Разработка масс-спектрометрического метода оценки содержания белков без использования изотопных меток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Копылов, Артур Тигранович

• Копылов, Артур Тигранович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Копылов, Артур Тигранович

1 Определение и постановка цели и задач проводимой работы. 8 Актуальность работы в фундаментальном и прикладном аспектах

2 Литературный обзор по современным метолам и достижениям в 11 относительной и абсолютной количественной протеомике

2.1 Краткая история развития количественной протеомики, важность и 12 области применения количественного анализа (медицина, фармакология, криминалистика, наркология, диагностика заболеваний)

2.2 Химические методы изотопного мечения в количественной протеомики

2.2.1 ICAT (сайт-специфическое мечение по цистеинам)

2.2.2 ICROS (метионин- и цистеин специфичное мечение)Теория масс- 21 спектрометрического количественного анализа, его возможности, достоинства и недостатки

2.2.3 Гуанидирование (лизин-специфичное мечение)

2.2.4 Изотопное мечение по лизину и свободным NH2-rpynnaM

2.2.5 Твердофазное изотопное мечение (лейцин) SIT

2.3 Ферментативное С-концевое (160/18Ь) мечение белков.

2.4 Изотопное мечение белков в культуре клеток SILAC

2.4.1 SILAC с изотопными аминокислотами в культуральной среде 2.4.2 SILAC с изотопными атомами 14N/15N в культуральной среде

2.4.3 SILAC с изотопными атомами 12С/13С в культуральной среде

2.5 Метод количественной оценки на уровне MS/MS. iTRAQ (изобарное 36 аминомечение)

2.6 Количественная масс-спектрометрическая оценка посттрансляционных 38 модификаций белков

2.6.1 Фосфопротеомика

2.6.1.1 IMAC-металлоаффинная хроматография

2.6.1.2 Метод без использования изотопной метки. Мультипротеазный подход

2.6.2 Гликопротеомика

2.6.2.1 Дериватизация и изотопное мечение з[0]-аргинином

2.6.2.2 Твердофазное изотопное мечение (SIT)

2.6.2.3 Метод без использования изотопной метки. Изучение О- 47 сульфатированных форм серина и треонина

2.6.2.4 Фронтальная аффинная хроматография (FAC)

2.7 Абсолютый количественный анализ белков и фосфопротеинов методом 49 тандемной масс-спектрометрии

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка масс-спектрометрического метода оценки содержания белков без использования изотопных меток»

5.2 Необходимость безметковых методов количественной протеомики с 124 использованием масс-спектрометрии

5.3 Оптимизация приборно-измерительной базы и ограничения методов 125 количественной протеомики

5.4 Сложности в обработке данных количественной масс-спектрометрии 127

5.5 Линейность зависимости масс-спектрометрического сигнала от 128 концентрации пептидов и динамические диапазоны детекции

5.6 Верификация гипотезы о линейной зависимости между интенсивностью 134 масс-спектрометрического сигнала и концентрацией пептидов общепринятыми методами относительной количественной протеомики

6 Выводы 138

7 Заключение 139 Список цитируемой литературы 141 Приложение 156

1. ВВЕДЕНИЕ. Определение и постановка цели и задач проводимой работы.

Актуальность работы в фундаментальном и прикладном аспектах.

Протекание любого биологического процесса неразрывно сопровождается изменениями химического состава клетки и биологических жидкостей. Изучение таких динамических изменений в белковом составе является основной задачей протеомных исследований, оказывающих неоценимый вклад в фундаментальное понимание биологических процессов и применении новых методов в диагностике и лечении. Самое популярное решение этих вопросов протекает через сравнительный анализ белков в протеоме, содержание которых может меняться в ответ на какие-либо воздействия химического или физиологического характера. Именно такие изменения в клеточном составе представляют собой наибольший интерес для дальнейших исследований. С ростом потребности в этих результатов к протеомике все больше предъявляются требования количественно оценки изменений. Однако из-за значительных технических и методических ограничений масс-спектрометрия, которая является основным инструментарием современной протеомики, не способна осуществлять количественную оценку непосредственно. Для решения этой проблемы со временем были разработаны методы относительной количественной протеомики с использованием стабильных тяжелых изотопов кислорода, углерода, азота и дейтерия. Эти тяжелые атомы включались в состав пептидов или белков, либо замещали их легкие аналоги в некоторых случаях, тем самым смещая действительную молекулярную массу пептида в большую сторону. Сравнивая площади под пиками пептидов одинакового химического состава, но с различным содержанием тяжелых изотопов, ученые научились проводить количественную оценку белков в организмах различного состояния. С течением времени исследователи обнаруживали все больше недостатков в методах количественной оценки с использованием различных изотопов. Прежде всего, ограниченная специфичность меток: многие из них были направлены на связывание с тиольной группой аминокислотного остатка цистеина. Это вызывало дополнительные трудности и расходы, связанные с необходимостью максимально полного восстановления цистеинов в процессе пробоподготовки, что также увеличивало время всего эксперимента. Белки с малым содержанием цистеинов или их отсутствием в первичной цепи, или отсутствие цистеинов в доступных для протеолиза пептидах, полностью исключались из количественной оценки. Метод метаболического изотопного мечения был доступен только для использования в культуре клеток in vitro или для простейших организмов. Изотопное мечение тяжелыми атомами кислорода 180 в ходе реакции гидролитического расщепления трипсином требовало масс-спектрометров с высоким разрешением, чтобы не допустить перекрывания изотопного распределения с меткой. Все это не могло оставаться без внимания исследователей, так как дальнейшее развитие количественной оценки с использованием различных меток и внутренних стандартов все больше заводило в тупик.

