Разработка тест-систем для диагностики герпесвирусной инфекции кошек на основе иммунологических методов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Перепечаев, Константин Андреевич

• Перепечаев, Константин Андреевич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Перепечаев, Константин Андреевич

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Вирус инфекционного ринотрахеита кошек герпесвирус кошек тип 1)

2.1.1. Историческая справка

2.2. Морфология вируса герпеса кошек

2.3. Химический состав вируса герпеса кошек

2.4. Очистка и концентрирование вирсуа герпеса кошек

2.5. Иммунитет при герпесвирусной инфекции кошек

2.6. Диагностика герпесвирусной инфекции кошек

2.6.1. Выделение вируса на культуре клеток

2.6.2. Реакция иммунофлюоресценции

2.6.3. Гистохимический вариант ИФА или иммунопероксидазная реакция

2.6.4. Диагностика герпесвирусной инфекции кошек в полимеразной цепной реакции

2 6.5. Реакция нейтрализации

2.6.6. Реакция гемагглютинации

2.6.7. Иммуноферментный анализ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тест-систем для диагностики герпесвирусной инфекции кошек на основе иммунологических методов»

1.1. Актуальность темы

На сегодняшний день диагностика у кошек инфекционных заболеваний, проявляющихся респираторно-окулярным синдромом, чрезвычайно важна. Трудно оценить экономический ущерб, наносимый этой группой заболеваний питомникам породистых кошек и владельцам животных, но не подлежит сомнению тот факт, что только наличие племенного ядра, свободного от респираторно-глазных инфекционных заболеваний позволяет получать здоровых котят, вести племенную работу, и, в конечном итоге, развивать зооиндустрию мелких домашних животных. Кроме того, домашняя кошка, средой обитания которой является жилище человека, непосредственно и постоянно контактирует с ним, что заставляет нас заботиться о ее здоровье не только из соображений гуманности и любви к животным, но и ради гигиены и сохранения здоровья человека.

Респираторно-окулярный синдром у кошек вызывают различные патогенные микроорганизмы, такие как герпес и калицивирусы, хламидии, микоплазмы. Но именно герпесвирусная инфекция кошек представляет наиболее серьезную проблему для фелинологов и ветеринарных врачей по причине ее повсеместной распространенности, высокой вирулентности, тяжелых окулярных поражений, установления пожизненного носительства с эпизодами периодического выделения активного вируса после переболевания этой инфекцией и относительно слабой эффективности средств активной и пассивной иммунизации.

Сегодня для диагностики герпесвирусной инфекции кошек, российская ветеринарная практика имеет в своем распоряжении метод выделения вируса (ВВ) на культуре клеток и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Метод ВВ, являясь классическим, надежным, специфическим и достаточно чувствительным диагностическим методом, в силу своей длительности (до 10 дней), высокой трудоемкости, сложности и дороговизны используется, в основном, лишь в научно - экспериментальных работах. Метод ПЦР, хотя и обладает высокой чувствительностью и специфичностью, не может являться экспресс-методом, так как сложен в постановке, требует дорогостоящего оборудования и его результаты трудно интерпретировать с точки зрения клинической значимости.

Метод определения антигенов и антител с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) позволяет быстро получать результаты, не требует дорогостоящего оборудования или особых условий для работы и стерильности. ИФА позволяет определять уровень антител как в сыворотке крови, так и во внутриглазной, спинномозговой жидкостях и в молоке, что необходимо при проведении любых научных и научно-практических исследований. С помощью ИФА можно проводить контроль эффективности вакцин и иммунных сывороток, определять напряженность иммунитета, что позволяет оценить степень защиты животных от заражения и заболевания. Метод также чрезвычайно удобен для выявления вирусного антигена в смывах и соскобах со слизистой оболочки глаз, ротовой и носовой полостей.

Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природой лиганда, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. Таким образом, очистка и концентрирование вирусов является решающим условием при изготовлении диагностикумов и получении высокоактивных иммунных сывороток, используемых при создании компонентов, необходимых для проведения иммуноферментного анализа.

Для получения антивидовых иммуноглобулинов животных, меченых пероксидазой из хрена (ПХ), необходимо наличие чистых препаратов иммуноглобулинов в, М и А классов.

