Протекторное действие активированного протеина C при нейротоксичности и ишемии мозга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат наук Савинкова, Ирина Григорьевна

• Савинкова, Ирина Григорьевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Савинкова, Ирина Григорьевна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Сопряжение процессов воспаления, свертывания и нейродегенерации

1.2.Активированный протеин С (АРС): структура, образование, функции

1.2.1. Использование АРС в моделях ишемического повреждения головного мозга

1.3.Тромбин: структурные особенности тромбина и свойства

1.4. Энтеропептидаза

1.5.Рецепторы, активируемые протеиназами

1.5.1.Новые механизмы смещённого агонизма при активации PARI АРС

1.5.2.Экспрессия рецепторов, активируемых протеиназами

1.6. Эндотелиальный рецептор протеина С (EPCR)

1.6.1. Экспрессия EPCR

1.7. Эксайтотоксичность, как модель нейродегенерации

1.8.Участие тучных клеток в воспалительной реакции

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Исследование влияния активированного протеина С и механизмов реализации его эффектов на культивируемые гиппокампальные нейроны при глутаматной эксайтотоксичности

3.1.1. Исследование действия активированного протеина С на выживаемость культивируемых нейронов в норме и при эксайтотоксичности, вызванной глутаматом

3.1.2. Исследование действия активированного протеина С на активацию проапоптотического каскада NfkB и транслокации NFKBp65 в ядро нейронов

3.1.3. Исследование влияния активированного протеина С на экспрессию мРНК PAR и EPCR в гиппокампальных нейронах при глутаматной эксайтотоксичности

3.1.4, Исследование влияния активированного протеина С на экспрессию белка PARI и EPCR в гиппокампальных нейронах при глутаматной эксайтотоксичности

3.2. Исследование действия пептидов-аналогов привязанного лиганда, освобождаемого активированным протеином С, на выживаемость гиппокампальных нейронов при глутаматной эксайтотоксичности

3.3. Исследование действия АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI на выживаемость гиппокампальных нейронов мышей, нокаутных по 2 изоформе Р-аррестина, в модели глутаматной эксайтотоксичности

3.4. Исследование влияния активированного протеина С на кокультуру гиппокампальных нейронов и перитонеальных тучных клеток, полученных в модели острого воспаления

3.5. Влияние активированного протеина С на размеры зоны поражения и морфометрические показатели нейронов и нейроглии в перифокальной

зоне

3.6. Исследование действия тромбина в низкой концентрации на экспрессию мРНК PAR и EPCR в гиппокампальных нейронах при глутаматной эксайтотоксичности

3.7. Исследование влияния полноразмерной энтеропептидазы быка и легкой цепи рекомбинантной энтеропептидазы человека на выживаемость культивируемых нейронов в сравнении с действием низкой концентрации тромбина

4. Обсуждение

5.Вывод ы

6.Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека Глу - глутамат

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер ДНК - дезоксирибонуклиновая кислота мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота ОТ - обратная транскрипция ПНС- периферическая нервная система ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

ТМ - тромбомодулин

АРС - активированный протеин С

EPCR - эндотелиальный рецептор протеина С

ТФ - тканевой фактор

ФХа - фактор X активированный

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЦНС - центральная нервная система

ЭП - энтеропептидаза

[Са ]j - внутриклеточная концентрация ионов кальция АМРА рецептор - ионотропный глутаматный рецептор, синтетический агонист DL-a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxasole propionic acid ARAC - арабинозинмоноцитозид ВЕК - полноразмерная энтеропептидаза быка CG - катепсин G

EPCR - эндотелиальный рецептор протеина С

GRK - киназы рецепторов, сопряженных с G-белком

HBSS - Hepes-солевой буфер

1кВ - ингибитор каппа В

IL-4 - интерлейкин

IP3 - инозитолтрисфосфат

L-HEP - легкая цепь рекомбинантной энтеропептидазы человека МТТ - 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide NF-кВ - ядерный фактор каппа В

NMDA рецептор - ионотропный глутаматный рецептор, синтетический агонист N-methyl-D-aspartate PC - протеин С PLC - фосфолипаза С

PAR - рецепторы, активируемые протеиназами

RT-PCR - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

sEPCR - растворенная форма EPCR

TNF-a - фактора некроза опухоли-а

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Протекторное действие активированного протеина C при нейротоксичности и ишемии мозга»

ВВЕДЕНИЕ

Ишемический инсульт - острое нарушение мозгового кровообращения, сопровождается гибелью клеток мозга и нарушением его функций вследствие тромбообразования, вазоспазма и затруднения или прекращения поступления крови к тому или иному отделу. По данным Всемирной Организации Здравоохранения инсульт - одно из основных заболеваний, уносящих больше всего человеческих жизней. Так, ежегодно от ишемического и геморрагического инсультов погибает около 6,4 млн человек. Поэтому исследование механизмов развития и регуляции нейродегенеративных процессов при ишемических инсультах и травмах мозга и поиск протекторных агентов является одной из важнейших проблем современной физиологии.

При ишемии мозга происходит освобождение глутамата в межклеточное пространство, приводящее к активации пре- и постсинаптических глутаматных рецепторов. Последующее увеличение внутриклеточного [Са ]¡ может приводить к дисфункции митохондрий, генерации активных форм кислорода и активации протеиназ, фосфорилаз и эндонуклеаз (Hazell,2007). Массивный вход Са в нервные клетки нарушает гомеостаз этого внутриклеточного посредника, запускает каскад внутриклеточных реакций, которые завершаются быстрой или отсроченной гибелью клеток механизмами апоптоза или некроза (Baño et al, 2007). В настоящей работе для изучения роли ключевых сериновых протеиназ гемостаза - активированного протеина С и тромбина, в нейропротективных и нейродегенеративных процессах в мозге использована модель глутаматной эксайтотоксичности. Первичная культура нейронов является удобной экспериментальной моделью для изучения нейродеструктивных процессов, вызываемых глутаматом, так как цитологические и биохимические характеристики культивируемых нейронов близки тем, что наблюдаются у нейронов in situ (Хаспеков, 1995).

Известно, что система свертывания крови и её протеиназы одними из первых в организме осуществляют запуск сложной ответной реакции на повреждающее воздействие. Ишемическое повреждение мозга сопровождается нарушением целостности гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и увеличением его проницаемости, что приводит к появлению в нервной ткани ключевых сериновых протеиназ системы свертывания крови, таких как тромбин, фактор Ха (ФХа) и активированный протеин С (АРС).

