Масс-спектрометрическая идентификация белков и белковых комплексов на чипах атомно-силового микроскопа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Кайшева, Анна Леонидовна

• Кайшева, Анна Леонидовна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кайшева, Анна Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Анализ научно-технического задела в области высокочувствительных протеомных технологий

1.2 Характеристика вируса гепатита С

1.2.1 Методы диагностики гепатита С

1.2.2 Серологические белковые маркеры гепатита С

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 АСМ-чипы

2.2 Препараты белков и реактивы

2.3 АСМ-анализ

2.4 Подготовка образцов для масс-спектрометрического анализа

2.5 Масс-спектрометрический анализ

2.5.1 МАЛДИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа

2.5.2 ЭСИ-МС-анализ белков на поверхности АСМ-чипа

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 МС-идентификация белков, выловленных с помощью 35 «химического фишинга» на поверхность АСМ-чипа из раствора аналита

3.2 МС-идентификация белков, биоспецифически выловленных 44 на поверхности АСМ-чипа из раствора аналита

3.3 МС-идентификация белков на поверхности АСМ-чипа, 60 биоспецифически выловленных из образцов сыворотки крови

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Масс-спектрометрическая идентификация белков и белковых комплексов на чипах атомно-силового микроскопа»

Актуальность.

На сегодняшний день протеомика решает широкий спектр фундаментальных и прикладных задач в науке. Протеомные методы лежат в основе фундаментальных исследований белок-белковых взаимодействий, что важно в выявлении потенциальных белковых партнеров в каскадах клеточных сигнальных путей и в мультиферментных комплексах. К прикладным протеомным исследованиям относят поиск новых лекарственных мишеней, выявление маркерных белков различных заболеваний, развитие методов персонифицированной медицины. Одним из приоритетных направлений в современной биохимии является создание эффективных аналитических методов для протеомного анализа, главная задача которых заключается в обнаружении и инвентаризации белков организма, исследовании их структуры, функций, выявлении белковых взаимодействий.

Решение данной задачи позволит создать новые системы диагностики заболеваний и их лечения. Стандартные методы современного протеомного анализа базируются на разделении многокомпонентных белковых смесей с помощью хроматографии, электрофореза в комбинации с масс-спектрометрическими методами (МС) идентификации белков. При несомненном достоинстве стандартного МС-анализа в плане быстродействия и достоверности идентификации белковых молекул, он обладает существенными ограничениями применения, обусловленными низкой о о концентрационной чувствительностью анализа на уровне 10" -10" Ми высоким динамическим диапазоном содержания белков в биологическом материале. В то же время подавляющее количество функциональных белков, в том числе биомаркеры таких социально-значимых заболеваний, как вирусные гепатиты В и С, онкомаркеры и др., присутствуют в плазме крови 1 в области концентраций 10" Ми менее [1,2].

Один из путей преодоления такого методологического ограничения концентрационной чувствительности анализа заключается в использовании биомолекулярных детекторов, которые позволяют регистрировать единичные молекулы и их комплексы и теоретически не имеют ограничений концентрационной чувствительности. К биомолекулярным детекторам относятся детекторы на базе нанотехнологических устройств, таких как атомно-силовые микроскопы (АСМ), нанопроводные детекторы, нанопоры и ряд других детекторов. Уникальная чувствительность АСМ-детекторов позволяет визуализировать отдельные молекулы, белков, и подсчитывать их количество. При использовании АСМ1 в, качестве биомолекулярного детектора необходимо- применение1 специальных, чипов, позволяющих сконцентрировать биологические макромолекулы аналита из большого объема инкубационного раствора на ограниченной1 поверхности- чипа. Исследуемые белковые объекты могут быть сконцентрированы на поверхности чипа как за счет физической или химической адсорбции, так и за счет биоспецифических взаимодействий' (АСМ-биоспецифический фишинг).

Однако на практике ограничение применения нанодетекторов на базе АСМ заключается в том, что, несмотря на. возможность визуализации отдельных белковых молекул на поверхности чипа, такие детекторы не способны идентифицировать их, что особенно важно в. исследовании, сложных белковых смесей, в том числе биологического материала. Поэтому разработка метода анализа, дополняющего возможности метода АСМ, представляется актуальной задачей. На сегодняшний5 день единственным протеомным методом, позволяющим однозначно и достоверно идентифицировать белковые молекулы, является * МС-анализ. В диссертационной работе разработан подход, объединяющий высокую чувствительность метода АСМ и достоверную МС-идентификацию для детекции белков и их комплексов из раствора-аналита.

