Разработка метода определения активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов как показателя адренергической регуляции в организме тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Хундерякова, Наталья Васильевна

• Хундерякова, Наталья Васильевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Хундерякова, Наталья Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Роль янтарной кислоты в энергообеспечении.

1.1. Субстратно - гормональная система.

1.2. Переаминирование ЩУК - ГЛУ - динамичная основа реципрокной регуляции.

1.3. Сигнальная роль янтарной кислоты в организме.

1.4. Модели исследования разных уровней адренергической регуляции.

1.5. Устойчивое поддёржание физиологической активации организма 20 животных и человека малыми дозами адреналина и янтарной кислоты.

1.6. Гиперактивация новорожденных как модель физиологической адренергической активации.

1.7. Свойства и локализация сукцинатдегидрогеназы.

Глава 2. Методы оценки функционального состояния митохондрий.

2.1. Гистологический метод определения «красных рванных волокон».

2.2. Биохимический метод определения функциональной активности митохондрий.

2.3. Цитохимический метод Нахлас определения активности СДГ.

2.4. Цитохимический метод Нахлас в модификации Нарциссова определения активности СДГ в лимфоцитах периферической крови.

2.5. Активность СДГ лимфоцитов, как показатель состояния внутренних органов и развития организма в целом.

ЧАСТЬ И. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Объекты исследования.

3.2. Забор крови у человека.

3.3. Создание разных состояний животного и эвтаназия.

3.4. Обработка, фиксация и окрашивание мазков крови нитросиним тетразолием.

3.5. Микроскопирование и измерение площади окраски.

3.6. Статистика.

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 4. Разработка нового цитобиохимического метода измерения активности сукцинатдегирогеназы в митохондриях лимфоцитов.

4.1. Принцип подбора условий для выявления окисляющей янтарной кислоты в митохондриях на мазке крови.

4.2. Различие состава инкубационных сред растворов по цитохимическим аналогам и по разработанному цитобиохимическому способу.

4.3. Влияние изменения величины рН 7,2 и 7,4 на активность СДГЛФ в присутствии 5мМ сукцината при разных физиологических состояниях животных.

4.5. Влияние содержания 1мМ ЭДТА в среде инкубации на результаты измерения активности сукцинатдегидрогеназы в покое и при действии адреналина на животное.

4.6. Выявление физиологической модуляции сукцинатдегидрогеназы в присутствии изолимонной кислоты у животных в разном физиологическом состоянии.

Глава 5. Применение цитобиохимического метода измерения активности сукцинатдегирогеназы на крысах.

5.1. Значение проб, выявляющих функциональную активность сукцинатдегидрогеназы. Расчет уровня эндогенной янтарной кислоты, истинной активности сукцинатдегидрогеназы.

5.2. Измерение активности сукцинатдегидрогеназы у новорожденных крысят сравнительно с показателями взрослых крыс в покое и при активации адреналином.

5.3. Изучение воздействия модулированной частоты 101 Гц от лазерного диода прибора Curator Professional на регуляцию превращений янтарной кислоты в лимфоцитах крыс.

Глава 6. Исследование взаимодействия ЯНТ с митохондриями условно здоровых добровольцев.

6.1. Четыре типа цитобиохимических паттернов (узоров) взаимодействия ЯНТ с митохондриями условно здоровых добровольцев.

6.2. Пример описания паттернов здоровых добровольцев.

6.3. Пример выявления у людей разного уровня метаболических процессов (метаболическая гипертрофия).

6.4. Выделение групп условно здоровых людей по субстратному действию ЯНТ. Характеристика каждого типа паттерна.

6.5. Значения показателей восстановления НСТ и истинной СДГЛФ у здоровых обследуемых.

6.6. Повторные измерения активности СДГ у одного и того же человека.

6.7. Сравнение активности СДГ лимфоцитов периферической и венозной крови условно здоровых людей.

Глава 7. Исследование взаимодействия ЯНТ с митохондриями в группе пациентов с пищевой аллергией и гипертонией.

7.1. Типы цитобиохимических паттернов у пациентов с пищевой аллергией и гипертонией и корреляция их с физиологическими параметрами.

Типы цитобиохимических паттернов пациентов по общей СДГДФ и действию ИЗЛ рис. 24.

7.2. Типы цитобиохимических паттернов пациентов по истинной СДГЛФ и действию ИЗЛ рис. 25.

7.3. Обсуждение сопоставления активности СДГЛФ крови с показателями интенсивности ГРВ у пациентов с пищевой аллергией в некоторых случаях с гипертонией.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка метода определения активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов как показателя адренергической регуляции в организме»

Открытие наследуемых по материнской линии мутаций митохондриальной ДНК стимулировало развитие новой области медицины -митохондриальных болезней, которые обусловлены этими мутациями (Luft 1994; Di Mauro et.al. 1980). Их круг очень широк - нейродегенеративные болезни, проявляющиеся в пожилом возрасте, кардиомиопатии, проявляющиеся в детском возрасте, некоторые формы диабета и связанной с ним ретинопатии и другие. Повреждение функций митохондрий является первичной причиной этих заболеваний (Скулачев 2000; Крыжановский 2002; Литвицкий 2002; Рере 2000; Banaclocha 2001; Sugrue, Tatton , 2001; Ward, 2005). Дисфункции митохондрий (MX) и гипоксию относят к типовым патологическим процессам (Лукьянова 1997; 2000; Hansford et al., 1999; Sastre et al., 2000; Cohen, Gold, 2001; Ward, 2005). Но развитие и других патологий во многих случаях также связано с повреждением митохондриальных процессов, которое является вторичным в развитии заболевания.

При нарушении энергообмена, которое клинические цитохимики обозначают термином "митохондриальная недостаточность", в первую очередь функционально страдают нервная и мышечные системы, в том числе гладкие мышцы т. к. они требуют высокого энергообеспечения, что делает эти ткани уязвимыми к митохондриальной дисфункции. Эти MX болезни называют митохондриальными энцефаломиопатиями, в случаях преимущественного нарушения функций мозга и кардиопатиями в случае преимущественного нарушения сердца (Сухоруков и др. 1997; 2003).

