (масс-спектрометру с ионизацией ДАРТ). Предложены способы визуализации ионизирующего потока, расширяющие возможности сканирования поверхностей объектов методом масс-спектрометрии ДАРТ. Разработанные способы анализа при сочетании ионизации ДАРТ и ТСХ обеспечивают одновременную регистрацию десятков соединений в идентичных условиях.

Установлена возможность быстрого обнаружения действующих веществ в ряде лекарственных препаратов отечественного и зарубежного производства (субстанции, капсулы, таблетки, суппозитории, мази, капли, эфирные масла) в отсутствие образцов сравнения методом масс-спектрометрии ДАРТ низкого и высокого разрешения.

Разработан быстрый и универсальный способ определения содержания действующего вещества в различных ЛС (субстанции, капсулы, таблетки, растворы в ампулах), основанный на АЭА и не требующий использования образцов сравнения аналитов, точность которого сопоставима с точностью общепринятых методов или превосходит ее.

С использованием разработанных подходов, основанных на масс-спектрометрии ДАРТ низкого и высокого разрешения и её сочетании с высокоэффективной ТСХ (ВЭТСХ), впервые охарактеризован состав компонентов бадана (Bergewa сгаллт/Ь/м L.), прополиса и мёда. Показана возможность быстрого контроля качества проб благодаря одновременной регистрации десятков соединений, в отличие от общепринятых методов анализа.

Разработана методология для быстрого обнаружения фальсификатов и определения качества ЛС, основанная на масс-спектрометрии ДАРТ низкого и высокого разрешения и автоматическом элементном анализе, а также методология быстрого контроля качества и изучения состава (природных) ЛС, основанная на масс-спектрометрии ДАРТ и ее сочетании с ТСХ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные о составе масс-спектров ДАРТ и его зависимости от условий эксперимента для широкого круга соединений позволяют сделать выводы о возможностях и ограничениях масс-спектрометрии ДАРТ, выявить критерии выбора условий анализа объектов и обосновать новые области применения масс-спектрометрии ДАРТ в фармацевтической химии. Благодаря разработке новых способов визуализации ионизирующего потока из источника ДАРТ и основанных на них способов сканирования объектов предложены новые способы подачи пробы в масс-спектрометрии ДАРТ, в том числе для её сочетания с ТСХ. Создан первый прототип трехмерного сканера для ДАРТ, обеспечивающий размещение плоских объектов в области ионизации ДАРТ с адаптируемыми координатами. Предложенные способы анализа методом масс-спектрометрии ДАРТ обеспечивают повышение избирательности и чувствительности, а

10

также возможность осуществления оперативного контроля качества анализируемых объектов благодаря новым подходам к отбору проб, их хранению и транспортировке к анализатору.

Систематизированы и расширены возможности масс-спектрометрии ДАРТ в решении различных задач фармацевтического анализа (контроль качества ЛС, исследование состава природных ЛС и вспомогательных веществ). За счет более простой пробоподготовки и возможности быстрого одновременного разделения до 20 проб в идентичных условиях производительность разработанного способа скрининга мёда на 5-гидроксиметилфурфурол в несколько раз выше производительности ВЭЖХ, что обеспечивает возможность более эффективного контроля качества. На основании анализа 91 образца прополиса, собранных в различных регионах, разработан новый подход к классификации образцов прополиса, основанный на совместном использовании масс-спектрометрии ДАРТ и ВЭТСХ для обнаружения фенольных соединений. Получены новые данные о составе компонентов прополиса и бадана, имеющие значение для оценки качества и изучения их медицинских свойств. Разработанные подходы к классификации и идентификации ключевых компонентов сложных смесей применимы для быстрой оценки качества природных лекарственных средств и получения информации об их компонентах, а также для быстрого установления происхождения (подлинности) образцов.

Разработанная методология скрининга, осуществляемого методами масс-спектрометрии ДАРТ и АЭА, обеспечивает быстрый контроль качества ЛС в отсутствие образцов сравнения действующих веществ. Разработанная методология анализа ЛС, основанная на масс-спектрометрии ДАРТ и ТСХ, обеспечивает возможность быстрого сопоставления объектов исследования по многомерным признакам и обнаружения веществ, определяющих качество ЛС. С использованием разработанных подходов возможно проведение предварительной идентификации и оценки чистоты фармацевтических субстанций, что позволит прогнозировать для вновь создаваемых лекарственных форм их безопасность и терапевтическую эффективность.

Значимость работы подтверждена показателями цитирования основных публикаций по теме исследования. Согласно данным Научной электронной библиотеки elibrary.ru, из них 17 статей процитированы более 5 раз. Максимальное число цитирований для публикации по результатам эксперимента - 29, для обзорной статьи - 67 (по состоянию на 17 апреля 2017 г.).

Методология и методы исследования. Наряду с масс-спектрометрией ДАРТ низкого и высокого разрешения в исследованиях, вошедших в данную работу, использовали следующие современные методы физико-химического анализа: ВЭТСХ, ВЭТСХ-МС с ионизацией электрораспылением (ВЭТСХ-ИЭР-МС), ГХ-МС, спектроскопию ЯМР, АЭА. Для оценки

11

достоверности количественных результатов и их сравнения с результатами, получаемыми с использованием традиционных подходов, в работе использовали предоставленные независимыми организациями данные анализа объектов исследования следующими методами: ВЭЖХ, спектрофотометрия, титриметрия, потенциометрия. Для статистической обработки результатов были использованы современные программные средства «Excel» и «MATLAB». Для информационного поиска использовали анализ литературных данных и поисковую систему для научного библиографического поиска «SciFinder».

Внедрение в практику. Результаты публикаций по теме работы частично использованы при создании общих фармакопейных статей (ОФС) «Автоматический элементный анализ» и «Масс-спектрометрия», вошедших в XIII издание Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ).

Методологические основы и подходы к анализу лекарственных средств и фармакогностических объектов, разработанные в ходе данной диссертационной работы, внедрены в деятельность Центра коллективного пользования (Научно-образовательном центре) Российского университета дружбы народов (ЦКП (НОЦ) РУДН), ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации», ООО «Экзакте Лабс», ООО «ИМИД» и ЗАО «Биокад». Материалы работы внедрены в учебный процесс Российского университета дружбы народов при проведении обучающих курсов ЦКП (НОЦ) РУДН и при разработке в рамках государственного контракта № 05.Р14.12.0018 от 05.10.2015 г. магистерской программы по инструментальным методам фармакопейного анализа. Также они внедрены в деятельность кафедры фармацевтической химии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России) и в деятельность ежегодного обучающего семинара Всероссийского масс-спектрометрического общества «Практические аспекты применения методов газовой хроматографии/масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии».

Результаты внедрения подтверждены соответствующими актами.

На защиту выносятся:

• Результаты изучения состава масс-спектров и обоснование выбора критериев для оптимизации условий анализа методом масс-спектрометрии ДАРТ.

• Способы увеличения воспроизводимости масс-спектров ДАРТ благодаря визуализации ионизирующего потока из источника ДАРТ на поверхности объекта исследования.

12

• Подходы в масс-спектрометрии ДАРТ, обеспечивающие снижение пределов обнаружения и оперативный контроль качества анализируемых объектов благодаря отбору проб на месте контроля и транспортировке к анализатору.

• Новые способы анализа, основанные на сочетании масс-спектрометрии ДАРТ с ТСХ, включая разработанные способы сканирования поверхностей образцов.

• Способы быстрого анализа органических субстанций и ЛС, позволяющие проводить обнаружение ДВ в отсутствие образцов сравнения, основанные на ДАРТ-МС низкого и высокого разрешения.

• Способы быстрого определения содержания действующего вещества в различных лекарственных препаратах (субстанции, капсулы, таблетки, растворы в ампулах), не требующие использования образцов сравнения аналитов.

• Новые сведения о составе прополиса и бадана толстолистного, полученные с использованием разработанных в работе новых подходов.

• Способ скрининга биологически активного вещества (5-гидроксиметилфурфурол) в сложной матрице природного происхождения (мед), превосходящий общепринятые методы по экспрессности.

• Методология экспрессного определения качества лекарственных препаратов и субстанций, основанная на масс-спектрометрии ДАРТ низкого и высокого разрешения и автоматическом элементном анализе.

• Методология быстрого контроля качества и изучения состава ЛС, основанная на масс-спектрометрии ДАРТ и ее сочетании с ТСХ или некоторыми другими методами (ГХ-МС, ЯМР), не требующими образцов сравнения действующих веществ.

Степень достоверности и апробация результатов. Диссертационная работа выполнена на современном научно-методическом уровне в объеме, достаточном для приведенных в работе обобщений и обоснования выводов. В ходе её выполнения использованы современные методы исследования. Экспериментальные данные, полученные автором, достоверны, обработаны с помощью современного программного обеспечения к аналитическим приборам (IonSense «DART Control», Agilent «Chemstation», Thermo Fisher Scienific «XCalibur», CAMAG «WinCats») с применением методов современной статистики. Научные положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертационной работе, аргументированы, достоверны и логически вытекают из полученных автором экспериментальных данных и их анализа, а также сопоставления с литературными данными. Первичная документация исследования проверена и полностью соответствует материалам, содержащимся в работе. В диссертации использован и

13

проанализирован достаточный объем литературных данных о работах отечественных и иностранных авторов, имеющих отношение к теме исследования.

Результаты работы были представлены на следующих российских и международных научных форумах:

1-й Конференции по фармацевтическим наукам „BBBB" (Венгрия, 2005); Международном конгрессе «ICAS-2006» (Москва); Всероссийском научно-практическом семинаре «Методы и приборное обеспечение для агропромышленного комплекса и пищевой промышленности» в рамках выставки «ЛабораторияЭкспо 2009» (Москва); III Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009» (Санкт-Петербург); II Международном симпозиуме по сорбции и экстракции с заочным участием (Владивосток, 2009); 11-й Международной конференции «ISMAS» (Хайдерабад, Индия, 2009); III, IV и V Всероссийской конференции «Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы» (Москва, 2009, 2011 и 2013); 11-м Международном симпозиуме «HTC-11» (Бельгия, 2010); Съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Москва, 2010); 4-й Всероссийской конференции «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» (Звенигород, 2010); Международной научной конференции по аналитической химии и экологии (Казахстан, 2010); 28-м Международном симпозиуме по хроматографии (Испания, 2010); Съезде Британского сообщества по МС (Великобритания, 2010); 1-й Международной академической конференции молодых ученых «Chemistry and Chemical Technology 2010» (Украина); Съезде немецкого сообщества специалистов по пищевой химии (Германия, 2011); Съезде пищевых химиков Германии «Deutscher Lebensmittelchemikertag» (Халле, Германия, 2011); Съезде немецкого сообщества специалистов по пищевой химии «Lebensmittelchemische Gesellschaft. Regionalverbande Nord & Sud-West. Gemeinsame Arbeitstagung 2011» (Германия, 2011); Конференции «ANAKON 2011» (Швейцария); 13-м симпозиуме молодых химиков Немецкого химического сообщества (Германия, 2011); 36-м Международном симпозиуме «HPLC 2011» (Венгрия); 9-й Международной конференции «PETROMASS 2011» (Москва); 5-м Международном симпозиуме «RAFA-2011» (Чехия); 2-м научном семинаре FCUB-ERA «Food chemistry and biotechnology» (Сербия, 2011); Европейской конференции «EuroAnalysis XVI» (Сербия, 2011); Международном симпозиуме по ВЭТСХ (Швейцария, 2011); XXXIV симпозиуме «Chromatographic Methods of Investigating the Organic Compounds» (Польша, 2011); Европейской зимней конференции по спектрохимии плазмы (Испания, 2011); 8-м зимнем симпозиуме по хемометрике (Дракино, 2012); Российско-Немецком коллоквиуме общества Гумбольдта «Die Rolle der Grundlagenwissenschaften in der Gesellschaft» (Москва, 2012); Международной конференции «NVMS - BSMS» (Нидерланды, 2012); XVI

14

Международном конгрессе «PHYTOPHARM 2012» (Санкт-Петербург); Совместной конференции немецкого и польского МС-сообществ (Польша, 2012); 9-й Всероссийской конференции «Химия фтора» (Москва, 2012); 13-й Европейской конференции по химии объектов окружающей среды (Москва, 2012); 6-м Международном симпозиуме «RAFA-2013» (Чехия); 2-м Съезде аналитиков России (Москва, 2013); 10-й Международной конференции «PETROMASS 2014» (Грузия); Международной конференции по анализу малых молекул методом ЯМР-спектроскопии (США, 2014); XIX Международном конгрессе «PHYTOPHARM 2015» (Германия) и 2-й Международной конференции «Инновации в масс-спектрометрии: приборы и методы» (Москва, 2016).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Исследование соответствует формуле специальности 14.04.02 - «Фармацевтическая химия, фармакогнозия» и пунктам 3 и 6 паспорта научной специальности.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно осуществлен выбор научного направления. Наибольшая часть исследований и 95% экспериментов по регистрации масс-спектров ДАРТ выполнены лично автором диссертационой работы. Во всех работах автору принадлежит ведущая роль в постановке цели и задач, выборе объектов исследования, планировании и проведении экспериментов, интерпретации и обобщении данных. В 26 из 33 основных публикаций по теме диссертации автор ответственен за корреспонденцию, связанную с этими статьями.

Публикации. По материалам работы опубликовано 33 публикации в журналах, рекомендованных ВАК для размещения материалов диссертаций, и 59 тезисов докладов.

Работа выполнена в Российском университете дружбы народов в рамках программы стратегического развития РУДН на 2012-2016 гг., а также при финансовой поддержке следующих организаций и программ:

- ироераммы межбунаробноео обмена межбу Россмей м сжранамм Рмроиейскоео Союза «Егалшмл Мми^мл Чсй'ои 2 - РаАиеглйтрл // Рко/'ес/ ТЧМОУЕТ-РС (Ео/ d)» (проект «New hyphenated approaches for determination of phytochemicals in medicinal herbs using HPTLC/UV/Vis/FLD/HPLC/MS and bioassay-based detection» 2011-2012),

- еерманско-россмйскоео межбмс^милмнарноео научного ^енжра (проект №C-2011b-x1 «Ion Formation in DART Mass Spectrometry», 2011);

- соммесжной россмйско-неме^кой ироераммы «^мхамл Ломоносом» межбу Чналмжмческой мебомсжменной ^елемой ироераммой «Разммжме научного иожен^мала мысшей школы» м Германском службой акабеммческмх обменом (проект №2.2.2.3/9055 «Новые подходы к анализу препаратов природного происхождения, основанные на использовании плоскостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией», 2010-2011; проект

15

№15112 «Сочетание плоскостной хроматографии с масс-спектрометрией: новые подходы к анализу биологических образцов», 2011);

- Собеса ио ЛрсзмЭсмжа Российском ФсЭсра^мп (грант МК-594.2010.3 «Масс-

спектрометрия DART: новый метод определения органических соединений в различных объектах без пробоподготовки и сопоставительная оценка возможности его использования для анализа лекарственных препаратов и биологических объектов», 2010-2011),

- .мсжЭумороЭноао ноучно-жсхничсскоао ^смжро (МНТЦ, проект №2829 «Investigation of analytical approaches to determine the authenticity/quality of pharmaceutical products to improve the public health by identifying counterfeit and ineffective products», 2004-2006).

