Разработка и совершенствование тест-систем на основе молекулярно-биологических методов для диагностики некробактериоза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Романенко, Михаил Николаевич

• Романенко, Михаил Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Романенко, Михаил Николаевич

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Некробактериоз

2.2. Характеристика возбудителя

2.2.1. Историческая справка, таксономическое положение

2.2.2. Морфология, тинкториальные свойства, метаболическая активность

2.2.3. Патологоанатомические изменения

2.3. Биохимическая характеристика возбудителя

2.3.1. Гемолизин

2.3.2. Липополисахаридный эндотоксин (ЛПС)

2.3.3. Лейкотоксин

2.4. Профилактика и меры борьбы

2.4.1. Чувствительность к антибиотикам

2.4.2. Специфическая профилактика

2.5. Диагностика

2.5.1. Иммуноферментный метод для диагностики некробактериоза крупного рогатого скота

2.5.2. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ)

2.5.3.Гистохимический вариант ИФА

2.6. Исследование клеточного иммунитета

2.6.1. Роль клеточного и гуморального иммунитета при бактериальных инфекциях

2.6.2. ELISPOT-метод

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и совершенствование тест-систем на основе молекулярно-биологических методов для диагностики некробактериоза»

2.2. Актуальность темы

Одно из центральных мест в инфекционной патологии крупного рогатого скота занимает некробактериоз. Некробактериоз - инфекционная болезнь, проявляющаяся гнойно-некротическими поражениями всех органов и тканей организма. Это заболевание наносило и продолжает наносить значительный экономический ущерб.

Кроме того, в последние годы прослеживается тенденция к обострению эпизоотической ситуации по некробактериозу, что связано с усложнившимися хозяйственно-экономическими условиями ведения животноводства.

Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией, огромен. Он складывается из затрат, связанных с профилактикой и лечением больных, гибелью или преждевременной выбраковкой животных, потерей продуктивности и других расходов, обусловленных мероприятиями по ликвидации болезни. Некробактериоз поражает все виды домашних и диких животных, птиц, пресмыкающихся и человека. Наиболее чувствительны к данной инфекции олени и овцы, а также крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Географически некробактериоз распространен на всех континентах, во всех странах, даже с высоко развитым животноводством. В Российской Федерации некробактериоз поражает ежегодно до 7% крупного рогатого скота и 16% мелкого рогатого скота, занимая, таким образом третье по распространенности место после лейкоза и туберкулеза. Огромный ущерб болезнь наносит оленеводству: из заболевших за год 50-70 тыс. оленей погибает 30-35% животных. Существенны потери от некробактериоза в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот.

В настоящее время для выявления и идентификации возбудителя некробактериоза применяют серологические, биохимические, микробиологические методы, а также постановку биопробы на лабораторных животных.

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) с успехом используют для обнаружения микробных антигенов в различных патологических материалах. Предложены и применяются несколько вариантов РИФ.

Длительность, трудоемкость, недостаточная специфичность и чувствительность, применяемых в настоящее время методов, заставляет исследователей обратить особое внимание на разработку и внедрение в ветеринарную практику новых высокочувствительных и специфичных методов диагностики некробактериоза. В этой связи актуальным является внедрение методов диагностики на основе иммуноферментного анализа (ИФА). Основными достоинствами ИФА являются высокая чувствительность, возможность анализа соединений с различной молекулярной массой, строго инструментальный учет результатов, что позволяет увеличить число проб, унифицировать методы и реагенты, а также вести прямую обработку информации.

Таким образом, создание тест-систем для ускоренной диагностики некробактериоза на сегодняшний день является важной и актуальной задачей.

1.2. Целью настоящей работы являлась разработка диагностикумов на основе очищенного антигена F.necrophorum, определение белкового состава и изучение иммуногенных свойств его отдельных компонентов для использования их при создании иммуноферментной и люминесцентной тест-систем для диагностики некробактериоза при определении уровня антител в крови больных и переболевших животных и определения наличия антигенов F.necrophorum в гнойно-некротических очагах.

Решались следующие задачи*.