Для лечения вторичных, и даже для первичных митохондриальных болезней разработан новый класс медицинских препаратов - регуляторов энергетического обмена, направленных на поддержание функций митохондрий, а лекарственные препараты составляют современный раздел здравоохранения - "митохондриальную медицину".

Широко используются такие метаболиты митохондрий как коэнзим Q, витамины - Bi, В2, Вб, липоевая кислота, кокарбоксилаза, цитохром с и другие.

В отечественных исследованиях, начиная с 60 - годов, развивиается новое направление посвященное изучению регуляции физиологического состояния организма янтарной кислотой, как физиологически активным веществом и лечебным средством. Огромная заслуга в этом принадлежит М.Н. Кондрашовой и ее школе (Кондрашова 1968; 1972; 1973). В России разработаны и уже длительное время используются стимулирующие биологически активные добавки к пище, содержащие ЯНТ, а также некоторые лекарства (Кондрашова и др. 1976; 1997; 2002; 2006; Хазанов и др. 2002 -2006). Эффективность ЯНТ обусловливается и тем, что нормализация энергетических процессов в митохондриях устраняет нарушения в усвояемости кальция (Kondrashova 1982), а также катионов калия (Саакян 1998), что обеспечивает их участие в метаболизме даже более эффективно, чем введение в условиях ослабленной усвояемости.

В клинических исследованиях цитохимическое определение активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови по восстановлению тетразолиевых красителей является информативным показателем уровня метаболизма в организме. (Нарциссов 1969, Зарецкая 1983; Петричук и др. 2005). Клиническая цитохимия рассматривает клетку как самостоятельный орган со всеми свойствами целого организма, что в полной мере относится к лимфоцитам периферической крови. Лимфоциты рассматриваются не только как клетки специальной иммунной защиты, но и как элементы единой информационной системы, отражающей состояние организма и процесс его развития. Биохимические методы определения СДГ не применяются по причине невозможности широкого взятия тканей для выделения митохондрий. Но они имеют и другой очевидный, но привычный и потому не учитываемый недостаток. Он состоит в нарушении важнейшего с точки зрения биофизики свойства живых тканей - их структурной и ультраструктурной организации в частности, и митохондрий в клетке при их выделении. При этом разрушается паракристаллический комплекс ферментов матрикса - метаболой и теряются физические механизмы регуляции ферментов (Shrere 1985; Fahient 1988;

Любарев и Курганов 1987; 1989). Недостаточно оцененным преимуществом цитохимического метода является сохранение структурной организации в мазке. Его можно рассматривать как иммобилизацию ферментов на подложке в клеточной среде, которая стабилизирует даже выделенные ферменты на длительное время (Вудворд 1988). Однако, несмотря на то, что цитохимический метод является информативным и широко используемым более 50 лет Кондрашова М.Н. обратила внимание на наличие весьма существенных недостатков в составе реактивов. Их набор остался в основном неизменным с времен классических работ и не соответствует современным биохимическим условиям работы с митохондриями.

На основании вышеописанного был разработан новый цитобиохимический метод определения СДГ в лимфоцитах крови, сочетающий преимущества биохимических и цитохимических методов и исключающий их недостатки. Нами проведена значительная часть этих исследований, а также получены результаты исследования состояния условно здоровых добровольцев и пациентов с пищевой аллергией. Эти исследования вошли в патент.

Данное изобретение значительно повышает чувствительность измерения активности СДГ вне организма, в лимфоцитах к изменениям состояния в организме, обусловленным адренэргической регуляцией. Это осуществляется путем приближения состава сред к биохимическим условиям. При этом необходимо использовать весь комплекс разработанных изменений состава сред, поскольку частичная замена мало эффективна. Кроме того, были введены дополнительные определения окисления и действия ЯНТ в митохондриях. На основании этих определений Кондрашовой М.Н. предложен более точный способ расчета активности СДГ лимфоцитов, который коррелирует с адренэргической регуляцией. Предложенные измерения впервые характеризуют действие ЯНТ в митохондриях не по одному показателю, а по специфическому паттерну (узору) характеристик. Установлено, что существуют несколько типов паттернов у здоровых животных или людей. Они служат чувствительной индивидуальной характеристикой. При усилении действия адреналина в организме наблюдается возрастание амплитуды изменений паттернов с прохождением четко выявляемых стадий: активации, гиперактивации, ингибирования. Для реализации разработанного метода создан стандартный набор сухих реактивов высокой чистоты, позволяющий унифицировать измерения в разных лабораториях.

Метод использует традиционную для Института Биофизики современную компьютеризованную видеомикроскопию, что обеспечивает автоматизацию обработки изображений: объективность измерения, необходимый для статистической репрезентативности объем выборки.

Целью работы было - разработка метода определения активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови более чувствительного, чем традиционные цитохимические методы, к уровню адренэргической регуляции в организме, благодаря максимально возможному сохранению структурной организации митохондрий и иммобилизованной СДГ в измеряемом препарате. Использование разработанного метода для исследования проблемы участия ЯНТ в энергообеспечении при разных физиологических и патологических состояниях крысы и человека и рекомендации средств оптимизирующих функционирование этого центрального механизма энергообеспечения. Задачи исследования:

1. Разработать оптимальные условия состава среды инкубации (величину рН, влияние ЭДТА, ИЗЛ, набор дополнительных показателей восстановления НСТ) для выявления функциональной активности СДГ в лимфоцитах на мазке крови.

2. Измерить активность СДГ лимфоцитов в разработанных условиях при разной степени выраженности адренергической регуляции у крыс (гиперактивные новорожденные крысята, сравнительно с показателями взрослых животных интактных - в покое и при активации адреналином).

3. Исследовать воздействие лазерного диода модулированной частоты 101 Гц от прибора Curator Professional на взаимодействие ЯНТ с митохондриями в лимфоцитах крыс.