Цель работы состояла в масс-спектрометрической идентификации белков и белковых комплексов, выявленных в биоматериале с помощью атомно-силовой микроскопии.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Разработка схемы МС-идентификации белков, выловленных на поверхность АСМ-чипа с . помощью химического или. биоспецифического фишинга;

2. Подбор условий- ферментативного-гидролиза белков на поверхности АСМ-чипа для последующей МС-идентификации;

3. Проведение МС-идентификации модельных белков на поверхности АСМ-чипа;

4. Проведение МС-идентификации белков на поверхности АСМ-чипа, биоспецифически выловленных из многокомпонентной смеси (сыворотки крови).

Научная-новизна работы.

В диссертации разработана схема, позволяющая проводить МС-идентификацию белков и белковых комплексов, выловленных из раствора или многокомпонентной смеси на поверхности АСМ-чипа. Для этого были подобраны оптимальные условия подготовки образцов, в том числе режим проведения гидролиза (температурный режим, влажность, состав трипсинолитической смеси, время трипсинолиза) белковых молекул, ковалентно. и нековалентно иммобилизованных на поверхности АСМ-чипа. Особенность настоящей работы заключалась в том, что- по сравнению1 со стандартными протеомными протоколами ферментативного гидролиза подготовка образцов для МС-анализа проводилась не в растворе, а на ограниченной площади поверхности чипа. Разработанная схема позволила эффективно провести МС-анализ и идентифицировать на поверхности АСМ-чипа как отдельные белки, так и белковые комплексы. МС-анализ протеотипических пептидов исследуемых белков проводился с использованием двух типов ионизации (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, МАЛДИ и электр оспрейная ионизация, ЭСИ) и двух типов детекторов (времяпролетного и типа ионная ловушка). Разработанная схема сопряжения АСМ-биоспецифического фишинга и МС была успешно апробирована для детекции белковых маркеров вирусного гепатита С (ВГС) (НСУсогеА§ и Е2) в образцах сыворотки крови.

Научно-практическая ценность работы.

Результаты данной работы могут служить основой для создания высокочувствительных протеомных методов без использования меток и* дополнительных процедур подготовки образцов- для обнаружения белков, находящихся в биологическом материале в низкой концентрации на1 уровне 10"13 М и ниже, в том числе в сыворотке крови. Предложен подход на основе атомно-силовой микроскопии и масс-спектрометрии, который позволит выявлять и идентифицировать белковые маркеры вируса гепатита С в сыворотке крови человека.

АСМ-МС подход может быть использован в разработках, направленных на создание новых диагностических чипов, поиск биомаркеров широкого диапазона социально-значимых заболеваний.

Апробация работы.

Основные результаты исследования были представлены на «1-м, 2-м Международном форуме по нанотехнологиям» (Москва, 2008-2009); «IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Амстердам, 2008; на Международной конгрессе «Протеом человека», Сидней, 2010.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 104 страницах, иллюстрирована 33 рисунками и 4 таблицами, список литературы состоит из 159 наименований.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кайшева, Анна Леонидовна

выводы

1. Разработана схема МС-анализа белков, выловленных на поверхность

АСМ-чипа с помощью химического или биоспецифического фишинга;

2. Подобраны условия ферментативного гидролиза белков на поверхности АСМ-чипа для последующей МС-идентификации с использованием МАЛДИ- и ЭСЯ-типов ионизации;

3. Проведена МС-идентификация 11 типов белков на поверхности АСМ-чипов: в том числе 6 типов белков, выловленных на поверхность АСМ-чипа с помощью химического фишинга и 5 типов белков, выловленных за счет биоспецифического взаимодействия на соответствующие молекулы-зонды, иммобилизованные на АСМ-чипе;

4. Проведен МС-анализ белка §р120, биоспецифически выловленного из раствора аналита на аптамер, иммобилизованный на поверхности АСМ-чипа. Схема АСМ-МС-анализа с использованием аптамера к §р120 в качестве биологического зонда была реализована впервые;

5. Разработанная схема АСМ-МС-анализа апробирована для выявления белкового маркера заболевания гепатита С НСУсогеА§ из сыворотки крови. Проведена МС-идентификация белков НСУсогеА§ и Е2 на поверхности АСМ-чипов, биоспецифически выловленных на иммобилизованные анти-НСУсоге из образцов сыворотки крови, содержащей частицы НСУ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современный подход к решению проблемы низкой концентрационной чувствительности аналитических систем, используемых в протеомике, заключается в использовании молекулярных детекторов, таких как атомно-силовой микроскоп, позволяющих регистрировать единичные белковые молекулы, в комбинации с биоспецифическим фишингом молекул-аналита. В связи с тем, что молекулярные детекторы не имеют ограничений по чувствительности и, теоретически, могут использоваться для регистрации низкокопийных белков (например, белковых маркеров гепатита С) в сыворотке человека [2]. Масс-спектрометрический анализ важен для идентификации визуализированных белковых объектов на поверхности АСМ-чипа, выяснения вклада неспецифической сорбции* при исследовании сложных смесей, таких как сыворотка крови.

