Комбинация планарной хроматографии и масс-спектрометрии МАЛДИ для исследования смесей органических соединений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.03, кандидат наук Эспарса Сандоваль Сесар Аугусто

• Эспарса Сандоваль Сесар Аугусто
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Эспарса Сандоваль Сесар Аугусто

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1: Литературный обзор

1.1 Применение комбинации Масс-спектрометрии с тонкослойной хроматографией для исследования органических соединений. История и развитие метода

1.1.1 Комбинация масс-спектрометрии с тонкослойной хроматографией в режимах офф-лайн и он-лайн. Преимушества и недостатки

1.1.2 ТСХ/МС в режиме онлайн. Классификация, разновидности метода и новые тенденции

1.1.2.1 Анализ липидов комбинированным методом ТСХ/МАЛДИ-МС

1.1.2.2 Анализ углеводов методом ТСХ/масс-спектрометрии МАЛДИ

1.1.2.3 Комбинация ТСХ/МАЛДИ-МС в анализе лекарственных веществ и наркотиков

1.1.2.4 Комбинация ТСХ/МАЛДИ при анализе других органических веществ и продуктов реакции

1.2. Поверхностью-активированная лазерная десорбция/ионизация (ПАЛДИ). Применение графита для комбинации ТСХ/МАЛДИ-МС при исследовании органических соединений

1.3. Перспективы использования дериватизации в комбинированном методе ТСХ/МАЛДИ-МС

1.3.1 Дериватизация в Масс-спектрометрии МАЛДИ

1.3.2 Дериватизация в ТСХ

1.3.3 Предпосылки использования дериватизации в комбинации ТСХ /МАЛДИ-

МС

ГЛАВА 2: Экспериментальная часть

2.1 Использованные вещества, растворители и материалы

2.2 Приготовление комбинированных матриц на основе традиционных матричных соединений, графита и глицерина

2.3 Синтез ионных жидкостей (ИЖ) как матриц для МАЛДИ

2.4 Приготовление комбинированных матриц на основе ионных

жидкостей

2.5 Аппаратура

2.6 Проведение экспериментов: хроматографическое разделение

2.7 Дериватизация на пластине ТСХ

ГЛАВА 3: Обсуждение результатов

3.1 Методические разработки для исследований комбинированным методом ТСХ/масс-спектрометрии МАЛДИ (на примере азотсодержаших гетероциклических соединений)

3.1.1 Использование графита при лазерной десорбции/ионизации с пластин ТСХ (метод графито-активированной лазерной десорбцией/ионизацией, ГАЛДИ)

3.1.2 Ионные жидкости как матрицы для масс-спектрометрии МАЛДИ

3.1.3 Комбинированные матрицы на основе глицерина, графита и традиционных матричных соединений для использования в ТСХ/масс-спектрометрии МАЛДИ

3.1.4 Комбинированные матрицы на основе ионных жидкостей

3.2 Пост-хроматографическая дериватизация при анализе ТСХ-МАЛДИ гидроксилсодержащих соединений

3.3 Дериватизация и анализ первичных аминов и аминокислот методом

ТСХ/масс-спектрометрии МАЛДИ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы и степень ее разработанности:

Среди различных новейших высокочувствительных и прецизионных методов анализа тонкослойная хроматография (ТСХ) до сих пор занимает одно из важных мест в качественном и полуколичественном анализе синтетических и природных смесей. Это объясняется простотой проведения анализа, низкой стоимостью расходных материалов и обширной базой практического применения. Однако этому методу свойственен ряд недостатков. Так, например, в практике ТСХ идентификация разделенных компонентов обычно проводится с использованием различных оптических, химических методов и величин Rf, не отличающихся высокой селективностью, чувствительностью и информативностью. Гораздо более эффективным подходом для идентификации компонентов разделенных с использованием ТСХ является применение масс-спектрометрии с десорбционными методами ионизации, в частности, с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (МАЛДИ).

Однако такой подход также не лишен недостатков, которые характерны для обоих этих методов. Как известно, ионизация в условиях МАЛДИ протекает за счет присоединения к молекуле аналита катионов металлов (К+, №+), протонирования или депротонирования. Если же для молекул аналитов такие процессы затруднены, эффективность ионизации значительно снижается. А это, в свою очередь, обуславливает значительное снижение чувствительности и уверенной идентификации соответствующих соединений с использованием масс-спектрометрии МАЛДИ и ее сочетания с ТСХ. Сюда относятся неполярные и слабополярные соединения как природного происхождения (например, спирты, фенолы, растительные стерины, стероиды, терпенолы, амины, аминокислоты), так и синтетические (например, биологически активные гетероциклические соединения) и многие другие.

Еще одной проблемой является то, что разделение соединений с использованием ТСХ приводит к значительному снижению концентрации аналита на поверхности адсорбента из-за распределения вещества по толщине слоя сорбента и увеличением

линейных размеров пятна в процессе хроматографирования, связанным с капиллярным эффектом. Это явление также значительно ухудшает чувствительность метода МАЛДИ при регистрации масс-спектров непосредственно с пластины для ТСХ. Данную проблему в какой-то мере можно решить с использованием композитных матриц для МАЛДИ. Однако в случае соединений, присутствующих в следовых количествах или слабо ионизирующихся малополярных соединений, этого может оказаться недостаточным для регистрации их масс-спектров.

Достаточно эффективным решением всех указанных проблем может быть применение дериватизации. При этом реакция должна проводиться непосредственно на пластине для ТСХ после хроматографического разделения компонентов, то есть этот процесс следует отнести к разряду постхроматографических. Наиболее оптимальным подходом в таком случае является химическая модификация, направленная на введение в молекулу детектируемого и идентифицируемого соединения остатка с фиксированным зарядом, который будет обеспечивать легкую десорбцию деривата в условиях МАЛДИ.

Следует подчеркнуть, что известно крайне мало публикаций, посвященных дериватизации для нужд комбинированного метода ТСХ/масс-спектрометрия МАЛДИ. Упоминания о постхроматографической дериватизации при анализе этим методом в литературе вообще отсутствуют. И это представляется довольно странным, так как в практике ТСХ различные дериватизационные подходы (правда, обычно используемые для визуализации хроматограмм в области видимого и УФ-света, флуоресценции) уже давно находят широкое применение.

Необходимо отметить, что разработка методов постхроматографической дериватизации, основанных на введении фиксированного заряда в молекулу аналита имеет перспективы применения не только в тандеме ТСХ/масс-спектрометрия МАЛДИ, но и в сочетании ТСХ с другими "мягкими" десорбционными масс-спектрометрическими методами такими, например, как DART («прямой анализ в режиме реального времени»). Можно ожидать

применение таких дериватизационных подходов при масс-спектрометрической визуализации соединений в тканях, например, в молекулярной гистологии.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комбинация планарной хроматографии и масс-спектрометрии МАЛДИ для исследования смесей органических соединений»

Цель работы:

Целью нашей работы являлась разработка эффективных методик детектирования и идентификации синтетических и природных органических соединений в смесях с использованием сочетания ТСХ и масс-спектрометрии МАЛДИ; разработка нового подхода для анализа этим методом (в он-лайновом режиме) плохо ионизирующихся веществ с использованием пост-хроматографической дериватизации.

Научная новизна работы:

Полученные результаты в рамках данной работы являются новыми. Разработаны и оптимизированы подходы для регистрация масс-спектров МАЛДИ непосрественно с пластин ТСХ в онлайновом режиме для широкого круга соединений. Впервые предложена комбинированная матрица, обеспечивающая десорбцию и ионизацию аналитов из сорбента ТСХ при их анализе методом МАЛДИ. Она позволяет увеличить концентрацию аналита на поверхности адсорбента и тем самым увеличить чувствительность анализа. Впервые предложен общий подход и разработаны методики для химической модификации (дериватизации) слабо и неполярных аналитов непосредственно на пластинах для ТСХ. Показано, что особенно эффективным является использование реагентов, позволяющих вводить в аналит остаток с фиксированным зарядом. Этот прием обеспечивает легкую десорбцию заряженной частицы, регистрацию масс-спектров МАЛДИ с хорошим соотношением сигнал/шум и получение надежной структурно-аналитической информации.