Автор выражает искреннюю признательность доктору фармацевтических наук, профессору Шикову А.Н. (ЗАО «Санкт-Петербургский институт фармации», Ленинградская область, п. Кузьмоловский, Россия) за консультирование и многочисленные полезные советы по работе с точки зрения специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия», а также за предоставление образцов листьев бадана, совместные исследования состава этих листьев и обеспечение проведения их анализа методом ГХ-МС; доктору химических наук, профессору Ревельскому И.А. (кафедра аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, г. Москва, Россия) за многолетнее плодотворное сотрудничество и совместные исследования в области применения автоматического элементного анализа для скрининга лекарственных средств на фальсификаты; директору подразделения токсикологической химии Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов Д. Сатцгеру (Food and Drug Administration, США) за предоставление образцов ряда лекарственных средств и данных их анализа независимыми фармакопейными методами; профессору Г.Е. Морлок (отдел наук о питании Университета имени Ю. Либиха, Гиссен, Германия) за консультации и совместные исследования в области тонкослойной хроматографии и ее сочетания с масс-спектрометрией ДАРТ, проведенные в рамках программ международного обмена между Россией и Германией в Университете Хоэнхайм (Штутгарт, Германия); специалистам фирмы-производителя оборудования для ДАРТ Муссельману Б. и Кроуфорд Е. (компания «IonSense», США) за совместные исследования по разработке трехмерного сканера для ДАРТ; доктору Ристивоевичу П. (центр инноваций Химического факультета Университета г. Белград, Сербия) за проведение обработки масс-спектров ДАРТ и ТСХ-хроматограмм средствами хемометрики в программе «MATLAB» и специалисту в области масс-спектрометрии Бромирски М. (компания «Thermo Fisher Scientific», Бремен, Германия) за предоставление временного доступа к масс-спектрометрам с анализаторами на основе орбитальной ионной ловушки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Чернецова, Елена Сергеевна, 2017 год

источника.

55

Рисунок 8 - Схема встроенного вакуумного интерфейса в масс-спектрометре модели

«AccuTOF» (JEOL), заимствовано из [64]

С 2009 года для сочетания источников ДАРТ с другими типами масс-спектрометров начали производить вакуумные интерфейсы (сепараторы) «Vapur» (IonSense). Эти интерфейсы, представляющие собой металлические конструкции с системой креплений, адаптированной под различные модели масс-спектрометров, позволяют сочетать источники ДАРТ с современными масс-спектрометрами большинства производителей. В отсутствие интерфейса-сепаратора сочетание ДАРТ с такими масс-анализаторами, как правило, невозможно из-за нарушения баланса давлений. В вакуумном интерфейсе «Vapur» для входа газа используется не конический скиммер с отверстием малого диаметра, как в приборе «AccuTOF», а обогреваемая керамическая трубка. Схема интерфейса приведена на рисунке 9. До проведения настоящего

исследования литературные данные о критериях оптимизации условий анализа с

использованием таких систем отсутствовали. Интерфейс «Vapur» разработан также и для масс-спектрометра модели «AccuTOF», однако нет ни одной публикации о том, обеспечивает ли его

применение при сочетании ДАРТ с масс-спектрометром «AccuTOF» какие-либо преимущества.

Рисунок 9 - Схема вакуумного интерфейса-сепаратора «Vapur» (IonSense) для различных моделей масс-спектрометров, заимствовано из [63] О 2009 American Chemical Society

56

Модификацией современного источника ДАРТ "DART SVP" является модель "DART SVP А" (рисунок 10; SVPA - обозначение производителя для «Standardized Voltage, Pressure and Angle)), что означает «стандартизированное напряжение, давление и угол))), позволяющая изменять угол наклона источника по отношению к поверхности анализируемого образца и входу в интерфейс. Такая модель появилась в 2010 году, что позволило нам в данном диссертационном исследовании изучить различные способы сочетания масс-спектрометрии ДАРТ с планарной хроматографией.

В упрощенной модели ионного источника ДАРТ модели «ID-CUBE)), появившейся в 2012 году, осуществление термодесорбции происходит не за счет нагретого потока газа, а за счет нанесения проб на металлическую сетку. В режиме анализа к такой сетке на короткое время прикладывают напряжение [143], за счет чего достигается экономия газа-носителя, поскольку он пропускается через область ионизации только в момент анализа (рисунок 11). Поэтому особенностями модели «ID-CUBE)) являлись сокращенное потребление газа-носителя, а также в 2-2.5 раза более низкая стоимость ионного источника за счет механизированного управления.

Особенности разных моделей источников ДАРТ следует учитывать при планировании эксперимента и интерпретации данных, однако большинство исследований влияния параметров эксперимента на состав масс-спектров ДАРТ выполнено при использовании первого поколения ионных источников.

Рисунок 10 - Модель ионного источника ДАРТ "DART SVPA" с изменяемым углом наклона, заимствовано из [144]

57

Рисунок 11 - Модель ионного источника ДАРТ «ID-CUBE» (А), нанесение жидких образцов на металлическую сетку картриджей «Open Spot Sample Card» (Б) и схема осуществления ионизации ДАРТ (В), заимствовано из [145]

В большинстве работ подтверждение состава компонентов смесей методом масс-спектрометрии ДАРТ проводят по значениям ти/z, поэтому возможности идентификации органических соединений во многом зависят от используемого масс-анализатора. В таблице 6 [146] приведено обобщение о способностях различных масс-анализаторов (приведены некоторые представительные примеры) к различению разных аналитов по их отношениям массы к заряду.

Используя сочетание ДАРТ с масс-спектрометрами высокого разрешения, можно идентифицировать аналиты, используя данные об их моноизотопных молекулярных массах (М) и брутто-формулах. Специфицируемое разрешение масс-спектрометра «АссиТОҒ» составляет 6000-7000, т е. расстояние между соседними пиками в масс-спектре, при котором они разделены на полувысоте, составляет около 0.01 а.е.м. при ти/z 100 и около 0.1 а.е.м. при ти/z 1000. Сообщалось [44] о средней точности определения массовых чисел, равной ±0.00004 а.е.м. при определении шестнадцати спиртов, что авторы объясняли тщательностью ухода за прибором и контролирования условий эксперимента. Однако в других работах точность определения массовых чисел, как правило, не превышала специфицируемой (5'10'6 при использовании внутреннего стандарта для калибровки), т е. 0.0005 а.е.м. при ти/z 100 и 0.005 а.е.м. при ти/z 1000.

58

Таблица 6 - Массовое разрешение и способность к разделению ионов

для различных масс-анализаторов, заимствовано из [146] О 2017 John Wiley & Sons, Ltd.

Массовое разрешение Способность к разделению ионов Примеры Масс-анализаторы

> 100 Различимо различное состояние заряда для ионов, образованных от одной и той же нейтральной частицы [M+H]+ пл. [M+2H]2+ Квадруполь, тройной квадруполь

> 1000 Различимы пики различной номинальной массы 325 Да пл. 326 Да Квадруполь, времяпролетный, гибридный масс-анализатор с двумя кваруполями и времяпролетным сегментом

> 10000 Различимы малые (массой менее 2500 Да) пептиды одной и той же номинальной массы с разницей в один аминокислотный остаток, за исключением лейцина и изолейцина Пептиды с различием в одном аминокислотном остатке Ионная ловушка, времяпролетный, орбитальная ионная ловушка, гибридные масс-анализаторы на основе линейной и орбитальной ионных ловушек

> 100000 Различимы пики номинально изобарных частиц (молекул с одной и той же номинальной массой, но разным элементным составом) N2 пл. CO (обе частицы - 28 Да) Времяпролетный, ионная ловушка, гибридные масс-анализаторы на основе квадруполя и орбитальной ионной ловушки, масс-анализато-ры ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием

Источник ДАРТ самой первой конструкции был приспособлен для сочетания только с времяпролетным масс-спектрометром «AccuTOF», и большинство опубликованных работ по масс-спектрометрии ДАРТ, доступных к моменту наших исследований (121 из 129 статей за 2005-2011 годы), выполнено с использованием такого сочетания. На сегодняшний день источники ДАРТ совместимы с масс-спектрометрами компаний AB Sciex, JEOL, Thermo Scientific, Bruker, Agilent, Shimadzu и Waters, однако на момент проведения наших

59

исследований литературные данные об использовании в фармацевтической химии и фармакогнозии таких инструментальных сочетаний практически отсутствовали.

Состав газа, используемого в источнике ДАРТ, и окружающей среды. В качестве газа-носителя для ДАРТ в большинстве работ использовали гелий чистоты 99.999%. Использование азота мало изучено, но известно, что при этом значительно снижается чувствительность. В работах [45, 46] для ДАРТ использовали аргон. Возможность использования неона до данного исследования не показана экспериментально ни в одной работе.

В публикации [31] приведено сравнение масс-спектров толуола при использовании гелия и азота. При использовании гелия сигнал с максимальной интенсивностью в спектре соответствовал протонированной молекуле, а при использовании азота - ион-радикалу М.+. Возможности использования He и N2 в качестве газа-носителя для ДАРТ сравнены также в работе [91]. Скорость потока He изменяли от 0.55 до 2 л-мин-1, а при использовании N2 скорость потока составляла 7 л-мин-1, поскольку при более низких скоростях базовая линия была нестабильна; прочие условия эксперимента при использовании обоих газов были одинаковыми. При использовании гелия в масс-спектрах перметрина и дельтаметрина зарегистрировано большое количество интенсивных сигналов фрагментных ионов, доля которых возрастала при увеличении температуры газа-носителя, а при использовании азота интенсивность сигналов протонированных молекул и фрагментных ионов была минимальна, но был зарегистрирован интенсивный ион [M+NH4]+. При использовании N2 доля фрагментных ионов снижалась. Это объясняли тем, что теплопроводность и энергия метастабильных частиц азота ниже, чем у гелия.

При анализе металлоорганических соединений, содержащих As, Fe, Hg, Pb, Se и Sn, состав масс-спектров сильно зависит от состава газа-носителя [147]. Подачу пробы осуществляли с помощью установки для отбора газовой фазы над раствором из-за токсичности аналитов. Ионизация триэтиларсина с использованием He протекала с преимущественным образованием протонированных молекул и аддуктов [M+OH]+, а при использовании N2 регистрировали ряд других ионов, которые, предположительно, являлись олигомерами триэтиларсина. При анализе других As, Fe, Hg, Pb, Se и Sn-содержащих соединений образовывались различные фрагментые ионы или ионы-аддукты, состав которых зависел от используемого газа. На основании приведенных в статье данных затруднительно выделить закономерности и обобщить информацию, какие ионы образуются преимущественно при анализе металлоорганических соединений с использованием He или N2. Авторы заключают, что азот подходит для идентификации неизвестных соединений методом масс-спектрометрии ДАРТ хуже, чем гелий,

60

поскольку при его использовании необходимы более жесткие условия эксперимента: более высокие температура и напряжения в ионном источнике [43].

Закономерности образования сложных масс-спектров часто можно объяснить различными процессами и ион-молекулярными реакциями, протекающими в области ионизации ДАРТ. Тем не менее, в некоторых работах упоминается наличие в масс-спектрах кластерных ионов-аддуктов аммония [M+NH4]+, появление которых в ряде случаев сложно объяснить. В различных публикациях называют разные возможные причины образования таких ионов, в том числе:

а) помещение источника аммиака (водного раствора гидроксида аммония) в область ионизации [32, 62, 69, 148 - 150];

б) использование вместо гелия азота [59];

в) присутствие в образце аммиаксодержащих примесей [86];

г) присутствие в атмосфере вокруг прибора аммиака [151];

д) выделение аммиака человеческим телом [32, 37, 152, 153].

Чаще всего в публикациях о масс-спектрометрии ДАРТ образование ионов [M+NH4]+ было упомянуто без объяснения его причин (например, в работах [59, 67, 154 - 159]), при этом состав ионов лишь в малом числе работ подтверждали с использованием масс-анализатора высокого разрешения - например, орбитальной ионной ловушки [159]. В нескольких работах утверждалось, что при использовании NH4OH в качестве реагента для ДАРТ можно увеличить чувствительность. Например, при использовании NH4OH детектирование кластерных ионов [M+NH4]+ позволяло увеличить чувствительность определения триацилглицеринов на порядок [62] и обеспечивало более высокую чувствительность детектирования соединений, содержащих только гидроксильные или карбоксильные группы [61]. Также сообщалось, что в масс-спектрах ДАРТ карбонилсодержащих соединений (кислоты, сложные эфиры, кетоны, пероксиды) характерно появление таких ионов-аддуктов [43].

При использовании в качестве реагента дихлорметана или 0.1% раствора трифторуксусной кислоты, размещаемых в нижней части области ионизации, показана возможность обнаружения в масс-спектрах ДАРТ ионов [M+Cl]- и [M+CF3COO]-. Для нитросодержащих взрывчатых веществ возможно образование ионов [M+Cl]- при использовании дихлорметана [160, 161].

Опубликованы работы о применении аргона в качестве газа-носителя для ДАРТ [45, 46]. В возбужденном состоянии внутренняя энергия Ar составляет 11.55 эВ, тогда как значение энергии ионизации воды - 12.6 эВ, поэтому при использовании аргона для ДАРТ не происходит ионизации Пеннинга, которая, согласно общепринятому механизму, является первой стадией ионизации ДАРТ при регистрации положительных ионов с использованием гелия. Такую

61

особенность ионизации использовали для анализа сухого молока и селективного определения меламина (ж/^теор.=127.0732 протонированной молекулы) в нем в присутствии 5-гидроксиметилфурфурола (ГМФ) (ж/^теор.=127.0395 протонированной молекулы) [45]. Аце-тилацетон и пиридин использовали в качестве газов-реагентов, так как они имеют низкие энергии ионизации. По механизму Пеннинга происходила ионизация ацетилацетона и происходил перенос протона от его протонированной молекулы к молекуле пиридина. Затем от протонированной молекулы пиридина протон переносился на молекулу меламина. При этом достигалось увеличение селективности, так как в выбранных условиях не происходила ионизация ГМФ.

Скорость потока газа и температура в ионном источнике ДАРТ. При описании экспериментальных условий почти во всех публикациях по масс-спектрометрии ДАРТ приводится температура, регулируемая с помощью программного обеспечения прибора и соответствующая температуре бнужрм источника ДАРТ. Следует различать температуру внутри источника ДАРТ и реальную температуру, воздействию которой подвергается образец. Температура внутри источника ДАРТ не равна температуре в области ионизации, так как при выходе газа-носителя в открытую атмосферу происходит быстрое охлаждение газа. Однако для удобства приводят температуру внутри источника ДАРТ, поскольку реальную температуру, воздействию которой подвергается образец и которая зависит не только от температуры внутри источника ДАРТ, но и от скорости потока газа через источник и от способа расположения образца, сложно в общем случае измерять. Этим объясняются различные приведенные литературные данные. В одном случае [67] при использовании гелия и температуре внутри источника ДАРТ, равной 200оС, измеренная температура, которой подвергся образец в области ионизации, составила 130оС, а при температуре ДАРТ 450оС - 310оС. В другом случае [162] на кончике капилляра с нанесенным образцом регистрировали изменение температуры во времени в момент начала подачи гелия из прогретого источника в область ионизации. При температуре внутри источника ДАРТ, равной 175оС, температура на кончике капилляра с образцом составляла около 167оС; при температуре внутри источника ДАРТ, равной 250оС - 230оС; при 325оС - 280оС. Температура в области ионизации сохранялась приблизительно постоянной при скорости потока гелия 2 л-мин-1 на всем протяжении изученного в работе интервала времени (0 - 120 с от момента начала подачи гелия), но при скоростях гелия от 4 до 6 л-мин-1 в течение первых 15 секунд от момента подачи газа-носителя в область ионизации температура падала на 20оС и более, и далее убывала медленнее: не более, чем на 10оС за 100 секунд.

62

Приведены данные влияния температуры в источнике ДАРТ на состав масс-спектров небольшого числа образцов, когда повышение температуры вплоть до 350°C не приводило к деградации аналитов [163]. Сигнал протонированных молекул был доминирующим, а интенсивности сигналов фрагментных ионов составляли не более 10 - 15% интенсивности сигнала протонированной молекулы. В ряде случаев происходило окисление аналитов, но интенсивности сигналов продуктов окисления составляли не более 10% интенсивности протонированных молекул соответствующих аналитов.