Показано, что АСМ-МС подход., может применяться- для выявления и идентификации белков из раствора на примере 6 модельных белков, отличных по своим физико-химическим свойствам и происхождению.

Данная работа дает возможность создания высокочувствительных протеомных методов для обнаружения маркерных белков в низкой концентрации в биологическом* материале, в том числе в сыворотке крови без использования флуоресцентных или радиоактивных меток. Показано, АСМ-МС анализ с использованием ЭСИ и МАЛДИ типов ионизации белков и белковых комплексов может осуществляться* и в сложных смесях (сыворотка крови). Предложенный подход был успешно апробирован при выявлении и идентификации белковых маркеров вируса гепатита С (НСУсогеА§) в сыворотке крови. Было установлено, что пептиды консервативных участков аминокислотной последовательности кор-антигена идентифицировались с высокой частотой, в отличии от пептидов^ вариабельных участков.

В дальнейшем этот подход может быть использован в разработках, направленных на создание диагностических систем, в поиске биомаркеров социально-значимых заболеваний. Другая область применения АСМ-МС подхода - использование для протеомных исследований. В этом случае, атомно-силовая микроскопия и масс-спектрометрия помогут распознать те виды белков, которые присутствуют в низкой концентрации в сыворотке человека, но еще не идентифицированы стандартными протеомными методами в связи с недостаточной концентрационной чувствительностью.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Проведенные исследования поддержаны финансированием из научных контрактов в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы» № 02.552.11.7060, в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 02.740.11.0791, гранта РФФИ 09-04-12113-офим.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю искреннюю благодарность научному руководителю V заведующему лабораторией нанобиотехнологии ИБМХ РАМН, доктору биологических наук Юрию Дмитриевичу Иванову за предоставление темы для настоящей работы, помощь и поддержку при ее выполнении.

Выражаю глубокую признательность коллективу лаборатории нанобиотехнологии и системной биологии, заведующему лаборатории системной биологии кандидату биологических наук Згоде Виктору Гавриловичу за полезные рекомендации и помощь в проведении4 экспериментов.

Особо благодарю заведующего кафедрой инфекционных болезней у детей РГМУ, академика РАМН В.Ф. Учайкина, а также сотрудников кафедры к.м.н. В.А. Конева и д.м.н. О.Б. Ковалева за предоставление сывороток крови для анализа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кайшева, Анна Леонидовна, 2010 год

1. Zhou Y., Wang Y., Kovacs M., Jin J., Zhang J. Microglial activation induced by neurodegeneration: a proteomic analysis // Mol. Cell. Proteomics. — 2005. — 4. -P.1471-1479.

2. Archakov A.I., Ivanov Yu.D. Analytical nanobiotechnology for medicine diagnostics // Mol BioSyst. 2007. - 3. - P.336-342.

3. Archakov A.I., Ivanov Yu.D., Lisitsa A.Y., Zgoda V.G. AFM fishing nanotechnology is the way to reverse the Avogadro number in proteomics // J. Proteomics. 2007. - 7. - P.4-9.

4. Reinders J., Lewandrowski U., Moebius J., Wagner Y., Sickmann A. Challenges in mass spectrometry-based proteomics // J. Proteomics. 2004. - 12. -P.3686-3703.

5. Guetens G., Van Cauwenberghe K., De Boeck G., Maes R., Tjaden U.R., van der Greef J., Highley M., van Oosterom A.T., de Bruijn E.A. Nanotechnology in bioclinical analysis // J. Chromatogr. В Biomed. Sci. Appl. 2000. - 739. - P. 139150.

6. Chen L., Fatima S., Peng J., Leng X. SELDI protein chip technology for the detection of serum biomarkers for liver disease // Protein. Pept. Lett. 2009. -16(5). -P.467-472.

7. Arroyo C.M., Broomfield C.A., Hackley B.E. Jr. The role of interleukin-6 (IL-6) in human sulfur mustard (HD) toxicology // Intern. J. Toxicol — 2001. 20. -P.281-296.

8. Zhao X.s Shippy S.A. Competitive immunoassay for microliter protein samples with magnetic beads and near-infrared fluorescence detection // Anal. Chem. — 2004. — 76. P.1871-1876.

9. Léonard J.-F., Courcol M. and Gautier J.-C. Optimization of SELDI for Biomarker Detection in Plasma // Methods Mol. Biol. 2011. - 691. - P.351-368.