Однако за последнюю декаду лет многие ученые стали обращать внимание на принципиально новый подход в количественной протеомике - без использования меток. Выявление и изучение закономерностей зависимости между сигналом масс-спектрометра и количеством измеряемого белка дали толчок бурному развитию двух основных направлений количественной протеомики без использования меток: более раннее из них, так называемый count-based, основан на корреляции суммарного индекса достоверности идентификации белка по всем зафиксированным в ходе эксперимента пептидам. Второе направление, более молодое, но более перспективное - intensity-based - основывается на существовании зависимости между уровнем усредненной суммы масс-спектрометрических сигналов пептидов, принадлежащих одному белку, и его содержанием в биологической пробе. В наши дни еще остается достаточно скептиков, утверждающих о невозможности корректной количественной оценки такими подходами. Но оба направления претерпевают бурное развитие и имеют все перспективы вытеснить в недалеком будущем количественные методы на основе использования тяжелых изотопных атомов.

Настоящей работой мы внесли вклад в развитие безметковой количественной протеомики с применением масс-спектрометрии. Нами была выявлена и доказано существование зависимости уровня ответного масс-спектрометрического сигнала от содержания белка в пробе, детально исследована математическая основа зависимости на индивидуальных белках и на белковых смесях; показаны особенности поведения кривой зависимости, связанные с числом индивидуальных пептидов одного белка и их сочетанием. Выявлены влияние скорости потока наноэлектроспрея на линейность кривой зависимости и на уровень интенсивности в отдельных точках и элементах кривой. На основе данных подходов разработан и охарактеризован новый метод количественного протеомного анализа без использования меток с включением изотопов атомов с применением масс-спектрометрии.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в разработке метода количественной оценки содержания белков без использования меток.

1. Выявить наличие и характер зависимости между уровнем масс-спектрометрического сигнала и концентрацией растворов 8 индивидуальных белков и их смесей. Определить концентрационные интервалы, в рамках которых проявляется зависимость масс-спектральной интенсивности от концентрации.

2. Определить условия линейности зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации триптических пептидов анализируемого белка в пробе.

3. Выявить влияние скорости потока наноэлектроспрея на зависимость интенсивности масс-спектрометрического сигнала от концентрации для указанных белков виде чистого препарата и в смеси.

4. Оценить эффективность разработанного метода путем его использования для количественной оценки белка MUP3 в пробе микросом ткани печени мыши.

Научная новизна работы. В диссертации разработан и охарактеризован метод количественного протеомного анализа без использования меток с включением тяжелых изотопов. Для этого приведена подробная доказательная база существования линейной корреляции уровня ответного масс-спектрометрического сигнала от концентрации анализируемого белка. Показано, что границы корреляции для количественного анализа с использованием масс-спектрометра типа ионной ловушки составляют от 1 fM до 1 рМ. Показано, что данная зависимость сохраняет характеристики линейности в условиях чистого препарата и в смеси белков и не зависит от физико-химических свойств белка, его функциональной принадлежности и организма происхождения. Впервые показано, что для соблюдения линейности необходимо наличие минимум трех различных достоверно идентифицированных пептидов, принадлежащих одному белку, и присутствие которых прослеживается на протяжении всего исследуемого концентрационного диапазона. Такие пептиды формируют интегрированную базовую кривую зависимости, свойства которой не зависят от сочетания базовых пептидов. Нами также были подобраны оптимальные условия скорости потока наноэлектроспрея применимые для поведения количественной оценки белков на ионных ловушках.

Практическая значимость работы. В работе показано, что разработанный нами метод позволяет эффективно решать поставленные проблемы в количественной протеомики для оценки содержания белковых компонентов в биологических пробах и в чистых препаратах без использования химических или метаболических меток, содержащих атомы тяжелых изотопов. Разработан общий подход к оптимизации условий метода количественной оценки белков с использованием масс-спектрометрии на примере ионной ловушки и нормализации и выравниванию данных для эффективного выявления линейности зависимости масс-спектрометрической интенсивности ответного сигнала от концентрации анализируемого белка в чистом препарате и в смеси белков.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Копылов, Артур Тигранович

6. выводы

В соответствии с поставленными задачами к разработке безметкового метода количественной оценки содержания белков в масс-спектрометрии по результатам работы нами были сделаны следующие выводы:

1. С использованием 8 модельных белков выявлено наличие зависимости масс-спектральной интенсивности их трипсиновых пептидов от концентрации белков в исходном образце. Данная зависимость определяется линейным характером с коэффициентом корреляции Пирсона от 0,96 до 0,99. Границы линейной зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации белка находятся в пределах от 1 нМ до 1 мкМ при использовании электроспрейной ионизации и ионной ловушки в качестве детектора. Линейность зависимости справедлива для изолированных белков и для белков в смесях

2. Для соблюдения линейной зависимости между концентрацией белков и масс-спектральной интенсивностью их трипсиновых пептидов необходимо выполнения условия регистрации спектров четырех уникальных пептидов, принадлежащих одному белку. Присутствие таких пептидов должно прослеживаться на протяжении всего исследуемого концентрационного диапазона.