Влияние температуры внутри ионного источника ДАРТ на чувствительность определения показано на примере анализа плазмы крови [61]. Повышение температуры содействовало десольватации аналитов и их переходу в газообразное состояние, но при слишком высоких температурах происходило быстрое высыхание и обугливание образца, поэтому переход молекул аналитов в газовую фазу замедлялся. В связи с этим значение 300оС выбрано в качестве оптимального. На примере двух соединений установлено, что при увеличении скорости потока гелия через источник увеличивались интенсивности сигналов аналитов, но при высоких скоростях потока происходило автоматическое отключение масс-спектрометра из-за нарушения баланса давлений, либо нежелательное затягивание капель образца в масс-спектрометр. Поэтому авторами рекомендовано значение скорости потока гелия 3.5 л-мин-1. По утверждению авторов, другие изученные параметры - такие, как расстояние от источника ДАРТ до входа в масс-анализатор, скорость внесения образца, напряжения на электродах - практически не влияли на интенсивности сигналов аналитов, хотя изученные интервалы значений этих параметров в работе не приведены.

В другой работе [164] диапазон более низких температур внутри источника ДАРТ 150 -200оС назван оптимальным. Утверждается, что при увеличении температуры до 250оС и выше термодесорбция аналитов (в данной работе, силилированные метаболиты) происходит слишком быстро, что приводит к снижению интенсивности ионов при использовании масс-анализаторов сканирующего типа из-за недостаточной для детектирования скорости сканирования. Кроме того, наблюдалось частичное разложение аналитов при высоких температурах. Оптимальными при использовании масс-спектрометра «AccuTOF», в котором диаметр входного отверстия скиммера составлял около 375 мкм, являлись скорости потока гелия 2.5 - 3 л-мин-1. Число регистрируемых сигналов росло при повышении скорости потока гелия, но при скоростях потока выше 3 л-мин-1 загрязнялась система входа в масс-анализатор, и из-за увеличения турбулентности потока газа снижалась воспроизводимость. Напротив, при сочетании источника ДАРТ посредством вакуумного интерфейса «Vapur» с квадрупольно-времяпролетным масс-

63

анализатором оптимальным, как было установлено, являлось минимальное значение скорости потока, равное 0.55 л-мин-1. Диапазон температур ДАРТ 150 - 250оС был выбран в качестве оптимального для идентификации производных бензола в природных водах [94]. При анализе стабилизаторов в образцах из полипропилена [150] указан более широкий диапазон оптимальных температур (150 - 350оС). В качестве оптимального выбрано значение температуры 250оС.

При изучении интенсивности сигналов некоторых компонентов лекарственных средств при варьировании температуры в источнике ДАРТ [165], напротив, колоколообразной зависимости от температуры ДАРТ не наблюдали. Использовали квадрупольный масс-анализатор, исследовали диапазон температур 50 - 500оС. Содержание аналитов в анализируемых растворах составляло 1 мг-мл-1. Зависимости интенсивностей протонированных молекул и некоторых характеристичных фрагментных ионов вориконазола в масс-спектрах от температуры не выявлено, но в качестве оптимального назван диапазон температур 200 -350оС, в котором результаты наиболее стабильны. Авторы заключают, что варьирование температуры газа-носителя для ДАРТ важно при управлении фрагментацией аналитов. При повышении температуры отмечено увеличение интенсивностей фрагментных ионов по отношению к протонированной молекуле.

Опубликованы данные исследования [63], в котором значение температуры ДАРТ 425оС выбрано в качестве оптимального для количественного анализа биожидкостей. Эффективность ионизации при более низких температурах была недостаточной. При более высоких температурах происходило разложение аналита. Для ионизации аналитов с относительной молекулярной массой более 600 а.е.м. также рекомендовано использовать высокие температуры [119].

Оптимизация скоростей потока и температур в зависимости от используемого газа - азота или гелия - проведена при анализе металлоорганических соединений при сочетании с ДАРТ линейной ионной ловушки [147]. Оптимальными значениями скоростей потока гелия, используемого в качестве газа-носителя для ДАРТ, являлись 6.5 л-мин-1 и более. При использовании азота оптимальными были значения 2.5 - 3.5 л-мин-1. Температура влияла по-разному на интенсивность сигналов различных аналитов. При температурах от комнатной до 350оС наблюдался как рост, так и снижение сигнала. Утверждается, что нагревания не требовалось при анализе высоколетучих соединений, но пределы их детектирования при этом не обсуждаются. Основная роль обогрева газа, как считают авторы работы, состоит в термодесорбции аналитов для последующей ионизации/диссоциации их кластеров в газовой фазе. При исследовании влияния температуры на состав масс-спектров при использовании

64

гелия или азота наблюдали ионы [M+NH4]+ [91, 147], но их происхождение не объясняли. При повышении температуры от 100 до 150оС и при использовании гелия происходило увеличение интенсивности сигналов протонированных молекул и снижение интенсивности сигнала ионов [M+NH4]+. Затем интенсивность протонированных молекул при еще большем повышении температуры начинала убывать за счет фрагментации. Напротив, интенсивность ионов [M+NH4]+ росла в диапазоне температур от 100 до 250оС при использовании азота. Наблюдали снижение или увеличение интенсивности сигналов протонированных молекул с увеличением потока гелия, в зависимости от положения образца в области ионизации.

При идентификации в оливковом масле триацилглицеринов рекомендованы температуры менее 200оС [62], так как при высоких температурах сильно падала интенсивность ионов [M+NH4]+. В работе использовали NH4OH в качестве реагента. В изученном диапазоне температур (100 - 450оС) с увеличением температуры росла интенсивность фрагментных ионов.

Для источника ДАРТ, изготовленного в лабораторных условиях, произведены газодинамические расчеты, смоделированы температурные градиенты и эксперименты [51]. Доказано, что интенсивность сигналов сильно зависит от положения образца в области ионизации - что ранее, особенно в первых работах по масс-спектрометрии ДАРТ, чаще всего не указывалось. Интенсивность сигнала увеличивалась на 128% при оптимизации расположения образца. Показана также возможность увеличения чувствительности определения на порядок при оптимальном расположении образца в области ионизации [70].

В небольшом числе работ варьирование температуры ДАРТ использовали для повышения селективности. Поочередную регистрацию различных классов соединений в зависимости от их температур кипения обеспечивало постадийное изменение температуры от 50 до 100, до 200 и до 300оС при исследовании состава листьев и побегов эвкалипта [166]. При самых низких температурах регистрировали легколетучие монотерпены и гидроксицитроналлал. Особенностью регистрируемых масс-спектров являлось присутствие кластерных ионов [2M+H]+ и [M1+M2+H]+. Интенсивность сигналов таких ионов снижалась с увеличением температуры газа-носителя гелия. При 200оС регистрировали терпены с более высокими Ткип.. При температурах выше 300оС регистрировали продукты пиролиза растительных волокон: альдегиды, кетоны, фураны, замещенные бензолы.

В первых моделях ионных источников ДАРТ была предусмотрена возможность программирования температурных градиентов, но первая статья о программировании температуры в масс-спектрометрии ДАРТ опубликована лишь в 2010 году [69]. 3 компонента с одинаковым целочисленным значением w/z (158.057 - ион [M+NH4]+ 5-нитро-1Н-пиридин-2-она; 158.075 - ион [M+NH4]+ изопропилового эфира фторангидрида метилфторфосфоновой

65

кислоты (зарина); и 158.191 - ион [M+H]+ ^№диметилоктан-1-амина) разделяли за счет различий в их температурах кипения при помощи программирования температуры в ДАРТ. Раствор гидроксида аммония использовали в качестве реагента. Температуру увеличивали со скоростью 1.5оС-с-1 от 75 до 400оС, при этом происходило разделение компонентов во времени. К сожалению, в более новых моделях ионных источников ДАРТ возможность программирования температуры исключена - видимо, с целью удешевления технологии. Кроме того, в них отсутствует возможность варьирования скорости потока газа-носителя, и она зафиксирована для гелия на значении около 3 л-мин-1.

Напряжения на игле и электродах источника ДАРТ и входе в масс-анализатор. В модели источника ДАРТ «DART 100» было три электрода - первый и второй перфорированные дисковые электроды (первый из которых был заземлен), а также решетчатый электрод. В современных моделях источника «DART SVP» и «DART SVPA» оставлен только решетчатый электрод.

В большинстве первых публикаций о масс-спектрометрии ДАРТ потенциал на газоразрядной игле составлял от +1 до +5 кВ, а потенциалы на втором перфорированном и решетчатом электроде составляли, в зависимости от того, положительные или отрицательные ионы регистрируются, около ±100 В и ±250 В, соответственно. В современных моделях источника «DART SVP» перфорированные электроды удалены. Только масс-спектрометр «AccuTOF» сочетается с источниками ДАРТ непосредственно, без вакуумного интерфейса-сепаратора, и для такого сочетания известны некоторые данные изучения влияния напряжения на входном скиммере масс-анализатора на состав масс-спектров ДАРТ. При использовании других масс-спектрометров, сочетаемых с ДАРТ посредством интерфейса «Vapur», следует также ожидать влияния напряжений на входной системе масс-анализатора на состав масс-спектров, но литературные данные об изучении этого влияния до данного исследования отсутствовали.

Возможность фрагментации ионов, образовавшихся в результате ионизации ДАРТ, с увеличением напряжения на входном скиммере масс-спектрометра «AccuTOF» впервые упомянута [2] без приведения соответствующих экспериментальных данных. Возможность управления фрагментацией напряжением на входном конусе масс-анализатора подтверждена в ряде публикаций. В работе [ 167] для преимущественного детектирования протонированных молекул напряжение на входном конусе устанавливали равным 20 В. Более высокие значения напряжений 40 и 60 В инициировали диссоциацию, индуцированную столкновениями. Для

66

меламина кроме протонированных молекул регистрировали также ионы [M+H-CH2N2]+ и [M+H-H2O]+ и некоторые фрагментные ионы.

Степень фрагментации наркотиков также увеличивалась с увеличением напряжения на скиммере [84]. По характеру фрагментации, увеличивая напряжение до 90 В, в некоторых случаях различали изомеры с одинаковой брутто-формулой и разными структурными формулами. Анализировали модельные растворы в метаноле с высоким содержанием аналитов (1 мг-мл-1). На примере 25 образцов кокаина установлено [168], что даже при высоких значениях напряжения на входном конусе масс-анализатора для следовых количеств (примесей) аналитов изомеры различить невозможно.

Дополнительную информацию об аналитах можно получать, варьируя напряжения на скиммере [152]. Минимальную, умеренную и выраженную диссоциацию, индуцированную столкновениями, можно было обеспечить при использовании значений напряжения на скиммере, равных 15, 40 и 70 В, соответственно. Доля димерных ионов [2M+H]+ и [2M+NH4]+ была минимальна в масс-спектрах, зарегистрированных при напряжении на скиммере, равном 40 В. Кроме протонированных молекул, образовывались также ионы [M-H2O+H]+, [M-CO2+H]+, [M+O+H]+ и [M-CO2+H]+. При увеличении потенциала на скиммере до 80 В создавалась разность потенциалов 65 В, обеспечивающая фрагментацию нековалентно связанных аддуктов, что использовали при изучении фрагментации нуклеотидов и нуклеозидов [169]. Однако в другой работе [86], напротив, для фрагментации применяли напряжения выше 60 В, а значение 60 В использовали в стандартном режиме.

Название фрагментации, обусловленной повышенными значениями напряжения на конусе, неоднозначно в разных литературных источниках. Её обозначали аббревиатурой CID и в большинстве статей [36, 62, 152, 167] расшифровывали как «collision induced dissociation» -диссоциация, индуцированная столкновениями. Несмотря на то, что при использовании понятия «диссоциация, индуцированная столкновениями» допускается возможность столкновения ионов с поверхностью [170], устоявшимся является применение этого значения для столкновений ионов с нейтральными частицами газа [127, 128]. В связи с этим, более удачной в данном случае нам представляется ее расшифровка как «cone-induced dissociation» - диссоциация, индуцированная напряжением на конусе, предложенная в работе [60].

Величина максимального упомянутого в литературе напряжения на скиммере масс-анализатора при ионизации ДАРТ, которое использовали для регистрации отрицательных ионов, составляет -240 В [57, 171]. За счет использования столь высоких напряжений (от -140 до -240 В) регистрировали изотопные распределения ионов 79Br- и 81Br- с высокой точностью, в

67

отсутствие перекрывающихся пиков, поскольку все органические ионы, которые могли бы мешать регистрации ионов брома, при таких высоких напряжениях фрагментировались. Аналогично [62] для содействия фрагментации положительных ионов также повышали значения напряжения на конусе - от 20 до 150 В.

На интенсивность сигналов металлоорганических соединений влияло напряжение на газоразрядной игле ионного источника ДАРТ [147]. Интенсивность сигналов увеличивалась с ростом напряжения. В качестве оптимального выбрано значение напряжения, равное 4 кВ. Интенсивность сигналов аналитов зависела от напряжений на электродах источника, что противоречит данным [163], где утверждается, что нет существенного влияния напряжений на электродах ДАРТ на интенсивность сигнала, но при этом изученный в работе диапазон напряжений не указан. Второй перфорированный электрод служил для удаления ионов, образовавшихся в источнике после разряда. При изменении его напряжения от -300 до 0 В интенсивность сигналов аналитов почти не менялась, но при увеличении напряжения от 0 В до +100 В происходило их резкое снижение. Последующее увеличение напряжения в диапазоне выше +100 В уже не влияло на интенсивность сигналов. Роль решетчатого электрода, по утверждению авторов, состоит в минимизации реакций ион-ионных рекомбинаций на выходе из источника ДАРТ. Утверждается, что при напряжении на нем, отличном от нуля, почти для всех аналитов наблюдали снижение интенсивности сигналов.

Приведенные выше рассмотрение и сопоставление данных из публикаций по оптимизации условий эксперимента в масс-спектрометрии ДАРТ и фрагментации соединений разных классов позволяют сделать вывод о том, что нет единых условий, универсальных для всех соединений и обеспечивающих высокую чувствительность и однозначность состава масс-спектров. Помимо описанных выше параметров, на окончательный состав масс-спектров ДАРТ могут также влиять особенности масс-анализатора, сочетаемого с источником ДАРТ, что необходимо учитывать при анализе любых литературных данных, полученных с использованием масс-спектрометрии ДАРТ.

1.2.4. Сопоставление с другими методами ионизации для масс-спектрометрии в нормальных условиях

Масс-спектрометрия ДАРТ является областью масс-спектрометрии, известной под собирательным термином «масс-спектрометрия в нормальных условиях» (ambient mass spectrometry) [172]. Внедрение масс-спектрометрии в нормальных условиях, благодаря

68

реализации путем прямой регистрации сигналов аналитов в их исходных матрицах или на подложках в условиях открытой атмосферы, привлекательно для сокращения пробоподготовки и разделения в масс-спектрометрическом анализе [ 173]. Методы масс-спектрометрии в нормальных условиях позволяют проводить анализ без пробоподготовки более эффективно по сравнению с другими способами прямого анализа объектов в масс-спектрометрии, существовавшими ранее (например, прямого ввода жидкостей в масс-спектрометр с ионизацией электрораспылением (ИЭР) [ 174] или прямого ввода органических субстанций в масс-спектрометр с электронной ионизацией [ 175]), в том числе, за счет отсутствия необходимости частой очистки источников ионизации и/или системы ввода масс-анализаторов.