10. Peter J., Unverzagt C., Krogh T.N., Vorm O., Hoesel W. Identification of precursor forms of free prostate-specific antigen in serum of prostate cancer patients by immunosorption and mass spectrometry // Cancer Res. 2001. - 61. — P.957-962.

11. Villanueva J., Philip J., Entenberg D., Chaparro C.A. Serum peptide profiling by magnetic particle-assisted, automated sample processing and MALDI-TOF mass spectrometry II Anal. Chem. 2004. - 76. - P. 1560-1570. '

12. Sandhu A., Handa H., Abe M. Synthesis and applications of magnetic nanoparticles for biorecognition and point of care medical diagnostics // Nanotechnology. 2010. -21(44).

13. Villanueva J., Lawlor K., Toledo-Crow R., Tempst P. Automated serum peptide profiling. Protein // Nat. Protoc. 2006. - 1(2). - P.880-891.

14. Petricoin E. F., Liotta L. A. Mass Spectrometry-based Diagnostics: The Upcoming Revolution in Disease Detection // Clinical Chemistry — 2003. 49. -P.533-534.

15. Guerrier L., Righetti P.G., Boschetti E. Reduction of dynamic protein concentration range of biological extracts for the discovery of low-abundance proteins by means of hexapeptide ligand,library // Nature Protocols. 2008. — 3 -P.883-890.

16. Niesen M.L., Savitski M.M., Zubarev R.A. Extent of modifications in human proteome samples and their effect on dynamic range of analysis in- shotgun proteomics // Mol Cell. Proteomics. 2006. - 5. - P.2384-2391.

17. Anderson N.L., Anderson- N.G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects // Molt Cell Proteomics. 2002. - 1. - P.845-867.

18. Ivanov Yu.D., Govorun V.M., Bykov V.A., Archakov A.I. Nanotechnology in proteomics II J. Proteomics. 2006. - 6. - P. 1399-1414.

19. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of head to bacteriophage T4 // Nature. 1970. - 227. - P.680-685.

20. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins HJBC. 1975. - 250. - P.4007^021.

21. Wu T., Malinverni J., Ruiz N., Kim S., Silhavy T.J. and Kahne D. Identification of a Multicomponent Complex Required for Outer Membrane Biogenesis in Escherichia coli H Cell. 2005. - 121. - P.235-245. ,<

22. Pietrogrande M.C., Marchetti N., Dondi F., Righetti P.G. Spot overlapping in two-dimensional Polyacrylamide gel electrophoresis separations: A statistical study of complex protein maps // Electrophoresis. 2002. - 23. - P.283-291.

23. Rabilloud T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Old, old fashioned, but it still climbs up the mountains // Proteomics. 2002. - 2. - P.3-10.

24. Kossowska B., Dudka I., Gancarz R., Antonowicz-Juchniewicz J. Proteomic analysis of protein profiles in some pathological stages of the human organism // Postepy Hig MedDosw. 2009. - 63. - P.549-563.

25. Anderson N.L., Anderson N.G. High resolution two-dimensional electrophoresis of human plasma proteins // PNAS. 1977. - 74. - P.5421-5425.

26. Cutler P. Protein arrays: the current state-of-the-art // Proteomics. 2003. -3. -P.3-18.

27. Mauri P., Scigelova M. Multidimensional protein identification technology for clinical proteomic analysis // Clin. Chem. Lab. Med. 2009. - 47. - P.636-646.

28. Jenkins R.E., Pennington S. Arrays for protein expression profiling: Towards a viable alternative to two-dimensional gel electrophoresis? // J. Proteomics. 2001. l.-P.13-19.

29. Nomura F. Clinical proteomics in laboratory medicine // Rinsho Byori. 2006.- 54. -P.413-420.

30. Mijatovic D., Eijkel J.C., den Berg A. Technologies for nanofluidic systems: top-down vs. bottom-up // RSC Lab. Chip. 2005 - 5 - P.492-500.

31. Pieper R., Su Q., Gatlin C.L., Huang S.T., Anderson N.L., Steiner S. Multicomponent immunoaffinity subtraction chromatography: An innovative step towards a comprehensive survey of the human plasma proteome // J. Proteomics.2003. 3. - P.422-432.

32. Echan L.A, Tang H.-Y., Ali-Khan N., Lee K., David W. SpeicherDepletion of multiple high-abundance proteins improves protein profiling capacities of human serum and plasma // J. Proteomics. — 2005. 13. - P.3292-3303.

33. Lueking A., Possling A., Huber O., Beveridge A., Horn M., Eickhoff H., Schuchardt J, Lehrach H., Cahill D.J. A Nonredundant Human Protein Chip for Antibody Screening and Serum Profiling // Mol. Cell. Proteomics. 2003. - 2. -P.1342-1349.

