Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Рахманин, Петр Владимирович

• Рахманин, Петр Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Рахманин, Петр Владимирович

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. БЕШЕНСТВО ЖИВОТНЫХ.

1.1.1. Эпизоотическая обстановка по бешенству в РФ.

1.1.2. Эпидемиологическая ситуация бешенства (гидрофобии) в Российской Федерации.*;.

1.2. .ВОЗБУДИТЕЛЬ БЕШЕНСТВА.

1.2.1. ' Характеристика возбудителя.

1.2.2. 'Морфология и химический состав.

1.2.3. Устойчивость вируса.

1.2.4. Культивирование вируса.

1.3. ЭПИЗООТОЛОГИЯ.

1.4. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА.

1.4.1. Методы обнаружения антигенов вируса бешенства.

1.4.2. Методы выделения вируса бешенства.

1.4.3. -Методы обнаружения генома вируса.

1.4.4. Обнаружение антирабических антител.

1.5. ИММУНИТЕТ, МЕРЫ БОРЬБЫ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуноферментная тест-система определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак»

- Актуальность темы. В Российской Федерации на протяжении последних 11 лет не снижается опасность распространения заболеваний бешенством среди животных и возникновения случаев заболевания людей. Несмотря на то, что основными резервентами и распространителями рабического вируса остаются дикие хищники семейства псовых, все чаще вовлекаются в эпизоотический процесс домашние животные (собаки и кошки) [1,2,8,15,34].

В 2005году, по сравнению с 2000 годом, число заболевших бешенством животных увеличилось в 3,7 раза с 1406 до 5253 случаев. Интенсивность распространения" бешенства домашних животных находится'в прямой зависимости от; численности безнадзорных собак и кошек [8,28,31,36,57,61].

В 2000-2005гг в Российской Федерации увеличилось количество неблагополучных пунктов по бешенству собак и кошек до 39,4%. Бешенство среди различных видов животных регистрировалось в 2007 году на территории 49 субъектов РФ.

Основными средствами контроля бешенства среди домашних и диких животных являются специфическая профилактика, обеспечивающая устойчивость животных к заражению бешенством, и лабораторная диагностика. Однако применение антирабических вакцин и эффективных схем иммунизации животных, часто недостаточно из-за гетерогенности популяционной и индивидуальной защиты животных [14,32].

Наличие в сыворотке крови вакцинированных животных вируснейт-рализующих антител является фактором эффективности вакцинации, так как только вируснейтрализующие антитела рассматриваются как основа защиты против рабической инфекции [15,119].

В соответствии с рекомендациями Комитета экспертов ВОЗ по бешенству, содержание в сыворотках крови привитых против бешенства животных вируснейтрализующих антител 0,5 МЕ/мл, считается минимальным уровнем протективного антирабического иммунитета (Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines,2004) [120].

С 2003 года обязательными условиями, подлежащими исполнению при ввозе домашних животных (кошек, собак, домашних хорьков) из стран, не входящих в Европейский Союз, являются наличие имплантированных микрочипов и содержание вируснейтрализующих антител в сыворотке крови не менее 0,5МЕ/мл (Регламент Совета и Европейского парламента,2003). 44

Для определения антител в сыворотках крови к вирусу бешенства, ВОЗ рекомендует использовать реакцию нейтрализации in vivo РН на мышах и тесты in vitro на культуре клеток: тест ингибиции фокусов флюоресценции (fluorescent focus inhibition test (RFFIT) и тест флюоресценции вируснейтрализующих антител (FAVN)[ 17,24,95,96,119,120].

Постановка тестов in vitro требует специально аккредитованной лаборатории, длительного времени (2-3 дня), необходимости поддержания культуры клеток, использования вирулентного вируса. Постановка РН на мышах трудоемка, длительна во времени (14-21 день), требует живого вируса и значительного количества мышей, что увеличивает • стоимость анализа.

В практике применяются традиционные методы определения антира-бических антител, такие как РНГА, РСК, РНИФ, РДП [24,26].

Для решения аналогичных задач предложены методы иммунофер-ментного анализа, основанные на использовании целого вируса бешенства, или и его оболочечного белка-гликопротеина (белок G), однако, эти методы пригодны для качественного определения антител, но не позволяют количественно определять наличие антител против бешенства в сыворотках крови животных после вакцинации [3,10,26,35,45,66,79,113].