1.2.1. разработать метод получения очищенного антигена F.necrophorum и изучить белковый состав антигена F.necrophorum',

1.2.2. изучить клеточный и гуморальный иммунитет КРС при некробактериозе;

1.2.3. выделить IgG КРС, получить анти-IgG КРС сыворотки на кроликах;

1.2.4. выделить awm-F.necrophorum антитела из сывороток клинически больных животных;

1.2.5. изготовить коньюгат пероксидазы из хрена с анти-IgG КРС и кролика, коньюгаты анти F.necrophorum IgG с ФИТЦ и ПХ;

1.2.6. провести сравнительную оценку эффективности определения уровня аши-F.necrophorum антител и антигена F.necrophorum в патологическом материале традиционными методами и ИФА;

1.2.7. разработать тест-систему для диагностики некробактериоза при определении уровня антинекробактериозных антител в крови больных и переболевших животных и определения наличия антигенов F.necrophorum в гнойно-некротических очагах методом иммуноферментного анализа.

1.3. Научная новизна.

- разработан метод получения очищенного антигена F.necrophorum',

- определен белковый состав F.necrophorum и изучены иммуногенные свойства его отдельных компонентов;

- установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК на 7-е сутки, что свидетельствует о совпадении динамики образования спонтанных Е-лимфоцитов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК;

- показана возможность выделения антинекробактериозных антител из сыворотки переболевших животных с помощью аффинной хроматографии на нерастворимой фракции бактериальных клеток;

- впервые в Российской Федерации разработана иммуноферментная тест-система для диагностики некробактериоза КРС на основе очищенного антигена F.necrophorum.

1.4. Практическая значимость работы

Разработана иммуноферментная, люминесцентная и гистохимическая тест-системы, предназначенные для диагностики некробактериоза КРС.

Созданы «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С», «Набор для иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А» и «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л». Материалы работы использованы при составлении научно-технической документации (НД) которая утверждается в установленном порядке. Наборы предназначается для индикации антигенов F.necrophorum и количественного определения анти- F.necrophorum антител в сыворотках крови КРС.

Внедрение в практику указанных наборов позволит проводить диагностику некробактериоза КРС в племенных и пользовательских хозяйствах при первых проявлениях клинических признаков, что будет способствовать оздоровлению хозяйств, обеспечению эпизоотологического благополучия, повышению сохранности и продуктивности поголовья, улучшению качества продукции.

1.5. На защиту выносятся следующие положения:

1.5.1. результаты разработки оптимальных условий очистки антигена F.necrophorum;

1.5.2. результаты исследования белкового состава антигена F.necrophorum',

1.5.3. результаты испытания антигенов F.necrophorum, полученных на базе очищенных препаратов, в качестве компонентов в серологических реакциях (РТГА и ИФА);

1.5.4. результаты исследования напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе КРС;

1.5.5. результаты разработки тест — системы ИФА для определения уровня анти- F.necrophorum антител в сыворотках вакцинированных, больных и переболевших животных и проведения сравнительной оценки определения уровня антител в РТГА и ИФА;

1.5.6. результаты разработки тест — системы ИФА для детекции антигенов F.necrophorum в различных патологически материалах и сравнения чувствительности и специфичности с традиционными методами;

1.5.7. результаты разработки люминесцентной тест — системы для детекции антигенов F.necrophorum в различных патологически материалах и сравнения чувствительности и специфичности с традиционными методами;

1.5.8. результаты испытания и промышленного изготовления наборов для иммуноферментной и люминесцентной диагностики некробактериоза КРС.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Некробактериоз

Некробактериоз - инфекционная болезнь, проявляющаяся гнойно-некротическими поражениями всех органов и тканей организма. Экономический ущерб, причиняемый этой инфекцией, огромен. Он складывается из затрат, связанных с профилактикой и лечением больных, гибелью или преждевременной выбраковкой животных на мясо, потерей продуктивности и других расходов, обусловленных мероприятиями по ликвидации болезни.