Теоретическая и практическая значимость работы:

Проведенные исследования расширяют границы применения комбинированного метода ТСХ/масс-спектрометрии МАЛДИ при анализе органических соединений, сокращают ограничения этих двух методов, что мотивирует внедерение разработанной методологии в химические и аналитические лаборатории.

Апробация работы.

Результаты работы докладывались на: XXI Международная научной конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2014», МГУ имени М.В. Ломоносова (2014г.), III Всероссийская научная конференция с международным участием «Успехи синтеза и комплексообразования», посвященной 55-летию РУДН (2014 г.), VII ВМСО, VI Всероссийская конференция с международным участием «Масс -спектрометрия и ее прикладные проблемы» (2015 г.), Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2016» (2016 г.), VIII съезд ВМСО "Масс-спектрометрия и её прикладные проблемы" (2017 г.), 6th World conference on physic chemical methods in drug discovery and development, Хорватия (2017 г) и др.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 5 статей в реферируемых журналах и 9 тезисов в материалах различных конференций.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа объемом 120 страниц машинописного текста состоит из введения, обзора литературных данных, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы, который включает 114 источников. Содержит 7 схем, 10 таблиц, 31 рисунок.

Благодарности.

Автор работы выражает благодарность д.х.н. профессору Заикину В.Г., к.х.н Борисову Р.С. и к.х.н. Половкову Н.Ю. за разнообразную помощь и консультации при выполнении работы.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Применение комбинации масс-спектрометрии с тонкослойной хроматографией для исследования органических соединений. История и развитие метода.

Среди различных хроматографических методов, тонкослойная хроматография (ТСХ) представляет собой важный недорогой вариант, отличающийся простотой и экспрессностью при разделении и полуколичественном анализе широкого круга химических веществ. Кроме того, он часто составляет конкуренцию таким методам как жидкостная хроматография (ЖХ) и газовая хроматография (ГХ) из за его способности разделять сложные смеси и давать количественные результаты с использованием минимальных количеств образца и растворителя [1]. В последнее время значительные усилия были направлены на разработку различных версий ТСХ таких как высокоэффективная ТСХ (ВЭТСХ) , ультратонкая (УТСХ), двумерная (2D) и трехмерная (3D), особенно при их сочетании с различными методами детектирования и анализа, включая УФ, флуоресценцию, инфракрасное излучение и масс- спетрометрию.

История создания и развития тонкослойной хроматографии начиналась с работ Исмаилова и Шрайбера в 1938 году. В этих первых работах были проанализированы растительные настойки на пластинках, покрытых слоями оксида алюминия, с использованием метанола как подвижной фазы. Эти работы были описаны Шермой и Морлоком в обзоре [2].

Первая работа, демонстрирующая возможности сочетания ТСХ с масс-спектрометрией (МС) была проведена Исааком лишь в 1977 [3]. Он использовал элюирование отдельных соединений из сорбента пятен на ТСХ с помощью инструмента CAMAG Eluchrom, разработанного в 1975 году [2]. Элюаты затем вводились в масс-спектрометр через входной зонд Pyrex. Комбинация ТСХ с МС позволяет получить максимальный объем информации с хроматограмм при идентификации отдельных зон, что очень важно для исследований во многих

областях таких как анализ лекарств, продуктов их распада и метаболитов, идентификация аналитов в судебно-экспертных образцах, анализ биологических активных компонентов в фитохимических образцах, быстрый скрининг пищевых продуктов и анализ образцов окружающей среды. Доступность МС особенно необходима при отсутствии аналитических стандартов для обычной идентификации путем сравнения значений Rf. Количественное определение идентифицированных соединений также может быть проведено с помощью ТСХ/МС как альтернативы или дополнения денситометрического количественного анализа.

1.1.1. Комбинация масс-спектрометрии с тонкослойной хроматографией в режимах офф-лайн и он-лайн. Преимушества и недостатки.

Среди способов сочетания ТСХ с МС особенно выделяются следующие:

1) Оффлайновый вариант, включающий соскабливание адсорбционного слоя пятна, содержащего аналит, с пластины ТСХ с последующим экстрагированием растворителем. Этот экстракт, как правило, можно проанализировать различными масс-спектрометрическими методами. Данный способ удобен и обеспечивает базовую информацию, однако является довольно утомительным и занимает много времени.

2) Онлайновый вариант следует считать наиболее эффективным, так как он позволяет проводить прямой масс-спектрометрический анализ непосредственно с пластинки для ТСХ путем двумерного сканирования пластин.

Комбинация ТСХ/МС в оффлайновом варианте долгое время использовалась в органическом синтезе, в фитохимическом анализе, в анализе пищевых продуктов, в фармацевтическом и медицинском анализе, в других естественных науках и во взаимосвязанных областях. Обычно этот вариант предполагает использование препаративных пластин ТСХ с довольно толстым слоем адсорбента (0,5-2 мм), что позволяет нанесение большого количества образцов, а это компенсирует потенциальные потери аналита из-за деградации соединений или потери в процессе очистки. Образцы обычно наносятся в виде широких полос от левой к правому

сторону пластины ТСХ, а затем соединения разделяются одним или несколькими последовательными прогонами элюентов на ТСХ. Соскобленные или иным способом изолированные пятна с веществами на сорбенте, представляющие интерес для анализа, повторно экстрагируются подходящей системой растворителей и анализируются способом МС. Иногда соскобленное пятно вместе с адсорбентом можно помещать вблизи области ионизации масс-спектрометра с помощью системы прямого ввода. Программируемый прогрев последнего обеспечивает термодесорбцию аналита и подачу паров аналита в область ионизации.

Такая утомительная и время-затратная процедура может сопровождаться воздействием деструктивных факторов (кислоты, свет, тепло и окислители -особенно кислород воздуха) на лабильные аналиты. Это может привести к окислению, деградации или изомеризации аналитов. В результате зарегистрированные масс-спектры могут быть обусловлены смесью веществ и поэтому трудно интерпретируемы. Ограниченное количество анализируемого вещества может оказывать негативное воздействие на масс-спектрометрическую чувствительность, причем его концентрация может оказаться ниже предела обнаружения. В ряде случаев для избежания таких нежелательных побочных химических процессов используют предварительную обработку пластин с сорбентом основаниями, парами аммиака и др., которые также могут добавляться к проявляющему растворителю [4-6].

Вместе с тем, очевидным преимуществом оффлайнового варианта ТСХ/МС является возможность анализа большой разновидности химических веществ. Например, практически не существует ограничений для выбора растворителей, которые могут быть использованы для повторной экстракции аналитов из хроматографического слоя сорбента. Многие растворители и буферы, несовместимые с масс-спектрометрическими методами (например, фосфатный буфер или ацетат триэтиламмония), могут быть легко использованы для оптимальной экстракции и стабилизации аналитов, если их удалить до регистрации

масс-спектров. Таким образом, при должной осторожности лабильные соединения могут быть перенесены с пластины ТСХ в масс-спектрометр с незначительной потерей аналита, хотя общий анализ методом ТСХ/МС может по-прежнему занимать много времени.

С созданием и развитием новых способов ионизации и технологии ионных источников в MQ а также интерфейсов для сочетания ТСХ и MQ онлайновый подход к анализу органических соединений этим комбинированным методом становится все более востребованным. В этом случае, предварительно проэкспонированная в среде подходящего растворителя хроматографическая пластина помещается непосредственно в ионный источник масс-спектрометра. Для этих целей разработаны и создаются соответствующие системы. Последние могут осуществлять элюирование из пластины ТСХ с помощью растворителя, либо термическую десорбцию аналита, либо прямую ионизацию на пластине с использованием специфических ионизационных методов, таких как десорбционная ионизация с электрораспылением (DESI), бомбардировка быстрыми атомами (FAB), масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS) и матрично-активированна лазерная десорбция/ионизация (MALDI).