Активированный протеин С - мультифункциональный фермент, участвующий в регуляции не только свертывания крови, но также воспаления и апоптоза, проявляя антивоспалительные и цитопротекторные свойства (Riewald et al., 2002; O'Brien et al., 2006). При ишемии происходит апоптотическая гибель эндотелиальных клеток и нарушение целостности ГЭБ, приводящая к нейровоспалению и гибели нейронов. АРС защищает эндотелиальные клетки сосудов, поддерживает целостность ГЭБ и предотвращает вторичное повреждение нейронов, опосредованное входом из кровотока нейротоксических веществ. АРС при ишемии может напрямую защищать нейроны головного мозга от гибели. Однако молекулярные основы антивоспалительного и антиапоптотического действия АРС еще не выяснены. АРС ингибирует апоптоз и блокирует воспаление, снижая образование р53, каспазы-3 и нормализуя соотношение про- и антиапоптотических генов Bax/Bcl-2 (Riewald M et al, 2002; Griffin et al, 2007; Cheng et al, 2003; Guo et al, 2009; Guo et al. 2004). Кроме того APC блокирует транслокацию NFkB в ядро и, как следствие, ингибирует экспрессию молекул адгезии, цитокинов, предотвращает апоптоз и модулирует выживаемость клеток эндотелия (Joyce et al, 2001; Levi et al, 2004). В нашей лаборатории было показано, что АРС в низких концентрациях (0,01-10 нМ) не вызывает гибель нейронов, но в узком диапазоне низких концентраций существенно (в 2 и более раз) снижает гибель клеток от токсического действия глутамата. АРС в высоких концентрациях (>50 нМ) вызывает гибель гиппокампальных нейронов, подобную токсическому действию

глутамата. (Горбачева и др., 2008) Однако влияние АРС па гиппокампальные нейроны при глутаматной эксайтотоксичности еще мало изучено. Поэтому исследование механизмов анти/проапоптотического действия АРС на различных экспериментальных моделях представляет интерес как для фундаментальной физиологии, так и для практической медицины и фармакологии.

Одним из ключевых ферментов свертывающей системы крови является тромбин, образующийся в результате ограниченного протеолиза протромбина фактором Ха свертывания крови в участках повреждения ткани, в том числе нервной, при травме, ишемических и геморрагических инсультах, нарушении ГЭБ при воспалении, гипертензии, эпилептическом статусе. Тромбин может индуцировать ретракцию нейронов, пролиферацию глии и модулировать процессы гибели нейронов, в зависимости от концентрации и времени воздействия (Струкова и др. 2005; Henrich-Noack et al., 2005).

Сериновые протеиназы регулируют функции клеток через трансмембранные рецепторы, активируемые протеиназами (PARs), сопряженные с 0-белками(Сои§ЬНп, 2002). К настоящему времени клонированы четыре подтипа PAR (PARI- рецептор тромбина, АРС, плазмина , PAR2 - рецептор трипсина, триптазы тучных клеток, ФХа и PAR 3- рецептор тромбина, и PAR 4- рецептор тромбина, плазмина) (Adams et al., 2011).

Протеиназы системы свертывания, взаимодействуя с мембранными семидоменными PAR, могут передавать сигналы клетка нервной системы при травме или воспалении, когда происходит увеличение сосудистой проницаемости. Протеиназы расщепляют одну пептидную связь экзодомена рецептора, что приводит к образованию нового N-конца («привязанный лиганд»), который обладает способностью специфически взаимодействовать со второй внеклеточной петлей той же рецепторной молекулы и активирует рецептор (Coughlin et al, 2005; Hollenberg et al, 2002; Trejo, 2003). Изменение

экспрессии данных рецепторов наблюдали при травмах, воспалении и ишемии мозга (Smith-Swintosky et al, 1997; Junge et al, 2004). Поэтому несомненный интерес представляет действие сериновых протеиназ гемостаза АРС и тромбина на регуляцию клеточной гибели при эксайтотоксичности, вызванной глутаматом, а также изменение экспрессии рецепторов, активируемых протеиназами и эндотелиальиого рецептора протеина С (EPCR), через которые осуществляется передача сигнала.

В связи с выше сказанным весьма актуальным представляется выяснение особенностей влияния АРС на выживаемость нейронов, и на количественные характеристики нейронов и нейроглии в перифокальной зоне экспериментального инфаркта крыс при окклюзии средней мозговой артерии.

Недавно обнаружено, что разнонаправленное действие тромбина и АРС может быть обусловлено смещённым агонизмом (biased agonism) при действии протеиназ тромбина и АРС на PAR-1 клеток эндотелия (Soh et al, 2011; Mosnier et al, 2011; Mosnier et al, 2012). При смещённом агонизме вместо канонического расщепления тромбином по Arg41 в экзодомене PARI идентифицировано APC-специфичное неканоническое расщепление по Arg46 в экзодомене PARI. Новый привязанный лиганд - пептид N47, на культивируемых клетках эндотелия имитировал вызванную АРС сигнализацию, но не сигнализацию, индуцируемую тромбином (Mosnier et al,

* 17 ¿I "7

2012). Показано, что пептид N' , повторяющий структуру остатка PARI N

66

, стимулирует цитопротекторныи путь сигнализации в клетках эндотелия посредством фосфорилирования Akt и GSK3ß, активации Racl и стабилизации эндотелиальиого барьера (Mosiner et al, 2012). Поэтому особый интерес представляет сравнение влияния АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда на выживаемость гиппокампальных нейронов в модели глутаматной эксайтотоксичности.

Кроме того известно, что PARI с корецептором EPCR , локализованный в кавеолах, связан с ß-аррестинами - мультифуикциональными адапторными

белками. Воздействие APC ведет к диссоциации рецептора и адапторной молекулы, но Р-аррестин в свою очередь необходим для активации малой ГТФазы Racl, что является ключевым механизмом в реализации цитопротекторного эффекта. (Soh et al, 2011). Исследование эффектов APC и пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI, освобождаемого АРС, на гиппокампальные нейроны мышей нокаутиых по 2 изоформе Р-аррестина позволит установить участие адапторного белка Р-аррестина в реализации эффектов АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда.

Однако ишемический инсульт представляет собой комплексный патологический процесс, обеспечивающий активацию не только процессов воспаления и нейродегенерации, но также участие иммунокомпетентных клеток, в частности тучных клеток. У крыс показано участие тучных клеток в формировании ишемического отека мозга на ранние сроках после начала очаговой церебральной ишемии (Strbian et al, 2006). Сравнительно небольшой концентрации тучных клеток может быть достаточно для изменения проницаемости ГЭБ и нарушения его целостности (Esposito et al, 2001). В связи с этим представляется важным исследование эффектов АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда, освобождаемого АРС, на гиппокамппальные нейроны, кокультивированные с активированными тучными клетками, позволяющую оценить возможность реализации протекторного эффекта веществ при наличии активных тучных клеток.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось выяснение влияния АРС как агониста PARI рецептора и ЭП на клетки мозга при токсическом воздействии глутамата и действия АРС в экспериментальной ишемии мозга крыс.

Для достижения цели в ходе работы решались следующие задачи:

1. Оценить влияние APC и тромбина на экспрессию рецепторов, активируемых протеиназами (PARs) и эпдотелиального рецептора протеина С (EPCR) в культивируемых нейронах гиппокампа крысы и выживаемость клеток при глутаматной эксайтотоксичности.

2 Исследовать влияние АРС на размеры ишемического очага и морфометрические показатели нейронов и нейроглии в перифокальной зоне фокального инсульта, моделируемого в мозге крысы с помощью окклюзии средней мозговой артерии.

3 Сравнить действие АРС с влиянием пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI, освобождаемого АРС, на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов крысы при глутаматной эксайтотоксичности.

4 Оценить зависимость нейропротекторного действия АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда PARI от Р-аррестина 2 в модели глутаматной эксайтотоксичности на гиппокампальных нейронах с использованием линии мышей, нокаутных по гену р-аррестина 2.

5 Оценить влияние энтеропептидазы на выживаемость культивируемых гиппокампальных нейронов при глутаматной эксайтотоксичности.

6 Проанализировать влияние АРС на нейродегенеративный эффект активированных воспалением тучных клеток, кокультивируемых с гиппокампальными нейронами крысы.