3. Скорость потока наноэлектроспрея и ICC (контроль потока ионов) воздействуют на свойства зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации. Оптимальной скоростью потока для поддержания линейной зависимости в диапазоне 0,001-1 мкМ является 0,3 мкл/мин.

4. Эффективность безметкового метода количественной оценки содержания белков была подтверждена альтернативными методами количественной протеомики. При сравнении с методом AQUA (абсолютная количественная оценка) совпадение результатов количественной оценки белка MUP3 в микросомах печени мыши составляет 87-92 %. При сравнении результатов безметкового количественного анализа с результатами, полученными методом количественной оценки с использованием изотопов атомов [180], совпадение результатов составляет 84-88 %.

7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Подводя итоги всему вышесказанному и результатам проведенной работы, можно сказать, что в данной работе нами была подтверждена и проверена на практике возможность осуществления количественного анализа содержания белков в биологических пробах без использования меток, содержащих атомы изотопов, с применением масс-спектрометрии. В работе были детально изучены закономерность зависимости масс-спектральной интенсивности сигнала от концентрации белка в пробе, приведена доказательная база линейности корреляции. Многие эксперименты направлены на выявление факторов, способных оказывать возможное влияние на линейность зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации: скорость потока наноэлектроспрея, использование режима ICC, алгоритма нормирования данных, физико-химические свойства изучаемых экспериментальных белков. В работе также выяснены некоторые особенности поведения линейной зависимости на различных участках концентраций, определены пределы чувствительности, в рамках которых сохраняется линейность корреляции. Проведено сравнение эффективности безметкового метода для исследования чистых препаратов белков и белковых смесей.

Показано, что для соблюдения линейности зависимости интенсивности масс-спектрометрического сигнала от концентрации белка в пробе необходимо наличие как минимум четырех уникальных идентифицированных пептидов, принадлежащих одному белку, которые формируют базовую кривую зависимости масс-спектральной интенсивности сигнала от концентрации, характерную для общей совокупности всех пептидов данного белка, идентифицированных в ходе количественного анализа. При этом, данные пептиды должны прослеживаться на протяжении всего интересуемого диапазона предполагаемых концентраций и имеют ограничения по индексу достоверности идентификации - не менее 6,0 (Spectrum Mill Agilent) для каждого; это правило сохраняется как для белков в виде чистого препарата, так и для белковых смесей. Также показано, что каждый белок обладает характеристическим для него значением тангенса наклона зависимости масс-спектральной интенсивности от концентрации. Данная величина не зависит от присутствия сторонних белков в пробе и от природы самого белка и изменяется в незначительных пределах в условиях чистого препарата и белковой смеси. В литературных источниках отсутствуют упоминания о таких деталях линейности зависимости и особенностях поведения белков. Эти факты отличают данную работу своей новизной от всех остальных подобных исследований, посвященных тематике количественной протеомики без использования меток.

Актуальность количественной протеомики в современной науке неоспорима. Данные количественной протеомики необходимы в медицине, токсикологии, криминалистике и многих других исследованиях, охватывающих широкий спектр прикладной и фундаментальной науки. Утверждение безметковых методов количественной протеомики в своей достоверности и эффективности поможет в значительной степени облегчить условия исследований, снизить их стоимость, сократить время и трудоемкость экспериментальной работы. Результаты данной работы и сравнение данных с общепринятыми методами относительной и абсолютной количественной протеомики (AQUA, мечение атомами [180] в ходе трипсинолиза) свидетельствуют в пользу возможности осуществления количественной оценки белков в биологических пробах без использования химических меток, содержащих изотопные атомы. Динамические диапазоны концентраций, которые охватываются в данной работе, сопоставимы с таковыми для иммуноблоттинга, ELISA и многих методов относительной количественной протеомики с использованием масс-спектрометрии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Копылов, Артур Тигранович, 2009 год

1. Patton, W.F. Detection technologies in proteome analysis. 11 J. Chromatography B.2002.- 771.-P.3-31.

2. Unlu, M., Morgan, E., Minden, J.S. Difference gel electrophoresis: a single gel method for detecting changes in protein extracts // Electrophoresis. -1997. -18. P.2071-2077.

3. Freeman, W.M., Hemby, S.E. Proteomics for protein expression profiling in neuroscience // Neurochem. Res. 2004. - 29. - P.1065-1089.

4. Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. // Proteomics. 2002. - 2 (1). - P.3-10.

5. Opitek, G.J., Ramirez, S.M., Jorgenson, J.W., Moseley, M.A. Comprehensive two-dimensional high-performance liquid chromatography for the isolation of overexpressed proteins and proteome mapping 11 Anal Biochem. 1998.- 258. - P.349-361.

6. Zhang, Z.L., Smith, D.L., Smith, J.B. Multiple separations facilitate identification of protein variants by mass spectrometry // Proteomics. 2001. -1. - P.1001-1009.

7. Feng, B.B., Patel, A.H., Keller, P.M., Slemmon, J.R. Fast characterization of intact proteins using a high-throughput eight-channel parallel liquid chromatography/mass spectrometry system // Rapid Commun. Mass Spectom. 2001. - 15. - P.821-826.

8. Krapfenbauer, К., Fountoulakis, M., Lubec, G. A rat brain protein expression map including cytosolic and enriched mitochondrial and microsomal fractions. // Electrophoresis. 2003. - 24. - P.1847-1870.

9. El Rassi, Z., Horvath, C. Tandem columns and mixed-bed columns in high-performance liquid chromatography of proteins // J. Chromatogr B. 1986. - 359. - P.255-264.

10. Gerber, S.A., Rush, J., Stemman, O., Kirschner, M.W., Gygi, S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS // Proc. Nat Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, №12. - P.6940-6945.

11. Oda, Y., Huang, K., Cross, F.R., Cowburn, D., Chait, B.T. Accurate quantitation of protein expression and site-specific phosphorylation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1999. 96. -P.6591-6596.

12. Gygi, S.P., Rist, В., Gerber, S.A., Turecek, F., Gelb, M.H., Aebersold, R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags// Nat.Biotechnol. -1999.- 17. P.994-999.

13. Wang, S., Regnier, F.E. Proteomics based on selecting and quantifying cysteine containing peptides by covalent chromatography // J. Chromatogr. A 2001. - 924. -P.345-357.

14. Flory, M.R., Griffin, T.J., Martin, D., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics using stable isotope tags // Trends in Biotechnology. 2002. - Vol. 20, №12. - P.S23-S29.

15. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics 11 Nature. 2003. - 422. -198-207.

16. Peng, J., Gygi, S.P Proteomics: the move to mixtures I I J Mass Spectro. 2001. - 36. -P.1083-1091.

17. Leither, A., Under, W. Predictive value of seven preoperative prognostic scoring systems for spinal metastases. // Proteomics. 2006. - 6. - P.5418-5434.

18. Hansen, К.С., Schmitt-Ulms, G., Chakley, F, Hirsch. Mass spectrometric analysis of protein mixtures at low levels using cleavable 13C-isotope-coded affinity tag and multidimensional chromatography // J. Mol. Cell. Proteomics. 2003. - 2. - P.299-314.

19. Li, J., Steen, H., Gygi, S.P. Protein profiling with cleavable isotope-coded affinity tag (cICAT) reagents: the yeast salinity stress response // J Mol. Cell. Proteomics, 2003. -2.-P.1198-1204.

20. Oda, Y., Owa, Т., Sato, Т., Boucher, B. Quantitative chemical proteomics for identifying candidate drug targets //Anal. Chem. 2003. - 75. - P.2159-2165.

21. Yu, L.-R., Conrads, T.P., Uo, Т., Isaaq, H.J. Evaluation of the acid-cleavable isotope-coded affinity tag reagents: application to camptothecin-treated cortical neurons. // J. Proteome Res. -2004. 3. - P.469-477.

22. Parker, K.C., Pattern, D., Williamson, В., Marches, J. Depth of proteome issues: a yeast isotope-coded affinity tag reagent study. // Mol. Cell. Proteomics. 2004. - 3. - P.625-659.

23. Sethuraman, M., McComb, M.E., Heibeck, Т., Costello, C.E., Cohen, R.A. Isotope-coded affinity tag approach to identify and quantify oxidant-sensitive protein thiols. // Mol. Cell. Proteomics. 2004. - 3. - P.273-278.

24. Dunkley, T.P.J., Watson, R., Griffin, J.L., Dupree, P., Lilley, K.S. Localization of organelle proteins by isotope tagging (LOPIT) // Mol. Cell. Proteomics. 2004. - 3. - P.1128-1134.

25. Li, K.W., Hornshaw, M.P., van Minnen, J., Smalla, K.-H. Proteomics of the injured rat sciatic nerve reveals protein expression dynamics during regeneration // Proteome Res. -2005.-4.- P.725-733.

26. Ranish, J.A., Yi, E.C., Leslie, D.M., Purvine, S.O., Goodlet, D.R. Eng, J., Aebersold, R. The study of macromolecular complexes by quantitative proteomics // Nature Genetics. -2003. Vol.33, №3. - P.349-355.

27. Wang, S., Regnier, F.E. Proteomics based on selecting and quantifying cysteine containing peptides by covalent chromatography // J. Chromatogr A. 2001. - 924. -P.345-357.