Первыми среди методов ионизации для масс-спектрометрии в нормальных условиях стали известны ионизация ДАРТ и десорбционная электрораспылительная ионизация (ДЭРИ) [ 176 -179]. После того, как в 2004-2005 г. появились ДЭРИ и ДАРТ, были изобретены десятки других методов ионизации в нормальных условиях, описанные в ряде обзоров [173, 180 -186]. К таким методам относятся, например:

• атмосферный зонд для анализа твердых образцов (atmospheric-pressure solids analysis probe, ASAP) [187 - 189];

• лазерная десорбция/ионизация при содействии электрораспыления (electrospray-assisted laser desorption/ionization, ELDI) [190,191];

• десорбционная ионизация звуковым спреем [192];

• десорбционная химическая ионизация при атмосферном давлении (desorption-atmospheric pressure chemical ionization, DAPCI) [193];

• десорбция/ионизация при содействии плазмы (plasma-assisted desoprtion/ionization, PADI) [194];

• ионизация гелиевой плазмой (helium plasma ionization, HePI) [ 195];

• ионизация звуковым спреем с бумаги (paper spray ionization, PSI) [ 196, 197];

• ионизация разрядом диэлектрического барьера (dielectric-barrier discharge ionization, DBDI) [198];

• ионизация с помощью низкотемпературной плазмы (LTP - low-temperature plasma) [199];

• ионизация звуковым спреем (desorption sonic spray ionization, SSI) [200 - 202], в том числе упрощенная ионизация звуковым спреем (easy ambient sonic spray ionization, EASI ) [203, 204] и ее модификация, включающая самонакачку Венчури (Venturi easy ambient sonicspray ionization, V-EASI) [205];

69

* поточная пост-ионизация при использовании атмосферного тлеющего разряда (flowing atmospheric-pressure afterglow, FAP А) [40, 206];

* экстракционная ионизация электрораспылением (desorption electrospray ionization, EESI) [207].

Масс-спектрометрия ДАРТ является одним из наиболее распространенных методов ионизации для масс-спектрометрии в нормальных условиях, основанных на использовании плазмы (рисунок 12).

Б

Рисунок 12 - Число публикаций по методам ионизации для масс-спектрометрии в нормальных условиях, основанным на использовании плазмы, в 2005-2013 гг. (А); распределение этих же публикаций в зависимости от типа ионизации (Б), заимствовано из [208] О 2014 Springer

PAD)1% ASAP/HeP)5%

FAPA2%

В открытом доступе находится небольшой обзор [209] о применениях различных методов ионизации в нормальных условиях для выявления фальсифицированных лекарственных средств, а также обзор о применениях таких методов в метаболомике [210]. В 2016 году исследователями из Китая опубликован обзор [211] об анализе синтетических и природных ЛС методом масс-спектрометрии ДАРТ.

В целом из всех методов масс-спектрометрии в нормальных условиях сегодня наиболее широко распространенными и отработанными способами ионизации являются ДАРТ и ДЭРИ [212], что связано, видимо, с их потенциальной привлекательностью для решения большого числа задач и коммерческой доступностью. В ДАРТ в общем случае не используется растворитель, что является одним из достоинств метода. На образец направляется из ионного источника нагретый поток газа (обычно это гелий или, реже, азот), который, как предполагается, содержит метастабильные частицы, посредством которых осуществляется десорбция и ионизация молекул аналитов с поверхности образца. В ДЭРИ, как и в ионизации электрораспылением, всегда используется растворитель и происходит генерация спрея

70

заряженных микрокапель с помощью электрораспылительного капилляра. Этот спрей в условиях открытой атмосферы направляется на поверхность анализируемого образца (рисунок 13).

' перемещаемая подложка ,

образца е условиях отрытой атмосферы

Рисунок 13 - Схема ионного источника ДЭРИ, заимствовано из [176] О 2004 AAAS

В ДЭРИ последовательно происходит десорбция молекул аналитов с поверхности образца, их ионизация, десольватация и попадание в масс-спектрометр. Фактически, электроспрей в ДЭРИ выполняет ту же функцию, что и поток газа в ионизации ДАРТ -функцию выделения молекул аналитов из поверхностного слоя образца, их ионизации и перевода в масс-анализатор.

Масс-спектры ДЭРИ похожи на масс-спектры ионизации электрораспылением, а достоинством ДАРТ по сравнению с ДЭРИ является отсутствие образования ионов-аддуктов с металлами и многозарядных ионов (рисунок 14).

Рисунок 14 - Масс-спектры субстанции сальвинорина, зарегистрированные с ионизацией ДАРТ (А) [213] и ДЭРИ (Б), заимствовано из [214] О 2010 John Wiley & Sons, Ltd.

71

Ионизацию ДАРТ можно применять для детектирования соединений с относительной молекулярной массой, как правило, не более 1000 а.е м., а в ионизации ДЭРИ рабочий диапазон массовых чисел более широк. В этом смысле методы следует считать не конкурирующими, а дополняющими друг друга. ДЭРИ можно применять как для малых молекул, так и для анализа полимеров.

На рисунке 15 [215] представлены области применимости методов масс-спектрометрии ДАРТ и ДЭРИ в зависимости от относительной молекулярной массы и полярности аналитов.

100000

ДЭРИ

10000

м !С

5

tn

I

О-

я

ё

s

1000

100

ж

ДАРТ

10

неполярные соединения

очень полярные соединения

Рисунок 15 - Области применимости масс-спектрометрии ДАРТ и ДЭРИ, заимствовано из [215]

Как известно из литературных данных и видно из рисунка 15, метод масс-спектрометрии ДАРТ применим для детектирования относительно небольших молекул и непригоден, например, для ионизации белков - но в случае анализа многих (био)проб это может являться, в зависимости от задачи, и достоинством метода, так как позволяет существенно снизить влияние высокомолекулярной матрицы образца на состав регистрируемых масс-спектров.

При анализе образцов сложного состава, например, биопроб, для ДАРТ и ДЭРИ проблему представляет воспроизводимость [212, 216]. Часто в биоанализе необходимы количественные измерения, что ограничивает применимость ДАРТ и ДЭРИ и их использование в биоанализе вместо ВЭЖХ-МС.

По сравнению с масс-спектрометрией ДЭРИ преимуществами масс-спектрометрии ДАРТ для решения ряда задач фармацевтической химии и фармакогнозии являются:

72

• отсутствие многозарядных ионов, что важно для однозначной интерпретации масс-спектров любых аналитов;

• ионизация в потоке газа, т.е. отсутствие влияния примесей из растворителя на состав масс-спектров;

• ионизация низкомолекулярных соединений с относительной молекулярной массой, как правило, не выше 1000.

Последнее условие обеспечивает минимизацию влияния матрицы при анализе таких образцов, как, например, таблетированные лекарственные препараты, матрица которых состоит преимущественно из неорганических или высокомолекулярных соединений. В связи с этим, анализ ЛС является одной из наиболее привлекательных областей применения масс-спектрометрии ДАРТ.

1.3. Анализ лекарственных средств, биоматериалов и прочих объектов методом масс-спектрометрии ДАРТ

В задачи современной фармации входит поиск и развитие новых методов и подходов для анализа не только ЛС, но и других объектов - например, фармакогностических объектов животного и растительного происхождения или биоматериалов подопытных животных, на которых тестируют новые лекарственные средства. К методам анализа предъявляются высокие требования как с точки зрения обеспечения необходимой производительности, так и с точки зрения высокой степени достоверности получаемых данных. Применимость метода ВЭЖХ-МС, часто используемого для высокоселективного и чувствительного определения полярных азотсодержащих молекул, содержащихся в ЛС или биоматериалах, может быть ограничена как высокой стоимостью одного анализа, включающего дорогостоящую пробоподготовку, так и недостаточно высокой производительностью, поэтому развитие других, более экспрессных, методов масс-спектрометрического анализа для решения задач фармации весьма актуально. В первых публикациях о масс-спектрометрии ДАРТ проводили только качественный анализ, а образцы вводили вручную. Впоследствии, после изобретения некоторых позиционирующих устройств и автодозаторов, появились публикации о возможности проведения количественного анализа методом масс-спектрометрии ДАРТ.

Необходимо пояснить, почему для методов масс-спектрометрии, включая масс-спектрометрию ДАРТ, понятие «предел детектирования» часто значительно отличается от его классического определения, в котором за предел детектирования прибора принимают

73

количество аналита, требуемое для регистрации сигнала, по величине трехкратно превосходящего стандартное отклонение уровня шума. В масс-спектрометрии во многих случаях нельзя корректно определить уровень шума, а сигнал шума или сигнал от холостой пробы отсутствуют за счет характеристик используемого масс-спектрометрического оборудования и применяемых особых условий обработки сигналов, в том числе программной. Поэтому к масс-спектрометрии в общем случае не применим ряд принятых в статистике нормативов, требующих использования величины разброса фонового сигнала или сигнала холостого опыта. Это связано с алгоритмами обработки масс-спектрометрических сигналов и проиллюстрировано рисунком 16.

Рисунок 16 - Отношения сигнал/шум для различных уровней сглаживания сигналов и задания пороговых значений: А) сглаживание по 9 точкам; Б) фильтр сглаживания отключен, чтобы видеть исходные данные, но уровень шума задан как положительный, что означает, что задано пороговое значение для шума для его маскирования; В) воссоздание реальной базовой линии -в этом случае реальное значение сигнал/щум приблизительно равно трем, но в системе, которую использует оператор для сбора данных, такое представление данных может быть не доступным для пользователя. Заимствовано из [217] О 2010 АВ SCIEX.

Как следует из этого рисунка и из разъяснений производителей масс-спектрометров, в масс-спектрометрии оценка реальной величины «шума)) часто затруднительна вследствие практического использования программ, не позволяющих увидеть реальный разброс сигнала шума. В связи с этим для оценки сигналов детектирования в масс-спектрометрии применяют приемы, основанные на обработке сигналов, полученных в результате серий многократных

74

вводов модельных растворов с содержанием аналита, близким к ожидаемому пределу детектирования прибора [218 - 221].

Следует понимать, что источник ДАРТ - это «приставка» к масс-спектрометру, а чувствительность каждой отдельной масс-спектрометрической системы в целом определяется совокупностью свойств ее отдельных узлов (включая источник ионизации, систему ввода, масс-анализатор и детектор). Кроме того, из того, что ионизация ДАРТ происходит в условиях открытой атмосферы, следует, что детектирующая способность масс-спектрометра с ионизацией ДАРТ будет зависеть не только от приборных характеристик, но и от постоянства условий окружающей среды в комнате, где находится такой прибор.

В последующем разделе рассмотрен качественный и количественный анализ различных объектов - не только ЛС и фармакогностических объектов, но и других, так как подходы, разработанные для различных аналитов, могут быть перенесены на объекты, важные для фармации. Если не оговорено иное, приведены данные, доступные в литературе во время проведения наших исследований. Данные, появившиеся после наших исследований, приведены преимущественно в главах, посвященных обсуждению результатов.

До наших исследований не опубликовано ни одной работы по анализу лекарственных средств российского производства методом масс-спектрометрии ДАРТ, а также ни одной другой работы об анализе каких-либо объектов этим методом в России.

1.3.1. Анализ синтетических лекарственных средств

Масс-спектрометрия ДАРТ может найти свое применение на разных стадиях разработки новых лекарственных средств [55]: для идентификации продуктов реакций, детектирование которых методом ВЭЖХ-МС затруднительно; для оценки степени прохождения реакций синтеза; для экспресс-анализа фракций препаративной ВЭЖХ; для изучения фотодеградации действующего вещества в капсулах; для полуколичественного определения действующего вещества в таблетках.

Уже после того, как была выполнена значительная часть наших исследований по развитию и применению масс-спектрометрии ДАРТ в фармацевтической химии и фармакогнозии, в ноябре 2012 г. в открытом доступе появилась первая версия базы масс-спектров ДАРТ для криминалистики, создаваемой Национальным институтом стандартов и технологии (NIST, США) [213]. На сегодняшний день после обновлений эта база содержит масс-спектры ДАРТ для 828 субстанций биологически активных соединений. Все приведенные

75

в ней масс-спектры получены с использованием одной и той же модели масс-спектрометра «АссиТОҒ», и в ней нет данных о том, в каком агрегатном состоянии, а также (если это были растворы) в какой концентрации и в каком растворителе аналиты подвергались анализу, поэтому применимость этой базы данных весьма условна. Однако на основании этой базы стало возможным получить первичное представление о том, как может выглядеть масс-спектр ДАРТ для ряда аналитов, представляющих интерес для фармацевтического анализа, что полезно при планировании экспериментов с использованием масс-спектрометрии ДАРТ. Рассмотрим на примере масс-спектра кофеина из этой базы данных (рисунок 17) достоинства быстрой идентификации компонентов фармацевтических субстанций методом масс-спектрометрии ДАРТ по сравнению с идентификацией методом спектроскопии в инфракрасной области спектра (ИК-спектроскопии).

В масс-спектре ДАРТ кофеина наблюдается интенсивный сигнал его протонированной молекулы с ти/z 195.0899, по наличию которого можно подтвердить наличие кофеина в исследуемом образце, зная только его моноизотопную молекулярную массу. Для сравнения на рисунке 18 приведены ИК-спектры субстанции кофеина.

Отн. интенсивность

Рисунок 17 - Масс-спектр ДАРТ кофеина, заимствовано из [213]

Заметны отличия между спектрами одной и той же субстанции, полученными на двух разных ИК-спектрометрах, а без сравнения с атласом спектров предположить, какому соединению принадлежат оба спектра, весьма затруднительно. При рассмотрении же масс-спектра ДАРТ отнесение сигнала можно произвести, зная только моноизотопную молекулярную массу аналита, являющуюся его универсальной характеристикой. Моноизотопная молекулярная масса кофеина равна 194, а в масс-спектре ДАРТ присутствует интенсивный сигнал протонированной молекулы этого соединения, для которой значение ти/z на единицу больше соответствующей моноизотопной молекулярной массы.

76

Рисунок 18 - Сравнение ИК-спектров субстанции кофеина, полученных на двух разных ИК-спектрометрах, заимствовано из [222]

С точки зрения скорости и простоты проведения анализа метод масс-спектрометрии ДАРТ значительно привлекательнее ВЭЖХ-МС и ГХ-МС. Проведено сопоставление возможностей масс-спектрометрии ДАРТ и метода ВЭЖХ-МС при анализе ряда фармацевтических субстанций [163]. Анализировали растворы в метаноле с содержанием 100 мкг-мл"'.

Хотя масс-спектры ДАРТ представлены полностью только для растворов ломефлоксацина и сульконазола, в работе приведены в табличном виде (таблица 7) для ряда других соединений данные сравнения интенсивностей сигналов протонированных и депротонированных молекул в масс-спектрах ДАРТ и ИЭР. Если в масс-спектрах ИЭР аналитов наблюдались ионы [М+Н] , то эти же ионы наблюдались для этих аналитов также и в масс-спектрах ДАРТ, но их интенсивности были на 1 - 2 порядка ниже, чем при ИЭР. Данные по идентификации этих же действующих веществ в готовых лекарственных формах в работе отсутствовали.

77

Таблица 7 - Сравнение относительных интенсивностей (/отн.) ионов в масс-спектрах ДАРТ и ИЭР для растворов фармацевтических субстанций при нормализации по наиболее интенсивным сигналам в масс-спектрах ИЭР, заимствовано из [163] О 2007 American Chemical Society

Соединение ДАРТ ИЭР

[M+H]+ [M-H]- [M+H]+ [M-H]-

^отн. ^/^ ^отн. ^/^ ^отн. ^/^ ^отн.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Варфарин 309 0.2 307 0.7 309 1.0 307 1.0

Терфенадин 472 0.4 - - 472 1.0 - -

Пропранолол 260 0.3 - - 260 1.0 - -

Лабеталол 329 0.2 327 0.5 329 1.0 327 1.0

Пироксикам 332 0.5 330 0.4 332 1.0 330 1.0

Пириметамин 249 0.4 - - 249 1.0 - -

Соталол 273 0.1 271 0.1 273 1.0 271 1.0

Лоперамид 477 0.4 - - 477 1.0 - -

Ломефлоксацин 352 0.07 - - 352 1.0 - -

в-Эстрадиол 273 0.1 - - 273 1.0 271 1.0

Хлорталидон 339 0.9 337 0.2 339 1.0 337 1.0

78

Таблица 7 (окончание)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Сульконазол 397 0.1 - - 397 1.0 - -

Тербуталин 226 0.6 - - 226 1.0 224 1.0

Оксифенциклимин 345 0.9 - - 345 1.0 - -

Пенацилламин 150 0.6 148 0.01 150 1.0 148 1.0

Г идроксизин 375 0.1 - - 375 1.0 - -

Проглумид 335 0.1 333 0.03 335 1.0 333 1.0

5-(4-гидроксифенил)-5-фенил- гидантоин 269 0.9 267 0.05 269 1.0 267 1.0

4-циано-4-фенилпиперидин 187 0.3 - - 187 1.0 - -

Г люкуроновая кислота - - 193 0.7 - 1.0 193 1.0

Атропин 290 0.1 - - 290 1.0 - -

Циметидин 253 0.7 251 0.1 253 1.0 251 1.0

Кленбутерол 277 0.4 - - 277 1.0 - -

Прометазин 285 0.4 - - 285 1.0 - -

79

При изучении состава субстанций в криминалистике сравнивали масс-спектрометрию ДАРТ и ГХ-МС [84]. Масс-спектры ДАРТ приведены для субстанций кодеина, гидрокодона, фентермина, метафентамина, морфина, гидроморфона, скополамина, кокаина, диэтиламида лизергиновой кислоты (LSD), метоксипропиламида лизергиновой кислоты (LAMPA), буфотенина и псилоцина. Пределы детектирования методом масс-спектрометрии ДАРТ в растворах составили около 10 - 30 нгмл-1. При использовании масс-спектрометрии ДАРТ было возможно зарегистрировать большее число примесей, чем при ГХ-МС. В другой работе со схожей задачей [168] методом масс-спектрометрии ДАРТ с времяпролетным масс-анализатором на примере анализа 25 образцов кокаина показано, что результат анализа сильно зависит от человеческого фактора, и для достоверного подтверждения результата для многих образцов необходимо многократное повторение анализов.