Некробактериоз поражает все виды домашних (72) и диких животных, птиц, пресмыкающихся и человека (114, 86, 148, 126). Наиболее чувствительны к данной инфекции олени и овцы, а также крупный рогатый скот, свиньи, лошади. Географически некробактериоз распространен на всех континентах, во всех странах, даже с высоко развитым животноводством. В Российской Федерации некробактериоз поражает ежегодно до 7% крупного рогатого скота и 16 % мелкого рогатого скота, занимая, таким образом, третье по распространённости место после лейкоза и туберкулёза (57, 35, 53). Огромный ущерб болезнь наносит оленеводству: из заболевших за год 50 — 70 тыс. оленей погибает 30 - 35% животных (21). Существенны потери от некробактериоза в хозяйствах, содержащих крупный рогатый скот. Даже, несмотря на то, что поголовье скота за последние годы резко сократилось, заболеваемость не только не имеет тенденции к снижению, но и даже несколько возросла (57).

Основным источником каждой вновь начинающейся эпизоотии среди крупного рогатого скота в первую очередь следует считать здоровых животных микробоносителей, а не больных, которые присоединяются позднее, так как бактерия представляет собой нормального обитателя пищеварительного тракта. Заселение желудочно - кишечного тракта

F.necrophorum происходит в первые дни жизни. Поэтому по месту обитания возбудителя некробактериоз следует отнести к факторным инфекциям (50).

В основном некробактериоз не заносится в хозяйство с больными животными, а возникает при появлении соответствующих условий, ведущих к нарушению существующего биологического равновесия между микро- и макроорганизмом. Нарушение рубцового пищеварения, вследствие дефицита микроэлементов и витаминов, влекущее за собой нарушение обменных процессов и снижение естественной резистентности организма, сырость в помещениях и недостаточно качественная очистка стойл, создающая агрессивную среду и ведущая к размягчению копытного рога и мацерации кожи, травмирование тканей разного рода колющими и режущими предметами - все это является предпосылкой для вспышки заболевания (50, 12). Следствием многообразия клинических форм болезни и полиморфностью возбудителя стало сравнительно недавнее присвоение некробактериозу статуса самостоятельной нозологической единицы. В 1932 году А. Г. Ревнивых своими опытами на северных оленях доказал, что возбудителем заболевания является F.necrophorum (42), хотя установлено, что в этиологии некробактериоза помимо основного возбудителя огромную роль играет гнойно-некротическая микрофлора: Clostridium petfringens, Staphilococcus aureus, Corynebacterium pyogenes и др. Микробные ассоциации своими ферментативными системами усиливают действие основного возбудителя, тем самым существенно повышая его вирулентность (54, 138).

У животных F.necrophorum вызывает абсцессы внутренних органов, аборты, копытную гниль, некротический ларингит (дифтерия телят) и другие поражения (123, 137). У человека некробактериоз клинически проявляется некротическим тонзиллитом, септицемией, стоматитом, периодонтитом, абсцессами печени и внутренних органов, эндокардитами (125, 131, 144, 46,

71,74).

Возможные факторы патогенности F.necrophorum - лейкотоксин, липополисахаридный эндотоксин, гемолизин, гемагглютинин, ферменты (ДНКазы, лецитиназа, фосфатидаза, коллагеназа, фибринолизин, стрептокиназа, декарбоксилаза, щелочная фосфатаза, липаза) (159, 67).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Романенко, Михаил Николаевич

Результаты исследования белков методом иммуноблотинга показали, что антитела сыворотки переболевшего некробактериозом животного реагировали с большинством белков, присутствующих в объединенной фракции. Наиболее яркие полосы соответствовали полипептидам с м.м. 300, 93, 75 55 кДа.

Из практики иммуноферментного анализа известно, что внесение в систему ИФА лишь одного элемента — сыворотки крови - создает столько проблем, сколько их может не встретится в разработке метода в целом. Антитела в ИФА используют в виде высокоактивных гипериммунных сывороток. Для сорбции на твёрдую фазу используют IgG - фракцию, выделенную из иммунной сыворотки. Методы выделения иммуноглобулинов, применяемые в разных лабораториях, различны. Используя накопленный опыт различных исследователей и применив отдельные этапы их разработок, мы, комбинацией ряда иммунохимических методов получили чистые и высокоактивные препараты иммуноглобулина КРС класса G с тем же или несколько более высоким титром преципитирующей активности.

Выделение антивидовых иммуноглобулинов (анти-IgG КРС) проводили методом аффинной хроматографии. Объем наносимой на колонку антисыворотки зависел от ее титра в РДП: чем ниже титр, тем больший объем наносили. Так, при титре 1:64 наносили 8 мл, 1:32 — 16 мл, 1:8 — 32 мл, соответственно.