4. Определить для группы здоровых добровольцев цитобиохимические показатели взаимодействия ЯНТ с митохондриями.

5. Определить у пациентов (с пищевой аллергией и гипертонией) цитобиохимические показатели взаимодействия ЯНТ с митохондриями и сопоставить с их функциональным состоянием.

6. Участвовать в создании набора реактивов для стандартизации результатов, получаемых в разных лабораториях при определении активности СДГ и других характеристик действия ЯНТ в митохондриях - на лимфоцитах в мазке крови и в патентовании разработанного способа.

Научная новизна работы.

Разработка метода повысила информативность существующих на сегодняшний день и ставших классическими цитохимических методов (Nachlas et. al.1957, Пирс 1962) и различных его модификаций (Quaglino 1960; Нарциссов 1969; Зарецкая 1983; Петричук и др. 2005) определения активности СДГ в лимфоцитах (СДГЛФ), за счет изменения состава сред, приближенной к внутриклеточной, применения физиологических подходов исследования и проведения дополнительных измерений с нескольких показателей восстановления НСТ , определяющих не только активность СДГЛФ , но и функциональное состояние СДГ по специфическому паттерну - узору характеристик. Благодаря этому выявили несколько уровней функциональной активности СДГЛФ, при разных адренергических состояниях организма.

Впервые у новорожденных крысят выявили гиперактивацию СДГЛФ, по сравнению с взрослыми животными в покое и даже при физиологической активации адреналином.

Впервые показано благоприятное действие лазерного диода модулированной частоты 101 Гц от прибора «Curator - professional», на активность СДГЛФ.

Впервые в группе условно здоровых добровольцев выявлены четыре типа цитобиохимических паттернов взаимодействия ЯНТ с митохондриями, связанных с разным функциональным состоянием СДГ.

Впервые у пациентов с пищевой аллергией и гипертонией выявлены четыре разные типы цитобиохимических паттернов, свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГ, отличающихся от здоровых людей утратой латентного состояния, увеличением амплитуды показателей и активирующим действием ИЗЛ.

Величина амплитуды прогрессивно нарастает при развитии активации и патологии (это явление названо метаболическая гипертрофия) и может служить более чувствительным показателем, чем измерение АД для выявления, развития и эффективности лечения гипертонии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Работа посвящена разработке метода для исследования проблемы участия ЯНТ в энергообеспечении при разных физиологических и патологических состояниях крысы и человека и рекомендации средств оптимизирующих функционирование этого центрального механизма энергообеспечения, поэтому в обзоре литературы будет рассмотрено два вопроса:

• роль янтарной кислоты в энергообеспечении

• анализ традиционных методов исследования митохондриальных функций. Сначала будут рассмотрены вопросы о роли ЯНТ как доминирующего субстрата цикла трикарбоновых кислот при физиологической активации; здесь речь пойдет о взаимодействии между двумя субстратами ЯНТ и КГЛ и катехоламинами адреналином и ацетилхолином (субстратно - гормональные взаимодействия), связывающие метаболизм тканей с симпатической и парасимпатической нервной регуляцией, о сигнальной роли ЯНТ в организме. Будет также рассмотрен вопрос о моделях исследования разных уровней адренергической регуляции (стресс Селье, физиологическая активация малыми дозами адреналина и ЯНТ, гиперактивация у новорожденных, сравнительно со взрослыми. Затем будут рассмотрены методы оценки функциональной активности MX, проанализированы их достоинства и недостатки (гистохимический, биохимический, цитохимический) и важность сохранения структурной организации митохондриальной - ретикулярной сети в исследуемых препаратах. Также будут проанализированы существующие аналоги метода определения СДГЛФ периферической крови по восстановлению тетразолиевых красителей.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Хундерякова, Наталья Васильевна

Выводы

1. Исследована возможность повышения чувствительности традиционного цитохимического метода определения активности СДГЛФ по восстановлению НСТ на мазке к ее изменениям в организме за счет: способа расчета, изменения состава сред, приближенных к внутриклеточным, проведения дополнительных измерений нескольких показателей: эндогенными субстратами, ингибитором активности СДГ малонатом, миллимолярной концентрацией ЯНТ с ИЗЛ. Благодаря этому выявили несколько уровней функциональной активности СДГЛФ, при разных адренергических состояниях организма.

2. Экспериментально обоснованы следующие модификации: поддержание рН 7,2 ± 0,05, характерной для внутри митохондриальной среды вместо 7,4 и исключение хелатора кальция ЭДТА.

3. Обнаружено двойное регуляторное действие ИЗЛ на активность СДГЛФ -значительное снижение гиперактивации и более сильное, чем было известно, устранение ингибирования. Ее добавление позволяет впервые определить не только активность, но и функциональное состояние СДГ.

4. Для новорожденных крысят с естественной гиперактивацией адренэргической регуляции характерна и гиперактивация СДГ по сравнению со взрослыми не только в покое, но и при введении адреналина.

В ходе иммобилизационного стресса крыс, происходит ярко выраженный переход от гиперактивации СДГ к ее ингибированию, особенно отчетливо выявляемый по смене регуляторного действия ИЗЛ от снижения гиперактивности к уменьшению ингибирования.

5. Впервые на группах животных выявлено регуляторное действие прибора лазерной терапии Curator Professional с модулированной частотой 101 Гц на основной процесс энергообеспечения в митохондриях за счет окисления ЯНТ.

6. У здоровых людей обнаружено 4 типа цитобиохимических паттернов свидетельствующих о разном функциональном состоянии СДГЛФ; глубокого покоя, оперативного покоя, активации, активации с ингибированием, включая неизвестное ранее латентное состояние.