Существует ряд преимуществ онлайнового варианта ТСХ/МС по сравнению с оффлайновым. Например, перенос аналитов из сорбентов с пластин ТСХ в масс-спектрометр в онлайновом режиме осуществляется очень быстро, что сводит к минимуму нежелательные превращения лабильных соединений. В анализе могут применяться классические хроматографические пластины, а также пластины, обеспечивающие высокое разрешение, такие как пластины для высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и ультратонкой хроматографии (УТСХ), без потери чувствительности. Таким образом, онлайновый интерфейс очень удобен, хотя потенциально могут возникнуть некоторые сложности в процессе анализа. Например, при анализе методом ТСХ/МАЛДИ-МС пятна на проявленных пластинах ТСХ могут размываться в ходе добавление матрицы, которая необходима для ионизации аналитов. Однако, область вокруг

пятен может быть тщательно отмечена заранее, что предотвратит размывание соединений и потерю чувствительности в MС [7]. Еще одна частая проблема в онлайновом анализе заключается в ограниченном выборе элюентов, подходящих для МС.

1.1.2. ТСХ/МС в режиме онлайн. Классификация, разновидности метода и новые тенденции.

Схема классификации подходов для переноса проб с пластин ТСХ/ВЭТСХ в масс-спектрометр была опубликована Морлоком и Шваком в обзорной статье [8]. Ряд из них основан на способах элюирования вещества и подразделяется на: микрокапиллярная решетка (microcapillary array) , система сбора проб с поверхности (surface sampling probe), перезаполняющая хроматография на полосе ТСХ (overrun chromatography on a TLC strip), методы принудительного потока (forced flow techniques) такие как хроматография на сверхплотном слое (overpressured layer chromatography [OPLC], ротационная планарная хроматография (rotation planar chromatography [RPC]), и другие.

Вторая основная классификация включает различные принципы десорбции проб из сорбента ТСХ. Сюда входят десорбция при бомбардировке быстрыми атомами (FAB); десорбция ионной бомбардировкой (масс-спектрометрия вторичных ионов [SIMS]); десорбция лазерным излучением (лазерная десорбция/ионизация, активированная матрицей [MALDI] с возможностью визуализации, лазерная десорбция/ионизация, активированная поверхностью [SALDI], лазерная десорбция/ионизация с включением электрораспыления [ELDI], лазерная абляция в масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой [LA-ICPMS] и лазерно-индуцированная акустическая десорбция с электрораспылительной ионизацией [LIAD-ESI-MS]); ионизация с десорбцией электрораспылением [DESI], масс-спектрометрия с акустической спрейной ионизацией в обычных условиях [EASI]); десорбция с помощью возбужденного газового пучка (прямой анализ в реальном времени [DART] и ионизация в тлеющем разряде при атмосферном давлении- [FA-APGD]). Суть процессов ионизации для каждого из этих методов МС был описан в

трех обширных обзорах [9-11] и четырех главах книг [12,13], посвященных комбинации масс-спектрометрии с ТСХ.

Несмотря на значительное разнообразие комбинаций ТСХ с МС, чаще всего используются только три коммерчески доступных интерфейса (рис. 1). Один из них, называемый «elution-head» интерфейсом и производимый CAMAG, на сегодняшний день чаще всего встречается при анализе методом масс-спектрометрии с иоизацией электрораспылением (ИЭР-МС; ESI-MS). Система МАЛДИ-МС, активно разрабатываемая компанией Bruker-Daltonics, включает интерфейс, который фактически используется при обычном анализе с применением лезерной десорбцией/ионизацией со стандартной мишени. Интерфейс для анализом ТСХ пластин с помощью DART-МС был разработан компанией IonSense, Inc.

В последние годы ТСХ успешно сочеталась с МАЛДИ для идентификации и количественного определения органических вещесть и биомолекул, таких как липиды, ганглиозиды, красители, различные лекарства и медикаменты.

1.1.2.1. Анализ липидов комбинированным методом ТСХ/МАЛДИ-МС.

Липиды представляют собой разнообразную по молекулярному составу группу соединений, проявляющих различные биологические функции в клеточных мембранах и, в частности, в сигнальных процессах [14]. Комплексный анализ липидных молекул («липидомика»), в контексте с геномикой и протеомикой имеет решающее значение для понимания клеточной физиологии и патологии, причем липидая биология стала основной целью исследования постгеномных превращений. Из-за большого разнообразия структур разделение и идентификация компонентов липидов является сложной задачей в аналитической химии. В последнее время прорывные исследования в области липидомики были обусловлены новейшими достижениями в ряде аналитических технологий, таких как масс спектрометрия (МС), ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и другие спектроскопические методы [15,16]. Среди них комбинированный метод ТСХ/МС

является особенно привлекательным и перспективным, поскольку позволяет быстро получать довольно значительное количество структурной и количественной информации о липидоме.

Рис. 1. Часто используемые интерфейсы в ТСХ/МС. Система CAMAG TLC/MS INTERFACE 2 предназначена для анализа методом ТСХ/ИЭРМС (а); MTP TLC-MALDI адаптер для пластин размером 50 х 75 мм; после разделения пластина ТСХ подается в масс-спектрометр для прямого анализа методом МАЛДИ (b); система DART-SVP от компании Ion Sense позволяет сканировать пластины ТСХ под разными углами для последуюшей регистрации масс спектров (с).

Сочетание ТСХ с МАЛДИ-МС было использовано для разделения и идентификации фосфолипидов в курином яичном желтке [17]. С применением 2,5-дигидроксибензойной кислоты ^НБ) как матрицы авторы идентифировали шесть фосфолипидов, таких как фосфатидилхолин ^^ 73%), лизофосфатидилхолин (LPC, 5,8%), сфингомиелин (SM, 2,5%), фосфатидилэтаноламин (PE, 15,0%), лизофосфатидилэтаноламин (LPE, 2,1%) и фосфатидилинозитол 0,6%). Было отмечено, что фосфатидилхолин является наиболее распространенным видом среди всех фосфолипидов, причем в его спектре в основном наблюдались два пика при т/г 760.6 и 782.6, которые были отнесены к протонированной молекуле и

также аддукту с натрием соответственно. Также было показано, что, даже небольшие количества мелких фракций (фосфатидилинозитол) могут быть легко проанализированы и дают спектры с хорошим соотношением сигнал/шум. Поскольку фосфатидилинозитол составляет лишь 0,6% от общего количества фосфолипидов яичного желтка, это доказывает преимущество данного метода. Отмечено, что в нижней и верхней части пятна фосфатидилэтаноламина регистрируются разные масс спектры. Объясняется это тем, что для случая использованного элюирующего растворителя фосфатидилэтаноламины с более длинными ацильными остатками перемещаются легче, чем

фосфатидилэтаноламины с короткими ацильными остатками (рис. 2).

Штубигер и коллеги описали использование тригидроксиацетофенона для улучшенной аналитической методики анализа сложных липидных смесей с использованием ВЭТСХ/МАЛДИ-МС [18]. Этот метод был эффективно применен для разделения и обнаружения различных классов нейтральных (триацилглицеридовов) и полярных (глицерофосфолипидов и сфинголипидов) липидов, в плазме крови или соевом лецитине. Структуры основных компонентов были подтверждены методом МАЛДИ-МС с использованием режима распада после источника (postource decay PSD).

Для более эффективного качественного и количественного анализа липидов используют различные процедуры их извлечения из конкретного анализируемого объекта. Эйбисш и коллеги, например, раздельно извлекали из куриного яичного желтка различные липиды, а также очищенные фракции фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина [19].

С помощью этого метода были эффективно разделены и с хорошей чувствительностью идентифицированы Ьпальмитоил^-олеоил^

фосфатидилхолин и 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-фосфатидилэтаноламин. Было замечено, что первый из них (пики потонированной и содиированной молекул, m/z 760,6 и 782,6) является наиболее распространенным видом. Причиной значительно более высокой интенсивности пика аддукта с Na+ (m/z 782,6) по сравнению с пиком протонированной молекулы (m/z 760,6) после разделения ТСХ является

использование физиологического раствора для повторного элюирования липидов из силикагеля. Часть фосфатидилэтаноламина легко наблюдается на пластинке ТСХ, но исключительно детектируется после отделения от фосфатидилхолина, который был четко идентифицирован по масс-спектрам МАЛДИ всего экстракта.