28. Zhou, H., Ranish, J.A., Watts, J.D., Aebersold, R. Quantitative proteome analysis by solid-phase isotope tagging and mass spectrometry // Nature Biotechnology. 2002. - 19.-P.512-515.

29. Zhang, H., Li, X.-J., Martin, D.B., Aebersold, R. Identification and quantification of relinked glycoproteins using hydrazide chemistry, stable isotope labeling and mass spectrometry // Nature Biotechnology. 2003. - Vol 21, №6. - P.660-666.

30. Spirson, D.B., Rittenberg, D. // Nature. -1951. -167. p.484-484,

31. Desidero, D.M., Kai, M. Preparation of stable isotope-incorporated peptide internal standards for field desorption mass spectrometry quantification of peptides in biologic tissue // Biomed. Mass Spectrum. -1983. 10. - P.471-479.

32. Stewart, 1.1., Thomson, Т., Figeys, D. 180 labeling: a tool for proteomics //Rapid Comm. Mass Spectrom. 2001. - 15. - P.2456-2465.

33. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J, Dmitriev, P.A., Fenselau, C. Proteolytic 180 labeling for comparative proteomics: model studies with two serotypes of adenoviru // Anal Chem. -2001.-73.-P.2836-2842.

34. Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 180 labeling: endoprotease-catalyzed 160-to-180 exchange of truncated peptide substrates // J. Proteome Res.2003.-2.-P.147-152.

35. Lopez-Ferrer, D., Ramos-Fernandes, A., Martinez-Bartolome, S., Garcia-Ruiz, P., Vaskez, J. // Proteomics. 2006. - 6. - P.S4-S11.

36. Zang, L„ Palmer, T.D., Hancock, W.S., Sgroi, D.C., Karger, B.L. 11 J. Proteome Res. 2004.3. P.604-612.

37. Bantscheff, M., Dumpelfeld, В., Kuster, B. Femtomol sensitivity post-digest (18)0 labeling for relative quantification of differential protein complex composition // Rapid Comm. Mass Spectrum. 2004. - 18. - P.869-876.

38. Staes, A., Demol, H., Van Damm, J., Martens, L. Global differential non-gel proteomics by quantitative and stable labeling of tryptic peptides with oxygen-18 // J. Proteome Res.2004.-3.- P.786-791.

39. Ong, S.-E., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative. // Nature Chem. Biology. 2005. - Vol. 1, №5. - P.252-262.

40. Julka, 5., Regnier, F.E. Benzoyl derivatization as a method to improve retention of hydrophilic peptides in tryptic peptide mapping // J. Proteome Res. 2004. - 3. - P.350-363.

41. Rao, K.C., Carruth, R.T., Miyagi, M. Proteolytic 180 labeling by peptidyl-Lys metalloendopeptidase for comparative proteomics. // J. Proteome Res. 2005. - 4. -P.507-514.

42. Hajkova, D., Rao, K.S.C., Miyagi, M. pH dependency of the carboxyl oxygen exchange reaction catalyzed by lysyl endopeptidase and trypsin //J. Proteome. Res. 2006. - 5. -P.1667-1673.

43. Brown, K.J., Fenselau, C. nvestigation of doxorubicin resistance in MCF-7 breast cancer cells using shot-gun comparative proteomics with proteolytic 180 labeling // J. Proteome Res. 2004. - 3. - P.455-462.

44. Chen, X., Cushman, S.W., Panel, L.K., Hess, S. Quantitative proteomic analysis of the secretory proteins from rat adipose cells using a 2D liquid chromatography-MS/MS approach //J. Proteome Res. 2005. - 4. - P.570-577.

45. Foster, L.J., de Hoog, C.L., Mann, M. Unbiased quantitative proteomics of lipid rafts reveals high specificity for signaling factors // Proceed. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, №10. - P.5813-5818.

46. Schlosser ,A., Amanchy ,R., Otto ,H. Identification of tyrosine-phosphorylation sites in the nuclear membrane protein emerin // FEBS. 2006. - 273. - P.3204-3215.

47. Everley, P.A., Krijgsveld, J., Zetter, B.R., Gygi, S.P. Quantitative cancer proteomics: stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) as a tool for prostate cancer research // Mol. Cell. Proteomics. 2004. - 3. - P.729-735.

48. Karimi-Busheri, F., Daly, G., Robins, P., Canas, В., Pappin, D.J., Sgouros, J., Miller, G.G., Fakhrai, H., Davis, E.M., Le Beau, M.M., Weinfeld, M. Molecular characterization of a human DNA kinase //J. Biol. Chem. -1999. 274. - P.24187-24194.

49. Hoss, M., Robins, P., Naven, T.J.P., Pappin, D.J.C., Sgorous, J., Lindahl, D.A. // 1999. -EMBOJ. 18. - P.3868-3875.

50. Mann, M., Jensen, O.N. Proteomic analysis of post-translational modifications // Nature Biotechnology. 2003. - Vol. 21, №3. - P.255-261.