Научная новизна работы

В работе впервые выявлены следующие закономерности:

• АРС нормализует экспрессию мРНК рецепторов PARs и EPCR в нейронах гиппокампа, нарушенную при глутаматной эксайтотоксичности;

• синтетические пептиды-аналоги «привязанного лиганда» PARI, освобождаемого АРС, обладают нейропротекторным действием при глутаматной эксайтотоксичности;

• АРС защищает культивируемые гиппокампальные нейроны от токсического влияния активированных тучных клеток;

• Низкие концентрации энтеропептидазы, подобно АРС, проявляют нейропротекторное действие в условиях глутаматной токсичности;

• Действие энтеропептидазы в низких концентрациях реализуется через активацию PARI, а в области высоких концентраций - через инактивацию этого рецептора.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в работе факты расширяют представления о механизмах протекторного действия АРС и демонстрируют новые свойства энтеропептидазы. Впервые обнаруженное PARI-опосредованное протекторное действие энтеропептидазы в условиях токсичности, вызванной глутаматом, позволяет высказать предположение о наличии протекторных свойств у некоторых других эндогенных протеиназ, кроме протеиназ гемостаза. Кроме того, в работе продемонстрирована возможность использования синтетических пептидов, сходных по строению с привязанным лигандом N47 рецептора PARI, образующимся при его активации АРС, для защиты клеток от гибели при ишемии мозга. Исследование механизмов действия пептидов-агонистов PARI, а также разработка их модифицированных укороченных версий с высокой нейропротекторной активностью, может быть важным и актуальным направлением в поиске новых нейропротекторных препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний и последствий инсульта. Использование низкомолекулярных соединений вместо крупных рекомбинантных белков

имеет существенные преимущества, увеличивая скорость и точность доставки препаратов.

Апробация материалов диссертации

Основные результаты работы были представлены на II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (2008. Кишинев, Молдова), XXII Congress of ISTH (2009, Бостон, США), на V международном междисциплинарном конгрессе «Нейро-наука для медицины и психологии» (2009, Судак, Украина), XXth ISFP Congress (2010, Амстердам, Нидерланды), на III Съезде физиологов СНГ (2011, Ялта, Украина), 7th International Interdisciplinary Congress «Neuroscience for Medicine and Psychology» (2011, Судак, Украина), на Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация» (2013, Пущино), на Всероссийской научной конференции с международным участием «Фармакологическая пейропротекция» (2013, Санкт-Петербург).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 работ в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 11 в материалах российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 140 страницах и включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (содержит 183 источника). Работа иллюстрирована 44 рисунками и 2 таблицами.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Сопряжение процессов воспаления, свертывания и нейродегенерации.

Исследование механизмов развития и регуляции нейродегенеративных процессов при ишемических инсультах и травмах мозга одна из важнейших проблем современной физиологии, направленная на разработку новых подходов к лечению этих тяжелых заболеваний. Ишемический инсульт -острое патологическое состояние, связанное с нарушением кровообращения, приводящим к локальной депривации кислорода, глюкозы и трофическому голоданию головного мозга. Поскольку нейроны

зависят от постоянного поступления кислорода и глюкозы для генерации АТФ, потеря АТФ при ишемии вызывает быстрое изменение ионных градиентов, что приводит к клеточной гибели. Ишемия характеризуется острой гибелью нейронов и отсроченной гибелью, происходящей через несколько дней после первичного повреждения (Sutherland et al, 2012).

Одним из важнейших пусковых механизмов развития нейродегенеративного процесса является гиперстимуляция глутаматных рецепторов (Hossain, 2005, Hazell,2007), приводящая к эксайтотоксичности, которая является причиной повреждения и гибели клеток. При эксайтотоксичности происходит уменьшение количества АТФ, подавление работы АТФ-зависимых систем повторного захвата нейромедиаторов и высвобождение высоких концентраций нейромедиаторов в межклеточное пространство. (Gorman, 2008). Так как глутамат является наиболее распространенным нейромедиатором мозга, происходит гиперстимуляция NMDA рецепторов и массивный вход Са~ . Вход Са в нервные клетки по каналам ионотропных глутаматных рецепторов нарушает гомеостаз этого внутриклеточного месенджера, запускает каскад внутриклеточных реакций,

которые завершаются быстрой или отсроченной гибелью клеток механизмами апоптоза или некроза (рис.1) (Berliocchi et.al 2005; Bano et al, 2007; Sutherland et al, 2012).

Рис 1. Каскад биохимических процессов, запускаемый при ишемическом повреждении головного мозга (Sutherland et al, 2012).

При фокальной ишемии наблюдается воспалительный ответ, который начинается через несколько часов после ишемии и является типичным вторичным или отсроченным ответом на ишемию. При развитии воспаления происходит активация микроглии и астроцитов за счет поступления через активированные стенки кровеносного сосуда цитокинов, молекул адгезии и хемокинов. На ранних стадиях воспаление усиливает область ишемического поражения. Таким образом, основные ответы на провоспалительные стимулы (выделение цитокинов TNFa и IL-ip и молекул адгезии ICAM-1, Р- и Е-селектинов) происходят в рамках так называемой «нейроваскулярной

единицы». Нейроваскулярная единица представляет собой нейрон, сосудистые клетки (эндотелий, перицит и клетки гладкой мускулатуры) и глиальные клетки (астроциты, микроглию и олигодендроциты). Эти клетки формируют анатомический, биохимический и иммунный гематоэнцефалический барьер, которые поддерживает оптимальный для нейронов химический и клеточный состав (рис.2) (21окоую, 2010).

в Астроцит

■ Эндотелиальная клетка

я Микроглия

S Нейрон

S Нейтрофнл

Олнгодендроцнт

в Перицит

Ремоделированне Активация внеклеточного матрнкса

Пластичность синапсов и дендритов

Ангпогене! н васкулогенет

Воспалительная инфильтрация

Рис 2. Схема процессов, происходящих в пределах нейроваскулярнойсубъединицы.

Ключевыми процессами, сопровождающими сосудистые нарушения при ишемическом повреждении мозга, являются нарушение целостности ГЭБ, гипоперфузия, гипоксия и метаболическая дисфункция эндотелия. (Zlokovic, 2011).

Нарушение целостности ГЭБ - критическое событие при ишемическом инсульте (Jin et al, 2011). Гематоэнцефалический барьер образован специализированными эндотелиальными клетками головного мозга, связанными между собой плотными соединениями и обеспечивающими динамическое взаимодействие между головным мозгом и кровотоком (Abbott et al, 2010). При ишемии или травме происходит увеличение концентрации матриксных металлопротеиназ (ММР-2, ММР-3, ММР-7, и ММР-9), нарушающих целостность сосудисто-нервного матрикса, разрушение плотных межклеточных контактов за счет деградации белков окклудина и

клаудина-5 (Cunningham, 2005). Однако, в рамках воздействия на нейроваскулярную единицу наблюдается многофазность эффектов ММР-9. Так, ММР-9 участвует в процессах, обеспечивающих нарушение целостности ГЭБ, гибель нейронов и кровотечение в первые часы после инсульта, в то время как в последующей фазе репарации благодаря ММР-9 осуществляется нервно-сосудистое ремоделирование (Adibhatla and Hatcher, 2008; Zhao et al., 2006; Cunningham, et al., 2005)