Рис. 2. Тонкослойная хроматограмма экстракт куриного яичного желтка (слева), разделенного на пластине (после окрашивания примулином). Около 35 мкг фосфолипида было взято для того, чтобы получить достаточно хорошие масс-спектры МАЛДИ. Масс-спектры зарегистрированы для случая положительно заряженных ионов с DHB в качестве матрицы. Фосфатидилхолин (РС), лисо-фосфатидилхолин (LPC), лисо-фосфатидилэтаноламин (LPE),

фосфатидилинозитол (Р1), фосфатидилэтаноламин (PE), сфингомиелин (SM).

Гликосфинголипиды (ГСЛ) представляют собой обширный класс липидов, имеющих одну и ту же основную структуру как и церамиды. Ганглиозиды - это отдельная группа сложных гликосфинголипидов, характеризующихся присуствием сиаловой кислотой в их углеводной цепи [20]. Эти вещества встречаются в тканях позвоночных и были обнаружены у некоторых беспозвоночных [21]. Из-за важности и роли ганглиозидов, ТСХ в сочетании с МАЛДИ-МС была успешно применена для разделения и определения

гликосфинголипидов в различных образцах. Например, группа Ивлевой описала использование ТСХ, связанной с внешним источником ионов МАЛДИ в масс-спектрометре с преобразованием Фурье (МАЛДИ-ФП-МС) для разделения и идентификации смесей ганглиозидов без потери точности определения массы и разрешения прибора [22]. Было замечено, что поскольку в ФП-МС используется колебательно-охлажденный источник ионов МАЛДИ, хрупкие гликолипиды десорбируются из адсорбционного слоя пластин ТСХ без фрагментациии. Авторы также апробовали около 20 органических молекул в качестве матриц для анализа ганглиозидов и фосфопептидов, десорбированных из пластин ТСХ, а также со стандартных металлических пластин для МАЛДИ-МС. Они также изучали зависимости фрагментации аналитов от мощности лазера. Среди испытанных матриц DHB, 6-аза-2-тиотимин (ATT) и антраниловая кислота существенно уменьшали потерю сиаловой кислоты в аналитах. Аналогично, использование матриц, таких как CHCA, синапиновая кислота (SA), потребовало максимального ослабления мощности лазера для получения, по меньшей мере, частично сиалилированных иинов ганглиозида. Используя этот метод, ганглиозиды цельного мозга разделяли на пластинах для ТСХ, которые затем прикрепляли непосредственно на мишени для МАЛДИ и подавали в масс-спектрометр с преобразованием Фурье с разрешением > 70 000 для детектирования и идентификации ганглиозидов. .

Эта же группа исследователей сравнивала стабилизацию и детектирование десорбированных ганглиозидов на коммерческом время-пролетном масс спектрометре с ортогональным вводом (o-ТОФ) [23]. Было показано, что сочетание ТСХ с прибором proTOF 2000 (компания Perkin Elmer) оспечивает простой и быстрый анализ ганглиозидов. При этом авторы оптимизировали условия десорбции/ионизации ганглиозидов с пластин ТСХ, варьируя тип и количество матрицы, необходимой для получения наилучших спектральных результатов. Было замечено, что SA является лучшей матрицей, поскольку она обеспечивает наиболее

однородную сокристаллизацию аналита внутри объемного слоя силикагеля на пластинке ТСХ и наиболее эффективно кристаллизуется с ганглиозидами.

Для целей анализа ганглиозидов были испытаны два типа лазеров (инфракрасный лазер [Er:YAG, 2,94 мкМ] и УФ-лазер). Оказалось, что чувствительность десорбции/ионизации гликолипидных молекул с пластин ТСХ существенно выше в случае инфракрасного лазера. Группа Дрейсеверда разработала новый метод прямого сочетания ВЭТСХ с МАЛДИ-МС с применением инфракрасного лазера как способа мягкой десорбции/ионизации биомолекул [24]. При этом авторы использовали глицерин в качестве жидкой матрицы. Оказалось, что глицерин обеспечивает гомогенное смачивание силикагеля, а также упрощает и ускоряет процесс. На рисунке 3 видно, что моносиалодигексозил ганглиозиды GM3 проявляются на пластинке для ВЭТСХ в виде двойной полосы. Доказано, что «нижняя полоса» обусловлена видами GM3 с короткоцепочечными жирными кислотами (в основном C16:0), тогда как «верхняя полоса» содержит виды GM3 с длинноцепочечными жирными кислотами (в основном C22:0, C24:1 и C24:0). В качестве минорных компонентов были обнаружены молекулы GM3 с остатками жирных кислот C14:0, C17:0 и C18:0 (пики депротонированных молекул при m/z 1123,69; 1165,74 и 1179,75 соответственно). Отметим, что пики разновидностей GM3 с остатками жирных кислот C22:0, C24:1 и C24:0, в больших количествах присутствующие в суммарной фракции, полностью отсутствуют в спектре ИК-МАЛДИ нижней полосы, что подтверждает преимущества комбинации ТСХ с ИК-МАЛДИ-МС при разделении и идентификации различных видов GM3.

Мускеи и коллеги описали способ прямой структурной и количественной характеризации микробных гликосфинголипидних рецепторов на базе комбинации ТСХ и ИК-МАЛДИ-оТОФ-МС [25]. Метод оказался эффективным при разделении смесей гликосфинголипидов, характеризации хроматограмм гликосфинголипидов из специфических бактерий, обнаружении связи микробов с первичными антителами.

Рис. 3. Масс-спектры ВЭТСХ-ИК-МАЛДИ (режим регистрации отрицательно заряженных ионов). (а) Масс-спектр нижной полосы GM3 после разделения на ВЭТСХ. (b) Увеличенный диапазон, показывающый область m/z между 1100 и 1400. (с) Увеличенный диапазон масс-спектра верхной полосы GM3 после разделения на ВЭТСХ, показывающий область m/z между 1100 и 1400. (Dreisewerd, K. et al., 2005. Anal. Chem., 77, 4098-4107).

1.1.2.2 Анализ углеводов методом ТСХ/масс-спектрометрии МАЛДИ.

Наряду с белками, нуклеиновыми кислотами и липидами углеводы являются еще одним важным и до сих пор изучаемым типом биомолекул. Интерес к углеводам и их анализу постоянно увеличивается и в круг исследований вовлекаются все новые их типы, проявляющие необычные физиологические свойства и выполняющие важные регуляторные функции в организме человека [26].

При анализе углеводов можно встретиться с большими сложностями, обусловленными следующими причинами [27]:

1. Углеводы существуют в виде различных изомеров (например, эпимерные сахара глюкоза и галактоза), которые разделяются с трудом. Поиск способов разделения сахаров всегда остается актуальным. Часто для этого используют газовую хроматографию (ГХ) и ГХ/МС, но анализ этим методом является трудоемким, поскольку требует предварительной дериватизации образцов [28].

2. Часто углеводы обладают крайне низкой летучестью, что усугубляет их анализ этими методами [29].

3. Отсутствие флуоресцентных или УФ-поглощающих фрагментов препятствует применению многих часто используемых аналитических методов, которые могут потребовать предварительной модификации целевого углевода путем введения хромо или флуорофора [30].

Хорошо известно, однако, что даже сложные углеводные смеси (обнаруженные в образцах пищи или мочи) могут быть разделены с помощью ТСХ [31]. Хотя в настоящее время существуют многие коммерчески доступные неподвижные фазы, на практике для разделения углеводов применяются в основном три вида сорбентов: целлюлоза, силикагель и аминопропил силика [32]. Среди них для разделения углеводов методом ТСХ силикагель в настоящее время является наиболее часто используемым сорбентом.. Слой такого сорбента подходит почти для всех углеводов (за исключением полисахаридов из за их низкой миграции) и могут обеспечивать оптимальное раделение. В частности было показано, что

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Эспарса Сандоваль Сесар Аугусто, 2019 год

«дп -

240 и и

... ... ••

ЗП - * — шт ч V

> ч

1 п VI

V I1

20 - V

-

у ■ш —

— — — — — — — — — / м +1 " + — — —

— — — — — — — — — — — —

п -

0 0 1 1 2 ■ 1 04 Инт 1 1 и 6 енсивно 1 1 и 8 сть, % 1 1 0 1С

НИ

N

1.12

^он

о Н3С

1.4

\\ СН2

о^оН

о

И—СН3

1.5

Рис. 16. Реальная и графическая хроматограммы для трехкомпонентной смеси после ее разделения и использования комбинированной матрицы DHB-графит-глицерин. На рисунке указаны ионы, по которым строилась графическая хроматограмма.