7. У пациентов с пищевой аллергией с гипертонией выявлены 4 типа цитобиохимических паттернов: условный покой, гиперактивация и гиперактивация с ингибированием, ингибирование, которые отличаются от здоровых утратой латентного состояния, увеличением амплитуды показателей и активирующим действием ИЗЛ. Развитие гиперактивации СДГ коррелирует с нарастанием артериального давления. Величина амплитуды прогрессивно нарастает при развитии активации и патологии (это явление названо метаболическая гипертрофия) и может служить показателем развития и эффективности лечения гипертонии, чем просто измерение артериального давления.

8. Проведенное исследование подтверждает и усиливает имевшиеся клинические данные о высокой информативности величины активности СДГ как показателя состояния организма.

Научно - практическая значимость

1. Разработанный метод соответствует запросам новых областей медицины-«Митохондриальных болезней» и «Митохондриальной медицины», учитывающих ведущую роль первичных и вторичных повреждений митохондрий в развитии и лечении заболеваний. Он является прямым показателем активности наиболее мощного процесса энергообеспечения в митохондриях - окисления ЯНТ и может служить для диагностики и контроля лечения.

2. Как другие функциональные показатели, этот метод должен быть стандартизован. Учитывая высокую чувствительность цитохимического определения к качеству реактивов, для получения стандартных результатов с нашим участием разработан и запатентован стандартный набор реактивов биохимической квалификации.

3. На основании определения уровня реактивности организма с помощью описанного метода возможно подбирать индивидуальную дозу лекарств и сочетать лекарства с природными регуляторами активности СДГЛФ. В частности, на основании наших результатов представляется перспективным использование ИЗЛ, как метаболита, выраженно нормализующего начальные патологические сдвиги - гиперактивацию СДГЛФ, а также и более глубокие -активировать ингибированную СДГ.

108

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенной работе осуществлена разработка принципиально нового метода определения активности СДГЛФ в митохондриях на основании сочетания преимуществ цитохимического и биохимического методов и исключения их недостатков. Поэтому метод назван цито-БИО-химическим. Он использует восстановление НСТ для определения взаимодействия ЯНТ с митохондриями. Подобно цитохимическим аналогам метод сохраняет структурную организацию митохондрий в клетке благодаря иммобилизации исследуемых клеток - лимфоцитов в мазке крови на стекле. Это представляет значительное преимущество перед биохимическими методами, которые традиционно связаны с сильным разрушением структуры воздействием сахарозы, холода и центрифугирования. С другой стороны, состав среды проведения реакции в биохимических исследованиях значительно более физиологичен. Разработка физиологической среды для цитохимического исследования значительно повышает его чувствительность к изменению физиологического состояния в организме. Важным усовершенствованием определения СДГЛФ разработанным методом является возможность определения дополнительных показателей взаимодействия ЯНТ с митохондриями - участие в окислении эндогенной ЯНТ, выявление регуляции СДГЛФ. Кроме того, на базе этих определений нами предложено более корректное определение величины активности СДГЛФ с учетом показателей пробы без добавления ЯНТ. Таким образом, вместо определения общей активности препарата по восстановлению НСТ по предложенному способу более точно определяется вклад СДГ. Поэтому мы обозначили используемый обычно показатель как «общую» активность СДГ, а более точно определенную как «истинную».

Исследовано применение этого метода для выявления различия физиологического состояния крысы и человека. В результате разработанных усовершенствований впервые выявлен набор состояний СДГЛФ при разных уровнях адренэргической регуляции крысы и человека. Он характеризуется не только единственным показателем - активностью СДГЛФ, определенной к тому же не в оптимальных условиях, а набором нескольких показателей -паттерном или узором. Эти паттерны представляют собой закономерное соотношение нескольких показателей и встречаются среди обследованных неоднократно. По этому признаку можно выделить несколько подгрупп, характерных и для крысы, и для человека. Они перечислены ниже в порядке от покоя для нормы к активности или патологии.

1. Глубокий покой. Латентная (" Спящая") СДГЛФ.

2. Оперативный покой. Латентная ("Спящая") СДГЛФ.

3. Активация. Небольшая активация СДГЛФ.

4. . Гиперактивация. Выраженная активация СДГЛФ. Впервые показано, что ИЗЛ снижает гиперактивность.

5. . Гиперактивация, сдерживаемая ингибированием меньшей или большей степени. Ингибирование выявляется по активации ИЗЛ. Активирующее действие ИЗЛ значительно сильнее, чем наблюдалось ранее.

Состояние полного отсутствия активности СДГЛФ, несмотря на добавление ЯНТ выявлено впервые благодаря тому, что комплексом условий работы с животным и препаратом нам удается сохранить состояние отключения фермента без активации адреналином. Это состояние не является ингибированным, на что показывает отсутствие эффекта активаторов. Оно представляет собой еще не активированное, латентное состояние фермента. Заключения о состоянии СДГЛФ сделано на основании учета дополнительных предложенных нами показателей взаимодействия ЯНТ с митохондриями.

Новым показателем является выявление двойного регуляторного (гомеостазирующего) действия ИЗЛ - снижение гиперактивации и уменьшение ингибирования

Таким образом, впервые можно выявить несколько уровней активности СДГЛФ при разных состояниях организма. Эти уровни отражают различное функциональное состояние фермента. Полученный результат впервые позволяет предложить биохимическую основу физиологического феномена, выразительно определенного А.А.Ухтомским как "послойное вовлечение живого субстрата в деятельность". Это явление показывает, что при нарастании степени (дозы) воздействия все большая часть ткани переходит из состояния покоя в возбуждение. При этом величина внешнего ответа может не отличаться, но на поддержание его тратятся разные усилия. Большие внутренние траты и обусловливают развитие напряжения при совершении внешне одной и той же работы. Эта же закономерность лежит в основе явления разных уровней (или этажей) адаптационных реакций, которые обнаружены JI.X. Гаркави. Она привлекает внимание к тому, что если внешне сходный ответ вызывается только повышенной дозой адреналина или других активаторов, это свидетельствует о более глубоком отклонении состояния организма от нормы к патологии. Такие состояния соответствуют нашим показателям при развитии ингибирования СДГЛФ.