Изменения метаболических функций сосуда могут привести к выделению ряда нейротоксических и воспалительных факторов (Glass et al, 2010). Одним из таких факторов является тромбин, концентрация которого увеличивается при ишемическом поражении, травме, болезни Альцгеймера или других патологических состояниях головного мозга. Тромбин может напрямую воздействовать на нейроны, приводя к их гибели, или косвенно путем активации микроглии и астроцитов (Mhatre et al, 2004). Тромбин играет ключевую роль в системе гемостаза, так как он активирует механизмы положительной и отрицательной обратной связи. Основным механизмом тромбиногенеза в сосудистом русле является так называемый «внешний путь» свертывания крови, индуцируемый тканевым фактором (TF), который экспонируется в кровоток вследствие повреждения или активации эндотелия (Mann, 1999; Roberts, et al., 1998, Strukova, 2006). Сначала на стадии инициации свертывания крови образуется небольшое количество фактора Ха, который, активируя протромбин, стимулирует появление следовых количеств тромбина, достаточных для активации кофакторов - факторов V и VIII - в активные формы (факторы Va и Villa). Активация этих двух кофакторов существенна для развития следующей стадии свертывания -стадии распространения, на которой образуются тенназа, комплекс фактора 1Ха с фактором Villa. В активации фактора IX в 1Ха участвует фактор Vila в комплексе с TF (тканевой фактор), образуемый на стадии инициации. Тенназа активирует фактор X в протеиназу - Ха. Комплекс фактора Ха с фактором Va, протромбиназа, расщепляя две пептидны связи (Arg32o-Ile и

Arg27i-Thr) в протромбине, превращает его в тромбин (Mann, 1999; Strukova, 2006).

PAR2

PAR!

стимул клетки, экспрессирующие тканевой фактор (TF) э

TFATIa

Тромбин (пМ)^- ПРОТРОМБИН

тромбоцит

Протеин С

ф-ген -> фибрин

ИНИЦИАЦИЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

ТМ-тромбомодулин, EPCR-эндотелиальный PC рецептор

Рис. 3. Роль тромбина в процессах, происходящих в фазе инициации (Струкова,

2013).

Тромбин регулирует положительную обратную связь, активируя факторы свёртывания крови V, VIII на стадии инициации и факторы XI, XIII на стадии распространения. Важнейшей функцией тромбина является активация на стадии инициации свертывания отрицательной обратной связи. В комплексе с тромбомодулином эндотелия тромбин превращает протеин С в протеиназу - активированный протеин С, который расщепляет факторы Va и Villa и тем самым лимитирует тромбинообразование (Ruf et al., 2003; Strukova, 2004; 2006) (рис.3).

Кроме того, тромбин вызывает активацию микроглии и опосредует высвобождение провоспалительных агентов, таких как оксид азота (NO),

интерлейкин (IL)-6, IL-la, IL-1(3, и TNF- a in vitro и in vivo (Carreno-Muller et al., 2003; Choi et al., 2003; Choi et al., 2005; Fujimoto et al., 2007). Под воздействием тромбина происходит высвобождение важных провоспалительных медиаторов таких как арахидоновая кислота (Hemendez et al., 1997; Strokin et al., 2003), IL-lp (Boven et al., 2003), и NO, который продуцируется индуцибильной NO-синтазой (Meli et al., 2001; Boven et al., 2003). Таким образом, и при физиологическом гемостазе, и при патологии тромбин стимулирует как фазу инициации свертывания, активируя кофакторы Va и Villa, так и антикоагулянтую систему протеина С, но также тромбин обеспечивает высвобождение провоспалительных медиаторов при появлении высоких его концентраций на стадии распространения свертывания, следующей за фазой инициации и завершающейся образованием фибрина, основы тромба.

Однако ишемический инсульт представляет собой комплексный патологический процесс, обеспечивающий активацию не только процессов воспаления и нейродегенерации, но также участие иммунокомпетентных клеток, в частности тучных клеток. Расположение тучных клеток субэндотелиально на границе между сосудистым руслом и окружающей тканью обеспечивают их способность быстро реагировать на высвобождаение в кровь при ишемии мозга и кровоизлияниях мощных сосудорасширяющех, протеолитических, фибринолитических и провоспалительных медиаторов (Strbian, 2009). Так, рЫ-зависимая активация тучных клеток при церебральной ишемии, связанная с локальным лактатацидозом, приводит к двухфазному высвобождению медиаторов, хранящихся в гранулах тучных клеток. Так, в течение первой быстродействующей фазы происходит высвобождение преформированных медиаторов гистамина, серотонина, гепарина, химазы, триптазы и катепсина G. Другие типы медиаторов, такие как простагландины, лейкотриены, тромбоксаны и цитокины синтезируются de novo и секретируются активированными тучными клетками (Theoharides, 2007, Дугина и др 2002).

Рис 4. Схема воздействия тучных клеток на нейроваскулярную единицу (Б^Ыап е1 а1, 2009).

В головном мозге у крыс тучные клетки обнаруживаются в мягкой оболочке мозга уже в конце внутриутробного развития, а в ЦНС появляются через 7-8 дней после рождения (ЬатЬгасМ-НаП е1 а1, 1990). Предшественники тучных клеток проникают в ЦНС через кровеносные сосуды, с которыми они остаются связанными. У крыс показано участие тучных клеток в формировании ишемического отека мозга на ранние сроках после начала очаговой церебральной ишемии (Б^Ыап е1 а1, 2006). Сравнительно небольшой концентрации тучных клеток может быть достаточно для изменения проницаемости ГЭБ и нарушения его целостности (Езрозко е1 а1, 2001; ЫпсЫэе^ е1 а1, 2010).

Таким образом, при ишемическом повреждении мозга происходит активация процессов воспаления и нейродегенерации, сопряженных с процессами гемостаза и гомеостаза за счет выделения медиаторов воспаления и токсических агентов. В патологический процесс вовлечены все компоненты нейроваскулярной субъединицы, поэтому при моделировании ишемического повреждения необходимо исследовать воздействие протекторных и токсических агентов как на каждый клеточный компонент, так и на всю

субъединицу в целом. В нашей работе мы исследовали влияние активированного протеина С, тромбина и пептидов-аналогов привязанного лиганда, освобождаемого APC, N , на гиппокампальные нейроны. Полученные ранее данные относительно влияния тромбина на астроциты (Gorbacheva et al, 2012; Иванова и др., 2013) и исследуемое в нашей работе влияние АРС и пептидов-аналогов привязанного лиганда- N ' па кокультуру нейронов и тучных клеток, позволяют смоделировать протекторные механизмы нейротропных протеиназ, которые осуществляются в пределах нейроваскулярпой субъединицы.