0

....

[М+Т -л+

[М+Ма]+

Г1\ А+Ц

[М

ш/г

145 330 210

50 100

Интенсивность, %

О^ООИЗ

N

1.11

1.3

ОИ2

1.7

Рис. 17. Реальная и графическая хроматограммы для трехкомпонентной смеси после ее разделения и использования комбинированной матрицы АТ-графит-глицерин. На рисунке указаны ионы, по которым строилась графическая хроматограмма.

+

0

3

0

0

[М [+И]+

¿шш ■ ■■■

...

[М

<

[М+Т Л+

_

N

ш/г

145 330 210

Л+№]+

100 200 300

Интенсивность, %

400

О^/ООИз

1.11

1.3 ОИ2

1.7

Рис. 18. Реальная и графическая хроматограммы для трехкомпонентной смеси после ее разделения и использования комбинированной матрицы 1АА-графит-глицерин. На рисунке указаны ионы, по которым строилась графическая хроматограмма.

з

N

1.11

О^ООИЗ

1.3

1.7

Рис. 19. Реальная и графическая хроматограммы для трехкомпонентной смеси после ее разделения и использования комбинированной матрицы ИАБА-графит-глицерин. На рисунке указаны ионы, по которым строилась графическая хроматограмма.

з

Вг

70

60

50

40

.их.

30

20

10

Н3С СН3

о

г

■ ■■

м +1

1

[М+Ыа]н

1

/

ч ч

ч ч

V \

) гм+ Г

1 х»

а

1

ш

т/г

о^ _оСН3

\\

СН2

409 330 206

0 10 20 30 40

Интенсивность, %

С1

о

1.2

1.3

1.9

Рис. 20. Реальная и графическая хроматограммы для трехкомпонентной смеси после ее разделения и использования комбинированной матрицы DHB-графит-глицерин. На рисунке указаны ионы, по которым строилась графическая хроматограмма.

0

Таблица 8. Данные масс-спектров МАЛДИ, зарегистрированных с пластинок ТСХ при использовании различных комбинированных матриц на основе ионных жидкостей (табл. 6).

В-во Комб. \Мат. Пик Относительные величины пиков

1 2 3 4 5 6 7 8 9

1.1 [M+H]+ 3 150 0 47 24 22 122 827 28

0 0 0 0 0 0 30 0 11

[M+K]+ 0 0 0 0 0 0 0 0 9

1.2 [M+H]+ 0 34 0 15 13 142 39 0 0

24 170 32 56 34 77 210 0 6

[M+K]+ 9 56 13 24 11 45 60 0 6

1.3 [M+И]+ 6 92 47 28 19 125 0 217 11

58 206 155 155 181 294 163 1822 37

67 45 47 99 103 299 73 213 28

1.4 11 146 71 94 39 391 0 335 15

103 473 305 417 296 954 408 1768 60

[M+K]+ 97 133 99 264 153 936 150 402 39

1.5 ^иГ 17 299 54 64 21 202 51 0 4

[M+Na]+ 112 1822 408 374 193 1031 101 191 9

[M+K]+ 62 750 206 230 94 1012 34 127 6

1.6 [M+И]+ 9 75 374 45 460 144 0 152 7

[M+Na]+ 13 0 0 26 0 0 0 0 0

^кг 4 0 24 11 0 0 0 0 0

1.7 [M+И]+ 1871 329 879 34 67 288 0 956 60

[M+Na]+ 0 0 84 0 0 39 0 0 0

[M+K]+ 0 0 26 7 0 32 0 0 0

1.8 [M+И]+ 0 0 127 0 0 0 0 614 223

0 0 0 0 0 0 0 0 0

[M+K]+ 0 0 0 0 0 0 0 0 0

1.9 [M+И]+ 0 62 0 0 0 0 0 0 0

[M+Na]+ 0 0 13 26 22 0 0 170 0

[M+K]+ 0 507 34 0 7 0 0 0 0

1.10 ^ИГ 41 728 543 131 163 180 0 0 114

[M+Na]+ 7 0 36 0 0 0 0 425 0

[M+K]+ 6 0 39 15 0 0 0 65 0

1.11 [M+И]+ 37 443 230 290 210 432 0 215 331

[M+Na]+ 7 0 95 0 56 0 0 0 0

[M+K]+ 6 0 133 202 75 277 0 0 0

[M+H]+ 0 606 56 247 159 37 0 279 277

1.12 [M+Na]+ 0 0 32 0 62 0 0 0 0

[M+K]+ 0 92 13 167 67 79 0 0 0

[M+H]+ 350 238 185 520 1513 404 0 668 610

1.13 [M+Na]+ 41 4 21 0 0 0 0 0 0

[M+K]+ 41 4 9 0 0 0 0 0 0

3.2 Пост-хроматографическая дериватизация при анализе ТСХ-МАЛДИ гидроксилсодержащих соединений.

В продолжение работы мы впервые исследовали возможность применения целевой дериватизации непосредственно на пластинке ТСХ после элюирования смеси (пост-хроматографическая дериватизация) с последующей онлайновой регистрацией масс-спектров МАЛДИ разделенных компонентов. Целью этих исследований являлось не получение производных для визуализации пятен на пластинке, а для увеличения эффективности ионизации, получения структурной информации об аналитах и в перспективе для количественного их определения. До наших исследований работы такого характера никем не проводились.

Наибольший интерес представляло введение в молекулу аналита группы с коваленто-связанным зарядом. При этом неполярные и слабополярные соединения, неподдающиеся прямому анализу методом МАЛДИ, превращаются в солеобразные производные, обеспечивающие значительную эффективность ионизации под действием МАЛДИ или даже ее безматричного варианта, поскольку они содержат уже готовый катион, легко десорбирующийся в этих масс-спектрометрических условиях. Хотя регистрируемые при этом масс-спектры МАЛДИ содержат только катионные части производных, их массовые числа (с учетом молекулярной массы реагента для дериватизации) позволяют получить важнейшую информацию о веществе - молекулярную массу. Целевая дериватизация может подтвердить наличие в молекуле конкретных функциональных групп и в общем случае добыть важную информацию о структуре

исследуемого соединения, в частности, при дополнительном использовании тандемной масс-спектрометрии.

Первыми объектами нашего исследования были различные спирты, приведенные в таблице 2 (раздел 2). Поскольку это неполярные или слабополярные соединения, то, как и ожидалось, их масс-спектры МАЛДИ, зарегистрированные с пластин ТСХ с использованием всех опробованных матричных соединений и композитных матриц на их основе, не содержали сколько-либо значимых пиков ионов, соответствующих аналитам.

Для дериватизации соединений, содержащих гидроксильную группу, нами было предложено использовать их ацилирование 3-бромпропионилхлоридом в присутствии пиридина до образования четвертичной аммониевой соли. Пиридин в этой реакции является катализатором ацилирования, но дополнительно способен претерпевать кватернизацию за счет концевой бромацильной группы. Формально эта реакция является двухстадийной, однако, как было показано ранее [101] на примере хлорфенолов и стеринов, в присутствии пиридина или других высокоосновных аминов этот процесс может быть представлен как одностадийный (Схема. 4).

О

Схема 4. Реакция дериватизации гидроксил-содержащих соединений смесью 3-бромпропионилхлорида/пиридина.