Методы выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека разработаны детально, но применительно к иммуноглобулинам животных они не всегда эффективны. Использование многих иммунологических методов для решения прикладных задач в области ветеринарии сдерживается отсутствием коммерческих моноспецифических антисывороток. Идеальным условием получения моноспецифических антисывороток представляется иммунизация продуцентов чистыми антигенами.

Ключевым моментом в отработке твердофазного непрямого ИФА является получение коньюгата, то есть иммуноглобулина меченого пероксидазой. Качество получаемого коньюгата находится в прямой зависимости от серологической активности иммуноглобулина, активности фермента и условий связывания этих компонентов.

Реакция иммунофлуоресценции, была предложена Кунсом в 1942 году, и ее трудно отнести к новым методам исследования. Однако, эта реакция получила в настоящее время "вторую жизнь" благодаря появлению гибридомных технологий, позволяющих получать моноклональные антитела. Их применение позволило значительно увеличить ее чувствительность и специфичность.

Популярность РИФ объясняется экономичностью, наличием широкого спектра диагностических наборов, быстротой получения ответа. Чаще всего РИФ используют для быстрого обнаружения возбудителя в патологическом материале. РИФ является чрезвычайно ценным методом диагностики, его можно по праву отнести к экспресс-методам, поскольку он позволяет получить результат в течение 1-1,5 часов с момента взятия образца на анализ, прост в исполнении, не требует стерильной работы.

Таким образом, существуют все предпосылки для расширения спектра методов диагностики герпесвирусной инфекции кошек, поскольку быстрый и точный диагноз является решающим условием организации необходимых мер борьбы с этим заболеванием.

1.2. Цели и задачи исследования

В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы являлось создание диагностикумов на основе очищенного и концентрированного вируса ГВК-1, штамм «Гранд», для использования его в качестве компонента наборов при определении уровня антител и детекции антигенов вируса ГВК-1 в различных биологических субстанциях при иммуноферментной и люминисцентной диагностике герпесвирусной инфекции кошек.

Решались следующие задачи:

1.2.1. Разработать метод получения очищенного и концентрированного вируса ГВК-1, штамм «Гранд», репродуцированного в перевиваемой культуре клеток CrFK.

1.2.2. Получить иммуносорбенты на основе активированной BrCN Сефарозы 4В с иммобилизованным в качестве анигена очищенным и концентрированным вирусом ГВК-1.

1.2.3. Выделить антитела к вирусу ГВК-1 из сыворотки естественно переболевших кошек методом аффинной хроматографии и получить пероксидазный и ФИТЦ-конъюгаты антител к антигенам ГВК-1.

1.2.4. Выделить IgG кошки, получить антисыворотку к IgG кошки на кроликах и получить пероксидазный и ФИТЦ-коньюгаты с анти-IgG кошки.

1.2.5. Разработать тест систему для определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек в непрямм твердофазнм ИФА.

1.2.6. Разработать тест систему для детекции антигена ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта в прямом и непрямом твердофазном ИФА.

1.2.7. Разработать тест систему для определения антигенов вируса ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта в непрямой и прямой РИФ.

1.2.8. Провести сравнительную оценку эффективности детекции вируса в прямой и непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом вирусовыделения на культуре клеток.

1.2.9. Провести сравнительную оценку определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек методами реакции нейтрализации на культуре клеток и непрямого твердофазного ИФА

1.3. Научная новизна

В результате проведенных исследований:

- испытаны различные методы очистки и концентрирования культурального вируса ГВК-1 штамм «Гранд», репродуцированного в перевиваемой культуре клеток СгИС и на их основе разработана схема получения очищенного и концентрированного вируса ГВК-1;

- разработана методика выделения кошки и усовершенствована схема иммунизации лабораторных животных, обеспечивающая получение высокоактивных специфических гипериммунных сывороток к кошки;

- разработана методика использования непрямой и прямой РИФ для определения антигенов вируса ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта;

- разработаны методики получения компонентов и отработаны условия постановки непрямого твердофазного ИФА для определения уровня антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек и твердофазного ИФА для определения антигенов ГВК-1 в смывах и соскобах с окулярного и респираторного тракта;

- установлена достоверная корреляция результатов, полученных при выявлении антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке крови кошек в непрямом твердофазном ИФА и реакции нейтрализации и детекции вируса в прямой и непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом вирусовыделения на культуре клеток.