1.2.Активированный протеин С (АРС): структура, образование, функции

Протеин С (PC) - витамин K-зависимый гликопротеин, который выполняет функции антикоагулянта, гидролизуя факторы Va и Villa (FVa и FVIIIa). PC имеет высокую степень гомологии с другими витамин IC-зависимыми факторами свертывания крови - FVII, FIX, FXa. PC синтезируется в печени как одноцепочечный предшественник, состоящий из 461 аминокислотного остатка. Кроме того, синтез PC обнаружен также в эндотелии сосудов и кератиноцитах кожи человека (Beckmann et al., 1985; Rezaie, 2003; Xue et al., 2004, 2005, 2007). Первые 42 аминокислоты составляют сигнальный пептид (42-25 остатки) и пропептид (24-1 остатки), которые содержат сайт, распознающий витамин K-зависимую карбоксилазу (Foster et al., 1987). Сигнальный пептид, пропептид и внутренний дипептид Lysl56-Argl57 удаляются протеолизом. Перед секрецией из печени происходит превращение PC в двухцепочечный полипептид, включающий лёгкую (155 аминокислот) и тяжёлую цепи (262 аминокислоты), соединенные дисульфидными связями. Молекулярный вес(Мг) зрелого белка 62 кД (23%. составляют углеводы), активированного протеина С (АРС)- 56,2 кДа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Савинкова, Ирина Григорьевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Балезина О.П., Герасименко НТО., Дугина Т.Н., Струкова С.М. Особенности нейротропного действия тромбина // Успехи физиол. наук. -2004. 35(3) - С.37-49.

2. Горбачева JT.P., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Ишивата С., Струкова С.М. Модуляция тромбином и фактором Ха выживаемости гиппокампальных нейронов // Биохимия. - 2006. 71(10). - С. 1338-1346.

3. Горбачева JI.P., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Давыдова О.Н., Ишивата С., Струкова С.М. Активированный протеин С через рецептор PARI регулирует выживаемость нейронов при глутаматной эксайтотоксичности // Биохимия. - 2008. 73(6). - С. 893-902.

4. Дугина Т.Н., Киселева Е.В., Чистов И.В., Умарова Б.А., Струкова С.М. // Биохимия. - 2002. 67(1). - С. 77-87.

5. Иванова А.Е., Горбачёва JT.P., Струкова С.М., Пинелис В.Г., Райзер Г. Участие активированного протеина С и тромбина в регуляции функций астроцитов // Биологические мембраны. - 2013. 30 (5-6). - С. 387-397.

6. Киселева Е.В., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Глуза Е., Струкова С.М. Участие тромбина в активации нейронов гиппокампа крысы // Бюлл.эксп.биол.мед. - 2004. 134(5). - С.519-523.

7. Русанова A.B., Васильева Т.В., Смирнов М.Д., Струкова С.М. Тучные клетки как мишень антивоспалительного действия АРС. // Цитокины и воспаление. - 2009.8(3). - С. 48-54.

8. Румш, JT. Д., Лихарева, В. В., Михайлова, А. Г., Горбачева, Л. Р., Струкова, С. М. Пути реализации уникальной специфичности энтеропептидазы. Физиологическая роль энтеропептидазы // Известия HAH Беларусии - 2008. №1. - С.31-38.

9. Струкова С.М., Серейская A.A., Осадчук Т.В. Структурные основы специфичности тромбина// Усп. совр. биол. - 1989. Т. 107. - С.41-54

10. Струкова С.М., Киреева Е.Г., Дугина Т.Н. Механизмы взаимодействия тромбина с клетками. Взаимодействие тромбина с клетками эндотелия, тучными и другими // Вестник МГУ. Биология. - 1997. № 1. - С. 8-13.

11. Струкова С.М. Тромбин - регулятор процессов воспаления и репарации тканей. - Биохимия. 2001 .Т 66. С. 14-27.

12. Струкова С.М. Роль тромбоцитов и сериновых протеиназ в сопряжении свертывания крови и воспаления // Биохимия. - 2004. Т. 69. - С. 1314-1331.

13. Струкова С.М., Киселёва Е.В., Дугина Т.Н., Глуза Э., Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г. Влияние тромбина на выживание гиппокампальных нейронов // Росс. Физиол. ж. им. Сеченова. - 2005. Т. 91(1). - С. 53-60.

14. Струкова С.М. Основы физиологии гемостаза. М.: Изд.МГУ, 2013.

15. Хаспеков Л.Г. Механизмы и факторы нейродеструктивного действия возбуждающих аминокислот на нейроны головного мозга in vitro.// Автореф. Докт. дисс. Москва. - 1995. - 75С.

16. Adibhatla RM, Dempsy R, Hatcher JF. Integration of cytokine biology and lipid metabolism in stroke // Front Biosci. 2008. 1; 13. - P. 1250-70.

17. Adams MN, Ramachandran R, Yau MK, Suen JY, Fairlie DP, Hollenberg MD, Hooper JD. Structure, function and pathophysiology of protease activated receptors // Pharmacol Ther. 2011. 130(3). P. - 248-82.

18. Abbott AC, Slater PG, Inestrosa NC, Varela-Nallar L, Aranguiz FC. Adult hippocampal neurogenesis in aging and Alzheimer's disease // Birth Defects Res С Embryo Today. 2010. 90(4). - P.284-96.

19. Afkhami-Goli A, Noorbakhsh F, Keller AJ, Vergnolle N, Westaway D, Jhamandas JH, Andrade-Gordon P, Hollenberg MD, Arab H, Dyck RH, Power C. Proteinase-activated receptor-2 exerts protective and pathogenic cell type-specific effects in Alzheimer's disease.// . Immunol.-2007.15; 179(8). -P.5493-503.

20. Anderson L.E., Walsh K.A., and Neurath IT. Bovine enterokinase. Purification, specificity, and some molecular properties. // Biochemistry. 1977. V.16, P.3354-3360.

21. Balazs A.B., Fabian A.J., Esmon Ch.T., and Mulligan R.C. Endothelial protein C receptor (CD201) explicitly identifies hematopoietic stem cells in murine bone marrow // Blood. - 2006. V.107, № 6. - P.2317-2321

22. Balcaitis S., Xie Y., Weinstein J.R., Andersen H., Manisch U.K., Ransom B.R., Möller T. Expression of proteinase-activated receptors in mouse microglial cells // Neuroreport. - 2003. 19; 14(18). - P.2373-7.

23. Barnes PJ, Newton R, Kuitert LM, Bergmann M, Adcock IM. Evidence for involvement of NF-kappaB in the transcriptional control of COX-2 gene expression by IL-lbeta // Biochem Biophys Res Commun. - 1997. 8;237(1). - P. 28-32.

24. Bano D, Nicotera P. Ca2+ signals and neuronal death in brain ischemia // Stroke. - 2007. 38(2 Suppl). - P.674-6.

25. Beckmann R.J, Schmidt R. J., Santerre R. F., Plutzsky J., Crabtree G. R., Long G. L. The structure and evolution of a 461 amino acid human protein C precursor and its messenger RNA, based upon the DNA sequence of cloned human liver cDNAs//Nucleic Acids Res. - 1985. 13.-P. 5233-5247.

26. Befus D, Maurer M, Theoharides T, Granstein RD, Bischoff SC, Bienenstock J, Henz B, Kovanen P, Piliponsky AM, Kambe N, Vliagoftis H, Levi-Schaffer F, Metz M, Miyachi Y, Forsythe P, Kitamura Y, Galli S. What is the physiological function of mast cells? // Exp Dermatol. - 2003. 12(6). - P. 886-910.

27. Berliocchi L., Bano P., Nicotera P. Ca signals and death programmes in neurons // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sei. - 2005. 29;360(1464). - P. 2255-8.

28. Bernard G.R., Vincent J.-.L, Laterre P.-F., LaRosa S.P., Dhainaut J.-F., Lopez-Rodriguez A., et al. Efficacy and safety of recombinant human activated protein C for severe sepsis // N Engl J Med.- 2001. 344,- P. 699-709.