51. Larsen, M.R., Larsen, P.M., Fay, S.J., Roepstoff, P. Characterization of differently processed forms of enolase 2 from Saccharomyces cerevisiae by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry // Electrophoresis. 2001. - 22. -P.566-575.

52. Loyet, K.M., Stults, J.T., Arnott, D. Mass spectrometric contributions to the practice of phosphorylation site mapping through 2003: a literature review // Mol. Cell. Proteomics. -2005.- 4.-P.235-245.

53. Zubarev, R.A., Kelleher, N.L., McLafferty, F.W. Two-dimensional mass spectrometry of biomolecules at the subfemtomole level // Curr Opinion Mol Biol. 1998. -Vol.2, №5. -P.571-578.

54. Syka, J.E., Coon, J.J., Schroeder, M.J., Shabanowitz, J., Hunt, D.F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. -101. - P.9528-9533.

55. Huang, S.-Y., Tsai, M.-L., Wu, C.-J., Hsu, J.-L., Ho, S.-H., Chen, S.-H. Quantitation of protein phosphorylation in pregnant rat uteri using stable isotope dimethyl labeling coupled with IMAC // Proteomics. 2006. - 6. - P.1722-1734.

56. Posewitz, M.C., Tempst, P. Immobilized gallium(lll) affinity chromatography of phosphopeptides 11 Anal Chem. -1999. 71. - P.2883-2892.

57. Huang, C.M., Foster, K.W., DeSilva, D., Zhang, J., Zhi, Z., Yusuf, N., Van Kampen, K.R., Elmets, C.A., Tang, D.C. Comparative proteomic profiling of murine skin //J. Investig. Dermatol. 2003. - 121. - P.51-64.

58. Takahashi, N., Nakagawa, H., Fujikawa, K.; Kawamura, Y., Tomiya, N. hree-dimensional elution mapping of pyridylaminated N-linked neutral and sialyl oligosaccharides. //Anal. Biochem. -1995. 226. - P.139-146.

59. Yamamoto, S., Hase, S., Fukuda, S., Sano, 0., Ikenaka, T, Structures of the sugar chains of interferon-gamma produced by human myelomonocyte cell line HBL-38 //J. Biochem .-1989.-105.-P.547-555.

60. Strott, C.A. Sulfonation and molecular action. // Endocr. Rev. 2002. - 23. - 703-732.

61. Robbins, P., Lippman, F. Enzymatic synthesis of adenosine-5'-phosphosulfate // J Biol Chem. 1958. - Vol.233, №3. - P.681-685.

62. Kasai, K, Ishii, S. Quantitative analysis of affinity chromatography of trypsin. A new technique for investigation of protein-ligand interaction. //J Biochem (Tokyo). 1975. -77. - P.261-264.

63. Zhang, B, Palcic, M.M, Schriemer, D.C, Alvarez-Manilla, G., Pierce, M., Hindsgaul, O. Frontal affinity chromatography coupled to mass spectrometry for screening mixtures of enzyme inhibitors //Anal Biochem. 2001. - 299. - P.173-182.

64. Hirabayashi, J., Arata, Y., Kasai, K. Reinforcement of frontal affinity chromatography for effective analysis of lectin-oligosaccharide interactions. // J Chromatogr A. 2000. -890. - P.261—271.

65. Gerber, S.A., Rush, J„ Stemmen, 0., Kirschner, M.W., Gygi, S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2003. - Vol. 100, №12. - P.6940-6945.

66. Hase S., Ibuki Т., Ikenaka T. Reexamination of the pyridylamination used for fluorescence labeling of oligosaccharides and its application to glycoproteins // J Biochem (Tokyo). 1984. - 95. - P.197-203.

67. Fiehn O., Weckwerth W. Mass spectrometry: Quantitation // Meth in Mol Biol. 2006. -358. - P.3-18.

68. Stevenson S.E. Validation of gel-free, label-free quantitative proteomics approaches: application for seed allergen profiling // J. Prot. 2009. - Vol.72, №13. - P.555-566

69. Burks W. Peanut allergy: a growing phenomenon // J. Clin. Invest. 2003. - 111. -P.950—952.

70. Anderson N.L., Anderson N.G. Proteome and proteomics: new technologies, new concepts and new words // Electrophoresis. 1998. - 19. - P.1853 -1861.

71. Jennie Lill Proteomics tools for quantitayion by mass spectrometry // Mass spectrometry Reviews. 2003. - 22. - P.182-194.

72. Hacket M. Science, Marketing and wishful thinking in quantitative proteomics // Proteomics. 2008. - 8. - P.4618-4623.

73. Mann M. Quantitative proteomics? // Nature Biotechnology. -1999. Vol. 17. - P.954-955.

74. Gygi, S. P., Rist, В., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., and Aebersold,R. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. // Nat. Biotechnol. -1999. 17. - P.994-999

75. Li, X. J., Pedrioli, P. G., Eng, J., Martin, D., Yi, E. C., Lee, H., Aebersold,R. A tool to visualize and evaluate data obtained by liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry Ц Anal Chem. 2004. - 76. - P.3856-3860

76. Ono M., Shitashige M., Honda К. Label-free quantitative proteomics using large peptide data sets generated by nanoflow liquid chromatography and mass spectrometry // Mol. Cel. Proteomics. 2006. - 5. - P.1338-1347.