На основании определения уровня реактивности можно подбирать дозу лекарств и сочетать лекарства с природными регуляторами активности СДГЛФ. В частности, на основании наших результатов представляется перспективным использование ИЗЛ, как метаболита, выражено нормализующего начальные патологические сдвиги - гиперактивацию СДГЛФ, а также и более глубокие - активировать ингибированную СДГЛФ.

Таким образом, проведенное исследование подтверждает имевшиеся клинические данные о высокой информативности величины активности СДГЛФ, как показателя состояния организма. Разработанные нами показатели значительно повышают чувствительность этого теста.

На современном этапе участию митохондрий в поддержании физиологического состояния организма и развитии болезней придается ключевое значение. Выделены новые области медицины - митохондриальные болезни и митохондриальная медицина. Как и другие области медицины, они должны иметь свои стандартные показатели. Разработанные нами подходы предлагают создание стандартизованного набора реактивов для определения показателей взаимодействия митохондрий с ЯНТ. При таких условиях можно получать универсальные характеристики физиологического состояния организма, отражающие функциональное состояние наиболее мощного фермента энергообеспечения СДГ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Хундерякова, Наталья Васильевна, 2008 год

1. Абрамченко А.В. Фармакотерапия преждевременных родов. Изд-во ЭЛБИ СПб, Санкт-Петербург, 2006, с. 116.

2. Аршавский И.А. Физиологические механизмы и закономерности индивидуального развития. М. 1976, с. 270.

3. Аршавский И.А. Некоторые методологические и теоретические аспекты анализа закономерностей индивидуального развития организмов. Вопросы философии. 1986, И, 95-104.

4. Бабский A.M., Кондрашова М.Н., Шостаковская И.В. Действие и последействие адреналина на дыхание митохондрий. Физиол. Журн., 1985, 31, 301 306.

5. Бабский A.M., Стефанкив Ю.С., Кондрашова М.Н., Шостаковская И.В. Субстратно-гормональная система янтарная кислота катехоламины. Новые данные. В кн.: Митохондрии в патологии. (М.Н.Кондрашова, Ю.Г.Каминский, Е.И.Маевский ред.) ОНТИПущино, 2001, 14-21.

6. Базарнова М.А. Активность некоторых ферментов лейкоцитов периферической крови при хроническом гломерулонефрите. Врачебное дело, 1983, 6, 33-35.

7. Баумуратов А.С., Кононов А. В., Ли В.В., Зинченко В.П. Импульсное освобождение АТФ из клеток асцитной карциномы Эрлиха при действии сапонина и ОН". Биологические мембраны, 2004, 21, 1, 46-52.

8. Васин М.В. Ушаков И.Б., Королева Л.В., Антипов В.В. Роль клеточной гипоксии в противолучевом эффекте радиопротекторов. Радиационная биология радиоэкология. 1999, 39. 2-3. 238-248.

9. Вудворд Дж. Иммобилизованные клетки и ферменты. Из-во «Мир» М. 1988, 177-182.

10. З.Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Кузьменко Т.С., Шихлярова А,И.

11. Антистрессовые реакции и активационная терапия. Реакция активации как путь к здоровью через процессы самоорганизации. Часть 1, Екатеринбург. «Филантроп» 2002, с 196.

12. У^.Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Кузьменко Т.С. Антистрессорные реакции и активационная терапия. М. «Имедис».1998. 654 с.

13. Гинецинский А.Г. Физиологические механизмы водно солевого баланса. Москва - Ленинград. 1964, 240-260.б.Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. 1978, 296 с.

14. Гордеева А. В., Звягильская Р.А., Лабас Ю.А., Биохимия, 2003, 68, 10, 1318

15. Дауранов И.Г. Функциональное состояние лейкоцитов у здоровых недоношенных детей и детей с внутричерепной родовой травмой Педиатрия, 1968, 6. 50-52.

16. Р.Дильман В.М., Анисимов В.Н., Кондрашова М.Н. Влияние янтарной и глутаминовой кислот на чувствительность гипоталамо-гонадотропной системы к ингибирующему действию эстрогенов у старых крыс. Фармакология и токсикология 1976, 3, 540.

17. Зарецкая Ю.М. Энзиматический тест, как вид иммунологического мониторинга кризисов отторжения. Клиническая гшмуногенетика. Медицина. 1983, 163-164.

18. Кребс Г., Корнберг Г. Превращение энергии в живой материи. М., 1959.

19. Кондрашова М.Н. Биохимический цикл возбуждения. Митохондрии, 1968, Наука, М., 122-131.

20. Кондрашова М.Н. Накопление и использование янтарной кислоты в митохондриях. Митохондрии, 1972, Наука, М, 151-169.

21. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В. Проявления стресса на уровне митохондрий, их стимуляция гормонами и регуляция гидроаэроионами. Журнал общей билогии, 1985, 4, 516-526.

22. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В. Бабский A.M., Хазанов В.А. Гомеостазирование физиологических функций на уровне митохондрий. Наука. Новосибирск 1987, 40-63.

23. Кондрашова М.Н. Структурно-кинетическая организация цикла трикарбоновых кислот при активном функционировании ткани. Биофизика, 1989, 34, 3, 450-458.

24. Кондрашова М.Н. Взаимодействие процессов переаминирования и окисления. Биохимия 1991, 56, 388-406.

25. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В., Хижняк Е.П. Теплопродукция в митохондриях при окислении разных субстратов. Биофизика, 1988, 33, 3, 527-528.

26. Кондрашова M.H. Гормоноподобное действие янтарной кислоты. Вопр.Биол. Мед.Фармац. Химии 2002.1, 7-12.

27. Кондрашова М.Н. Субстратно-гормональная система регуляции физиологического состояния. Условия ее выявления. Использование в практике. Горизонты биофизики. ОНТИНЦБИ., Пущшо, 2003, 147-154.

28. Кондрашова М.Н., Григоренко Е.В. Проявления стресса на уровне митохондрий, их стимуляция гормонами и регуляция гидроаэроионами. Журнал общей билогии, 1985, 4, 516-526.