29. Biran V., V.Cochois, A.Karroubi, J.M.Arrang, C. Charriaut-Marlangue, A.Heron. Stroke induces histamine accumulation and mast cell degranulation in neonatal rat brain. // Brain pathology - 2007.

30. Bohrer Ii, Qiu F, Zimmermann T, Zhang Y, Jllmer T, Männel D, Böttiger

BW, Stern DM, Waldherr R, Saeger HD, Ziegler R, Bierhaus A, Martin E,

124

Nawroth PP. Role of NFkappaB in the mortality of sepsis. // J Clin Invest. - 1997. 100(5).-P. 972-85.

31. Boven L.A., Vergnolle N., Henry S.D., et al. Up-regulation of protease-activated receptor 1 expression in astrocytes during HIV encephalitis // J Immunol. -2003. 170.-P.2638-2646. Bretschneider et al, 2010

32. Bunnett N.W. Protease-activated receptors: how proteases signal to cells to cause inflammation and pain // Semin Thromb Hemost. - 2006. V. 32. - P. 39-48.

33. Carreno-Muller E., Herrera A.J., de Pablos R.M. Tomas-Camardiel M., Venero J.L., Cano J., Machado A. Thrombin induces in vivo degeneration of nigral dopaminergic neurones along with the activation of microglia // J Neurochem. -2003. 84.-P. 1201-1214.

34. Cannon J. R., Keep R. F., Schallert T., ITua Y., Richardson R.J., Xi G. Protease-activated receptor-1 mediates protection elicited by thrombin preconditioning in a rat 6-hydroxydopamine model of Parkinson's disease. // Brain Res.-2006. 1116.-P. 177-186.

35. Cheng T., Liu D., Griffin J.H., Fernandez J.A., Castellino F., Rosen E.D., et al. Activated protein C blocks p53-mediated apoptosis in ischemic human brain endothelium and is neuroprotective // Nat. Med. - 2003. 9. - P. 338-342.

36. Choi S.H., Joe E.IT., Kim S.U., Jin B.K. Thrombin-induced microglial activation produces degeneration of nigral dopaminergic neurons in vivo // J Neurosci. - 2003a. 23. - P. 5877-5886.

37. Coughlin S.R. Thrombin signalling and protease activated receptors // Nature. - 2000. V. 407. - P. 258-264.

38. Coughlin S.R. Protease-activated receptors in vascular biology // Thromb. Haemost. - 2001. V. 86. - P. 298-307.

39. Coughlin S.R. Protease-activated receptors in the cardiovascular system // Cold Spring I-Iarb Symp Quant Biol. - 2002. 67. - P. 197-208.

40. Coughlin S.R. Protease-activated receptors in hemostasis, thrombosis and vascular biology//J Thromb Haemost. - 2005. V. 3(8). - P. 1800-1814.

41. Critchley G, Sumar N, O'Neill K, Iiermon-Taylor J, Bell BA. Cerebral trypsinogen expression in human and rat cerebrospinal fluid // Neurosci Lett. -2000. 283(1).-P. 13-6.

42. Cunningham D.D., Pulliam L., Vaughan P.J. Protease nexin-1 and thrombin: injury-related processes in the brain // Thromb Haemost. - 1993. 70. - P. 168-171.

43. Cunningham C, Wilcockson DC, Campion S, Lunnon K, Perry VII. Central and systemic endotoxin challenges exacerbate the local inflammatory response and increase neuronal death during chronic neurodegeneration // J Neurosci. - 2005. 25(40).-P. 9275-84.

44. Dahlback B, Villoutreix BO. The anticoagulant protein C pathway // FEBS Lett. - 2005. 579(15). - P. 3310-6.

45. De La Houssaye BA, Mikule K, Nikolic D, Pfenninger KIT Thrombin-induced growth cone collapse: involvement of phospholipase A(2) and eicosanoid generation//Neurosci. - 1999 .19(24).-P. 10843-55.

46. de Cristofaro R., Carotti A., Akhavan S., Palla R., Peyvandi F., Altomare C., Mannucci P.M. The natural mutation by deletion of Lys9 in the thrombin A-chain affects the pKa value of catalytic residues, the overall enzyme's stability and conformational transitions linked to Na+ binding // FEBS J. - 2006. 273(1). - P. 159-69.

47. Didonato JA, Saatcioglu F, Karin M. Molecular mechanisms of immunosuppression and anti-inflammatory activities by glucocorticoids // Am J RespirCrit Care Med. - 1996. 154.-P. 11-5.

48. Domotor E, Benzakour O, Griffin JH, Yule D, Fukudome K, Zlokovic BV. Activated protein C alters cytosolic calcium flux in human brain endothelium via binding to endothelial protein C receptor and activation of protease activated receptor-1 //Blood. - 2003 .101(12).-P. 4797-801.

49. Donovan F.M., Cunningham D.D. Signaling pathways involved in thrombin-induced cell protection //J Biol Chem. - 1998. 22;273(21). - P.: 12746-52.

50. Donovan FM, Pike CJ, Cotman CW, Cunningham DD. Thrombin induces apoptosis in cultured neurons and astrocytes via a pathway requiring tyrosine kinase and RhoA activities //Neurosci.- 1997. 17(14).- P. 5316-26.

51. Dugina T.N., Kiseleva E.V., Glusa E., Strukova S.M. Activation of mast cells induced by agonists of proteinase-activated receptors under normal conditions and during acute inflammation in rats // Eur. J. Pharmacol. - 2003. V. 471(2). - P. 141147.

52. Dumas J.J., Kumar R., Seehra J., et al. Crystal structure of the Gplbalpha-thrombin complex essential for platelet aggregation // Science. - 2003. 301. - P. 222-226.

53. Esposito I, Friess IT, Kappeler A, Shrikhande S, Kleeff J, Ramesh H, Zimmermann A, Büchler MW. Mast cell distribution and activation in chronic pancreatitis // Hum Pathol. - 2001. 32(11).- P. 1174-83.

54. Esmon C.T., Gu J-M, Xu J, Qu D, Stearns-Kurosawa D J., Kurosawa SH Regulation and functions of the protein C anticoagulant pathway // Haematologica -1999. 84,-P. 363-368.

55. Evstratova AA, Mironova EV, Dvoretskova EA, Antonov SM. Apoptosis and its receptor selective pathways during neurotoxic action of glutamate // Ross Fiziol Zh Im IM Sechenova. - 2008. 94(4). - P. 380-93.

56. Feistritzer C, Riewald M. Endothelial barrier protection by activated protein C through PARI-dependent sphingosine 1-phosphate receptor-1 crossactivation // Blood. - 2005.105(8). - P.3178-84.

57. Foster D.C., Rudinski M.S., Schach B.G., Berkner K.L., Kumar A.A., Hagen F.S., Sprecher C.A., Insley M.Y., Davie E.W. Propeptide of human protein C is necessary for gamma-carboxylation // Biochemistry. - 1987. 26. - P. 7003-7011.

58. Fujimoto S., Katsuki H., Ohnishi M., et al. Thrombin induces neurotoxicity depending on mitogen-activated protein kinase pathways in vivo // Neurosci. -2007. 144.-P. 694-701.

59. Fukudome K., Esmon C.T. Identification, cloning, and regulation of a novel endothelial cell protein C/activated protein C receptor // J Biol Chem. - 1994. V.269. - P. 26486-26491.