На основании этого, комитет экспертов ВОЗ по бешенству, в качестве альтернативного, рекомендует метод непрямого иммуноферментного анализа для количественного определения в сыворотке крови привитых кошек и собак антител к вирусу бешенства [96].

К преимуществам непрямого ИФА относится высокая чувствительность, автоматизация, использование инактивированного вируса бешенства штамм «CVS», референс-сыворотки с известным содержанием вирус-нейтрализующих антител и возможность в короткие сроки (3-4ч) по количественному содержанию антител в сыворотках крови вакцинированных животных определить уровень антирабического иммунитета.

С учетом этого, разработка тест-системы непрямого ИФА для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак, является актуальной задачей для практической ветеринарии. 7 Цель и задачи исследования Основной целью данной работы являлась разработка тест-системы, на основе непрямого иммуноферментного анализа, для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Отработать условия получения очищенного и концентрированного вируса бешенства штамм «CVS» и его компонента-гликопротеина для использования их в качестве антигенов в иммуноферментной тест-системе.

2. Синтезировать протеин А- пероксидазный коньюгат для иммуноферментной тест-системы.

3. Получить контрольные сыворотки для иммуноферментной тест-системы.

4. Разработать тест-систему на основе непрямого ИФА для количественного определения к вирусу бешенства антител в сыворотках крови привитых кошек и собак.

5. Исследовать эффективность применения разработанной иммунофер-ментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в сравнении с РН в культуре клеток.

7 Научная новизна работы.

Научная новизна результатов, полученных при выполнении работы, состоит в следующем:

Впервые в РФ разработана иммуноферментная /гест-система на основе непрямого ИФА с применением культурального фиксированного вируса бешенства штамм «CVS» и референс-препарата для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак

Отработаны условия очистки и концентрирования культурального фиксированного вируса бешенства' штамм «CVS» и гликопротеина вируса бешенства, пригодных в качестве антигенов иммуноферментной тест-системы.

Подобрана схема иммунизации продуцентов для получения антира-бической сыворотки, используемой в качестве контрольной при постановке непрямого ИФА.

Исследована возможность применения протеин А- пероксидазного коньюгата в иммуноферментной тест-системе для определения антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак.

Установлена согласованность между результатами определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства ко г Практическая значимость работы.

Впервые в РФ разработан набор компонентов и иммунофермент-ная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак, внедрение которой в практику ветлабораторий, позволит в короткие сроки провести исследования сывороток крови на наличие антирабических антител, и оценить эффективность вакцинации кошек и собак.

Разработанная тест система может быть использована для определения антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак, при перевозе их через границу Российской Федерации. з Практические предложения

Для практического использования предлагаются: Инструкция по применению набора «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных». Регистрационный № ПВР.1.2.-9/00080, утверждена 22.02.06. Инструкция по изготовлению и контролю «Глобулина флюоресцирующего для диагностики бешенства животных» утверждена директором ВНИТИБП 01.2006г.

Методические указания по определению уровня антител у привитых против бешенства кошек и собак методом ИФА», рассмотренные и одобренные на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Технические условия «Иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак».

Временная инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в сыворотках привитых против бешенства кошек и собак».

НТД и акты комиссионных испытаний одобрены Ученым советом, утверждены директором ВНИТИБП (03.2008г).

Основные положения, выносимые на защиту.

Иммуноферментная тест-система для количественного определения антител в сыворотках крови кошек и собак, привитых против бешенства.

Результаты определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак в иммуноферментной'тест-системе и РН в культуре клеток. :

Оценка эффективности применения разработанной иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител у привитых против бешенства кошек и собак.

Апробация работы и публикация результатов

Материалы исследований были доложены на заседаниях научного совета ГНУ ВНИТИБП. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария и кормление».

Личный вклад соискателя

Представленные в диссертационной работе материалы получены, проанализированы и обработаны автором самостоятельно. Практическую и консультативную помощь при исследовании сывороток крови кошек и собак в РН на культуре клеток оказал д.б.н., профессор Кузнецов Д.П., ведущий научный сотрудник ФГУ ВГНКИ к. б.н. Елаков A.JI.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ I. Бешенство животных.