77. Liu H., Sadygov R.G., Yates J.R. Amodel forrandom samplingandestimation of relative protein abundance in shotgun proteomics // Anal Chem. 2004. - 76. - P.4193-4201.

78. Lu P.; Vogel.C., Wang R., Yao X., Marcotte E.M. Absolute protein expression profiling estimates the relative contributions of transcriptional and translational regulation // Nat Biotechnol. 2007. - 25. - P.117-124.

79. Sardiu M.E. Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics // Proc Natl Acad Sci USA. 2008. - Vol.105, №45.1. P.1454-1459.

80. Mann M. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy // Proc Natl Acad Sci USA. 2008.-Vol. 105, №47. - P.1832-1838.

81. Peng J., Gygi P. Proteomics: the move to mixture //7 Mass Spectrom. 2001. - 36. -P.1083-1091.

82. Comisarow M.B., Marshall A.G. The early development of Fourier transform ion resonance cyclotron spectroscopy // J Mass Spectrom. -1996. 31. - P.581-585.

83. Makarov A. Electrostatic axially harmonic orbital trapping: A high-performance technique of mass analysis // Anal Chem. 2000. - 72. - P.1156-1162.

84. Hu Q. The Orbitrap: A new mass spectrometer // J Mass Spectrom. 2005.-40. -P.430-443.

85. Panchaud A., Affolter M., Moreillon P. Experimental and computational approach to quantitative proteomics: Status Quo and outlook // J Proteomics. 2008. - 71. - P.19-33.

86. Pedrioli P.G., Eng J.K., Hubley R., Vogelzang M„ Deutsch E.W., Raught B. A common open representation of mass spectrometry data and its application to proteomics research // Nat Biotechnol. 2004. - 22. - P.1459-1466.

87. Palagi P.M., Walther D., Quadroni M., Catherinet S., Burgess J., Zimmermann-lvol C.G. MSight: an image analysis software for liquid chromatography-mass spectrometry // Proteomics. 2005. - 5. - P.2381-2384.

88. Mueller L.N., Rinner O., Schmidt A., Letarte S., Bodenmiller В., BrusniakM.Y. SuperHirn— anovel tool forhighresolution LC-MS-based peptide/protein profiling // Proteomics.2007. Vol.7, №19. - P.3470-3480.

89. Leptos K.C., Sarracino D.A., Jaffe J.D., Krastins В., Church G.M. MapQuant: open-source software for large-scale protein quantification // Proteomics. 2006. - 6. - P.1770-1782.

90. Li X.J., Yi E.C., Kemp C.J., Zhang H., Aebersold R. A software suite for the generation and comparison of peptide arrays from sets of data collected by liquid chromatography-mass spectrometry // Mol Cell Proteomics. 2005. - 4. - P.1328-1340.

91. Matthiesen R., Bunkenborg J., StensballeA., Jensen O.N.,Welinder K.G., Bauw G.Database-independent, database-dependent, and extended interpretation ofpeptidemass spectra in VEMSV2.0 // Proteomics. 2004. - 4. - P.2583-2593.

92. Gruhler A.,Olsen J.V., Mohammed S. Quantitative Phosphoproteomics applied to yeast pheromone signaling pathways // Mol Cell Proteomics. 2005. - 4. - P.310-327.

93. Mann В., Madera В., Sheng Q., ProteinQuant Suit: a bundle of automated software tolls for label-free quantitative proteomics // Rapid Communication in Mass Spectrometry.2008.- 22. P.3823-3834.

94. Levin Y., Schwatrz E., Wang L. Label-free quantitative LC-MS/MS proteomics for large-scale biomarkers discovery in complex samples //J. Sep. Sci. 2007. - 30. -P.2198-2203.

95. Kuhn E., Wu J., Karl J., Liao H. Quantification of C-reactive protein in serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and 13C-labeled peptide standards // Proteomics. 2004. - 4. - P.1175-1186.

96. Korf U., Derdak S., Tresch A. Quantitative protein microarrays for time-resolved measurements of protein phosphorylation // Proteomics. 2008. - 8. - P.4603-4612.

97. Kirkpatrick D., Gerbes S., Gygi S. The absolute quantification strategy: a general procedure for the quantification for proteins and post-translation modifications // Methods. 2005. - 35. - P.265-273.

98. Cutillas P., Vanhaesebroeck B. Quantitative profile of five murine core proteomes using label-free functional proteomics // Mol Cell Proteomics. 2007. - 6. - P.1560-1573.

99. Steen H., Jebanathirajah J., Springer M. Stable isotope-free relative and absolute quantification for protein phosphorylation stochiometry by MS // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. - Vol.102, №11. - P.3948-3953.