60. Fukudome K, Esmon CT. Molecular cloning and expression of murine and bovine endothelial cell protein C/activated protein C receptor (EPCR). The structural and functional conservation in human, bovine, and murine EPCR // J Biol Chem. - 1995. 270(10). - P.5571-7.

61. Fukudome K, Ye X, Tsuneyoshi N, Tokunaga O, Sugawara K, Mizokami II, Kimoto M. Activation mechanism of anticoagulant protein C in large blood vessels involving the endothelial cell protein C receptor // J Exp Med. - 1998.187(7). -P.1029-35.

62. Galligan L., Livingstone W., Volkov Y., Hokamp K., Murphy C., Lawler M., Fukudome K., and Smith O. Characterization of protein C receptor expression in monocytes // Br J Haematol. - 2001. V.l 15. - P.408-414.

63. Gasparian M.E., Ostapchenko V.G., Schulga A.A., Dolgikh D.A., Kirpichnikov M.P. Expression, purification, and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coll // Prot. Expr. Purif. - 2003.31 — P. 133-139

64. Gorbacheva L., V. Pinelis, S. Ishiwata, G. Reiser. Activated protein C prevents glutamate and thrombin-induced activation of NF- kB in cultured hippocampal neurons.//Neuroscience.-2010. 165.-P. 1138-1146.

65. Gorbacheva L., Ivanova A., Reiser G., Strukova S. The thrombin-induced proliferation of astrocytes is regulated by activated protein C // European Journal of Neurology. - 2012. 19, № SI Suppl. - P.506- 506.

66. Gorbacheva L, Strukova S, Pinelis V, Ishiwata S, Strieker R, Reiser G. NF-KB-dependent and -independent pathways in the protective effects of activated protein C in hippocampal and cortical neurons at excitotoxicity // Neurochem Int. -2013. 63(2).-P. 101-11.

67. Gorman AM. Neuronal cell death in neurodegenerative diseases: recurring

themes around protein handling // J Cell Mol Med. - 2008. 12(6A). - P. 2263-80.

128

68. Griffin J.I-L, Fernandez J.A., Mosnier L.O., Liu D., Cheng T., Guo IT., Zlokovie B.V. The promise of protein C // Blood Cells Mol Dis. - 2006. 36(2). -P. 211-6.

69. Griffin J.I-L, Fernández J.A., Gale A.J., Mosnier L.O. Activated protein C // J Thromb I-Iaemost. - 2007. 5 Suppl 1. - P. 73-80.

70. Guo II., Liu D., Gelbard TL, Cheng T., Insalaco R., Fernandez J.A., et al. Activated protein C prevents neuronal apoptosis via protease activated receptors 1 and 3 // Neuron. - 2004. 41. - P. 563-572.

71. Guo H, Singh I, Wang Y, Deane R, Barrett T, Fernández JA, Chow N, Griffin JH, Zlokovie BV. Neuroprotective activities of activated protein C mutant with reduced anticoagulant activity // Eur J Neurosci. - 2009.29(6). - P. 1119-30.

72. ITadorn B, Tarlow M.J., Lloyd J.K, and Wolff O.H. Intestinal enterokinase deficiency.//Lancet - 1969 - P.812-813.

73. Haworth J.C., Gourley B, ITadorn B., Sumida C. Malabsorption and growth failure due to intestinal enterokinase deficiency. // J. Pediatr. 1971. V. 78. P. 481— 490.

74. Hazell AS. Excitotoxic mechanisms in stroke: an update of concepts and treatment strategies // Neurochem Int. - 2007.50(7-8). - P. 941-53.

75. Flinchcliff M, Varga J. Obliterative vasculopathy in systemic sclerosis: endothelial precursor cells as novel targets for therapy // Expert Rev Clin Immunol. -2007. 3(1). — P. 11-5.

76. Henrich-Noack P., Riek-Burchardt M., Reymann K.G., Reiser G. Cellular expression pattern of the protease-activated receptor 4 in the hippocampus in naieve rats and after global ischaemia // Journal of Neuroscience Research - 2010. 88.-P. 850-857.

77. Hoffmann J.N., Vollmar B., Laschke M.W., Fertmann J.M., Jauch K-W., Menger M.D. Microcirculatory alterations in ischemia-reperfusion injury and sepsis: effects of activated protein C and thrombin inhibition // Critical Care. -2005. V. 9(suppl 4). - P. S33-S37.

78. Hollenberg M.D., Iioule S. Proteinases as hormone-like signal messengers // Swiss Med Wkly. - 2005. 23; 135(29-30). - P. 425-32.

79. Iiossain M.A. Molecular mediators of hypoxic-ischemic injury and implications for epilepsy in the developing brain // Epilepsy Behav. - 2005. 7(2). -P. 204-13.

80. Hu IT, Yamashita S, Iiua Y, Keep RF, Liu W, Xi G. Thrombin-induced neuronal protection: role of the mitogen activated protein kinase/ribosomal protein S6 kinase pathway // Brain Res. - 2010. 18; 1361. - P. 93-101.

81. Huang C.F., Li G., Ma R., et al. Thrombin-induced microglial activation contributes to the degeneration of nigral dopaminergic neurons in vivo // Neurosci Bull.-2008. 24.-P. 66-72.

82. Ishida Y., Nagai A., Kobayashi S., Kim S. U. Upregulation of protease-activated receptor-1 in astrocytes in Parkinson disease: astrocyte-mediated neuroprotection through increased levels of glutathione peroxidase // J Neuropathol Exp Neurol. - 2006. 65. - P. 66-77.

83. Ishihara H, Connolly AJ, Zeng D, Kahn ML, Zheng YW, Timmons C, Tram T, Coughlin SR. Protease-activated receptor 3 is a second thrombin receptor in humans // Nature. - 1997. 386 (6624). - P. P502-6.

84. Jin R, Song Z, Yu S, Piazza A, Nanda A, Penninger JM, Granger DN, Li G. Phosphatidylinositol-3-kinase gamma plays a central role in blood-brain barrier dysfunction in acute experimental stroke // Stroke. - 2011. 42(7). - P.2033-44.

85. Joyce D.E., Gelbert L., Ciaccia A., DeHoff B., Grinnell B.W. Gene expression and profile of antithrombotic protein c defines new mechanisms modulating inflammation and apoptosis //J Biol Chem. - 2001. 276.- P. 11199-11203.

86. Joyce D.E., Nelson D.R., Grinnell B.W. Leukocyte and endothelial cell interactions in sepsis: relevance of the protein C pathway // Crit Care Med. - 2004. 32.-P. S280-S286.

87. Junge C.E., Lee C.J., Hubbard K.B., et al. Protease-activated receptor-1 in human brain: localization and functional expression in astrocytes // Exp Neurol. -2004. 188.-P. 94-103.

88. Kuboyama K, Harada H, Tozaki-Saitoh H, Tsuda M, Ushijima K, Inoue K. Astrocytic P2Y(1) receptor is involved in the regulation of cytokine/chemokine transcription and cerebral damage in a rat model of cerebral ischemia // J Cereb Blood FlowMetab.-2011. 31(9).-P. 1930-41.

89. Lambracht-Hall M, Dimitriadou V, Theoharides TC. Migration of mast cells in the developing rat brain // Brain Res Dev Brain Res.- 1990. 1;56(2). - P. 151-9.

90. Laszik Z., Mitro A., Taylor F.B., Jr., Ferrell G., Esmon C.T. Human protein C receptor is present primarily on endothelium of large blood vessels: implications for the control of the protein C pathway. // Circulation. - 1997. V. 96. - P. 36333640.