Бешенство - особо опасная инфекционная болезнь, характеризующаяся поражением центральной нервной системы, к которой восприимчивы домашние и дикие животные, а также человек [2,5]. Бешенство, по оценкам ВОЗ, входит в пятерку зоонозов, наносящих наибольших социально-экономический ущерб и является постоянной угрозой для жизни человека и животных [15,17,89].

Бешенство распространено практически по всему миру, за исключением некоторых островных государств (Великобритания, Ирландия, Новая Зеландия, Япония) и Антарктиды. По данным экспертов'ВОЗ и МЭБ болезнь регистрируется более чем в 110 стран земного шара. Ежегодно погибает около 50 тысяч человек, из этого числа 35-45 тысяч (90%) приходится на Азиатский континент, в основном на Индию. Доля детской смертности составляет 30-50%, от числа заболевших [1,7,98].

В зависимости от резервуаров и особенностей течения, распространение t бешенства можно отнести к нескольким ареалам:

Полярный ареал, включающий РФ, Чукотку, Гренландию, Аляску, где в 60 - 90% случаев резервуаром вируса бешенства служат песцы.

Центральная и Западная Европа, азиатская часть РФ, США, Мексика входят в зону, характеризующуюся многочисленными носителями бешенства: куницы, красные лисы, барсук, волки, грызуны, скунсы, енотно-видная собака [75,117].

Южная и Центральная Америка, где резервуарами являются летучие мыши-вампиры [62,94,97].

Африканский ареал, где основными носителями вируса являются собаки, шакалы, мангусты.

Распространено бешенство, главным образом, среди плотоядных животных как диких, так и домашних.

Из всего многообразия животного мира только 4 отряда хладнокровных животных не подвержены этой инфекции, которая, помимо диких животных, поражает домашних и сельскохозяйственных животных, а также человека [25,36,48,50].

За период 2000-2005 гг. среди животных было отмечено более 82 тыс. случаев бешенства, подтвержденных лабораторным анализом; погибло свыше 30 млн человек и более 10 млн. человек получили различные повреждения от животных и более 5 млн. человек специфическое антираби-ческое лечение [15,22].

Несмотря на все усилия санитарных властей, случаи заболевания среди людей все еще регистрируются в районах, где дикие животные служат резервуаром вируса бешенства [29,34]. Спектр патогенности ВБ тесно связан с его экологией и имеются 2 формы эпизоотии Б: городская и лесная, при которой возбудитель циркулирует среди диких плотоядных по типу природно-очаговой инфекции. Периодичность эпизоотии — характерная особенность Б, а сезонные подъемы заболеваемости Б среди животных тесно связаны с географией региона и биологическими циклами активности животных [75,90,121].

Лисицы обусловливают 60 - 85% от'всех случаев заболевания бешенством среди диких животных. Их роль в эпизоотологии бешенства объясняется чрезвычайной восприимчивостью к ВБ, увеличением популяции этих животных, а также возможностью перорального заражения[ 19,29,47].

Увеличению численности лисиц способствует истребление их естественных врагов - волков, рысей, медведей, орлов и других хищников, а также увеличение количества грызунов - основного источника корма для лисиц[69,70]. У 40-89% лисиц болезнь часто протекает хронически и латентно, обеспечивая длительную персистенцию вируса в естественных условиях^ 6,65].

Имеются сообщения о выделении возбудителя.Б от грызунов — белок, сурков, крыс, зайцев, ондатр, хомяков, мышей. Однако роль этих животных в экологии Б окончательно не установлена [29,47].

Несмотря на то, что эпизоотии Б поддерживаются, главным образом, дикими животными, человеку угрожают, прежде всего, собаки и кошки [5,8,34,48]. Собаки, летучие мыши, обезьяны, волки, енотовидные собаки, койоты, кошки составляют не более 5% от общего числа иммунизированных животных и существенно влияют на распространение Б [15,47,52,112,115].

Собаки среди прочих восприимчивых животных представляют собой группу наивысшего риска в виду их абсолютной преобладающей роли в реализации связей между природными и антропургическими экотипами бешенства за счет контактов с лисицами — в свою очередь преобладающими резервуарами и источниками инфекции.