34. Rai A.J. Abundant protein' depletion in search of biomarkers // Med. Sci. (Paris). — 2007. 1. - P.5-8.

35. Archakov A.I., Ivanov Y.D., Lisitsa A.V., Zgoda V. Biospecific irreversible fishing coupled with atomic force microscopy for detection of extremely low-abundant proteins //Proteomics. 2009. - 9. - P.1326-1343.

36. Zhu H., Snyder M. Protein chip technology // Curr. Opin. Chem. Biol 2003.- 7. P.55-63.

37. Zhu H., Snyder M. Protein arrays and microarrays // Curr. Opin. Chem. Biol -2001. 5. - P.40-45.

38. Lee K.-B., Park S.-J. Protein Nanoarrays Generated By Dip-Pen Nanolithography // Science. 2002. - 295. - P. 1702-1705.

39. Agarwal G., Naik R.R. Immobilization of Histidine-Tagged Proteins on Nickel by Electrochemical Dip Pen Nanolithography // JACS. 2003. - 125. - P. 74087412.

40. Jwa-Min N., Sang Woo H. Bioactive Protein Nanoarrays on Nickel Oxide Surfaces Formed by Dip-Pen Nanolithography // Angew. Chem. Int. Edit. 2003.- 43. P.1246-1249.

41. Minsu L., Dong-Ku K. Protein nanoarray on Prolinker surface constructed by atomic force microscopy dip-pen nanolithography for analysis of protein interaction // J. Proteomics. 2006. - 6. - P. 1094-1103.

42. Schweitzer B., Kingsmore S.F. Measuring proteins on microarrays // Curr. Opin. Biotechnol 2002. - 13. - P. 14-19.

43. Arntz Y., Lang H.P., Zhang J., Hunziker P., Ramseyer J.P., Meyer E., Hegner M. and Gerber Ch. Label-free protein assay based on a nanomechanical cantilever array // Nanotechnol. 2003. - 14. - P.89-90.

44. Ji H.F., Yang X. Molecular recognition of biowarfare agents using micromechanical sensors // Expert Rev. Mol. Diagn. 2004. - 4. - P.859-866.

45. Mukhopadhyay R., Sumbayev V.V. Cantilever Sensor for Nanomechanical Detection of Specific Protein Conformations // Nano Letters. 2005. -5. -P.2385-2388.

46. Huber, F., Hegner M. Label free analysis of transcription factors using microcantilever arrays // Biosens. Bioelectron. 2006. - 21. - P. 1599-1605.

47. Backmann N., Zahnd C., et al. A label-free immunosensor array using single-chain antibody fragments // PNAS. 2005. - 102. - P. 14587-14592.

48. Tian F., Hansen K. M. Dynamic Microcantilever Sensors for Discerning Biomolecular Interactions // Anal. Chem. 2005. - 77. - P.1601-1606.

49. Braun T., Backmann N., Vogtli M., Bietsch A., Engel A., Lang H.-P., Gerber C. and Hegner M. Conformational Change of Bacteriorhodopsin Quantitatively Monitored by Microcantilever Sensors // Biophys. J. 2006. - 90. - P.2970-2977.

50. Thompson J.B., Hansma H.G., Hansma P.K., Plaxco K.W. The backbone conformational entropy of protein folding: experimental measures from atomic force microscopy // JMB. 2002. - 322. - P.645-652.

51. Ng S.P; Randies L.G., Clarke J. Single molecule studies of protein folding using atomic force microscopy // Meth. Mol. Biol. 2007. - 350. - P. 139-167.

52. Best R.B., Clarke J. What can atomic force microscopy tell us about protein folding? // Chem Commun (Camb). 2002. - 7. - P. 183-192.

53. MacBeath G., Koehler A.N., Schreiber S.L. Printing small molecules as microarrays and detecting protein-ligand interactions // J ACS. 1999. - 121. -P.7967-7968.

54. El Kirat K., Morandat S., Dufrene Y.F. Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy // Biochim. Biophys. Acta. 2009. - 1798. -P.750-765.

55. Stephan, H., Horst V. Covalent attachment of functionalized lipid bilayers to planar waveguides for measuring protein binding to biomimetic membranes // Prot. Sci. 1995. - 4. - P.2532-2544.

56. Rich R.L., Day Y.S.N. Higb-Resolution and High-Throughput Protocols for Measuring Drug/Human Serum^ Albumin Interactions Using BIACORE // Analyt. Biochem. 2001. - 296(2). - P. 197-207.