Чувствительность и воспроизводимость ИФА во многом зависит от качества используемых коньюгатов. Для конъюгации ферментов с антителами или антигенами используют чаще всего глутаровый альдегид или перийодат натрия. Мы в своей работе исплдьзовали для получения коньюгатов пероксидазу из хрена (ПХ), марки A, RZ - 2,8 - 2,9. В результате был получен высокоспецифичный, стабильный коньюгат, сохраняющий свою активность после лиофильного высушивания.

Результаты, полученные в ИФА, сравнивали с результатами, полученными в РПГА. 35 сывороток отрицательных в РПГА (т.е. 24,1%) были положительны в ИФА. Обе методики быстры и позволяют исследовать большое количество сывороток. Преимуществом метода ИФА является его более высокая чувствительность, чем РПГА.

Таким образом, при сравнительной оценке уровня анти -F.necrophorum антител, полученных различными методами РПГА и ИФА, установлено, что результаты титрования сывороток в ИФА имеют высокую степень соответствия с результатами РПГА. Метод чувствителен, быстр в исполнении и может быть использован при определении уровня анти-F.necrophorum антител при обследовании большого количества животных.

Анти-F.necrophorum IgG получали с помощью аффинной хроматографии. Приготовление сорбента на основе очищенного видоспецифичного антигена F.necrophorum проводили по стандартной методике, предварительно очистив антигенную фракцию от низкомолекулярных продуктов на Sephadex G-25.

С иммуносорбента элюировалось 6-7 мг антигена, сорбировалось, соответственно, 37-43 мг, что составляет 74-86 % от исходного. Объем сорбента был равен 12 мл, в 1 мл геля иммобилизовано 3,5 - 3,7 видоспецифичного антигена F.necrophorum.

На колонку наносили сыворотку, содержащую антитела к F.necrophorum с титром в ИФА не менее чем 1:12800.

Специфичность и активность полученных иммуноглобулинов была проверена в тест-системе для определения анти-F.necrophorum

Для сравнительной оценки конкурентного и «сэндвич» — вариантов ИФА был использован патматериал, полученный от больных и подозрительных животных различных хозяйств.

Явным преимуществом методов ИФА оказалась более высокая чувствительность, чем РТГА. Однако, при общей высокой чувствительности сэндвич»-вариант ИФА был более прост и быстр в исполнении чем конкурентный.

Результаты детекции антигенов F.necrophorum, полученные в гистохимическом варианте ИФА, сравнивали с результатами, полученными в РТГА, непрямом и прямом вариантах РИФ. Из 130 образцов патматериала 8 образцов оказались отрицательными во всех четырех реакциях, 4 образца — отрицательными в РТГА и положительными в двух вариантах МФА и гистохимическом варианте ИФА, остальные были положительными во всех четырех сравниваемых реакциях. Таким образом, гистохимический вариант ИФА не уступает по чувствительности и воспроизводимости прямому и непрямому варианту РИФ и такому надежному методу как РТГА. Неоспоримым преимуществом гистохимического варианта ИФА являются простота и доступность для ветеринарных лабораторий не оснащенных оборудованием для люминесцентной микроскопии. Предложенная схема постановки ИФА может быть использована как в практических, так и в научных целях.

Одним из перспективных направлений в плане совершенствования флуоресцирующих диагностикумов является получение фракции антител, используемых для метки, с максимальным содержанием специфических антител. Преимуществом РИФ является ее специфичность, высокая чувствительность, определение искомого антигена среди других смешанных антигенов, получение быстрого результата, выявление как живых, так и мертвых микроорганизмов и их антигенов, простота выполнения.

Первым этапом создания люминесцентной тест-системы для определения F.necrophorum в патматериале было получение коньюгата анти-F.necrophorum IgG - ФИТЦ и коньюгата анти-IgG КРС IgG - ФИТЦ.

Результаты, полученные при проверке работы иммунофлюоресцентной тест-системы, сравнивали с результатами в РТГА. Из 130 образцов патматериала 8 образцов оказались отрицательными во всех трех реакциях, 4 образца — отрицательными в РТГА и положительными в двух вариантах РИФ, остальные были положительными во всех трех реакциях.