Такой процесс отвечает почти всем критериям, предъявляемым нами к реакции дериватизации, проводимой в сорбенте для ТСХ in situ в сочетании с MALDI. Эта реакция протекает быстро и количественно при комнатной температуре, а предел обнаружения соединений, модифицированных таким образом, достигает нанограммовых уровней. Данный способ дериватизации не позволяет получать окрашенные соединения, но для локализации положения разделенных компонентов можно использовать детектирование компонентов в свете УФ лампы, однако это не всегда удобно. В этих случаях было предложено использование параллельно второй, контрольной, пластины ТСХ, хроматографирование которой производится в тех же условиях, а визуализация хроматограмм проводится стандартными методами, описанными в литературе.

Первыми объектами, на примере которых был опробован предложенный подход, стали насыщенные спирты линейного строения, а именно гексадеканол (2.1) и эйкозанол (2.2). Их растворы были нанесены на хроматографическую пластину в индивидуальном виде без последующего хроматографирования. После высушивания растворителя полученные пятна спиртов были обработаны последовательно 3-бромпропионилхлоридом и пиридином (схема 5). Далее пластинки помещались в масс-спектрометр, и регистрировались масс-спектры МАЛДИ синтезированных производных. Полученные масс-спектры содержали пики катионных частей солей, образовавшихся в результате проведения дериватизации.

OH BrCHCH COC1 /Q

2.1

OH BrCH CH COC1 / I

2 2 N'

2.2

V\

O .Nt Br "

О

O .Nt Br -

О

Схема 5. Реакция дериватизации гексадеканола (2.1) и эйкозанола (2.2) смесью 3-бромпропионилхлорида/пиридина.

Для оценки полученных результатов и выявления особенностей протекания реакции дериватизации в различных условиях дериаатизпцию проводили ííoff-linë" в виалах для микросинтезов. Далее синтезированные производные были нанесены на стандартные стальные мишени для МАЛДИ и зарегистрированы их масс-спектры. Спектры, полученные с пластин для ТСХ, оказались полностью идентичны спектрам, зарегистрированным со стальных мишеней. Но интенсивность спектров, полученных с пластин для ТСХ, оказалась ниже, чем в случае регистрации со стальных мишеней, что и следовало ожидать, так как вещество при нанесении на пластину ТСХ распределяется не только по поверхности, но и по толщине слоя силикагеля, тем самым резко уменьшая концентрацию аналита на поверхности адсорбента и, следовательно, чувствительность. Пиков же исходных спиртов зарегистрировано не было. Пятно на ТСХ, содержащее адсорбированный аналит, визуализировалось в УФ-свете, а его контуры обводились мягким графитовым карандашом; дополнительно на пятно наносилась графитовая сетка. В данном случае графит выполнял роль некой «матрицы», необходимой для регистрации спектров МАЛДИ.

Поскольку ранее нами было показано, что чувствительность метода ТСХ/МАЛДИ резко падает после элюирования аналитов в результате снижении их концентрации в приповерхностном слое, далее предложенный дериватизационный подход был опробован на соединениях, нанесенных на пластины для ТСХ и подвергшихся хроматографированию. На этом этапе работы к взятым выше модельным аналитам были добавлены природные спирты - терпенолы (фарнезол 2.3 и ментол 2.4). Вещества наносили на пластины для ТСХ в чистом виде, после чего хроматографировали с использованием ряда наиболее распространенных растворителей: этилацетат, гексан, хлороформ, метанол. После высушивания элюента проводили дериватизацию по описанной выше схеме.

Локализация положения гидроксилсодержащих аналитов после хроматографирования, что необходимо для целевого проведения дериватизации, здесь и далее осуществлялась с использованием контрольной пластины ТСХ.

Визуализацию контрольной пластины осуществляли обработкой хроматограммы раствором анисового альдегида в метаноле с добавлением уксусной и серной кислот с последующим нагреванием пластины. После определения положения аналитов на контрольной проэлюированной пластине в соответствующие места основной аналитической хроматограммы наносились реагенты, необходимые для проведения дериватизации с введением фиксированного заряда. Во всех случаях были зарегистрированы масс-спектры МАЛДИ соответствующих производных, качество (соотношение сигнал/шум) которых, к сожалению, оказалось не вполне удовлетворительным. Для улучшения качества спектров было решено применить комбинированные матрицы на основе глицерина, графита и традиционного для МАЛДИ матричного соединения, разработанные нами ранее для регистрации спектров с пластин для ТСХ без дериватизации. Такой подход действительно позволил значительно улучшить качество получаемых масс-спектров.

Вообще выбор оптимальной матрицы для регистрации масс-спектров в МАЛДИ является исключительно эмпирической задачей, которая решается для каждого конкретного класса соединений индивидуально. Поэтому для всех типов, использованных в нашей работе аналитов был проведен отбор наиболее подходящих классических матричных соединений, что являлось само по себе достаточно трудоемкой задачей. В итоге было установлено, например, что для регистрации производных спиртов наиболее подходящим является антрацентриол (АТ).

На следующем этапе были подобраны условия для хроматографического разделения смесей ряда гидроксилсодержащий соединений из серии 2.1-2.6. В частности при ТСХ были разделена модельная смесь, состоящая из эйкозанола 2.2, фарнезола 2.3 и ментола 2.4 (Рис. 21). Каждый разделенный компонент был продериватизирован, и для синтезированных производных были успешно зарегистрированы спектры МАЛДИ. Они отличались хорошим соотношением сигнал/шум и были безусловно пригодны для определения массы исходного аналита.

Рис. 21. Тонкослойная хроматограмма смеси (слева) и масс-спектры МАЛДИ продуктов дериватизации ментола (2.4), эйкозанола (2.2) и фарнезола (2.3) (дериватизация проведена после разделения на ТСХ). Масс-спектры зарегистрированы с использованием комбинированной матрицы состава: АТ-графит-глицерин.

Хотя фенолы менее реакционно-способны в процессах ацилирования, обсуждаемый метод дериватизации для ТСХ/масс-спектрометрии МАЛДИ оказался применимым к ним также. Он был опробован, в частности, на ряде

модельных смесей из серии галогензамещенных фенолов (2.7-2.10). Были подобраны условия их хроматографического разделения, проведена дериватизация in-situ и зарегистрированы масс-спектры производных с пластин для ТСХ. Качество регистрируемых масс-спектров позволяло однозначно идентифицировать разделенные компоненты (рис. 22) а также построить графическую хроматограмму по характеристическим ионам разделенных компонентов (рис. 23).

Рис. 22. Тонкослойная хроматограмма смеси и масс-спектры МАЛДИ продуктов дериватизации 2,4-дихлорнафтола-1 (2.9); 2,4,6-трихлорфенола (2.7) и 4-бромфенола (2.10) (дериватизация проведена после разделения на пластинке ТСХ).

Масс-спектры зарегистрированы с использованием комбинированной матрицы состава: АТ-графит-глицерин.

350000

300000

250000

И

¡5 200000 у

0

§ 150000 а

1 100000 н

в

Я 50000

10

20

30 X, [мм]

40

2.10

2.7 2.9

60

Рис. 23. Хроматограмма, построенная по характеристическим ионам (масса регистрируемых катионов указана в табл. 1) c пластин ТСХ после разделения трехкомпонентной смеси соединений 2.7, 2.9 и 2.10 c последующей дериватизацией 3-бромпропионилхлоридом и пиридином (матрицы АТ-графит-глицерин).

Поскольку разнообразные соединения фенольного типа являются постоянными объектами анализа из-за их потенциальной опасности для здоровья человека, были исследованы возможности описываемого подхода к анализу и других фенолов.

Мы показали, что комбинация ТСХ/масс-спектрометрия МАЛДИ в сочетании с предлагаемым дериватизационным принципом подходит для разделения, детектирования и идентификации в смеси, например, таких фенолов как бисфенол (используется в производстве пластмасс), триклозан (широко применяется как антибактериальное и противогрибковое средство), а также промышленно значимый нонилфенол (Рис. 24). Обратим внимание на продукт дериватизации бисфенола, содержащего две ОН-группы (Рис. 24 с). Наиболее вероятно, что в данном случае модификации с введением фиксированного заряда подвергаются обе гидроксильные группы, а продукт является двойной солью. К сожалению, поскольку метод масс-спектрометрии МАЛДИ в подавляющем большинстве

случаев не позволяет детектировать двухзарядные ионы, в зарегистрированном спектре мы естественно его не наблюдали.