57. Templin M.F., Stoll D., Schrenk M., Traub P.C., Vohringer C.F., Joos T.O. Protein microarray technology // Trends Biotechnol: 2002. - 20. - P. 160-166.

58. Zhu H., Klemic J.F., Chang S., Bertone P., Casamayor A., Klemic K.G., Smith D., Gerstein M., Reed M.A., Snyder M. Analysis of yeast protein kinases using protein chips // Nat. Gen. 2000. - 26. - P.283-289.

59. Kim J., Junkin M., Kim D.-H., Kwon S., Shin Y. S., Wong P.K., Gale B.K. Applications, techniques, and microfluidic interfacing for nanoscale biosensing // Microfluid. Nanofluid. 2009. - 7. - P. 149-167.

60. Gymara M.J., Ercilla G. Assessment of synthetic peptides for hepatitis A diagnosis using biosensor technology // J. Immunol. Meth. 2000. - 246. - P.13-24.

61. Baldini F., Carloni A., Giannetti A.m, Porro G., Trono C. A new optical platform for biosensing based on fluorescence anisotropy // Anal. Bioanal. Chem. -2008.- 391. -P.1837-1844.

62. Ivanov Yu.D., Govorun V.M., Bykov V.A., Archakov A.I. Nanotechnology in proteomics // J. Proteomics. 2006. - 6. - P.1399-1414.

63. Homola J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors // Anal. Bioanal. Chem. 2003. - 377. - P.528-539.

64. Breitenstein M, Hôlzel R, Bier FF. Immobilization of different biomolecules by atomic force microscopy II J. Nanobiotech. -2010. 8. - P. 10-17.

65. Tang Q., Shi S.Q., Zhou L. Nanofabrication with atomic force microscopy // J. Nanosci. Nanotechnol. 2004. - 4(8). - P.948-963.

66. Abgrall P., Gué A.-M. Lab-on-chip technologies: making a microfluidic network and coupling it into a complete microsystem // J. Micromech. Microeng — 2007.-. 17.-P. 15-25.

67. Hinterdorfer P., Dufrene Y.F. Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy // Nat. Meth. 2006. - 3. -P.347-355.

68. Pawlak M., Schick E., Bopp M.A., Schneider M.J., Oroszlan P., Ehrat M. Zeptosens' protein microarrays: A novel high performance microarray platform for low abundance protein analysis // J. Proteomics. 2002. - 2. - P.383-393.

69. Chilkoti A., Boland T., Ratner B.D. and Stayton P.S. The relationship between ligand-binding thermodynamics and protein-ligand interaction forces measured by atomic force microscopy // Biophys. J. 1995. - 69. -P. 2125-2130.

70. Hinterdorfer P., Dufrene Y.F. Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy // Nat. Methods.- 2006. 3. -P.347-355.

71. Frank I., Hofbauer F. Single-molecule mechanics: Breaking bonds at a stretch //Nat. Chemistry. 2009. - 1.-P.180-181.

72. Bentzen E., Wright D.W., Crowe J.E. Nanoscale tools for rapid and sensitive diagnosis of viruses // Future Virology. 2006. - 1. - P.769-781.

73. Kuznetsov Y.G., McPherson A. Nano-fibers produced by viral infection of amoeba visualized by-atomic force microscopy// Biopolymers. 2010.

74. Nettikadan S.R., Johnson J.C., Mosher C., Henderson E. Virus particle detection by solid phase immunocapture and atomic force microscopy // BBRC. -2003 .-311.- P.540-545.

75. Gaczynska M., Osmulski P. A. AFM of biological complexes: What can we learn? // COCIS. 2008. - 13. - 351-367.

76. Allen S., Chen X. D. Detection of Antigen-Antibody Binding Events with the Atomic Force Microscope // Biochemistry. 1997. - 36. - P.7457-7463.

77. Breitenstein M., Holzel R., Bier F.F. Immobilization of different biomolecules by atomic force microscopy // J Nanobiotechnology. — 2010. — 8. -P. 10-17.

78. Johnson J.C., Nettikadan S.R., Vengasandra S.G., Henderson E. Analysis of solid-phase immobilized antibodies by atomic force microscopy // J. Biochem. Biophys. Meth. 2004. - 59(2). - P167-180.

79. Polishchuk V.P., Tyvonchik T.P., Boiko A.L. Use of atomic force microscopy to study the morphology and structure of virusis // Mikrobiol. Z. -2000. 62. - P.40-43.

80. Salgia R. Expression of the focal adhesion protein paxillin in lung cancer and its relation to cell motility // Oncogene. 1999. - 18. - P. 67-77.

81. Cross S., Jin Y.-S., Rao J., Gimzewski J. K. Nanomechanical analysis of cells from cancer patients // Nature Nanotech. 2007. - 13. - P.33-37.