Преимущества быстрого обнаружения фальсифицированных лекарственных препаратов методом масс-спектрометрии ДАРТ впервые показаны для антималярийных таблеток, содержащих артесунат [153]. При использовании гидроксида аммония наблюдали ионы [M-H]-или [M+NH4]+, а в его отсутствие - только фрагментные ионы. В спектрах некоторых поддельных препаратов регистрировали сигналы артемизинина в виде ионов [M+H]+ и [M+NH4]+. Для некоторых аналитов наблюдали димерные ионы [2M+H]+ и [2M+NH4]+, а также фрагментные ионы. Теми же соавторами выполнено еще несколько экспериментальных работ по анализу антималярийных ЛС методом масс-спектрометрии ДАРТ с применением некоторых других методов анализа [223 - 227] и небольшой обзор литературы о различных методах идентификации поддельных ЛС [ 228].

В 2009 году эта группа разработала новый гибридный способ ионизации, сочетающий ДАРТ и ДЭРИ [229], а в 2010 году - способ ионизации с абляцией инфракрасным лазером, индуцированной метастабильными частицами [139], в котором пространственное разрешение для источника ДАРТ улучшали за счет дооснащения его лазером и приложения лазерного импульса. Когда с использованием такого модифицированного ионного источника ДАРТ получали масс-спектрометрические изображения таблеток и водорослей, пространственное разрешение определялось размерами микролунки, образуемой за счет лазерного импульса, а не диаметром сечения ионизирующего потока, а предел детектирования составлял 15 - 30 пг.

В 2008 г. осуществлено сочетание прототипа мобильного масс-спектрометра весом менее 45 кг с коммерческим источником ионизации ДАРТ [154] и показана возможность идентификации компонентов таблетки препарата «Ибупрофен» с использованием такого прибора. В спектрах этой таблетки присутствовали сигналы действующего вещества [M+H]+,

80

[M+NH4]+ и [M-COOH]-. Работы по развитию применений данного прототипа в фармацевтическом анализе отсутствуют. В 2011 году впервые проведено сочетание ионизации ДАРТ со спектрометрией ионной подвижности [230], а с 2013 компанией «Photonics» (США) разработан серийный спектрометр ионной подвижности с ионизацией ДАРТ весом 14.5 кг, в котором в качестве газа-носителя используется азот. Метод спектрометрии приращения ионной подвижности, изобретенный в 1982 году в Новосибирском Академгородке [231], обладает более высокими чувствительностью и селективностью по сравнению с методом спектрометрии ионной подвижности [232], поэтому его сочетание с ионизацией ДАРТ может представлять практический интерес. В настоящее время этот метод развивают научные коллективы Конструкторско-технологического института геофизического и экологического приборостроения Сибирского отделения Российской Академии Наук и Национального исследовательского ядерного университета «МИФИ».

Показана возможность полуколичественной оценки содержания действующего вещества в таблетках [55]. Использовали таблетки весом 100 мг, содержащие 0.25, 2.5 и 25 мг действующего вещества (название соединения не приведено), для их ввода в область ионизации ДАРТ использовали пинцет и для каждой таблетки проводили 5 параллельных измерений. Для оценки количества аналита использовали среднюю высоту пика на хронограмме ДАРТ, зарегистрированного в режиме мониторинга протонированных молекул.

Опубликованы данные о возможности выявления фальсифицированных ЛС, содержащих этокситриб [55] и алпразолам [233], путем идентификации этих действующих веществ в масс-спектрах ДАРТ. Анализ ЛС методом масс-спектрометрии ДАРТ упоминается также в работах нескольких других групп, в которых приведены масс-спектры таблетки обезболивающего препарата, содержащей ацетаминофен и оксикодон [31], таблеток препаратов «Метоклопрамид», «Анадин» и «Солпадеин» и мази «Проктоседил», некоторых тайских таблетированных биологически активных добавок [234] (анализ препарата «Анадин» упоминается также в работе [235]) и утверждается о возможности выявления фальсифицированных препаратов «Сиалис» [236].

Других литературных данных об анализе синтетических ЛС методом масс-спектрометрии ДАРТ до нашего исследования не было известно.

81

1.3.2. Анализ фармакогностических объектов и биоматериалов

Ниже приведены сведения о литературных данных по анализу фармакогностических объектов и биоматериалов методом масс-спектрометрии ДАРТ, опубликованные до завершения основной части настоящего исследования.

Метод масс-спектрометрии ДАРТ использовали для идентификации соединений класса таксолов в каллюсе Тһхмл waZ/7'сА/һиа [148], тропановых алкалоидов в корнеплодах [237], метиловых эфиров жирных кислот в бактериальных клетках [238], а также компонентов, входящих в состав частей некоторых растений - бузины [149], эвкалипта [166], пшеницы [60], бамбука [ 239]. Близкие виды перца дифференцировали по их масс-спектрам ДАРТ, полученным при прямом анализе листьев [240]. Структуру каннабиоидного индола в растительном наркотическом сырье, нелегально распространяемом в Японии, успешно установили при сочетании данных масс-спектрометрии ДАРТ, ГХ-МС, ВЭЖХ-МС и ЯМР [ 241].

Определение фунгицидов в зернах пшеницы [60, 171 ] проводили путем предварительной экстракции этилацетатом. Изучали диапазон содержаний фунгицидов 6 - 1200 мкг-кг-1, что соответствовало 3 - 600 нг-мл-1 экстракта. Прохлораз использовали в качестве внутреннего стандарта. Использовали времяпролетный масс-анализатор «AccuTOF» и автодозатор "AutoDART HTC PAL”. Для пяти фунгицидов коэффициенты корреляции градуировочных графиков составляли R2>0.99. Пределы определения составляли 5-30 нг-г-1, что соответствовало 2.5 - 15 нг-мл-1 экстракта, и превышали пределы определения сочетания высокоэффективной хроматографии/масс-спектрометрии с тандемным масс-анализатором (ВЭЖХ-МС/МС) в 3 - 6 раз. Достоинством подхода, основанного на определении методом масс-спектрометрии ДАРТ, являлась упрощенная пробоподготовка экстрактов.

Данные по анализу биожидкостей и тканей методом масс-спектрометрии ДАРТ также важно рассмотреть для оценки перспектив использования метода в фармации. При разработке и внедрении новых лекарств и поиске биомаркеров заболеваний анализируют большое число однотипных образцов, чаще всего методом ВЭЖХ-МС, наиболее затратными стадиями при этом являются пробоподготовка и хроматографирование. Масс-спектрометрия ДАРТ может стать хорошей альтернативой ВЭЖХ-МС для решения таких задач. Так, показана принципиальная возможность определения лекарств и их метаболитов в биожидкостях и биоматериалах (моча, кровь, ткани) [61, 63], идентификации в слюне кофеина и аминокислот [31], получения профилей метаболитов методом масс-спектрометрии ДАРТ [94, 164, 242, 243] и

82

обнаружения биомаркеров рака яичника при анализе сыворотки крови с проведением дериватизации [244].

При исследовании свойств биологически активных компонентов экстракта крапивы [82] изучены фармакокинетические кривые никотинамида, аденина, синетрина и остхола в сыворотке крови. Пептиды, белки и полисахариды осаждали этанолом с последующим центрифугированием, а полученный супернатант анализировали методом масс-спектрометрии ДАРТ. Концентрации аналитов в сыворотке составляли сотни нгмл-1. Для каждого образца получали данные 7 параллельных измерений и строили градуировочные графики по 4 уровням концентраций. Никакой внутренний стандарт или автодозатор не упоминается. Ввод пробы описан минимально, следующим образом: 3 мкл образца наносили на боросиликатный капилляр, который затем держали в потоке гелиевой плазмы «до полного исчезновения образца». Тот же коллектив изучал [72] фармакокинетические свойства флавоноидов в экстракте бузины. Сыворотку крови также обрабатывали этанолом и центрифугировали. Наносили 10 мкл экстракта на капилляр, вносили его в область ионизации ДАРТ и удерживали до полного исчезновения сигнала пробы. В качестве внутренних стандартов использовали деметоксикуркумин и метиллинолеат. Максимальная концентрация цианидина в сыворотке крови, определенная методом масс-спектрометрии ДАРТ, составила 3.1±1.0 нмоль-л-1, а при ВЭЖХ-МС определении - 5.4±2.8 нмоль-л-1, то есть, в пересчете на массу вещества, определение обоими методами проводили на уровне нг-мл-1. Авторы заключают о том, что данные масс-спектрометрии ДАРТ и ВЭЖХ-МС сопоставимы, но из приведенных в статье фармакокинетических кривых следует, что результаты, полученные для одних и тех же образцов двумя методами, существенно различались.

Областью биоанализа, в которой возможности масс-спектрометрии ДАРТ в связи со сравнительно узким массовым диапазоном очень ограничены, является протеомика. В первой публикации о методе масс-спектрометрии ДАРТ утверждалось о возможности анализа пептидов [31], но до сих пор нет ни одной статьи, в которой было бы опубликовано подтверждение этой возможности с представлением экспериментальных данных. Известны некоторые публикации об исследованиях белков [245 - 247], но в них масс-спектрометрию ДАРТ использовали только для детектирования низкомолекулярных соединений - например, продуктов ферментативных реакций.

Масс-спектрометрию ДАРТ использовали даже для анализа живых организмов [248] - для определения состава феромонов мухи-дрозофилы до и после спаривания. Для пробоотбора к мухе осторожно прикасались специальным стержнем, который затем вносили в область

83

ионизации ДАРТ. Масс-спектры насыщенных углеводородов содержали интенсивный молекулярный катион-радикал, а масс-спектры гетероатомсодержащих или ненасыщенных углеводородов содержали протонированные молекулы.

Количественная масс-спектрометрия ДАРТ при условии дальнейшего развития подходов, обеспечивающих достаточно высокую воспроизводимость анализов, может найти свое применение при определении компонентов лекарственных средств в биологических жидкостях и тканях, полученных при доклинических и клинических исследованиях. В таких исследованиях необходимо анализировать большие количества однотипных проб, и анализы обычно проводят методом ВЭЖХ-МС с ИЭР и тройным квадрупольным масс-анализатором. Пробоподготовка и хроматографирование являются наиболее затратными стадиями такого анализа. Поскольку каждая серия проб содержит не менее 18 образцов, общая длительность анализа составляет несколько часов даже при отработке условий для быстрого анализа. Продолжительность одного анализа при этом играет критическую роль не только с точки зрения себестоимости анализа, но и с точки зрения правильности получаемых результатов, так как в течение нескольких часов работы прибора может происходить изменение чувствительности системы, которое не всегда удается скомпенсировать методом внутреннего стандарта, поэтому актуальным может являться применение масс-спектрометрии ДАРТ для определения содержания в биологических материалах потенциальных компонентов новых лекарственных средств и их метаболитов.

Описано определение компонентов лекарственных средств в плазме крови методом масс-спектрометрии ДАРТ с тройным квадрупольным масс-анализатором [61], при котором использовали автодозатор "AutoDART HTC PAL” и вакуумный интерфейс. Для 39 биологически активных веществ пределы детектирования при прямом анализе плазмы крови варьировались от 0.25 до 20 нг-мл-1. Для 80% аналитов пределы детектирования составляли ~5 нг-мл-1. Линейный динамический диапазон для более 10 аналитов составлял приблизительно 0.5 - 2000 нгмл-1. При анализе тех же аналитов с использованием масс-спектрометрии ИЭР линейный динамический диапазон был несколько шире: 0.5 - 5000 нг-мл-1. На примере анализа 4 глюкуронидов утверждается, что их предполагаемое разложение в источнике ДАРТ не приводило к увеличению сигнала дочернего иона и не влияло на результат анализа. Данные фармакокинетического исследования лоперамида и верапамила были фактически идентичны для ВЭЖХ-МС и масс-спектрометрии ДАРТ. Преимуществом масс-спектрометрии ДАРТ являлось отсутствие пробоподготовки и быстрый анализ каждого образца в течение 54 секунд, а ограничениями являлись меньшая чувствительность и отсутствие ионизации некоторых

84

веществ. В другом фармакокинетическом исследовании [63] определение лекарств в биоматериалах также проводили методом масс-спектрометрии ДАРТ с тройным квадруполем. По утверждению авторов, использование автодозатора "AutoDART HTC PAL” и интерфейса "Vapur” обеспечивало выигрыш в чувствительности в 10 - 100 раз - видимо, по сравнению с чувствительностью при работе системы в отсутствие вакуумного интерфейса. В той же работе сообщается, что в отсутствие вакуумного интерфейса нарушался уровень вакуума, необходимый для стабильной работы системы. Для разных аналитов оценивали влияние матрицы. Как правило, внутренние стандарты не использовали. Отношения интенсивностей сигналов аналитов при их сравнении для необработанной плазмы крови и для модельных растворов составляли от 0.05 до 0.7. Эффекты матрицы также оценены для разных тканей. Наибольшее влияние матрицы наблюдали при анализе тканей мозга. Для снижения матричных эффектов в некоторых случаях белки предварительно осаждали ацетонитрилом. Пределы детектирования в плазме крови составляли около 1 нг-мл-1 и ниже, что было достаточно для большинства биоаналитических приложений. Данные масс-спектрометрии ДАРТ и ВЭЖХ-МС с ИЭР хорошо коррелировали, но чувствительность масс-спектрометрии ДАРТ была в 2 - 10 раз хуже. Кроме того, установили снижение специфичности за счет отсутствия хроматографирования, тенденцию к разрушению при ионизации некоторых лабильных связей у метаболитов (глюкурониды) и отсутствие детектирования аналитов с относительной молекулярной массой более 1000 а.е.м.

Методом масс-спектрометрии ДАРТ возможно проводить скрининг L-фенилаланина в крови новорожденных для ранней диагностики фенилкетонурии [ 249]. Для этого наносили плазму крови на фильтровальную бумагу, высушивали, вырезали пятно, экстрагировали и проводили анализ экстрактов на кончиках стеклянных капилляров с использованием тройного квадруполя в качестве масс-анализатора. Этап экстракции являлся обязательным, так как прямой анализ пятен с поверхности фильтровальной бумаги не позволял определять аналит с необходимой для данного типа скрининга чувствительностью. Использовали внутренний стандарт без изотопной метки со структурой, близкой к структуре аналита - N,N-диметилфенилаланин, погрешность определения составляла при этом около 15%. Для улучшения чувствительности в метанол для экстракции добавляли 0.1% муравьиную кислоту. Предел детектирования составлял 1 мкмоль-л-1 экстракта, что могло соответствовать количеству около 0.2 нг L-фенилаланина в экстракте, наносимом на кончик стеклянного капилляра.