В городских эпизоотиях бешенство у собак, как правило, заканчивается их гибелью, поэтому механизм поддержания вируса сводится к коротким циклам репродукции в организме и быстрой передаче восприимчивому организму [30,31,82].

В настоящее время наблюдается увеличение популяции собак, в том числе бездомных, которые служат звеном в цепи передачи инфекций во многих развивающих странах, продолжают также сохраняться среди диких животных очаги бешенства, даже в условиях ежегодной вакцинации^,30,81].

Кошки, среди прочих восприимчивых животных, представляют собой по значению вторую после собак и прогрессирующую группу риска. Кошки вовлекаются в экологические циклы инфекции лишь спорадически, не участвуют в циркуляции возбудителя, остаются его биологическими тупиками и обладают низким эпидемическим потенциалом[29].

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Рахманин, Петр Владимирович

5. ВЫВОДЫ

1. С использованием последовательного центрифугирования при 1 Tbic.g , 50 Tbic.g и гель-хроматографии на сефарозе 4В получен очищенный и концентрированный вирус бешенства штамм «CVS», 97,4% чистоты по- белку, инфекционностью на 1,2 IgLD 5о/сМ выше исходной и активностью в ИФА 1:800.

2. Обработкой вируса бешенства штамм «CVS» 2% тритоном Х-100 получен гликопротеин вируса с сохранением антигенной активности, определяемой в ИФА в титре 1:600.

3. При введении животным очищенный вирус бешенства и гликопротеин вызывали образование в сыворотках вируснейтрализующих антител в титрах 1:8 -1:64 и содержанием антирабических антител 2-12 МЕ/мл.

4. Иммунизацией баранов и собак инактивированным (З-пропиолактоном 1:4000 очищенным вирусом бешенства штамм «CVS» получены антирабические сыворотки с титром вируснейтрализующих антител, определенных в РН 1:16-1:64 и содержанием 4-24 МЕ/мл антител, пригодные в качестве контрольных, положительных сывороток и референс-препаратов для иммуноферментной тест-системы.

5. Показано, что протеин А- пероксидазный коньюгат в рабочем разведении 1:4000 и концентрации по ПХ - 240 мкг/ОДмл может быть использован в иммуноферментной тест-системе для количественного определения антител к вирусу бешенства в сыворотках привитых кошек и собак.

6. Разработана иммуноферментная тест-система непрямого ИФА для количественного определения в сыворотках крови антител к вирусу бешенства с чувствительностью 0,02-0,03 МЕ/мл антирабических антител. Установлено, что относительно РН, чувствительность и специфичность тест-системы непрямого ИФА с использованием в "качестве антигена очищенного вируса была выше ( 91% и 94%), в сравнении с использованием гликопротеина вируса (88% и 86% соответственно).

6. Установлена пороговое значение ОП490 =0,620 о.е., по которой определен в сыворотках крови привитых кошек и собак минимальный уровень антирабических антител (менее 0,5 МЕ/мл).

7. Установлена согласованность (К=0,67) результатов, полученных при определении уровня' антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в разработанной' иммуноферментной тест-системе и РН в культуре клеток. Чувствительность разработанной тест-системы непрямого ИФА относительно РН составила 88%, специфичность 80%.

6. Практические предложения

Для практического использования- предлагаются:

Инструкция по применению набора «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных». Регистрационный № ПВР.1.2.-9/00080, утверждена 22.02.06. Инструкция по изготовлению и контролю «Глобулин флюоресцирующий для диагностики бешенства животных» и утвержденная директором ВНИТИБП 01.2006г.

Методические указания по определению уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак методом ИФА», рассмотрены и одобрены на заседании секции «Ветеринарная биотехнология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии.

Технические условия «Иммуноферментная тест-система для определения уровня антирабических антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак».

Временная инструкция по применению иммуноферментной тест-системы для определения уровня антирабических антител в. сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак».

НТД и акты комиссионных испытаний одобрены Ученым советом, утверждены директором ВНИТИБП (03.2008).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Рахманин, Петр Владимирович, 2008 год

1. Авилов В.М.,Седов В .А. и др. Необходим учет новых особенностей эпизоотологии бешенства. //Ветеринария.-1998,№6,-С.З-б

2. Авилов В.М., Гусев А.А., Савин А.В. Эпизоотическое состояние и эффективность производимых мероприятий против бешенства в России. //Ветеринария., №6.,2002,-С.З-6.