82. Guresh S., Spatz J., Mills J.P., Micoulet A., Dao M., Lim C. T., Beil M., Seufferlein T. Connections between single-cell biomechanics and human disease states: gastrointestinal cancer and malaria II Acta Biomater. 2005. - 1. - P. 15-30.

83. Suresh S. Nanomedicine: elastic clues in cancer detection // Nat. Nanotechnol. 2007. - 2. - P.748-749.

84. Gan Y. Atomic and subnanometer resolution in ambient conditions by atomic force microscopy // Surface Science Reports. — 2009. 64. - P.99-121.

85. Casuso I., Scheming S. Automated setpoint adjustment for biological contact mode atomic force microscopy imaging // Nanotech. J.- 2010.-21 (3).

86. Perez R., Garcia R., Schwarz U. High-resolution noncontact atomic force microscopy // Nanotech. J. 2009. - 20 (26) - P.264001-264021.

87. MacBeath G., Koehler A.N., Schreiber S.L. Printing small molecules as microarrays and detecting protein-ligand interactions // JACS. — 1999. 121. -P.7967-7968.

88. Radke K.M., Nettikadan S.R., Johnson J.C., Vengasandra S.G., Henderson E. ViriChip enhances reverse transcriptase polymerase chain reaction in biological fluids and environmental*samples // Anal. Biochem. 2004. - 330. - P.350-352.

89. Henderson E. BioForce Nanosciences // Nanomed. — 2007. 2. - P.391-396.

90. Allen S., Chen X. D. Detection of Antigen-Antibody Binding Events with the Atomic Force Microscope // Biochemistry. 1997. - 36. - P.7457-7463.

91. Shepard C., Finelli L., Alter M. Global epidemiology of hepatitis C virus infection // Lancet Infect. Dis.- 5. P.558-567.

92. Wong T., Lee S.S. Hepatitis C: a review for primary care physicians // CMAJ. 2006. - 174. - P.649-659.

93. Simmonds P., Holmes E.C., Cha T.A., Chan S.W., McOmish F.} Irvine B., et al. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series ofsubtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region // J. Gen. Virol. — 1993. -74. -P.2391-2399.

94. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A.J. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome // Science. 1989. - 244. -P.359-362.

95. Alberti A.L. Prevalence of liver disease in a population of asymptomatic persons with hepatitis C virus infection // Hepatology. 2002. - 36. - P. 195-200.

96. Walker C.M. Adaptive immunity to the hepatitis C virus // Adv. Virus Res. -2010. 78. - P.43-86.

97. Szalay F. Hepatitis C virus infection and hepatocarcinogenesis // Orv Hetil. -2010.-151-P.1524-1529.

98. Wilkins T., Malcolm J.K., Raina D., Schade R.R. Hepatitis C: diagnosis and treatment // Am. Fam. Physician.- 2010. -81(11). P. 1351-1357.

99. Alberti A.L. Prevalence of liver disease in a population of asymptomatic persons with hepatitis C virus infection // Hepatology. 2002 - 36. - P. 195-200.

100. Di Bisceglie A.M. Natural history of hepatitis C: Its impact on clinical management // Hepatology. 2000. - 31. - P. 1014-1018.

101. Seeff L.B. Natural history of hepatitis C // Hepatology. -1997. 26. - P.21 -28.

102. Glick M. Treating asymptomatic patients // J. Am. Dent. Assoc. 2005. -136(12).-P.1632-1634.

103. Ogata N.3 Alter H.J., Miller R.H., Purcell R.H. Nucleotide sequence and mutation rate of the H strain of hepatitis C virus // PNAS. 1991. - 88. - P.3392-3396.

104. Prince A.M., Huima-Byron T., Parker T.S., Levine D.M. Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins // J. Viral Hepatitis. 2007. - 3. - P. 11-17.

105. Alter M.J. Epidemiology of hepatitis C in the West // Semin. Liver Dis. -1996.- 15.-P.5-14.

106. Courouce A.M., Bouchardeau F., Girault A., Le Marrec N. Significance of NS3 and NS5 antigens in screening for HCV antibody // Lancet. 1994. - 343. -P.853-854.

107. Kobayashi M., Tanaka E., Matsumoto A., Yoshizawa K. Clinical application of hepatitis C virus core protein in early diagnosis of acute hepatitis C II J. Gastroenterology. — 1998. — 33. — P.508-511.

108. Kapprell H.P., Michel. G., Hampl H. Demonstration of specific detection of anti-HCV IgM core antibodies // J. Virol. Methods. 1996. - 59. - P.121-126.