85

1.3.3. Анализ прочих объектов

Подходы, разработанные на примере анализа различных объектов (в том числе и не связанных напрямую с фармацевтическим анализом) методом масс-спектрометрия ДАРТ, могут быть перенесены на объекты, важные для фармации. В связи с этим, рассмотрение публикаций по анализу объектов, не связанных с фармацией, также представляло интерес. В большинстве публикаций рассматривались только подходы, связанные с проведением качественного анализа.

Идентификация компонентов продуктов питания и душистых веществ. Пищевая химия является одной из областей наук, смежных с фармацевтической химией, а качество и состав продуктов питания напрямую влияют на здоровье человека. Использование масс-спектрометрии ДАРТ в анализе продуктов питания, на наш взгляд, представляет большой интерес с точки зрения разработки и развития методов быстрого скрининга.

Детектирование ү-гидроксибутирата в алкогольных напитках проводили [31] методом масс-спектрометрии ДАРТ на уровне 10-3%. Показана возможность его идентификации в виде отложений соли, содержащейся на уровне 100 нг на ободке питьевого бокала. При регистрации отрицательных ионов возможен скрининг [250] ү-гидроксимасляной кислоты в напитках с пределом обнаружения 0.05 мг-мл-1. Преимущества масс-спектрометрии ДАРТ перед ГХ-МС в анализе безалкогольных напитков показаны в работе [ 251]. По сигналам протонированных или депротонированных молекул идентифицировали антимикробные добавки, искусственные подсластители, регуляторы кислотности и сахариды без пробоподготовки и хроматографирования.

Для идентификации меламина в кормах животных методом масс-спектрометрии ДАРТ предложен [167] нестандартный 4-этапный подход к идентификации, включающий, помимо точного определения и сопоставления отношений ж/z, изучение данных фрагментации, полученных при увеличении напряжения на скиммере масс-анализатора «AccuTOF», и данных водородно-дейтериевого обмена. Для более достоверной идентификации можно использовать изотопные соотношения, характеристичные для соединений заданного элементного состава [149].

Проведена идентификация стробилуриновых фунгицидов и пестицидов в зернах пшеницы методом масс-спектрометрии ДАРТ [60, 171 ]. Порошок из перемолотых зерен анализировали при температуре <200оС в конверте из фильтровальной бумаги. Для количественного анализа использовали экстракты перемолотых зерен в этилацетате, а анализ проводили при 300оС.

86

Масс-спектрометрию ДАРТ использовали для определения качества оливковых масел [62]. Для улучшения воспроизводимости пробоотбора с помощью автодозатора для ДАРТ образцы оливковых масел разбавляли органическим растворителем в соотношении 1:1. Для разных компонентов оливковых масел регистрировали ионы [M+NH4]+, [M+H-RCOO]+, [M+H-RCOOH]+, [M+H-RCO]+, [RCO]+ и [RCO-H2O]+, где R - органический фрагмент молекулы аналита.

При изучении [156, 157] состава компонентов чеснока и лука и возможных механизмов реакций, происходящих с этими компонентами, впервые экспериментально доказали, путем изучения ионов [M+H]+, [M+NH4]+ и [2M+H]+, образование нескольких промежуточных соединений, существование которых ранее было предсказано теоретически.

Дополнительные аналитические возможности возникают при сочетании ДАРТ с масс-анализатором на основе ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (Rs=60000 -70000) [158]. Вблизи области ионизации ДАРТ размещали пробирку с раствором NH4OH и проводили прямой анализ мякоти грейпфрута. Для сахаров наблюдали ионы [M+NH4]+, [2M+NH4]+, [2M+H]+ и [M+NH4-H2O]+. Также идентифицировали капсацин в соке перца. При этом регистрировали ионы [M+H]+, [2M+H]+ и [M+O+H]+. Сравнительно высокую

интенсивность сигналов димерных ионов объясняли ион-ионными и ион-молекулярными взаимодействиями ионов в гексаполе масс-анализатора ионного циклотронного резонанса.

Показана возможность идентификации душистых веществ, нанесенных на полоски для имитации анализа с поверхности, на тканях и волосах, методом масс-спектрометрии ДАРТ, а также возможность определения охлаждающих агентов в составе жевательных резинок [56]. Помимо протонированных молекул в работе упомянуты ионы состава [M-2Н+H]+. При использовании масс-спектрометрии ДАРТ изучены кинетические закономерности высвобождения душистых веществ из жевательной резинки в слюну [71]. Дополнительно подтверждена возможность дифференциации разных ароматизаторов по масс-спектрам ДАРТ [154]. Метод масс-спектрометрии ДАРТ высокого разрешения как средство идентификации и методы газовой хроматографии с различными способами детектирования могут дополнять друг друга как средства идентификации летучих и среднелетучих соединений, как показано, например, при сочетании с газовой хроматографией с пламенно-ионизационным детектированием [252] для идентификации токсичных примесей в глицерине, используемом, например, в сиропах от кашля и зубных пастах. В 2015 году Хасловой и коллегами опубликован обзор [253] о новых достижениях в применениях масс-спектрометрии высокого разрешения в метаболомных исследованиях продуктов питания, основанный во многом на богатом опыте этого коллектива в масс-спектрометрии, включая масс-спектрометрию ДАРТ.

87

Идентификация токсичных и взрывчатых веществ в объектах окружающей среды. При определении четырех боевых отравляющих веществ (трех фосфорсодержащих и одного серосодержащего) в дихлорметане и в мутной воде методом масс-спектрометрии ДАРТ [254] в качестве внутренних стандартов использовали дейтерированные аналоги аналитов. В работе не упоминаются автодозаторы. Градуировочные графики, как при 7-кратном измерении для каждого раствора, так и при однократном, были линейны (R2>0.99) для всех аналитов в диапазоне 5 - 1500 нг-мл-1. Достоинствами подхода являлись высокая экспрессность и, по мнению авторов, возможность исключения анализа холостого раствора, который, как правило, необходим в количественной масс-спектрометрии. Действительно, в масс-спектрометрии ДАРТ не происходит прямого контакта между образцом и прибором. На наш взгляд, тем не менее, при анализах методом масс-спектрометрии ДАРТ все же необходим анализ холостых образцов, так как из-за загрязнения входа в вакуумный интерфейс частицами или микрокаплями образца возможно возникновение ложных положительных сигналов.

Показана возможность обнаружения 15 взрывчатых нитросодержащих соединений на разных поверхностях (стекло, полиуретановые пластики, сталь, дерево, асфальт) методом масс-спектрометрии ДАРТ [160]. Для изготовления модельных поверхностей - твердых образцов сравнения - использовали нанесенные на алюминиевую фольгу и высушенные двухмикролитровые аликвоты модельных растворов, содержащие по 2 мкг аналитов. Образцы сравнения получали, натирая фольгой изучаемые поверхности. В качестве газа-реагента использовали дихлорметан. Все масс-спектры отрицательных ионов содержали молекулярные ионы, депротонированные или дехлорированные молекулы, также в некоторых случаях наблюдали ионы [M+NO2]- и [M+NO3]-. При детектировании боевых отравляющих веществ методом масс-спектрометрии ДАРТ на 20 различных поверхностях [32] в масс-спектрах положительных ионов перекисных и тетразиновых веществ отмечено наличие интенсивных ионов-аддуктов [M+NH4]+, что объяснено близостью человеческого тела к области анализа. В среднем чувствительность определения составляла 500 пг на 25 мм2 и зависела от используемого напряжения на скиммере масс-анализатора «AccuTOF».

В первой публикации о масс-спектрометрии ДАРТ показана возможность [31] детектирования нитроглицерина на поверхности мужского галстука, при этом в масс-спектрах отрицательных ионов присутствовали ионы NO2-, NO3-, C3H5O3- и [M+Cl]-, и нескольких взрывчатых соединений, содержащихся на уровне 3*10-4% в воде из загрязненного пруда. Приведены данные регистрации некоторых неорганических взрывчатых веществ методом масс-спектрометрии ДАРТ: нитрата аммония, азида натрия и перхлората натрия. Сообщается о

88

возможности идентификации боевых отравляющих веществ, но приведен только масс-спектр агента VX (О-этил^-(2-изопропиламиноэтил) метилфосфонотиолат), состоящий из сигнала протонированной молекулы с отношением сигнал/шум более 100000 для количества вещества менее 1 мкг. Кроме того, утверждается о возможности анализа солей методом масс-спектрометрии ДАРТ. В качестве подтверждения этого утверждения приведен масс-спектр ДАРТ цвиттер-ионного производного VX - Җ№диизопропиламиноэтилметилфосфоно-тионовой кислоты.

Идентификация бромсодержащих ингибиторов горения в разных объектах окружающей среды возможна [57] по масс-спектрам ДАРТ отрицательных ионов. Также возможна идентификация бромсодержащих ингибиторов горения в пыли внутри помещения и пестицида тиабендазол в листьях растений [171]. Показана возможность идентификации компонентов сырой нефти при использовании масс-спектрометрии ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье [158].

Анализ бытовых предметов (игрушки, бумага, чернила и др.). При разработке способа скрининга игрушек из поливинилхлорида методом масс-спектрометрии ДАРТ на присутствие фталатов [67] для растворов с концентрациями >100 мкг-мл-1 регистрировали ионы [M+H]+, [M+NH4]+, [2M+H]+ и [2M+NH4]+. Пластиковые пластинки с содержанием фталатов на уровне 0 - 25% специально изготавливали для оценки пределов детектирования в твердых пробах. Пределы детектирования при регистрации протонированных молекул составили менее 0.1%, а при регистрации иона [M+NH4]+ - менее 5%. Это противоречит данным [61, 62], что при регистрации ионов [M+NH4]+ чувствительность значительно выше чувствительности при регистрации протонированных молекул.

Показана возможность дифференциации чернил путем сопоставления масс-спектров ДАРТ [255].

Исследована возможность быстрой идентификации стабилизаторов и продуктов их разложения при температурах выше 190оС в образцах полипропилена [150], при этом стабилизаторы содержались в исследованных модельных образцах на уровне 2 мг-г-1. Показана применимость масс-спектрометрии ДАРТ в качестве метода скрининга для идентификации добавок (пластификаторов, антиоксидантов, красителей, стабилизаторов) в упаковочных материалах для продуктов питания [70]. При исследовании пластификаторов в поливинилхлоридных уплотнителях крышек бутылок [159] пределы детектирования 13 различных добавок по протонированным молекулам и ионам [M+NH4]+ составляли 0.1 - 5%, но

89

для трех других добавок даже при их содержании в образце, равном 5 - 40%, такие сигналы не наблюдались. Пределы детектирования в толуоле составляли не менее 1%.

Анализ неорганических и органических субстанций, установление механизмов химических реакций, исследования наноматериалов. Методом масс-спектрометрии ДАРТ можно охарактеризовать вещества с низкой растворимостью, которые затруднительно идентифицировать обычно используемыми в органическом синтезе методами. До проведения настоящего исследования опубликовано несколько работ по идентификации продуктов органического синтеза [55, 119, 163]. Состав синтезируемых нерастворимых полициклических ароматических углеводородов подтверждали методом масс-спектрометрии ДАРТ [82]. Механизмы реакций фрагментации различных соединений, протекающих при ионизации ДАРТ, изучали в работах [156, 157, 169]. В частности, масс-спектрометрию ДАРТ использовали для изучения механизмов фрагментации нуклеотидов и нуклеозидов в режиме регистрации положительных и отрицательных ионов [169].

Исследования наноматериалов методом масс-спектрометрии ДАРТ проведены на примере самособирающихся монослоев додекантиола на поверхности золота [256]. Метод масс-спектрометрии ДАРТ, в большинстве случаев описываемый как малоразрушающий, не позволял проводить многократный анализ монослоев из-за нарушения их структуры. Образовывались молекулярные ионы, по значениям ж/z которых определяли особенности строения монослоев. При использовании масс-спектрометрии ДАРТ в сочетании с УФ-, флуоресцентной спектроскопией и ЯМР показана возможность изучения явления самосборки структур амфифильных периленовых дииминов в различных растворителях до нанополосок и нановолокон [ 257].

Что касается неорганических субстанций, опубликованы данные анализа йода и красного фосфора методом масс-спектрометрии ДАРТ [151]. Масс-спектр образца йода состоял из высокоинтенсивных сигналов состава [I2]+, а также ионов [I3]+, [I4]+, [I+NH3]+, [I+2H2O]+, [I2+H2O]+. Масс-спектр красного фосфора состоял из ионов [P+O]+ и [P+O2]+. Изучена возможность идентификации серосодержащих газов, выделяемых образцами гипсокартона [258]. Регистрировали ионы S2-, SO2-, HS2-, SO3-, S2O-, SO4-, S4- и др. Отмечено, что в режиме регистрации отрицательных ионов наблюдался очень низкий уровень фонового сигнала.

90

1.4. Перспективные для фармацевтической химии и фармакогнозии направления развития масс-спектрометрии ДАРТ

Анализ литературных данных показал, что метод масс-спектрометрии ДАРТ весьма привлекателен для решения ряда задач фармацевтической химии за счет возможности не проводить или минимизировать пробоподготовку, то есть существенно сэкономить время проведения анализов. Поскольку масс-спектрометрия ДАРТ появилась сравнительно недавно, методология анализа данным методом не была сформирована, а многие потенциальные области применения не были исследованы. До настоящего исследования доступные литературные данные были разобщены и получены для ограниченного числа компонентов и матриц чаще всего только при использовании времяпролетного масс-спектрометра модели «AccuTOF». Влияние на состав масс-спектров параметров эксперимента, включая настройки ионного источника и масс-анализатора, не было изучено на представительной выборке соединений и матриц.

Для расширения возможностей и комплексного развития метода масс-спектрометрии ДАРТ требовалось систематическое исследование возможностей метода и отработка его методологии, включающая изучение и оптимизацию инструментальных параметров, влияющих на аналитические характеристики метода, разработку подходов к улучшению этих характеристик, а также развитие и расширение применений метода в фармацевтической химии и фармакогнозии с учетом новых полученных данных и подходов, разработанных в рамках предыдущего исследования.

Из-за недостаточно высокого массового разрешения и неоднозначности состава масс-спектров для разных классов аналитов сочетание ДАРТ с времяпролетным масс-анализатором «AccuTOF» ограниченно применимо для идентификации неизвестных компонентов смесей. В публикациях с использованием этого масс-анализатора при анализе сложных многокомпонентных образцов отношение числа идентифицированных компонентов к общему числу детектируемых сигналов невелико: например, из ~700 зарегистрированных сигналов может быть идентифицировано [246] лишь 12 - 15%. Кроме того, при идентификации необходимо учитывать неоднозначность фрагментации разных классов соединений. Из опубликованных данных следовало, что масс-спектрометрия ДАРТ при использовании времяпролетного масс-анализатора может быть востребована для поиска заданных соединений и подтверждения их присутствия в образцах.

Отсутствовали обобщенные данные об особенностях использования разных масс-анализаторов, отличных от времяпролетного, и о преимуществах, обеспечиваемых использова

91

нием таких масс-анализаторов. Сочетание ионизации ДАРТ с масс-анализаторами более высокого разрешения, например, с орбитальной ионной ловушкой [159] или с масс-анализатором ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье [158], более привлекательно для идентификации неизвестных компонентов сложных смесей, но о таких сочетаниях были опубликованы лишь единичные работы. Изобретателем орбитальной ионной ловушки для масс-спектрометрии [259 - 261] является кандидат физико-математических наук, профессор университета города Утрехт (Нидерланды) Александр Алексеевич Макаров, всемирно известный российский ученый, лауреат главной награды международного масс-спектрометрического сообщества (медали Томсона) и практически всех остальных наград в области масс-спектрометрии. Первые данные о сочетании ДАРТ с орбитальной ионной ловушкой опубликованы в 2010 г. [159], при этом точность определения отношений ж/z составляла около 0.0001 а.е.м. Значения ж/z для масс-спектрометрии ДАРТ с масс-анализатором ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье также определяли с точностью до 4 знака после запятой. При этом отмечено, что таким путем можно идентифицировать только летучие компоненты с небольшой относительной молекулярной массой, и высказано предположение о том, что использование добавок (например, гидроксида аммония) может способствовать расширению диапазона масс возможных аналитов. В недавней работе [ 262] обсуждается ряд новых возможных применений в масс-спектрометрии ДАРТ с масс-анализатором ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье в органическом анализе, в том числе, в анализе фуллеренов.