29. Кондрашова М.Н., Бабский A.M. Изменение стимуляции дыхания адреналином в зависимости от дозы. Укр. Биох. Журн. 1986, 58, 6, 49-54.

30. Кондрашова М.Н. Взаимодействие метаболической и гормональной регуляции (биоэнергетические аспекты) В сб. Регуляторы энергетического обмена (В.А.Хазанов ред.) IX-ый Российский Национальный конгресс «Человек и лекарство», 2002, с. 16-25.

31. Клиническая цитохимия /Под ред. Ягоды А.В., Локтев Н.А., Ставрополь -2005, 485.

32. Кулинский В.И. Кунцевич А.К., Труфанова Л.В. Активация дегидрирования сукцината в печени крыс под влиянием норадреналина, цАМФ и острого охлаждения. Бюл. Эксп. Биол. Мед. 1981, №8, 33-34.

33. Курганов Б.И., Любарев А.Е. Принципы организации и функционирования микрокомпартмента метабол она. Биохимия, 1989, 54, 5, 183-191.

34. Крыжановский Г.Н. Дизрегуляционная патология. М., 2002, 96.

35. Поборский А.Н. Особенности вегетативной регуляции и цитохимического статуса лимфоцитов у детей перед началом обучения в школе. Физиология человека. 2007, 33, 1, 55-62.

36. Лецкий В.Б. Цитохимичская характеристика лейкоцитов в норме, при опухолевых и не опухолевых заболеваниях; автореф. д-ра. мед. наук. В.Б. Лецкого. Л. 1979. 45 с

37. Ленинджер А., Биохимия, пер. с англ., М., 1974.

38. Лойда 3. Госсрау Р., Шиблер Т. /В кн. под. ред. Н.Т. Райхлина. «Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. Москва. 1982,211-213.

39. Локтев Н.А. Основы количественной гистохимии. Ставрополь, 1999, 128с.

40. Любарев А.Е., Курганов Б.И. Надмолекулярная организация ферментов цикла трикарбоновых кислот. Молекулярная биология 1987, 21, 5, 1286 -1296.

41. Маевский Е.И., Розенфельд А.С., Гришина Е.В., Кондрашова М.Н. Коррекция метаболического ацидоза путем поддержания функций митохондрий. ОНТИITyufUHo. 2001.

42. Наточин Ю.В. Ионрегулирующая функция почки. Ленинград: Наука. -1976.

43. Нарциссов Р.П. Применение п нитротетразолия фиолетового для количественной цитохимии дегидрогеназ лимфоцитов человека. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1969, LVI, 5,. 85 -91.

44. Нарциссов Р.П. Цитохимия ферментов лейкоцитов в педиатрии. Дисс. Докт. Мед. Наук. М., 1970, с. 378.

45. Нарциссов Р.П. Прогностические возможности клинической цитохимии. Сов. Педиатрия. М., 1984, 267-275.5 7. Нарциссов Р.П. Митохондриальные болезни. Взгляд цитохимика. НЦЗД РАМН. 1999, с 51.

46. Петричук С.В., Шищенко В.М., Духова З.Н., Измайлова Т.Д., Семенова П.Ф., Писарева И.В., Поляков С.Д., Корнеева И.Т. Диагностические и прогностические возможности клинической цитохимии. Москва, 2005.

47. Пирс Э. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. Под ред. Португалова В.В., М. 1962, 844 845.

48. Регуляторы энергетического обмена. Клинико-фармакологические аспекты. Материалы симпозиумов на ГХ, X, XI, XII, XIII Российском Национальном конгрессе «Человек и Лекарство». В.А.Хазанов ред., Москва, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006.

49. Саакян И.Р. Вопросы медицинской химии,-1998, 44, 2, 151-157.

50. Соколов. В.В., Нарциссов Р.П., Иванова Л.А., Цитохимия ферментов в профпатологии. Москва « Медицина» 1975, 119.

51. Селье Г. Очерки об адаптационном синдроме. М., 1960, 3-17.

52. Сухоруков B.C., Ростовская В.В., Вишневский Е.Л. Показатели энергетической дисфункции почечной лоханки и мочеточника у детей с гидронефротической трансформацией. В сб. «Митохондрии в Саакян И.Р.,

53. Сухоруков B.C. Гистологический анализ митохондриальных нарушений у человека. Сборник трудов Всерос.научн.конф. «Гистологическая наука России в начале XXI века: итоги, задачи, перспективы», М., 2003, Изд-во РУДН, 177-181.

54. Тихонов В.П., Цветков В.Д., Литвинова Е.Г., Сирота Т.В., Кондрашова М.Н. Генерация отрицательных аэроионов растениниями при импульсной электрической стимуляции через почву. Физиология растений, 2004, 51 (3), 459-465.

55. Лукьянова Л. Д. Биоэнергетическая гипоксия: понятие, механизмы и способы коррекции. Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1997, 124, 9, 244-254.

56. Лукьянова Л. Д. Современные проблемы гипоксии. Вестник РАМН. 2000, 2, 3-11.

57. Литвицкий П.Ф. Патофизиология для мед. вузов в 2-х томах. 2002, ГЭОТАР., Медицина.

58. Скулачев В.П. Кислород и явления запрограммированной смерти. Первое Северинское чтение. Рос. биохим. общество, Москва, 2000.

59. Шостаковская И.В., Долиба Н.М., Бабский A.M., Кондрашова М.Н. Активация ацетилхолином окисления альфа-кетоглутарата в митохондриях печени. Укр. Биох. Журн., 1986, 58, 6, 54-61.

60. Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. (М.Н.Кондрашова, Ю.Г.Каминский, Е.И.Маевский ред.) ОНТИ Пущино, 1997.