1.4. Практическая значимость работы

Разработаны методики получения компонентов для иммуноферментных и люминесцентных тест-систем, предназначенных для диагностики герпесвирусной инфекции кошек. На основе проведенных исследований разработаны методические рекомендации по определению уровня антител к ГВК-1 и антигенов ГВК-1 в иммуноферментном и РИФ-анализах: «Методические рекомендации по лабораторной диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)», «Методические рекомендации по серологической диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммунофрментного анализа (ИФА)» и «Методические рекомендации по применению для диагностики герпесвируса кошек тип 1 (FHV-1) анти- FHV-1 флюоресцирующих антител»

Разработанные методики определения уровня антител в РИФ и ИФА рекомендуется использовать для оценки напряженности иммунитета, определения материнских антител у котят с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих моно- и поливалентных вакцин.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета у кошек, а также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных заболеваний кошек и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпесвирусами.

1.5. На защиту выносятся следующие положения:

1.5.1. Схема очистки и концентрирования ГВК-1, штамм «Гранд», репродуцированного в культуре клеток СгРК.

1.5.2. Методика выделения кошки, получения анти-^в кошки на кроликах, и получения пероксидазного и ФИТЦ-коньюгатов с антикошки для использования последних в тест-системах индикации антигенов ГВК-1 и определения уровня анти-ГВК-1 антител.

1.5.3. Методика выделения анти-ГВК-1 анттел и получения пероксидазного и ФИТЦ-коньюгатов с анти-ГВК-1 анттелами.

1.5.4. Результаты выявления антгена вируса ГВК-1 в различных вариантах постановки РИФ и ИФА и антител к вирусу ГВК-1 в непрямом твердофазном ИФА

1.5.5. Результаты полученные при выявления антител к вирусу ГВК-1 в своротке крови кошек в непрямом твердофазном ИФА и реакции нейтрализации и детекции вируса в прямой и непрямой РИФ, прямом и непрямом твердофазном ИФА и методом вирусовыделения на культуре клеток.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Перепечаев, Константин Андреевич

6. ВЫВОДЫ.

6.1. Предложена схема комбинированной очистки и концентрирования герпесвируса кошек, штамм «Гранд», репродуцированного в культуре клеток СгБК, позволяющая получать препараты вируса, очищенные на 91% в расчете на инфекционную дозу, с титром инфекционности на 1,6-2,0 1§ТЦД50/мл выше, чем в исходной суспензии.

6.2. Показана возможность одноэтапного препаративного выделения антигена ГВК-1 из вирусосодержащей суспензии с помощью препаративной аффинной хроматографии на анти-ГВК-1Сефарозе 4В.

6.3. Усовершенствованы метод выделения из сыворотки крови кошек и схема получения сывороток анти- кошки на кроликах, позволяющая получать сыворотки с активностью в РДП 1:32 - 1:256.

6.4. Методом аффинной хроматографии с использованием иммуносорбента на основе активированной ВгСЫ Сефарозы 4В с иммобилизованным в качестве антигена очищенным и концентрированным вирусом ГВК-1 выделены антитела к вирусу ГВК-1 из сыворотки естественно переболевших кошек и получены пероксидазный и ФИТЦ-конъюгаты с антителами анти-ГВК-1.

6.5. Разработаны тест-системы прямой и непрямой РИФ с использованием ФИТЦ-конъюгатов анти-ГВК-1 антител и антикв кошки. Методы позволяют определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале.

6.6. Разработана тест-система непрямого ИФА для выявления антител к вирусу ГВК-1 в сыворотке кошек с использованием в качестве антигена очищенного и концентрированного вируса ГВК-1.

6.7. Разработанная тест-система для выявления анти-ГВК-1 антител позволяет определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале методом ингибирования антигена в конкурентном твердофазном ИФА.