Ограничением масс-спектрометрии ДАРТ являлись слабо отработанные условия ввода: в связи с зависимостью интенсивности сигнала от положения образца в области ионизации главную проблему при попытках количественного и полуколичественного анализа представляла малая воспроизводимость позиционирования образцов. Количественный анализ проводили, как правило, при построении градуировочных зависимостей, для чего необходимы образцы сравнения с заданными содержаниеми аналита. О полуколичественном анализе твердых образцов методом масс-спектрометрии ДАРТ было опубликовано лишь несколько работ. Не было данных об оптимальных условиях работы с позиционирующими устройствами. Были мало изучены способы изготовления твердых образцов сравнения и отсутствовали данные о степенях десорбции аналитов в масс-спектрометрии ДАРТ. Для отработки методологии фармацевтического анализа методом масс-спектрометрии ДАРТ требовалось провести обобщающие исследования возможностей использования масс-спектрометрии ДАРТ на представительной выборке соединений, при использовании разных матриц и подложек для жидких проб и при сравнении разных типов масс-анализаторов. Требовали дальнейшего совершенствования возможности повышения чувствительности определения за счет

92

увеличения поверхности наконечника, которым производят отбор и ввод жидких проб. Лишь в одной работе [163] показана возможность повышения чувствительности определения за счет изменения материала наконечника: некоторое увеличение чувствительности достигалось путем использования для наконечников стекла с полиимидным покрытием вместо обычного. Возможность проведения сорбционного концентрирования аналитов из жидких растворов с последующим помещением сорбента непосредственно в область ионизации ДАРТ изучена лишь в одной публикации [150], в которой для концентрирования аналитов использовали якорь магнитной мешалки, покрытый полидиметилсилоксаном.

Развитие сочетания масс-спектрометрии ДАРТ с планарной хроматографией позволит использовать высочайшую селективность метода масс-спектрометрии при прямом анализе с пластины в потоке газа (ои//'ие), без использования растворителей для экстракции, размывающих пятно и искажающих его состав за счет содержащихся в них примесей. Преимуществом сочетания ТСХ-МС перед ставшим уже традиционным методом ВЭЖХ-МС является возможность детектировать и те компоненты пробы, которые не передвигаются вместе с подвижной фазой [103, 104, 263]. Однако возможности осуществления такого сочетания с ионизацией ДАРТ были показаны лишь для единичных объектов в нескольких работах, перечисленных в обзоре литературы. Можно было бы предположить, что недостатком сочетания ТСХ с ионизацией ДАРТ является проникновение аналитов в толщу неподвижной фазы на пластине для ТСХ, но этот эффект не изучен ни в одной из работ, опубликованных до нашего исследования. В связи с проявлением такого эффекта при сочетании ТСХ с масс-спектрометрией ДАРТ ои//'ие в зависимости от задачи исследования перед таким сочетанием может обладать определенными преимуществами сочетание о^///'ие, осуществляемое путем экстракции аналитов с участков неподвижной фазы на пластинах ТСХ в отдельные пробирки и последующего масс-спектрометрического анализа экстрактов. Требовались исследования в этой области, включающие оценку влияния полноты десорбции на эффективность анализа и сопоставление достоинств и недостатков сочетания ТСХ с масс-спектрометрией ДАРТ ои//'ие и о^%ие.

Привлекательной новой, неизученной областью применения представлялся анализ высушенных пятен биожидкостей методом масс-спектрометрии ДАРТ на фильтровальной бумаге или другой подложке. Такой подход важен не только для разработки новых способов диагностики заболеваний, но и для развития методов пробоподготовки, хранения и транспортировки жидких проб, а также унификации условий исследований одних и тех же образцов в различных лабораториях.

93

До наших работ в литературе отсутствовали обобщения о возможности использования масс-спектрометрии ДАРТ в сочетании с планарной хроматографией для идентификации биологически активных веществ в фармакогностических объектах.

Представляло интерес дальнейшее развитие способов скрининга синтетических лекарственных средств на фальсификаты и способов идентификации ключевых компонентов в фармакогностических объектах, основанных на масс-спектрометрии ДАРТ. Особый интерес представляло установление достоинств и ограничений сочетания масс-спектрометрии ДАРТ с другими методами анализа, не требующими образцов сравнения - например, с автоматическим элементным анализом.

На момент начала наших исследований было очень мало литературных данных о сочетании источников ДАРТ с масс-анализаторами на основе орбитальной ионной ловушки (к концу 2009 года нами были найдены только публикации [67, 264]), несмотря на

привлекательность такого сочетания для идентификации неизвестных компонентов сложных смесей. Другие публикации появлялись с 2010-2011 гг., когда наши исследования находились в активной фазе. Так, в 2013 г. опубликована работа [265] об обнаружении 20 бензимидазолов в молоке и 4 кокцидиостатов в корме для цыплят методом масс-спектрометрии ДАРТ с орбитальной ионной ловушкой. Опубликованы также следущие работы по применениям ДАРТ с орбитальной ионной ловушкой в контроле качества продуктов питания и для обеспечения их безопасности:

• обнаружение тиосульфинатов в работе Кучеровой и соавторов 2011 г. [ 266];

• обнаружение фталатов-пластификаторов в продуктах питания и пищевых добавках Селфом и Ву в 2012 г. [ 267];

• обнаружение эфиров 3-хлорпропан-1,2-диола в растительных маслах в работе Моравковой и соавторов 2012 г. [ 268];

• поиск изофлавонов в соевых бобах в работе Лоджа с соавторами 2012 г. [269];

• скрининг ксенобиотиков в работах Кажка и соавторов 2011 г. [96] и Эдисона и соавторов 2011 г. [270, 271], Кроуфорд и Муссельмана в 2012 г. [272], Фарре, Пико и Барсело в 2013 г. [273], а также Керна, Лина и Фрике в 2014 г. [274];

• контроль качества напитков и некоторых продуктов питания путем обнаружения в них токсинов, опубликовано Вацлавиком и Захариасовой с соавторами в 2010 г. [ 275, 276], Шеном, Шраге и соавторами в 2012-2013 гг. [ 277, 278], а также Бусманом и соавторами в 2014 г. [ 279];

94

• обнаружение триацилглицеролов в молоке, сыре и маслах в работе 2014 г. Хрбека и соавторов [ 280];

• анализ фруктового сока и обнаружение в нем полисорбатных наномицелл в работе Кртковой и соавторов 2014 г. [ 281].

Значительная часть этих работ выполнена при участии профессоров Яны Хасловой (Институт химической технологии, Прага, Чехия) и Мишеля Нилена (Институт продуктов питания и их безопасности, Университет г. Ванинген, Нидерланды), являющихся признанными ведущими европейскими исследователями в области масс-спектрометрии ДАРТ, и их учеников. Эти исследования велись и их результаты публиковались приблизительно в том же временном интервале, что и наши работы по применениям ДАРТ с орбитальной ионной ловушкой, описанные далее в диссертации.

В литературном обзоре 2016 г. [ 282] по применению масс-спектрометрии ДАРТ в анализе лекарственных растений приведена таблица 8, в которой в сжатой форме приведены известные авторам публикации по теме этого обзора. Из других недавних публикаций по анализу фармакогностических объектов растительного происхождения, появившихся после наших исследований, следует также отметить работу [283] 2016 года, в которой для идентификации компонентов растений «якон» в составе чаев использовали метод полимеразной цепной реакции и масс-спектрометрию ДАРТ с последующей обработкой масс-спектров с помощью средств хемометрики, работу по оценке качества растительных чаев методом масс-спектрометрии ДАРТ [284], развитие способов быстрой идентификации синтетических каннабиноидов и других наркотических веществ в образцах растительного происхождения [285, 286, 287], разработки способов для быстрой идентификации частей различных растений или ЛС на их основе, установления происхождения и оценки качества фармакогностических объектов по характеристичным масс-спектрам ДАРТ при обработке этих масс-спектров специальными способами [288 - 297], разработку способа быстрой идентификации

ингибитора ксантиноксидазы и антиоксидантов из растений [298],

исследование возможности быстрого мониторинга 1-деоксиноджиримицина в листьях

L. [299], а также исследование [300] ДАРТ-профилей метаболитов томатов и перца для классификации плодов, полученных в обычных и «экологически чистых» («organic») условиях.

95

Таблица 8 - Соединения, обнаруженные методом масс-спектрометрии ДАРТ при анализе лекарственных растений, заимствовано из [282]

Лекарственное растение или ЛС на его основе Прибор Режим Обнаруженные соединения Ссылка, год публикации

1 2 3 4 5

Р/per Масс-спектрометр ДАРТ с времяпролетным масс-анализатором Положительные ионы Фенолы и их ацетаты: хавикол, аллилпирокатехол, хавибетол, хавиколацетат, аллилпирокатехолацетат, хавибетолацетат, аллилпирокатехолдиацетат [240], 2008 г.

ЛсошУмж carwz'cAae/z'z, Масс-спектрометры ДАРТ с линейной ионной ловушкой и с квадрупольно-времяпролетным масс-анализатором Положительные ионы Алкалоиды: сонгорин, изоталатизидин, талатизамин, неолин, фузилин, мезаконин, бензоилпаконин, бензоилмезаконин, бензоилаконин, гипаконитин, деоксиаконитин, мезаконитин, аконитин, 10-гидроксимезаконитин, 10-гидроксиацеонитин [301], 2015 г.

Рамах gz%seMg Масс-спектрометр ДАРТ с времяпролетным масс-анализатором Положительные ионы Сахариды: глюкоза, манноза, галактоза, рамноза, арабиноза, ксилоза, сахароза, трегалоза, мальтоза, целлобиоза, лактоза, рафиноза, женьшеневый тетрасахарид [302], 2014 г.

96

Таблица 8 (продолжение)

1 2 3 4 5

СогубО/А уаиАмл/о, ЛгА/7/аг/'а ^а///'^/'-у/ога, ^геса са/есАм, (Тисаг/'а гАуисАо-^Ау//а, 5*см/е//аг/'а ^а/са/еиб'/'б' Масс-спектрометр ДАРТ с времяпролетным масс-анализатором Положительные ионы Алкалоиды, флавоноиды и and гинзенозиды: коридалин, тетрагидропальматин, пеимин, пеиминин, арекаидин, ареколин, ринхофиллин, баикалеин, вогонин, псевдогинзенозид F11, вещество K, протопанаксатриол, метилированный гинзенозид Rc [303], 2014 г.

Смгсмжа /оиgа Масс-спектрометр ДАРТ с линейной ионной ловушкой Положительные и отрицательные ионы Куркумин, альфатурмерон, дигидро-альфатурметон, (А)-альфаатлантон, 1,3-дигидроизобензофуран, кофейная кислота, метил-8,11-октадекадиеноат, артурмерон, (E)-3 -метил-6-и-толилгепта- 1,4-диен-3 -ол, 6-(3-гидрокси-4-метилциклогекса-2,4-диенил)-2-метилгепта-2-ен-4-он, 7-(циклогекса-1,3-диенил)-5-гидрокси-2,6-диметилгепта-2-ен-4-он, н-гексадекановая кислота, линоленовая кислота [304], 2015 г.

97

Таблица 8 (окончание)

1 2 3 4 5

Рголорм у'м/т//ога Масс-спектрометр ДАРТ с времяпролетным масс-анализатором Положительные ионы Алкалоиды: юлипрозопин, юлипрозин, прозофлорин, юлипрозинин, 3-оксоюлипрозин, 3''-оксоюлипрозопин, прозопин, прозопинин, юлифлоридин, проюлин, прозафринин, N-метилюлифлоридин [305], 2012 г.

С;'ииажожмж /ажа/а Масс-спектрометр ДАРТ с времяпролетным масс-анализатором Положительные ионы Полифенолы и терпеноиды: циннамальдегид, и-цимен, камфен, лимонен, фелландрен, коричная кислота, карвон, камфора, линалоол, евгенол, коричный ацетат, метилевгенол, евгенолацетат, р-кариофилленоксид [306], 2012 г.

Вегйегм ^ейо/аЛл Масс-спектрометр ДАРТ с времяпролетным масс-анализатором Положительные ионы Алкалоиды: берберрубин, деметилэнеберберин, ретикулин, берберин, ятрорризин, тетрагидроберберин, магнофлорин, 8-оксоберберин, пальматин, N-метилтетрагидроберберин, тетрагидропальматин [307], 2015 г.

Ле Лм A^z'Mg для инъекций Масс-спектрометр ДАРТ с квадрупольно-времяпролетным масс-анализатором Положительные и отрицательные ионы Иридоидные гликозиды и кофеилхинные кислоты: гени-прозид, секоксилоганин, ранолазин, 4-амино-6-хлоро-1,3-бензендисульфонамид, неохлорогеновая кислота, хлорогеновая кислота, криптохлорогеновая кислота, 3,4-O-дикофеилхинная кислота, 4,5-О-дикофеилхинная кислота, 3,5-О-дикофеилхинная кислота [308], 2013 г.

98

Кроме того, в 2014-2017 гг., уже после завершения основной части наших исследований, в литературе появился ряд публикаций о новых применениях масс-спектрометрии ДАРТ в решении различных задач фармации и медицины. В литературе последних лет представлены примеры решения таких задач, как быстрый скрининг тетрагидроканнабитола в волосах с использованием ДАРТ с орбитальной ионной ловушкой [ 309] и другими масс-анализаторами [310], расширение возможности детектирования наркотических веществ путем дооснащения источника ДАРТ специальным термодесорбером [ 311], быстрое детектирование бактериальных эндотоксинов в материалах для устройств, использующихся в офтальмологической хирургии [312], одновременное определение 3-хлоротирозина и 3-нитротирозина в плазме крови при использовании тандемной масс-спектрометрии ДАРТ и изотопно-меченных внутренних стандартов [313], детектирование никотина для индикации табачного дыма [314], скрининг диметиламиламина в моче [315], оценка качества семян горчицы и паст на ее основе [316], скрининг пестицидов и других нежелательных компонентов в винах [ 317], оценка степеней соэкстрагирования с молекулами ДНК ингибиторов полимеразной цепной реакции [318], быстрый скрининг тестостерона в образцах воды [ 319]. Применениям масс-спектрометрии ДАРТ в токсикологии, в том числе для обнаружения наркотических субстанций, посвящен обзор [ 320]. Это указывает на большой потенциал к дальнейшему развитию подходов, основанных на масс-спектрометрии ДАРТ, в фармацевтической химии, фармакогнозии и в междисциплинарных исследованиях, связанных с улучшением качества жизни и охраной здоровья человека.

1.5. Обоснование выбора объектов исследования

В диссертации в качестве объектов исследования был выбран ряд модельных органических соединений и синтетических лекарственных средств, а также фармакогностические объекты животного и растительного происхождения. Для развития системы подходов к анализу синтетических лекарственных средств мы сочли допустимым выбор для исследования модельных объектов, обусловленный их доступностью и распространенностью. Их перечень приведен в следующей главе диссертации.

В качестве фармакогностических объектов исследования были выбраны продукты пчелы медоносной (мёд, прополис), а также зеленые и ферментированные листья бадана.

Продукты пчелы медоносной (^м L.) относят к фармакогностическим объектам

животного происхождения [ 321, 322]. Пчела выделяет шесть веществ, в которых содержатся

99

биологически активные вещества, обладающие антибактериальными свойствами: мёд, воск, прополис, пыльца, маточное молочко и пчелиный яд. Благодаря их свойствам они широко используются в народной медицине, что отражено в ряде публикаций коллективов, работающих в области изучения состава и свойств таких объектов [323 - 325]. Согласно имеющимся в литературе данным [ 326], их химический состав варьируется в широких пределах в зависимости от географического положения места сбора, окружающей среды и способа переработки. Необходимо дальнейшее изучение их состава, свойств и влияния на организм человека с использованием новых подходов, позволяющих получать дополнительную информацию о составе компонентов по сравнению с традиционными и/или более эффективных с точки зрения соотношения между их стоимостью, экспрессностью и информативностью.