Рис. 24. Тонкослойная хроматограмма смеси и масс-спектры МАЛДИ продуктов дериватизации триклозана (2.33) - а; нонилфенола (2.25) - Ь и бисфенола-А(2.20) -с (дериватизация проведена после разделения на пластинке ТСХ). Масс-спектры зарегистрированы с использованием комбинированной матрицы состава: АТ-графит-глицерин.

Однако получен высококачественный спектр однозаряданого иона, в котором вторая ОН-группа оказалась просто ацилированной 3-бромпропионилхлоридом без сопутствующей кватернизации пиридина. Тем не менее, регистрация масс-спектра такого смешанного производного позволяет уверенно идентифицировать бисфенол в смесях.

Важным классом природных фенолов являются токоферолы и ретинол. В этом случае также были получены положительные результаты дериватизации на ТСХ (рис. 25), однако нам не удалось хроматографически разделить смесь токоферолов, хотя суммарный масс-спектр содержал все пики гомологов, и их соотношение соответствовало данным ГХ / МС для этой смеси.

Рис. 25. Тонкослойная хроматограмма смеси и масс-спектры МАЛДИ продуктов дериватизации смеси токоферолов (а, в, у, и 5-токоферола) (2.32) (дериватизация 3-бромпропионилхлоридом/пиридином проведена после элюирования пластинки ТСХ). Масс-спектры зарегистрированы с использованием комбинированной матрицы состава: АТ-графит-глицерин.

Безусловно важными природными соединениями, содержащими одну ОН-группу, являются растительные и животные стерины, а также некоторые стероиды, например, тестостерон. Известно, что одним, из распространенных методов их определения все еще является тонкослойная хроматография. Использование

предлагаемого дериватизационного подхода позволит значительно повысить чувствительность анализа, а также надежность идентификации. Как было показано в наших предыдущих работах, применение химической модификации по предложенной схеме без разделения сопряжено с рядом трудностей. Так, например, такой подход непригоден для прямого определения стеринов в неразделенных каким-либо образом растительных маслах. Содержащиеся в них свободные жирные кислоты проявляют значительный «матричный» эффект, что снижают эффективность ионизации синтезируемых дериватов или вообще ее ингибирует. Однако, применение комбинированного метода ТСХ/МАЛДИ в комплексе с рассматриваемым дериватизационным принципом позволяет обойти такие ограничения.

Для изучения такой возможности с использованием литературных данных были подобраны условия хроматографического разделения ряда наиболее распространенных стеринов и стероидных гормонов (2.19-2.31), содержащих одну или более гидроксильных групп. Эксперименты проводились также с использованием как модельных соединений, так и их смесей. Локализация положения разделенных компонентов также осуществлялась с использованием контрольной ТСХ. После разделения модельных смесей была проведена дератизация по описанной схеме и зарегистрированы масс-спектры синтезированных производных с хорошим соотношением сигнал/шум (рис. 26, 27). Это демонстрирует возможность применения метода для детектирования и идентификации даже минорные компонентов в сложных природных объектах.

Следует также заметить, что в случае стероидных диолов, как и для рассмотренного выше бисфенола, удается зарегистрировать только однозарядные катионы. Вторая ОН-группа в них просто подвергнута ацилированию 3-бромпропионилхлоридом без сопутствующей кватернизации пиридина (Рис. 26 Ь). В случае стероидных триолов регистрируемые масс-спектры МАЛДИ производных также соответствуют моносолям с примесью продуктов дополнительного ацилирования одной или двух ОН-групп (Рис. 27 Ь,с).

Рис. 26. Тонкослойная хроматограмма смеси и масс-спектры МАЛДИ продуктов дериватизации холестерина (2.21) - а; в-эстрадиола (2.30) - Ь и тестостерона (2.31) - с (дериватизация бромпропионилхлоридом/пиридином проведена после разделения на пластинке ТСХ). Масс-спектры зарегистрированы с использованием комбинированной матрицы состава: АТ-графит-глицерин.

1Н—■—.—.—,—,—.—■—■—,—,—.—,—,—.—,—,—,—.—,—,—,—.—.—,—,—.—.—.—,—,—.—■—,—,—

100 200 300 400 500 600 700 т;г

Рис. 27. Тонкослойная хроматограмма смеси и масс-спектры МАЛДИ продуктов дериватизации транс-андростерона (2.19) - а; преднизолона (2.26) - Ь и эстриола (2.23) - с (дериватизация 3-бромпропионил хлоридом /пиридином проведена после разделения на пластинке ТСХ). Масс-спектры зарегистрированы с использованием комбинированной матрицы состава: АТ-графит-глицерин.

Следует еще раз подчеркнуть, что в случае замещенных фенолов и различных спиртов соотношение сигнал/шум в регистрируемых спектрах синтезированных производных достаточно высоко, хотя и варьируется в зависимости от природы спирта (Таблица 9). Так, например, при равной концентрации исходных аналитов, соотношение сигнал/шум в случае производных эйкозанола (2.2), 2,4,6-трихолрфенола (2.7) и 2,4-дихлор-1-нафтола (2.9) достигало 532, 336 и 395, а в случае тестостерона (2.31), ситостерина (2.27) и холестерина (2.21) составило 56, 72 и 91 соответственно. При проведении реакции in vitro и регистрации масс-спектров со стальной мишени такой зависимости не наблюдалось, что может говорить о влиянии адсорбента для ТСХ (в данном случае - силикагель 60 F254) на протекание реакции дериватизации. Однако изучение влияния сорбента и других поверхностей на протекание реакции дериватизации требует отдельного исследования.

Таблица 9. Коэффициенты удерживания аналитов (Rf) , молекулярная масса катионов в продуктах дериватизации 3-бромпропионилхлоридом/ пиридином, условные интенсивности и соотношения сигнал/шум (S/N) для соответствующих пиков ионов в масс-спектрах ТСХ/МАЛДИ.

№ Соединение Rf AT-gly-gra, BrPrCl-Py

Ион, [M]+ Интенсивность, Гу.е1 S/N

2.1 Гексадеканол 0.60b 376 329856 194

2.2 Эйкозанол 0.38b 432 48469 532

2.3 Фарнезол 0.28b 356 22642 196

2.4 Ментол 0.45b 290 37749 193

2.5 Тимол 0.58с 284 66022 940

2.6 3,5 - Диметилциклогексанол 0.52b 262 7570 38

2.7 2,4,6-Трихлорфенол 0.54с 330 57409 336

2.8 Пентафторфенол 0.30с 318 13588 101

2.9 2,4-Дихлор-1-нафтол 0.63с 346 72204 395

2.10 4-Бромфенол 0.19с 306 168284 232

2.11 4-трет-Бутилциклогексанол 0.31b 290 16128 55

2.12 2-Этилгексан-1 -ол 0.66b 264 480274 967

2.13 2-Пропилфенол 0.56с 270 21438 79

2.14 3,4-Диметилциклогексанол 0.76с 262 5790 46

2.15 3 -Фенилпроп-2-ен- 1-ол 0.32b 268 247203 454

2.16 (2Е)-3,7-Диметилокта-2,6-диен-1-ол 0.51ь 288 66820 301

2.17 (2Z)- 3,7-Диметилокта-2,6-диен-1-ол 0.6ь 288 46786 308

2.18 3,7- Диметилокта-1,6-диен-3-ол 0.48ь 288 3764 30

2.19 транс- Андростерон 0.80й 424 26759 113

2.20 Бисфенол-А 0.12е 496 331778 581

2.21 Холестерин 0.56а 520 27706 91

2.22 Эргостерин 0.48а 530 51112 230

2.23 Эстриол 0.54й 556 12474 82

0.54й 692 35695 285

2.24 Эстрон 0.42а 404 47842 140

2.25 Нонилфенол 0.56е 354 225240 1221

2.26 Преднизолон 0.63й 494 27815 126

0.63й 628 26147 135

0.63й 764 5383 26

2.27 Р-Ситостерин 0.54а 548 15491 72

2.28 Стигмастанол 0.56а 550 41058 299

2.29 Стигмастерин 0.57а 546 21350 168

2.30 Р-Эстрадиол 0.27а 540 23934 84

2.31 Тестостерон 0.15а 422 13995 56

2.32 Токоферол 0.32с 536 302456 856

0.32с 550 233020 683

2.33 Триклозан 0.74с 422 21665 103

2.34 Ретинол 0.24е 420 56216 186

а - гексан : этилацетат в соотношении 3:1; Ь - гексан : этилацетат в соотношении 6:1; с - гексан: этиловый эфир в соотношении 30:7; d - этилацетат : ацетонитрил в соотношении 5:1.