Таким образом, оба варианта РИФ не уступают по чувствительности такому надежному методу как РТГА. Неоспоримым преимуществом РИФ являются простота и высокая скорость постановки реакции. Метод технически не сложен, хотя и требует определенных навыков в интерпретации результата.

Для изучения напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе использовали опытную (п=6) и контрольную (п=6) группы телят. Предварительно все животные были проверены на отсутствие антител к F.necrophorum. Телятам опытной группы вводили некробактериозную вакцину производства ГЩБК (Щёлковский биокомбинат) согласно наставлению. Контрольной группе животных вводили неполный адьювант Фрейнда. Кровь брали на 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 14 день после введения вакцины.

В результате изучения напряженности клеточного и гуморального иммунитета при некробактериозе, установлено, что в крови контрольных животных наблюдается увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК клеток на 7 сутки. Полученные данные свидетельствуют о том, что динамика образования спонтанных Е-лимфоцитов совпадала с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.

6.1. Отработан метод получения очищенного антигена F.necrophorum. С помощью электрофореза в ПААГ в составе антигена определена молекулярная масса белков в диапазоне от 30 до 300 КД, специфичных в ИФА.

6.2. Установлено, что в крови вакцинированных животных наблюдалось увеличение абсолютного количества спонтанных Т-лимфоцитов (Е), ЕАС-В-лимфоцитов и АСК на 7-е сутки, что свидетельствует о совпадении динамики образования спонтанных Е-лимфоцитов с таковой ЕАС-В-лимфоцитов и АСК.

6.3. Показана возможность выделения антинекробактериозных антител из сыворотки переболевших животных с помощью аффинной хроматографии на нерастворимой фракции бактериальных клеток.

6.4. Получены анти-IgG КРС сыворотки на кроликах с титром в РДП 1:32 - 1:256. Синтезированы высокоактивные коньюгаты анти-IgG КРС с ФИТЦ (1:1000 в непрямой РИФ) и ПХ (1:20000 в непрямом твердофазном ИФА).

6.5. Показано, что разработанная тест-система характеризуется специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью результатов. Установлена явная корреляционная зависимость методов РТГА и РИФ при обнаружении антигена F.necrophorum в гнойно-некротических поражениях КРС, ИФА и РПГА при количественном определении содержания антител к F.necrophorum. Выявлено, что метод ИФА при определении антигена F.necrophorum, превосходит по чувствительности РТГА.

6.6. Технология получения реагентов и методика проведения ИФА положены в основу разработанной тест-системы и созданы «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-Л», «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С» и «Набор для гистохимической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А»;

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В практику предложены тест-системы для обнаружения антител и антигенов к F.necrophorum в сыворотках КРС методом иммуноферментного анализа. Метод может быть рекомендован для включения в схему лабораторных исследований с целью диагностики некробактериоза.

Материалы работы использованы при составлении нормативной документации на «Набор для люминесцентной диагностики некробактериоза КРС Н-JI», «Набор для серологической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-С» и «Набор для гистохимической иммуноферментной диагностики некробактериоза КРС Н-А» (ТУ, Инструкция и Наставление)

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Романенко, Михаил Николаевич, 2004 год

1. Абдугалиев Ж.Д. /Опыт лечения некробактериоза КРС. /Проблемы развития животноводства и кормопроизводства Северного Казахстана в современных условиях. Петропавловск, 1992, с. 64-65;

2. Авилов B.C., Мникова Л.А., Сологуб В.К., Коромыслов Г.Ф., Дзантиев Б.Б., Сорокина Н.В., Егоров A.M. /Иммуноферментный анализ /Ветеринария, 1981, 8, 33-35;

3. Балабанов В.А. /Некробактериоз животных., М., 1971;

4. Бережнов М.Н. /Хирургическое лечение некробациллеза оленей. /Магаданский оленевод , вып. 14, 1965;

5. Бондарько Д.Н. /Болезни копытец у крупного рогатого скота в животноводческих комплексах. /Диагностика и профилактика болезней животных в молочных комплексах. Омск, 1980, 51-59;