Пчелиный мёд - это переработанный пчелами цветочный нектар [321]. Хотя в фармакогнозии его не относят к лекарственным средствам, широко известно, что его используют в качестве вспомогательного средства для лечения различных заболеваний, оказания общеукрепляющего, иммуностимулирующего, потогонного и противовоспалительного действия. Его используют как в чистом виде, так и в качестве вспомогательного вещества для получения готовых лекарственных средств, также он входит в состав многочисленных биологически активных добавок. На основе натурального мёда выпускают препарат «Витамедин-М» (капли назальные), мёд также входит в состав комплексных препаратов общетонизирующего действия («Апимикроэлфит», эликсиры «Кедровит», «Эвалар», «Алтайский»). В состав мёда входят витамины, аминокислоты, ферменты, эфирное масло, органические кислоты и другие биологически активные компоненты растений [321]. Основную часть мёда (до 70%) составляют полисахариды, декстроза, состоящая из молекул глюкозы, и левулеза, состоящая из молекул фруктозы [321]. Основные требования к качеству мёда известны и установлены законодательствами многих стран. Так, в Европе его качество урегулировано содержанием Директивы Совета Евросоюза 2001/110/EC [327], а в России - ГОСТом 19792-2001 [328]. Показателями качества меда являются, например, содержание влаги, водонерастворимых веществ, сахаров и кислот, электропроводность и диастазная активность, а также содержание 5-гидроксиметилфурфурола (ГМФ) [327]. Известно [ 329], что ГМФ образуется при длительном хранении меда или его фальсификации путем нагревания с сахарным раствором в присутствии кислоты для инверсии сахарозы, а также что ГМФ в результате метаболизма в живых организмах превращается в 5-сульфгидроксиметилфурфурол, являющийся генотоксичным соединением [330]. По этим причинам необходим контроль содержания ГМФ в мёде при изготовлении лекарственных средств на его основе.

100

Прополис, или «пчелиный клей» - продукт жизнедеятельности пчел со сложным химическим составом, вырабатываемый ими для укрепления сот, покрытия стенок ульев и т.д. [321, 322, 331 ]. Цвет прополиса варьируется от темно-коричневого и желтого (чаще всего) до зеленого или красного. В медицинской практике в России используют различные препараты на основе прополиса - настойки, таблетки, мази и аэрозоли. Химический состав прополиса зависит от подвида пчел, ботанического и географического происхождения и времени года [332] и требует дальнейшего изучения, поскольку обуславливает его фармакологические свойства -антибактериальные, противовоспалительные, гепатопротекторные, антиоксидантные, противоопухолевые и др. [321, 333]. Наиболее распространенным типом прополиса в странах Европы, Северной Америки и Азии является тополевый прополис, состоящий, согласно оценкам, из более чем 420 соединений [ 334, 335]. Прополис представляет собой практически не растворимую в воде смесь воска, бальзамических веществ и полисахаридов, содержащих сложный комплекс фенольных соединений [322]. Фенольные соединения - фенольные кислоты, флавоноиды, флавоны, флаваноны, флавонолы и дигидрофлавонолы, халконы, дигидрохалконы и их производные - являются важнейшими компонентами прополиса, обуславливающими его лечебные свойства [ 336, 337]. Их идентификацию чаще всего проводят методами капиллярного электрофореза, ВЭЖХ или ВЭЖХ-МС [338 - 342]. Интерес представляют новые стратегии анализа, имеющие преимущества по сравнению с общепринятыми за счет более высокой экспрессности или предоставления новой информации о составе низкомолекулярных органических компонентов. В литературе отсутствовали данные об анализе продуктов пчелы медоносной методом масс-спектрометрии ДАРТ, поэтому представляло интерес изучение состава таких объектов этим методом.

Растения рода Bergew'a (Sax/agaceae) используются в традиционной медицине России, Китая, Монголии, Индии и ряда других стран Азии. В России чаще всего используют вид Bergew'a сгаж/Ъ/м (L.) Fritsch (Saxz/raga сгаж/Ъ/м) - бадан толстолистный, который давно известен как ценное растение, обладающее лекарственными, дубильными и красящими свойствами [343]. Это единственный вид растений рода Bergew'a, вошедший в Государственные фармакопеи СССР и РФ [ 344].

Экстракты листьев и корневищ этого растения обладают противовоспалительным, антиоксидантным, противомикробным и иммуностимулирующим эффектами [345. - 352].

В корневищах бадана содержится 15 - 25% дубильных веществ, относящихся преимущественно к пирогалловой группе, свободные полифенолы и гликозид бергенин, а листья бадана также богаты дубильными веществами и, кроме того, содержат гликозид арбутин (до 12%) [343].

101

Напиток на основе листьев бадана отдаленно напоминает черный чай, обладает рядом полезных свойств и тонизирующим эффектом, используется для устранения лихорадки, кашля, а также симптомов диареи, рвоты [ 353]. Черные и ферментированные листья бадана используются в качестве общеукрепляющего средства и для повышения устойчивости к стрессу [354 - 356]. Их экстракты подавляют аппетит и потребление энергии у крыс с ожирением, вызванным высококалорийной диетой [ 357].

Ранее в литературе идентифицированы такие гидрофильные компоненты листьев бадана, как некоторые флавоноиды, фенолы, кумарины, некоторые фенольные кислоты, таннины, катехины, галлаты, арбутин и полисахарид бергенин, а также такие липофильные вещества, как хлорофилл, каротиноиды и витамины А и Е [348 - 361]. В дистиллятах зеленых листьев В. сга^^//о//'а идентифицированы также 3-метил-2-бутен-1-ол, гексадекановые, додекановые и октадекадиеновые кислоты и линалоол [ 362].

На момент начала нашего исследования полностью отсутствовали данные исследования состава каких-либо частей бадана методами масс-спектрометрии высокого разрешения. Об использовании масс-спектрометрии для исследований каких-либо частей и компонентов этого растения упоминалось только в трех статьях [363 - 365]: ГХ-МС низкого разрешения использовали [363, 364] для идентификации некоторых летучих компонентов, а методом ВЭЖХ-МС с ионной ловушкой определяли [365] арбутин. В связи с этим, дальнейшее изучение состава компонентов частей бадана с использованием подходов, основанных на масс-спектрометрии ДАРТ, представляло особый интерес.

1.6. Выводы к обзору литературы

До наших исследований в имеющихся литературных данных о масс-спектрометрии ДАРТ и ее применении для быстрого анализа (скрининга) синтетических и природных лекарственных средств

1) не была обобщена и систематизирована информация по следующим вопросам:

• каковы критерии выбора условий для проведения анализа лекарственных средств методом масс-спектрометрии ДАРТ,

• каким образом можно влиять на состав масс-спектров ДАРТ компонентов различных лекарственных средств,

102

• каковы возможности и ограничения масс-спектрометрии ДАРТ в обнаружении компонентов лекарственных средств;

2) было недостаточно информации по следующим вопросам:

• какими способами можно увеличить избирательность и чувствительность детектирования компонентов лекарственных средств методом масс-спектрометрии ДАРТ,

• каким образом следует осуществлять анализ образцов с твердых подложек методом масс-спектрометрии ДАРТ, чтобы оптимизировать отбор, хранение и транспортировку(био)проб,

• решение каких задач фармацевтического анализа возможно, сочетая масс-спектрометрию ДАРТ с ТСХ и другими методами анализа, и какой способ сочетания ТСХ с масс-спектрометрией ДАРТ (ои/'ие и о/ие) может дать больше преимуществ в зависимости от конкретной задачи;

3) полностью отсутствовала информация о том, возможно ли рассматривать автоматический элементный анализ как метод быстрого фармацевтического анализа, комплементарный масс-спектрометрии ДАРТ, и какие преимущества может дать сочетание масс-спектрометрии ДАРТ и автоматического элементного анализа для быстрого скрининга лекарственных препаратов на фальсификаты.

Кроме того, полностью отсутствовали данные о составе масс-спектров ДАРТ каких-либо ЛС российского производства, а также не было обнаружено публикаций о новых возможностях и преимуществах по сравнению с другими методами анализа, обеспечиваемых при использовании этого метода для установления состава таких фармакогностических объектов, как продукты пчелы медоносной (мёд, прополис) и лекарственное растение бадан толстолистный (Bergew'a craxyz/b/za (L.) Fritsch).

103

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования

2.1. Оборудование

Работу проводили с использованием следующего оборудования.

1) Для пробоподготовки:

• аналитические весы модели «MX5» (Mettler Toledo, Швейцария) c точностью взвешивания 1 мкг и «ME 235S» (Sartorius AG, Германия) c точностью взвешивания 10 мкг;

• ультразвуковые ванны модели «Laboson 200» (Bender & Hobein, Швейцария) и модели «Branson 2510» (Bransonic, США);

• центрифуга модели «ЦЛН-2» (СССР) со скоростью вращения от 3000 мин-1 до 8000 мин-1;

• центрифуга модели «Heraeus® Multifuge® 1» (Thermo Scientific, Германия) со скоростью вращения до 4700 мин-1;

• центрифуга модели «Mini Spin plus» (Eppendorf, Германия) со скоростью вращения от 3000 до 14000 мин-1;

• миксеры «вортекс» «VF 2ТМ» (IKA Janke und Kunkel, Германия) и «Genie 2ТМ» (Bender & Hobein AG, Швейцария);

• термостат модели «LT-Mini» (Liebisch, Германия);

• термопушка «Clatronic® HAT 2668» (Clatronic, Германия);

• системы для получения деионизованной воды сопротивлением 18.2 МОм «Synergy

System» (Millipore, Германия) и «Водолей М» («Химэлектроника», Россия);

• автоматизированные пипетки объемом 10-100 мкл и 200-1000 мкл (Eppendorf, Германия);

• газохроматографические шприцы объемом 10-250 мкл (Agilent, Германия; Hamilton, США);

• стандартные пузырьки для ВЭЖХ-автодозаторов объемом 2 мл (Agilent, Германия);

• запаянные стеклянные капилляры, изготовленные для научных коллективов, в которых проводились исследования в области масс-спектрометрии ДАРТ;

• запаянные стеклянные капилляры «Dip-It» (IonSense, США);

104

* стеклянные лодочки, изготовленные путем срезания верхних частей пузырьков для ВЭЖХ-автодозаторов объемом 2 мл (Agilent) на уровне 3 мм от донца;

* металлические спирали (нержавеющая сталь, толщина 0.2 мм, длина 1 см, 20 витков), предоставленные профессором В. Шваком (Университет Хоэнхайм, Штутгарт, Германия);

* картриджи «Open Spot Sample Card)) (IonSense, США);

* пластины для ВЭТСХ фирмы «Merck)) (Германия) «Silica gel 60)) и «Silica gel 60 Ғ254» с диаметром пор 60А и толщиной слоя неподвижной фазы (силикагель) 200 мкм на стеклянной подложке размером 20 х 10 см;

* стеклянные пластины, изготовленные путем смыва неподвижной фазы с пластин ВЭТСХ деионизованной водой и последующего высушивания полученных пластин.

2) Для органического элементного анализа:

* автоматический элементный анализатор модели «Flash ЕА 1112)) (ThermoFinnigan, Италия) (схема прибора представлена на рисунке 19);

* автоматический элементный анализатор модели «Duratherm)) (Gerhardt, Германия) (основное отличие от анализатора «Flash ЕА 1112)) состоит в том, что в анализаторе «Duratherm)) присутствует трубка из водопроницаемой мембраны, а фильтр для удаления воды объемом меньше, чем в приборе «Flash ЕА 1112))).

автодозатор

кислород

СО, ловушка

Н,0 ловушка

Рисунок 19 - Схема элементного анализатора «Flash ЕА 1112)) (ThermoFinnigan, Италия) в конфигурации для определения содержания азота в образцах (ДТП - детектор по теплопроводности, ПК - персональный компьютер), заимствовано из [366, 367] О 2000, 2008 Thermo Fisher Scientific Inc.

105

3) Для спектроскопии ЯМР:

• ЯМР-спектрометр модели «JNM ECA 600» (JEOL, Япония) с рабочей частотой для ядер 1Н 600 МГц.

4) Для ВЭТСХ и ВЭТСХ-МС:

• лабораторный комплекс оборудования для тонкослойной хроматографии (CAMAG, Швейцария), включающий

о нагреватель пластин «Lamellate TLC Plate Heater III» с температурой нагрева до 200оС;

о устройство для разрезания пластин «Smart-Cut»;

о камеру с двумя отсеками «Twin Trough Chamber»;

о камеру для варьируемого числа пластин «HPTLC Vario Chamber»;

о автоматизированный автодозатор для ТСХ «ATS4»;

о автоматизированную камеру для ТСХ-элюирования «ADC2»;

о сканер для тонкослойной хроматографии «TLC Scanner 3»;

о систему цифровой фотодокументации «DigiStore 2 Documentation System»;

о программное обеспечение «winCATS», версия 1.4.1 (CAMAG, Швейцария).

• экстракционный ТСХ-МС интерфейс (CAMAG) с овальной и круглой головками для элюирования (рисунок 20);

• система ВЭЖХ-МС с квадрупольным масс-спектрометром модели «G1956B» (Agilent, Германия) с источником ионизации электрораспылением в сочетании с ВЭЖХ-хроматографом модели «1100» (Agilent), оборудованным системой градиентного смешивания под высоким давлением «G1311A» и дегазатором «G1322A».

5) Для ГХ-МС:

• газовый хроматограф модели «5890» (Hewlett-Packard, США), оборудованный

инжектором для ввода проб с делением/без деления потока, c капиллярными колонками «RTX-1» (Crossbond® 100% диметилполисилоксан; длина 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм; толщина слоя неподвижной фазы 0.25 мкм; Restek, США) и «Stabilwax» (Crossbond® Carbowax®, полиэтиленгликоль; длина 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, толщина слоя неподвижной фазы 0.25 мкм; Restek, США), с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором модели «HP 5970» (Hewlett-Packard) в режиме электронной ионизации;

106

* газовый хроматограф модели «6890N» (Agilent, Германия), оборудованный инжектором для ввода проб с делением/без деления потока, с капиллярной колонкой «HP-5MS» (5% дифенил 95% диметилсилоксан; длина 30 м, внутренний диаметр 0.25 мм, толщина слоя неподвижной фазы 0.32 мкм; Agilent, Германия), с магнитным секторным масс-спектрометрическим детектором GCmate II (JEOL, Япония), работающим в режиме электронной ионизации.

Рисунок 20 - ТСХ-МС интерфейс (CAMAG), заимствовано из [108] О 2009 CAMAG

6) Для масс-спектрометрии ДАРТ:

* времяпролетный масс-спектрометр модели «AccuTOF» (JEOL, Япония) с ионным источником «DART-100)) (IonSense, США; схема прибора представлена на рисунке 21);

* квадрупольный масс-спектрометр модели «G1956B)) (Agilent, Германия) в сочетании с ионным источником «DART-SVPA)) (IonSense) и вакуумным интерфейсом «Vapun) (IonSense; схема прибора представлена на рисунке 22);

* два масс-спектрометра типа «орбитальная ионная ловушка)) серии «Exactive)) (Thermo Fisher Scientific, Германия; схема прибора представлена на рисунке 23), оснащенных вакуумными интерфейсами «Vapun) (IonSense) и ионными источниками ДАРТ «DART-SVPA)) и «ID-CUBE)) (IonSense);

* керамические трубки для интерфейсов «Vapun) с внутренним диаметром 3.18 мм и 4.75 мм и длиной 83 и 173 мм;

* устройство для автоматизированной подачи наконечников «12 DIP-it sampler)) (IonSense);

107