109. Lau G.K., Lesniewski R., Johnson R.G., Davis G.L. Immunoglobulin M and A antibodies to hepatitis С core antigen in chronic hepatitis С virus infection // J. Med. Virol. 1994. - 44. - P. 1-4.

110. Martinelli A.L., Brown D., Braun H.-B. Quantitative assessment of hepatitis С virus RNA and IgM antibodies to hepatitis С core in chronic hepatitis С И J. Hepatol. 1996. - 24. -P.21-26.

111. Афанасьев А.Ю. Индикация антител к вирусу гепатита С с разделением на классы IgM и lgG и ее клиническое значение // Клинич. лаб. Диагностика. 1996. - 2. - С.43-44.

112. Caruntu F.A., Benea L. Acute hepatitis С virus infection: Diagnosis, pathogenesis, treatment// J. Gastrointestin. Liver Dis. 2006. - 15(3)-. — P.249-256.

113. Zaaijer H.L., Cuypers H.T., Reesink H.W., Winkel I.N., Gerken G., Lelie P.N. Reliability of polymerase chain reaction for detection of hepatitis -С virus // Lancet. 1993. - 341. - P.722-724.

114. Hijikata M., Kato N., Ootsuyama Y., Nakagawa M., and Shimotohno K. Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis C virus genome by in vitro processing analysis IIPNAS. 1991. - 1. - P. 5547-5551.

115. Grakoui A., Wychowski C., Lin C., Feinstone S.M. Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products // Journal of Am. Soc. Microbiol. 1993 - 67. - P.1385-1395.

116. Bukh J., Purcell R.H., Miller R.H. At least 12 genotypes of hepatitis C virus predicted by sequence analysis of the putative El gene of isolates' collected worldwide // PNAS. 1993. - 90. P.8234-8238.

117. Hussy P., Langen H., Mous J., Jacobsen H. Hepatitis C virus core protein: Carboxy-terminal boundaries of two processed species suggest cleavage by a signal peptide peptidase // Virology. 1996. - 224. - P.93-104.

118. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.-S., Zhu-N., Michael L. Homotypic Interaction and Multimerization of Hepatitis C Virus Core Protein // Virology. -1996.-218.-P.43-51.

119. Nolandt O., Kern V., Muller H., Pfaff E., Theilmann L., Welkerl R. and Krausslich H.-G. Analysis of hepatitis C virus core protein interaction domains // J. Gen. Virol 1997. - 78. - P. 1331-1340.

120. Yan B.-S., Tam M.H., Syu W.-Jr. Self-association of the C-terminal domain of the hepatitis C virus core protein // FEBS. 2004. - 258. - P.100-106.

121. Miller R.H., Purcell R.H.Hepatitis C virus shares amino acid sequence similarity with pestiviruses and flaviviruses as well as members of two plant virus supergroups // PNAS. 1990. - 87. - P.2057-2061.

122. Collett M.S., Larson R., Belzer S.K., Retzel E. Characterization of bovine viral proteins // Virology. 1988. - 165. -P.200-208.

123. Reed K.E., Rice C.M. Overview of hepatitis C virus genome structure, polyprotein processing, and protein properties // Current topics in microbiology and immunology. — 2000. -242. — P.55-84.

124. Dubuisson J., Rice C.M. Hepatitis C virus glycoprotein folding: disulfide bond formation and association with calnexin // J. Virol. — 1996. 70. - P.778-786.

125. Matsuura Y., Suzuki T., Suzuki R., Sato M., Aizaki H., Saito I., Miyamura T. Processing of El and E2 glycoproteins of hepatitis C virus expressed in mammalian and insect cells // J. Virol- 1994. 205. - P.141-150.

126. Reed K.E., Rice C.M. Overview of hepatitis C virus genome structure, polyprotein processing, and protein properties // Curr. Top Microbiol. Immunol. -2000.-242.-P.55-84.

127. Op De Beeck A., Cocquerel L., Dubuisson J. Biogenesis of hepatitis C virus envelope glycoproteins // J. Gen. Virol 2001. - 82. - P.2589-2595.

128. De Beeck A.O., Dubuisson J. Topology of hepatitis C virus envelope

129. Glycoproteins // Rev. Med. Virol. 2003. - 13. - P.233-241.

130. McCaffrey K., Gouklani H., Boo I., Poumbourios P., Drummer H.E. The variable regions of Hepatitis C Virus glycoprotein E2 have an essential structural role in glycoprotein assembly and virion infectivity // J. Gen. Virol. 2010.

131. Cividini A., Rebucci C., Silini E., Mondelli M.U. Is the natural history of hepatitis C virus carriers with normal aminotransferase really benign? // Gastroenterology. -2001. 121. - P. 1526-1527.