3. Акиныпина Т.В. Разработка набора реагентов для оценки эффективности поствакцинального иммунитета к вирусу бешенства в серологических реакциях. Автореферат дисс., Щелково, 2005, С.-25

4. Березин В.Э., Артамонов А.Ф.// Вопросы вирусологии-1985,-№ 5,-С.568-571

5. Бакулов И.А., Книзе А.В., Котляров В.М. и др. Система эпизоотологиче-ского мониторинга и особо опасных, экзотических, малоизученных, в том числе зооантропонозных болезней животных. Покров, ВНИИВВиМ, 2001,72С.

6. Белоусов В.И.; Бирюков А.Г.; Кузнецова С.В.; Клюкина В.И.; Кочиш ИМ. Флюоресцирующий антирабический глобулин из сыворотки крови различных видов животных. Науч.основы технологии пром.пр-ва

7. Бешенство. Сюрин В.Н.,Самуйленко А.Я.,Соловьев Б.В.,Фомина Н.В. //Вирусные болезни животных.- МД998.-С.300-319

8. Березина Е.С. Особенности экологии собак.// Вет. консультант М.,2002,№5, -С.13-15

9. Бручнев К.Н.; Квасов И.Л.; Турсункулов Ш.Ж. Вируснейтрализующая и преципитирующая активность сывороток крови лошадей,привитых ра-бическими вирус-антигенами. Вестник с.-х. .науки Казахстана, 1985; T.2I -С. 71-75.

10. Ботвинкин А.Д., Наволокин В.В. Обнаружение антител к вирусу бешенства с помощью ELISA в пробах крови, собранных на бумажные диски. Лаб. Дело,1988, №3, -С. 73-77

11. Волкова Р.А.; Рунова В.Ф.; Романова Л.Н.; Храпова И.С.; Эльберт Л.Б.; Мальдов Д.Г. Применение ракетного иммунозлектрофореза для определения гликопротеина в концентрированных антирабических вакцинах. Вопр.вирусологии, 1994; Т.39, N2 -С. 68-71 ,

12. Вишняков И.Ф., Недосеков В.В. ,Груздев К.Н. и др. Способ определения антирабических вируснейтрализующих антитиел.// Патент № 97116427, 1997г

13. Гринь С.А., Сазанова Э.Я.,Акиньшина Т.В. и др. Клеточный иммунитет при культуральной антирабической вакцинации. Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. 2006, №2,-С 76-78.

14. Груздев Л.К., Дешевых А.Е., Груздев К.Н., Изучение репродукции фиксированного штамма вируса бешенства в культуре клеток. Вопр. Приклад. Экологии (природопользования), охотоведения и звероводства.-Киров,1997,-С. 285-286.

15. Государственный стандарт СССР. Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики бешенства. ГОСТ 26075-84 (СТ СЭВ 3452-81 ).-М. 1984.9с.

16. Дудников С.А., Кременчугская С.Р., Дудникова Е.К., Селютина И.Н. Получение гликопротеина GP-67 вируса бешенства. Проблемы инфек. па-тол, с-х животных.-Владимир,1997*.-С. 171-172

17. Дудников С.А. Лисы как маркеры при бешенстве. ч1-2., Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Материалы научно-прак. конфе-рен. Покров 2003.,-С 69-73

18. Идрисова Н.Т. Чувствительность некоторых культур клеток к вирусу бешенства. Бюл.ВИЭВ, 1991; Вып.75-76. -С. 119-121

19. Иванов B.C., Школьников Е.Э. Состояние и перспективы борьбы с бешенством. //Вестник РАСХН, 2000,№2,-С 63-65

20. КовалевА.Н.,ШашёнькоА.С.,Иммунофлюоресцентное исследование отпечатков роговицы глаза при бешенстве.//Ветеринария,1970,№9,-С.44-46.

21. Кунакаев Г.Г. Эпизоотическая обстановка по бешенству животных в

22. РБ. // Информ.бюл.МСХ и продовольствия Респ.Башкортостан,2000; N 11.-С. 26-27*

23. Кузнецова С.В. Диагностикумы на основе очищенных и концентрированных вирусных антигенов (на примере вируса бешенства и инфекционного ринотрахеита КРС). Авт. дис. док. биол. наук., ВИЭВ, 1991.