6.8. Разработан «сэндвич»-вариант ИФА с использованием коньюгата анти-ГВК-1 антител. Метод позволяет определять вирус ГВК-1 в вирусосодержащих суспензиях и патологическом материале, чувствительность тест-системы составила 2 ^ ТЦД 50/мл

6.9. Установлено, что методы вирусовыделения, прямой и непрямой РИФ, ингибирования антигена в ИФА и «сэндвич»-ИФА пригодны для выявления ГВК-1 в острый период заболевания, но с точки зрения простоты, удобства постановки реакции, быстроты получения результата метод «сэндвич»-ИФА и прямая РИФ имеют преимущество перед другими методами

6.10. ИФА является наиболее быстрым, удобным, и экономичным методом для определения анти-ГВК-1 антител, превосходит по чувствительности на 1-2 порядка реакцию нейтрализации (РН) и может быть рекомендован для выявления анти- ГВК-1 антител в низких титрах.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В практику предложены иммуноферментная и люминиецентная тест-системы, предназначенные для диагностики герпесвирусной инфекции кошек. На основе проведенных исследований разработаны методические рекомендации по определению уровня антител к ГВК-1 и антигенов ГВК-1 в иммуноферментном и РИФ-анализах: «Методические рекомендации по лабораторной диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)», «Методические рекомендации по серологической диагностике герпесвирусной инфекции кошек методом иммуноферментного анализа (ИФА)» и «Методические рекомендации по применению для диагностики герпесвируса кошек тип 1 (FHV-1) анти- FHV-1 флюоресцирующих антител»

Разработанные методики определения уровня антител в РИФ и ИФА рекомендуется использовать для оценки напряженности иммунитета, определения материнских антител у котят с целью корректировки сроков первой вакцинации, а также в качестве методов контроля антигенной активности соответствующих моно- и поливалентных вакцин.

Полученные результаты являются основой для дальнейших исследований по изучению механизмов и закономерностей формирования постинфекционного и поствакцинального противовирусного иммунитета у кошек, а также дают возможность расширить научные знания относительно роли вирусов в возникновении массовых респираторных заболеваний кошек и могут быть использованы при дальнейшем изучении иммунологии и патогенеза инфекций, вызванных герпесвирусами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Перепечаев, Константин Андреевич, 2007 год

1. Авилов B.C., Мникова JT.A., Сологуб В.К., Коромыслов Г.Ф., Дзантиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егоров A.M. // Иммуноферментный анализ // Ветеринария, 1981, 8, 33-35.

2. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. // Статистические методы в микробиологических исследованиях // JT, Медгиз, 1962.3. Биотехнология,— М., 1984.

3. Бобкова А.Ф., Чирков С.Н. // Применение иммуноферментного анализа для диагностики вирусных заболеваний растений (Обзор) // С/х биология, 1983, 5, 32-36.

4. Богаров А.Ф., // Вирусы группы герпеса, М., 1979.

5. Богаров А.Ф., Гофман Ю.П., Бикбулатов P.M. Морфология внутриклеточного паразитизма вируса герпеса человека // В кн., Труды стоматологов Лит. ССР, Каунас, 1967, 49.

6. Богаров А.Ф., Кицак В.Я. Некоторые аспекты персистенции вируса простого герпеса человека // В кн., Хроническая вирусная инфекция и ее роль в патологии человека. Новосибирск, 1978, 63 - 69.

7. Богаров А.Ф., Кицак В.Я., Богаров Е.Ф., Трухачев A.A. // Вирус простого герпеса, Новосибирск, Наука, 1982,4 27.

8. Брондз Б.Д. // Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом распознавании. // М., 1987.

9. Быкова H.H., Лукина В.А., Бойко A.A. // Сравнительная оценка иммуноглобулинов, меченых пероксидазой (иммуноферментных конъюгатов). // Передовой науч.-производст. Опыт в биологической промышленности, 1985, 9, 8-11.

10. Голшмид В.К., Шрешнев А.Г., Чензова О.И. // К методике выделения фракций IgG из кроличьих агглютинирующих сывороток. // Лаб.дело, 1976, 10, 601.

11. Жданов В.М., Гайдамович С.Я. // Частная вирусология, М., «Медицина», 2,375-412.

12. Игнатьев A.M., Мони Ю.В., Бабикова P.A., Петрова И.А. -Использование метода иммунофлуоресценции при диагностике Инфекции КРС // Сб. научн. Трудов МВА им. Скрябина, 1973, 70, 118119.15,1617,1821,22