61. Altman, F.P. Tetrazolium salt and formazans. Prog. Histochem. Cytochem. 1976, 9, 3, 1-56.

62. Asada K. Causes of Photo oxidative Stress and Amelioration of Defense Systems in Plants, Eds: С. H. Foyer, P. M. Mullineaux, Boca Raton, CRC Press, 1994, 77-104.

63. Banaclocha M. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in age-related mitochondrial neurodegenerative diseases. Med. Hypotheses. 2001, Apr., 56(4), 472-7.

64. Bonomi F., Pagani S., Cerletti P., Giori C. Modification of the thermodinamic properties of the electron transferring groups in mitochondrial succinate dehydrogenase upon binding of succinate. Eur. J. Biochem., 1983, 134, 439.

65. Beyer R.E. The participation of coenzyme Q in free radical production and antioxidation. Free Radic Biol Med. 1990;8, 6, 545-65.

66. Chance В., Hollunger G. The interaction of energy and electron transfer reactions in mitochondria. J.Biol.Chem., 1961, 236, 1453-1584.

67. Coleman P.S. in Chemical Carcinogenesis 2. (Columbano, A., ed.), Plenum Press, N.Y., 1991, 265 288.

68. Cohen BH, Gold DR. Mitochondrial cytopathy in adults: what we know so far. Cleve Clin J Med. 2001 Jul; 68(7):625-6, 629-42. Erratum in: Cleve Clin J Med 2001. Sep; 68(9):746.

69. Dogan M.D. Central angoitensin II increases biosynthesis of tyrosine hydroxylase in the rat adrenal medulla. Bioch. Bioph. Res. Comm. 2004, 313 -623.

70. Di Mauro S, Mendell J.R., Sahenk Z., Bachman D., Scarpa A., Scofield R.M., Reiner C. Fatal infantile mitochondrial myopathy and renal dysfunction due to cytochrome-c-oxidase deficiency Neurology. 1980 Aug, 30(8), 795-804

71. Fahien L.A. Kmiotek S.H. McDonald MJ. J. Biol.Chem. 1988, 263, 22, 10687-10697.

72. Jezova M. Angiotensin II AT and AT2 receptors Contribute to maintain basal adrenomedullary norepinephrine synthesis and tyrosine hydroxylase transcription. Endocrinology 2005, 144, 2092.

73. Hansford RG, Tsuchiya N, Pepe S. Mitochondria in heart ischaemia and aging. Biochem Soc Symp. 1999, 66:141-7.

74. He W., Mlao F., Lin D., Schwandner R.T., Wang Z., Gao J., Chen J-L., Tlan H., Ling L. Citric acid cycle intermediates as ligands for orphan G-protein-coupled receptors. Nature, 2004, 429, 188-193.

75. P5.Hesketh T. R., Moore J.P. Morris J. D. H., Taylor M. V., Rogers J., Smith G., Metcalfe J. C. A common seguence of calcium and pH signals in the mitogenic stimulation of eukaryotic cells. Nature. 1985. 313. 481-484.

76. Grinstein S., Goetz J.D. Control of free cytoplasmic calcium by intracellular pH in rat lymphocytes.Biochim Biophys Acta. 1985 Oct 10;819(2):267-70.

77. Guneral, F. and Bachmann, C. Age-Related referece values for urinary organic acids in a healthy Turkish pediatric population. Clin Chem., 1994, 40, 862 -868.

78. Geiszt, M. Cardiovasc. Res, 2006, 71 (2), 289-293.

79. Kazakof, R.E., Litvinova, E.G., Venediktova, N.I., and Kondrashova, M.N. (2006) Bioch. Bioph. Acta. Suppl., 14, P 2.2.19.

80. Kondrashova M.N. Biochemical cycle of excitation. InrBiological and Biochemical Oscillators. Academic Press, New York-London, B. Chance Editor, 1973, 373-389.

81. Kondrashova M.N., Grigorenko E.V., Kosenko E.A. Rapid cycle of substrate oxidation under activation of energy metabolism. The 5th EBEC, 1988, Aberysthwith, 287.

82. Kondrashova M.N., Gogvadze V.G., Babsky A.M. Succinic acid as the only1 Q |energy support of intesive Ca uptake by mitochondria. Bioch. Bioph. Res. Comm. 1982, 109, 2, 376-381.

83. Kondrashova M.N., Doliba N.M. Polarographic observation of substrate-level phosphorylation and its stimulation by acetylcholine. FEBS Lett 1989, 243, 153-155.

84. Kondrashova M.N., Kuznetzova G.D. Succinic acid as a physiological signal molecule. Manchester University Press, Manchester, New York, 1991, 295.

85. Kondrashova M.N. Mechanisms of physiological activity and curative effect of small doses of succinic(amber) acid. Eur.J.Med.Res. 2000, 5, 28.

86. Kondrashova M.N. Perspective of medical treatment with amber (succinic) acid in homeopathic doses. Mitochondrion 2002, 1, 522.

87. Kondrashov F.A., Koonin E.V., Morgunov I.G., Finogenova T.V., and Kondrashova M.N. 2006, Biology Direct, 1, 31 (http://www.biology-direct.com/content/1/1/3 П.

88. Luft R. The development of mitochondrial medicine. Proc. Natl Acad. Sci., USA. 1994 Sep., 13, 91(19), 8731-8.

89. Lehninger. Principles of biochemistry. David L. Nelson., M.M. Cox. Worth publishers.2000.

90. Maevsky E.I., Guzar I.B., Rosenfeld A.S., Kondrashova M.N. Doesn't succinic acid mediate adrenaline stimulation in mitochondria? EBEC Reports. LBTM-CNRS, Lyon. 2, 1982, 537.

91. Maevsky E.I., Rosenfeld A.S., Peskov A.B., Kondrashova M.N. Signal, sympathetic action of succinate in experimental and clinical studies. BBA, Suppl.v.14, 14thEBEC Short Reports, 2006, 536-537.

92. Morgunov, I.G., Kondrashova, M.N., Kamzolova, S.V., Sokolov, A.P., Fedotcheva, N.I., and Finogenova, T.V. Evidence of the glioxylate cycle in the liver of newborn rats. Med Sci Monit., 2005, 11, 57 60.