24. Кузнецова С.В.,Кузнецов П.П.,Иванов B.C. Субъединичная антираби-ческая вакцина.// Науч.основы технологии пром.пр-ва вет.биол.препаратов. -Щелково, 1996, -С. 54,

25. Литвинов О.Б., Яковлев С.С., Бессонов И.Е. и др. Информационный бюллютень «Бешенство».-М.2007

26. Макаров В.В. Бешенство, очерк мирового нозоареала и общие элементы контроля. /Ветеринарная патология. 2002,№1. -С. 13-20

27. Макаров В.В., Недосеков В.В.; Середа А.Д., Сошенко Л.П. Опыт серологического мониторинга популяции собак при бешенстве. Ветеринарная патология, 2002,№1,-С. 140-143

28. Макаров В.В., Джупина С.И., Ведерников В.А. и др. Бешенство животных разных видов в современных условиях-эпизоотологический образец и клиническая характеристика. Ветеринарная патология.-2002, №1.-С. 214-217

29. Макаров В.В.; Воробьев А.А. Актуальные проблемы бешенства: природная очаговость, методология исследований и контроля в центре России. Журн.микробиологии,эпидемиологии и иммунобиологии, 2005; N 1, С. 89-95

30. Мелимов М.А.; Татаров А.Т. Бешенство животных.// Ветеринария, 1984; № 12 . -С. 67-69

31. Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом. Владимир, 1998г.

32. Мовсесянц А.А. Современные проблемы бешенства. //Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Материалы научно-прак. конф. Покров 2003.,-С 26-31

33. Недосеков В .В., Вишняков И.Ф., Жестерев В.И.,Балышев В.М., Груздев К.Н Титрование антирабических антител с помощью теста фокусов флюоресценции. Ветеринария, 1998: №7,-С. 28-30

34. Пилявская Е.А. Изучение некоторых свойств антирабического имму-ноглобулина.Труды Томского НИИ вакцин и сывороток, 1983; Т. 7.-С. 103-109

35. Полюшкина Г.С. Изучение иммуномоделирующих свойств неотима при рабической инфекции.// Вирус.болезни с.-х.животных. -Владимира 1995 -С. 153,

36. Сазанова Э.Я., Кузнецова С.В., Маслов Е.В., Бойко А.А., Иванов B.C., Кузнецов П.П. Иммуноферментный анализ при индикации вируса бешенства и определения уровня антител. Ветеринария, 1991,Т 8,-С. 62-64

37. Селимов М.А.; Фодор И.И.; Грабко В.И. К проблеме генно-инженерной антирабической вакцины.//Генно-инженерные и синтетические вакцины. Пущино, 1990-С. 64-70

38. Селимов М.А.Современная эпизоотическая ситуация и перспективы элиминации бешенства. Вопросы вирусологии. Т 43., №5, 1998,—С. 196-198

39. Седов В.А.; Коромыслов Г.Ф.; Куликовский А.В. Семинар всемирной организации здравоохранения по борьбе с бешенством диких животных (Женева, июль 1990 г.), Вестн. с.-х. науки. М, 1991; № 4 -С. 172-173

40. Сологуб Т.В.,Никишин И.В.,Вишняков И.Ф и др.Совершенствование МФА для обнаружения антигена вируса бешенства. Вопр.вет.вирус.,микробиологии и эпизоотологии, 1992;Т.Ч.2;-С.260-261.

41. Тургенбаев А.а. Суюбаева Б.П. перспективы и практические аспекты применения гибридомной технологии на модели вируса бешенства.// Вестник с-х науки Казахстана, 1990,Т 3,-с 69-72

42. Черкасский Б.Л. Типологическая классификация природных очагов иструктура мирового ареала природного бешенства. Журн. микробиологии,эпидемиологии и иммунобиологии, 1984; № 9 -С. 16-21• / *

43. Чернов С.М. и др. Результаты использования прямого твердофазного иммуноферментного анализа для оценки специфической активности антирабических вакцин. ЖМЭИ, «Медицина»,М 1991, №5-С. 30-33

44. Шафеева Р.С.,Фролова А.В. репродукция вируса бешенства в культуре перевиваемых клеток Vero. //Цитология, 1994/Г.36,№6,-С. 587-588

45. Шашенько А.С. Распределение вируса бешенства и прижизненное обнаружение его с помощью исследования отпечатков роговицы. Автореферат дис. кан. вет. наук. Минск. 1971, 21с.