6. Бондарько Д.Н., Циро А.И. /Клинико-бактериологические исследования и лечение окситетрациклином при некробактериозе пальцев у крупного рогатого скота/Науч. тр. Омского ветеринарного института. 1967, вып. 1,т.25, с. 138-148;

7. Босхомоджиева Е.Д. /Гипериммунная сыворотка против некробактериоза КРС. Автореферат канд. Диссертации , М. 1994;

8. Бывкова Н.Н., Лукина В.А., Бойко А.А. /Сравнительная оценка иммуноглобулинов, меченых пероксидазой (иммуноферментных конъюгатов). /Передовой науч.-производст. Опыт в биологической промышленности, 1985, т.9, с. 8-11;

9. Волкова А.А., Галиев P.P., Овчаренко В.И. /Некробациллез овец. Фрунзе, 1965;

10. Гарбарец Б.А. /Биохимическая лабораторная техника. Киев. Здоровье, 1983, с. 200;

11. Демкин Т.П., Баренов В.Н., Александров В.М. /Некробактериоз свиней. Межвузовский сборник, часть 2, Саратов, 1990;

12. Дженсен Р., Маккей Д. /Болезни крупного рогатого скота при промышленном откорме. М.: Колос, 1977;

13. Джутгина С.И. Некробактериоз инфекция факторная /Ветеринария 1999, №2, с. 9-11;

14. Забородин В.А., Лайшев А.Х. /Болезни северных оленей. М., Колос, 1980;

15. Захаров В.И. /Лечение и профилактика заболеваний копыт у коров в условиях привязного содержания. Материалы в помощь с-х16,17.18,19,20,21,22,23,24,25,2627,28

16. Игнатьев A.M., Мони Ю.В., Бабикова Р.А., Петрова И.А. /Использование метода иммунофлуоресценции при диагностике Инфекции КРС /Сб. научн. Трудов МВА им. Скрябина, 1973, 70, с.118 -119;

17. Каган Ф.И., Соломатин В.И. /Лечение биомицином и террамицином КРС и овец, больных некробациллезом / Ветеринария, 1963, 3, с.46-48;

18. Калашник И.А. Болезни копытец у коров в хозяйствах промышленного типа /Теоретические и практические вопросы ветеринарии. Тарту, 1983, Т. 1., с.80-82;I

19. Караваев Ю.Д., Мачахтыров И. /Некробактериозу можно сказать "нет". /Животновод. 1998, №7, с.24-25;

20. Караваев Ю.Д., Семенова И.Н. /"Вооружена" и очень опасна" /Животновод. 1995, №3. с. 12;

21. Караваев Ю.Д., Семенова И.Н. /Ветеринария 1999, №8, с.11-12;

22. Караулов А.В. Клиническая иммунология. // М., Медицинское информационное агентство, 1999,-604с

23. Кицак В.Я. /Твердофазный иммуноферментный анализ в вирусологии. Обзор литературы. /МРЖ, 1988, разд.М., I, 20-23;

24. Козин А.И., Зимонов А.Н. /Некробактериоз КРС и способы его ликвидации . Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ветсанэкспертизы, Ульяновск, 1990, с. 64-66;

25. Кокуричев П.И., Домнин Б.Г., Кокуричева М.П. /Патологическая анатомия сельскохозяйственных животных./СПб, Агропромиздат, 1994, с.9-13;

26. Коленкин Е.Т., Абрамов Е.Н., Кокорин Н.А. /Эффективность различных методов лечения некробактериоза. Болезни конечностей сельскохозяйственных животных, Москва, 1988, с. 60-62;

27. Кэрстак Э. /Успехи в разработке иммуноферментных методов: получение реагентов, планирование экспериментальных исследований и интерпретации результатов. /Семинар ВОЗ по проблеме получения вирусных реагентов, М., СССР, 11-24/XII, 1983.;

28. Лайшев А.Х., В.П. Афанасьев, A.M. Силков, Р.И. Булгаков и др. /Лечение и профилактика некробактериоза северных оленей /Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 1988. №2, с. 74-79;

29. Маслов М.В. /Лечение коров с некробактериозными поражениями копытец. Сб научных трудов Ленинград, вет. Институт, 1989, вып 102, с. 143-147;30,31.