93. Muller, H., Kondrashova, M.N. Quantenmedizin melodishes licht gegen alterungund Zellschadigung. 2006, Raum/Zeit, 143, 75-77.

94. Nachlas M.M., Tsou K.C., De Souza E., Cheng C.S., and Seligman A.M. Cytochemical demonstration of Succinic dehydrogenase by the use of a new p-nitrophenil substituted ditetrazole. J. Histochem. Cytochem., 1957, 5(4), 42036.

95. Nachlas M.M., Walker D.G., Seligman A.M. J. Biophys. Bioche. Cytol., 1958, 4, 29-38.

96. Quaglino, D and Hayhoe, F.G. J. Acetone fixation for the cytochemical demonstration of dehydrogenasee in blood and bone marrow cells. // Nature. 1960, Jul 2; 187:85-6

97. Park J. B, Exp. Mol. Med. 2003, 35 (5), 1563.

98. Popov, V.N., Igamberdiev,A.U., Schnarrenberger, C., and Volvenkin, S.V. FEBS Lett., 1996, 390, 258 60.

99. Pollard P.J., Wortham N.C., Tomlinson I.PM. The TCA cycle and tumorogenesis:the examples of fumarate hydratase and succinate dehydrogenase. Ann Medicine, 2003, 35, 632-639.

100. Pouyssegur J., Franchi A.L., Allemain G., Paris S. Cytoplasmic pH, a key determinant of growth factor- induced DNA synthesis in guiescent fibroblasts // FEBS Lett. 1985. V. 190, 115-119.

101. Pouyssegur J., Sardet C., Franchi C., L Allemain G., Paris S. A specific mutation adolishing Na/ H antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH // Proc.Nat. Acad. Sci. USA. 1984, 81. 4833 -4837.

102. Pepe S. Mitochondrial function in ischaemia and reperfusion of the ageing heart. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2000 Sep., 27(9), 745-50.

103. Rustin P., Munnich A., Rotig A., Succinate dehydrogenase and human diseases: new insights into a well-known enzyme. Eur. J. Human Genetics, 2002, 10, 289-291.

104. Samokhvalov V.N., Ignatov V.A, Kondrashova M.N. Inhibition of Krebs cycle and activation of glyoxylate cycle in the course of chronological aging of Saccharomyces cerevisiae. Compensatory role of succinate oxidation. Biochimie. 2004, 86, 39-46.

105. Sastre J, Pallardo FV, Vina J. Mitochondrial oxidative stress plays a key role in aging and apoptosis. IUBMB Life. 2000, May; 49(5), 427-35.

106. Sinhorin V.D.G., Roehrs C., Pasin J.S.M., Belle N.A.V., Rubin M.A., Mello C.F.,. Succinate causes oxidative damage through N-methyl-D- aspartate-mediated mechanisms. Brain Res., 2005, 1051, 66-71.

107. Sivaramakrishnan S., Ramasarma T. Activation of succinate dehyrogenase in brown adipose tissue mitochondria. Indian Jornal of Biochemistry biophysics, February 1978, 15. 14-18.

108. Sivaramakrishnan S., Ramasarma T. Noradrenaline stimulates succinate dehudrogenase through (3 adrenergic receptors. Indian Jornal of Biochemistry biophysics. February 1983. V. 20. 16-22.

109. Sivaramakrishnan S., Panini S. R., Ramasarma T. Activation of succinate dehydrogenase in isolated mitochondria by noradrenaline. Indian Jornal of Biochemistry biophysics. February. 1983. V. 20. P. 23-28.

110. Singer T.P., Kearney E.B., Kenney W.C. Succinate dehydrogenase, в кн.: Advances in Enzymology and related subjects of biochemistry, N. Y., 1973, 37.

111. Srere P.A. in; Organized multienzyme systems: catalytic properties/ Welch G.R., ed. N.Y., Acad.Press, 1985, 89 127.

112. Sugrue M., Tatton W. Mitochondrial membrane potential in aging cells. Biol Signals Recept. 2001 May-Aug., 10(3-4), 176-88.

113. Turrens J.F. Superoxide production by the mitochondrial respiratory chain. Bioscience Reports, 1997, 17, 1,3-8.

114. Ward D.S, Evenson K.R, Vaughn A., Rodgers A.B., Troiano R.P. Accelerometer use in physical activity: best practices and research recommendations. Med Sci Sports Exerc. 2005,Nov, 37(11 Suppl), 582-8.

115. Wojtczak A.B. Inhibitory action of oxalacetate on succinate oxidation in rat liver mitochondria and the mechanism of its reversal. Bioch.Biophys. Acta, 1969. 172, 1, 52-65.1201. Благодарности.

116. Выражаю глубокую признательность д.м.н. проф. Зав. лаб. Евгению Ильичу Маевскому за консультации по вопросам статистики, весьма ценные советы по нестандартным методам оценки результатов.

117. Выражаю благодарность за помощь в экспериментальной работе с животными, работе с видео микроскопией, при компьютерной обработке видеоизображений сотрудникам нашей лаборатории Марине Владимировне Захарченко и Андрею Владимировичу Захарченко.

118. Глубоко признательна сотрудникам института микробиологии (ИБФМ) г. Пущино к.б.н. Игорю Григорьевичу Моргунову за ценное обсуждение функционирования глиоксилатного цикла у новорожденных и д.б.н. проф.

119. Татьяне Васильевне Финогеновой автору природного препарата изолимонной кислоты, за любезно предоставленную ИЗЛ для исследований.

120. Хочу выразить особую благодарность Директору завода «Диод» Владимиру Петровичу Тихонову за многолетнюю финансовую поддержку нашей лаборатории, которая была очень необходима при проведении этой работы.

121. Сердечная благодарность моей семье супругу Хундерякову Александру Евгеньевичу и маме Бутяновой Розе Алексеевне за всестороннюю помощь.