100. Ong S.-E., Mann M. Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative // Nature chemical biology. 2005. - 1. - P.252-262.

101. Old W.M., Meyer-Arendt K., Veline-Wolf L., Pierce K.G., Mendoza A., Sevinsky J.R., Resing K.A., Ahn N.G. Comparison of label-free methods for quantifying human proteins by shotgun proteomics // Mol Cell Proteomics. 2005. - 4. - P.1487-1502

102. Andreev V.P., Li L., Cao L., Gu Y., Rejtar T„ Wu S.-L. A New Algorithm Using Cross-Assignment for Label-Free Quantitation with LC/LTQ-FT MS // J Proteome research. -2007. 6. - P.2186-2194.

103. Bantscheff M., Dumpelfeld В., Kuster B. Femtomole sensitivity post-digest 180 labeling for relative quantification of different protein complex composition // Rapid Comm Mass Spec. 2004. - 18. - P.869-876.

104. Bantscheff M., Schirle M., Sweetman G., Rick J., Kuster B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review //Anal Bioanal Chem. 2007. - 389. -P.1017-1031.

105. Ischihama Y., Sato Т., Tabata T. Quantitative mouse brain proteomics using culture-derived isotope labeled tags as internal standatrds // Nat Biotech. 2005. - Vol. 23,№5. - P.617-621.

106. Oda Y., Huang K., Cross F.R., Chait B.T. Accurate quantification of protein expression and site-specific phosphorylation // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. - 96. - P.6591-6596.

107. Haqquani A., Kelly J.F., Stanimirovich D.B. // Quantitative proteins profiling by mass spectrometry using label-free proteomics. Chapter 17. P.241-56. - Springer, UK

108. Oeljeklaus S, Meyer HE, Warscheid B. Advancements in plant proteomics using quantitative mass spectrometry // J Prot. 2009. - Vol.72, №3. - P.545-554.

109. Yuzuru S., Sam D., Eugene C.Yi, Goodlett D.R., Aebersold R., Eisenman R.N. Quantitative proteomic analysis of Мус oncoprotein function // The EMBO. 2002. - Vol.19, №21. -P.5088-5096.

110. Fu C., Hu J., Liu Т., Ago Т., Sadoshima J., Li H. Quantitative Analysis of Redox-Sensitive Proteome with DIGE and ICAT// J Prot Res. 2008. - Vol. 7, №9. - P.3789-3802

111. Alterman M.A., Kornilyaev B, Duzhak Т., Yakovlev D. Quantitative analysis of cytochrome P450 isozymes by means of unique isozyme-specific tryptic peptides: a proteomic approach // Drug Metab. Dispos. 2005. - 33. - P.1399-1407.

112. Bamidge D.R., Dratz E.A., Martin Т., Bonilla L.E. Absolute quantification of the G protein-coupled receptor rhodopsin by LC/MS/MS using proteolitic product peptides and synthetic peptide standarts. //Anal. Chem. 2003. - 75. - P.445-451.

113. Ross P.L, Huang Y.N, Marchese J.N, Williamson D. Multiplexed protein quantification in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents //Mot Cell Proteomics. 2004. - 3. - P. 1154-1169.

114. Wang Y., Al-Gazzar A., Seibert C., Sharif A. Proteomic analysis of cytochromes P450: a mass-spectrometry approach // Biochem Soc Trans. 2006. - 34. - P.1246-1251.

115. Zhao Y., Lee W.N., Lim S., Go V.L., Xiao J., Cao R., Zhang H., Recker R.R., Xiao G.G. Quantitative Proteomics: Measuring Protein Synthesis Using (15)N Amino Acid Labeling in Pancreatic Cancer Cells // Anal Chem. 2009. - Vol. 81, №2. - P.764-771.

116. Simpson K.L., Whetton A.D., Dive C. Quantitative mass spectrometry-based techniques for clinical use: Biomarker identification and quantification //J Chromatogr В Analyt Technol Biomed Life Sci. 2009. - Vol.877, №13. - P.1240-1249.

117. L. Vos and R. Van Grieken. Influence of ion source geometry in spark source mass spectrometric analysis // International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. Vol. 59, №3. - 1984. - P.221-229.

118. Huang M., Hirabayashi A., Okumara A. Matrix Effect on the Analysis of Oligonucleotides by Using a Mass Spectrometer with a Sonic Spray Ionization Source // Analyt Sci. 2001. -Vol. 17, №10.-P.1179.

119. Steven L. Cohen and Brian T. Chait, Influence of Matrix Solution Conditions on the MALDI-MS Analysis of Peptides and Proteins // Anal. Chem. -1996. 68. - .P31-37.

120. Kushnir M.M., Rockwood A.L., Nelson G.J., Terry A.H., Meikle A. W. Liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of urinary free Cortisol // Clin Chem. 2003. - 49. - P.965-967.

121. Zgoda V., Tikhonova O., Viglinskaya A., Serebriakova M., Lisitsa A., Archakov A. Proteomic profiles of induced hepatotoxicity at the subcellular level // Proteomics. -2006. 6. -P. 4662-4670.