46. Шестопалов A.M. Дисурина М.И.; Груздев К.Н. Бешенство и его распространение в мире. //Вопр. вирусологии, 2001; T.46,N 2, -С. 7-12

47. Информационный бюллетень по бешенству. //ФГУ «Центр ветеринарии»., Лаборатория эпизоотологии ВИЭВ, 20005г, 41с.

48. Хисматуллина Н.А.; Разработка средств и методов иммунологического мониторинга и мер борьбы при бешенстве и лихорадке Ку животных. Автореферат дис. доктора биол. наук. -Казань, 2000, -С.48

49. Хисматуллина Н.А.; Савицкая Т.А. и др., Прижизненая диагностика гиброфобии. Междунар.науч.практ.конф." Ветеринарные и медицинские91

50. Цыбанов Я.С. Разработка тест-системы для идентификации вируса арк- • тического бешенства на основе методов анализа генома: Автореферат дис. кан. биол. наук.-Покров, 2001. —24с.

51. Цвиль JI.А.,Родина JI.A. Эпидемическая ситуация и меры профилактики бешенства в г. Москве. Междунар.науч.практ.конф." Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. Покров ,2003,4.1.-С 146-151.

52. Alvarez Peralta Е. Rabia transmitida рог vamphos,distribution,frecuencia е importancia // Tecn.pec.en Mexico, 1997; Vol.35,N 2\ -P. 93-104

53. Aubert M. F. A. Practical significance of rabies antibodies in cats and dogs.//Rev. Sci. Tech. Off int. Epis ,1992, №11, -P 735-760

54. Arai Y.T.; YamadaK.; Kameoka Y.; Horimoto Т.; Yamamoto K.; Yabe S.; Nakayama M.; TashiroM. Nucleoprotein gene analysis of fixed and street rabies virus variants using RT-PCR //Arch.Virol., 1997; Vol. 142,N 9; -P. 17871796

55. Artois M:; Cliquet F.; Barrat J.; Schumacher C.L. Effectiveness of SAG1 oral vaccine for the long-term protection of red foxes (Vulpes vulpes) against rabies //Veter.Rec, 1997; Vol. 140,N 3 ,P. 57-59

56. Atanasiu P., Perrin P., Delegneau J. E., Use of an enzyme immunoassay with protein A for rabies antigen and antibody determination. // Proc. 3-d Gen. Meet. Eur. Soc. Anim. Cell Technol., 1979,-P 207-215

57. Albas A.; Pardo P.E.; Rinaldi P.L.F.; Tarumoto M.H. Avaliacao do metodo de contra-imunoeletroforese para titular soros de bovinos vacinados contra a raiva Veter.Zootecn., 1995; Vol.7, -P. 141-145

58. Artois M.; Charlton K.M.; Tolson N.D. Vaccinia recombinant virus expressing the rabies virus glycoprotein: safety and efficacy trials in Canadian

59. Временная инструкция по изготовлению и контролю набора компонентов для определения уровня антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в ИФА1. Щелково-2008г1. УТВЕРЖДАЮ:1. ВНЩИБП Я. Самуйленко2006г

60. Акт межлабораторных комиссионных испытаний метода определения антител в сыворотках крови привитых против бешенства кошек и собак в ИФА

61. Разработанная иммуноферментная тест-система пригодна для серологического мониторинга вакцинированных против бешенства кошек и собак.1. Заключение.

62. Комиссия рекомендует одобрить Ученым советом ВНИТИБП настоящий акт комиссионных испытаний и утвердить «Методические рекомендации по применению метода ИФА для

63. Председатель комиссии И,И.Кочиш /

64. Члены комиссии: Г.Л.Молчанова1. УфбГ П-В.Рахманинук),„^А-ЪЛРоничев

65. Акт рассмотрен на ученом совете ВНИТИБП, одобрен и рекомендован для утверждения директором института.

66. Протокол заседания ученого совета № /Г от 03. 2008г Ученый секретарь ^(^A&jT&ft Ю.Д.Фролов