3.3 Дериватизация и анализ первичных аминов и аминокислот методом ТСХ/масс-спектрометрии МАЛДИ.

Еще один прием, впервые предложенный нами для пост-хроматогафической дериватизации, был разработан для химической модификации амино-групп аналитов (первичные амины, аминокислоты и пептиды) непосредственно на пластине для ТСХ. При выборе соответствующей реакции учитывались следующие требования: реакция должны протекать быстро и количественно, желательно при комнатной температуре, а синтезируемые производные должны обладать максимально высокой эффективностью ионизации в условиях МАЛДИ. Исходя из

особенностей метода тонкослойной хроматографии, крайне желательно было также, чтобы образующиеся производные были окрашенными. Это условие необходимо, для того чтобы иметь возможность наносить матрицу, необходимую для регистрации масс-спектров, непосредственно на пластину и локализовать пятно для регистрации масс-спектра без использования дополнительной контрольной пластины. Используемые в стандартной практике ТСХ химические приемы для визуализации пятен невозможно применять в случае сочетания ТСХ/МАЛДИ, так как используемые при этом реагенты, как правило, значительно видоизменяют структуру определяемых соединений, что непредсказуемым образом сказывается на эффективности ионизации и характере масс-спектра. Так, например, производные аминокислот, разделенных на пластинке и для визуализации пятен модифицированных стандартном способом с использованием нингидрина, не способны ионизироваться в МАЛДИ. Кроме того, такие реакции могут блокировать или модифицировать функциональные группы, подходящие для химической модификации, что сделает проведение целевой дериватизации бессмысленным.

Всем названным требованиям удовлетворяет впервые предложенный в рамках настоящей работы дериватизационный подход, основанный на взаимодействии первичных аминов и аминокислот с гексафторфосфатом трис(2,6-диметоксифенил)метилия (1). Эта реакция протекает за счет того, что соответствующий катион реагирует с первичными аминами путем нуклеофильного замещения метоксигруппы в пара-положении бензольного кольца. При проведении реакции при комнатной температуре образующиеся производные не претерпевают дальнейших превращений (Схема 6). Ранее такой дериватизационный подход применительно к масс-спектрометрии МАЛДИ (без комбинации с ТСХ) для получения производных соединений, содержащих первичную аминогруппу (в том числе аминокислот и пептидов), был предложен в работе [100].

О—

б+с +

К

, \ /з ИОЧ

О 3 РР6- О

N—( ^ К

ОИ

РРб

Схема 6. Схема взаимодействия а-аминокислоты с гексафторфосфатом трис(2,6-диметоксифенил)метилия (1).

Данный дериватизационный подход соответствует всем требованиям, предъявляемым нами к реакциям, используемым при анализе методом ТСХ/МАЛДИ: высокая скорость реакции, отсутствие необходимости термического воздействия, высокая эффективность ионизации производных в условиях МАЛДИ. В данном случае очень важным является то, что получаемые производные окрашены, а это не требует использование дополнительной визуализации положения разделенных на ТСХ компонентов. Еще одним положительным моментом является выведение сигнала из области матричных шумов, так как происходит введение фрагмента с большим инкрементом (359 Да).

Наиболее интересными объектами для опробования такого подхода являются аминокислоты и биологически активны амины, поскольку их точная идентификация в следовых количествах представляет собой несомненно актуальную задачу. Применение данного дериватизационного метода к смесям без предварительного хроматографирования весьма затруднительно, поскольку амины и некоторые аминокислоты могут быть представлены в виде структурных изомеров, а знание одной лишь молекулярной массы, определяемой методом МАЛДИ, часто недостаточно для их идентификации. Предварительное разделение таких соединений методом ТСХ может оказаться весьма полезным, а порой решающим при анализе смесей различных аминов.

Для оценки эффективности описываемого дериватизационного подхода применительно к сочетанию ТСХ/МАЛДИ были выбраны несколько первичных аминов 3.1-3.16 (некоторые из которых обладают биологической активностью и

входят в составе фармацевтических препаратов), а также наиболее распространенных аминокислот среди которых аланин, валин, изолейцин и лейцин. Две последних из них относятся к так называемым аминокислотам с разветвлёнными боковыми цепями и являются изомерами, способы раздельной идентификация которых в индивидуальном виде и в составе пептидов являются предметом многих исследований. Качественный и количественный анализ выбранных нами аминокислот является актуальным еще и потому, что они зачастую являются основными компонентами многих лекарств или биологически-активных добавок (БАД).

Растворы первичных аминов были нанесены на хроматографические пластинки сначала без последующего хроматографировани. После высушивания растворителя они были дериватизированы последовательной обработкой растворами реагента 1 и триэтиламина в ацетонитриле. При этом было отмечено обесцвечивание раствора, наносимого для дериватизации, в месте нахождения амина. Таким образом, не было необходимости в использовании дополнительной контрольной пластинки ТСХ для локализации анализируемых веществ на основной аналитической пластинке. Пластинки ТСХ помещались в масс-спектрометр МАЛДИ, где регистрировались спектры (в качестве матрицы использовались уже приготовленными нами комбинированные матрицы). Полученные масс-спектры содержали пики, соответствующие катионам синтезированных производных с инкрементом в массе +359Да.

После этого из исследуемых соединений были собраны модельные смеси (как для первичных аминов. так и для а-аминокислот) и подобраны условия их хроматографического разделения. Как обычно, после высушивания элюента была проведена дериватизация по приведенной схеме и зарегистрированы масс-спектры МАЛДИ (в качестве матрицы использовались комбинированные матрицы). В результате были зарегистрированы масс спектры производных всех аминов и аминокислот, представленных в разделяемой смеси (Таблица 10).

Представительные масс-спектры МАЛДИ производных фармпрепаратов содержащих первичную амино-группу, приведены на рис. 28.

Рис. 28. Тонкослойная хроматограмма смеси и масс-спектры МАЛДИ продуктов дериватизации Масс-спектры МАЛДИ продуктов дериватизации прокаина (3.14) -а; римантадина (3.16) - б и баклофена (3.13) - в (дериватизация проведена регентом 1 после разделения на пластинке ТСХ). Масс-спектры зарегистрированы с использованием комбинированной матрицы состава: АТ-графит-глицерин.

Важно отметить, что особенностью масс-спектров производных а-аминокислот является то, что наряду с пиками целевых катионов наблюдаются также более интенсивные пики, имеющие на 44 единиц меньшую массу. Совершенно очевидно, что они возникают при декарбоксилировании производных возможно под воздействием лазерного излучения источника ионов МАЛДИ (схема 7).

ОН

\

О

УФ-лазер -О

МАЛДИ

- С02 —О

Я

О-

/

Р^

Схема 7. Процесс декарбоксилирования производных а-аминокислоты с гексафторфосфатом трис(2,6-диметоксифенил)метилия (1) под воздействием лазерного излучения в источнике ионов МАЛДИ.

Действительно, на процесс декарбоксилирования явно не влияет присутствие сорбента и матрицы, поскольку при регистрации спектра производного без матрицы с металлической мишени также фиксируется преимущественно пик декарбоксилированного катиона. Кроме того, в спектре, зарегистрированном с использованием ионизации электрораспыления, наоборот доминирует пик ожидаемого катиона и слабый пик продукта его декарбоксилирования.