91. Levi M., Poll T., Biiller TI.R. Bidirectional Relation Between Inflammation and Coagulation. // Circulation. - 2004. V. 109. - P. 2698-2704.

92. Light A, Janska IT. Enterokinase (enteropeptidase): comparative aspects // Trends Biochem Sci. - 1989. 14(3). - P. 110-2.

93. Lindsberg P., Strbian D., Karjalainen-Lindsberg M. Mast cells as early responders in the regulation of acute blood-brain barrier changes after cerebral ischemia and hemorrhage // J Cereb Blood Flow Metab. - 2010. 30(4). - P. 689702.

94. Lopez I., Mak E.C., Ding J., ITamm H.E., Lomasney J.W. A novel Afunctional PLC that is regulated by G alpha 12 and stimulates the Ras/mitogen activated protein kinase pathway. // J. Biol. Chem. - 2001. 276. - P. 2758-2765.

95. Loubele ST, Spronk HM, Ten Cate IT. Activated protein C: a promising drug with multiple effects? // Mini Rev Med Chem. - 2009. 9(5). - P. 620-6.

96. Lu, D., Futterer, K., Korolev, S., Zheng, X., Tan, K., Waksman, G., Sadler, J.E. Crystal structure of enteropeptidase light chain complexed with an analog of the trypsinogen activation peptide // J. Mol. Biol. - 1999. 292. - P. 361-373.

97. Luo W., Wang Y., Reiser G. Protease-activated receptors in the brain: receptor expression, activation, and functions in neurodegeneration and neuroprotection. // Brain Res Rev. - 2007. 56. - P. 331-345.

98. Macfarlane SR, Scatter MJ, Kanke T, Hunter GD, Plevin R. Proteinase-activated receptors // Pharmacol Rev. - 2001.53(2). - P. 245-82.

99. Madhusudhan T., Tsermann B. At the cutting edge: conformational PARtiality. //Journal of Thrombosis and Haemostasis. - 2012. 10.-P. 1672-1674.

100. Mann K.G. Biochemistry and physiology of blood coagulation. // Thromb Haemost. - 1999. 82. - P. 165-174.

101. Maroux S., Baratti J., Desnuelle P. Purification and Specificity of Porcine Enterokinase.//J. Biological Chemistry.- 1971.246, N16.- P. 5031-5039.

102. Masada T., Xi G., Hua Y., Keep R.F. The effects of thrombin preconditioning on focal cerebral ischemia in rats // Brain Res. - 2000. 867(1-2). - P. 173-9.

103. Mather T, Oganessyan V, Hof P, Huber R, Foundling S, Esmon C, Bode W. The 2.8 A crystal structure of Gla-domainless activated protein C // EMBO J. -1996. 15(24). - P. 6822-31.

104. McCutcheon K.R., Freese J.A., Frean J.A., Veale R.B., Sharp B.L., Markus M.B. Chloroquine-resistant isolates of Plasmodium falciparum with alternative CG2 omega repeat length polymorphisms // Am J Trop Med Hyg. - 2000. 62(2). -P. 190-2.

105. McLaughlin JN, Patterson MM, Malik AB. Pro tease-activated receptor-3 (PAR3) regulates PARI signaling by receptor dimerization // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2007. 104(13). - P. 5662-7.

106. Mhatre M., Nguyen A., Kashani Sh., Pham T., Adesina A., Grammas P. Thrombin, a mediator of neurotoxicity and memory impairment. // Neurobiology of Aging. - 2004. 25. - P. 783-793

107. Meli R., Raso G.M., Cicala C., Thrombin and PAR-1 activating peptide increase iNOS expression in cytokine-stimulated C6 glioma cells. // J Neurochem. -2001. 79.-P. 556-563.

108. Mikhailova, A.G., Rumsh, L.D. Enteropeptidase: structure and function: application in biotechnology // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2000. V. 88 - P.l 59— 174.

109. Miyata S., Koshikawa N., ITigashi S., Miyagi Y., Nagashima Y., Yanoma S., Kato Y., Yasumitsu II., Miyazaki K. Expression of trypsin in human cancer cell lines and cancer tissues and its tight binding to soluble form of Alzheimer amyloid precursor protein in culture. // J Biochem. - 1999. 125(6). - P. 1067-76.

110. Molino M., Barnathan E.S., Numerof M., Clark J., Dreyer M., Cumashi A., Hoxi J.A., Schechter N., Woolkalis M., Brass L.F. Interactions of mast cell tryptase with thrombin receptors and PAR-2. // J. Biol. Chem. - 1997. V. 272. - P. 4043-4049.

111. Mosnier LO, Castellino FJ, Weiler H, Rosen IT, Niessen F, Furlan-Freguia C, Fernandez JA, Griffin JH, Ruf W. Endogenous EPCR/aPC-PARl signaling prevents inflammation-induced vascular leakage and lethality // Blood - 2009. 113(12).-P. 2859-2866.

112. Mosnier LO, Sinha RK, Burnier L, Bouwens EA, Griffin JH. Biased agonism of protease-activated receptor 1 by activated protein C caused by noncanonical cleavage at Arg46 // Blood - 2012. 120(26). - P. 5237-46.

113. Nakanishi-Matsui M, Zheng YW, Sulciner DJ, Weiss EJ, Ludeman MJ, Coughlin SR.PAR3 is a cofactor for PAR4 activation by thrombin. . // Nature. 2000 Apr 6;404(6778). - P. 609-13

114. Nakayama T., ITirano K., Hirano M., Nishimura J., Kuga H., Nakamura K., Takahashi S., Kanaide IT. Inactivation of protease-activated receptor-1 by proteolytic removal of the ligand region in vascular endothelial cells. // Biochem Pharmacol. -2004. 1.68(1).-P. 23-32.

115. Nanevicz T, Ishii M, Wang L, Chen M, Chen J, Turck CW, Cohen FE, Coughlin SR. Mechanisms of thrombin receptor agonist specificity. Chimeric receptors and complementary mutations identify an agonist recognition site // J Biol Chem. - 1995. 270(37). - P.21619-25

116. Niclou S.P., Suidan H.S., Pavlik A., Changes in the expression of protease-activated receptor 1 and protease nexin-1 mRNA during rat nervous system development and after nerve lesion. // Eur J Neurosci. - 1998. 10. - P. 1590-1607.

117. Noorbakhsh F., Vergnolle N., McArthur J.C., Silva C., Vodjgani M., Andrade-Gordon P., Iiollenberg M.D., Power C. Proteinase-activated receptor-2 induction by neuroinflammation prevents neuronal death during HIV infection. // J Immunol.-2005. 1, 174(11).-P. 7320-9.

118. Noorbakhsh F, Tsutsui S, Vergnolle N, Boven LA, Shariat N, Vodjgani M, Warren KG, Andrade-Gordon P, Iiollenberg MD, Power C. Proteinase-activated receptor 2 modulates neuroinflammation in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis // J Exp Med. - 2006. 203(2). - P. 42535.

119. O'Brien L.A., Gupta A., Grinnell B.W. Activated protein C and sepsis. // Front Biosci. - 2006. 1; 11. - P. 676-98.

120. Oganesyan V., Oganesyan N., Terzyan S., Qu D., Dauter Z., Esmon N.L., Esmon C.T. The crystal structure of the endothelial protein C receptor and a bound phospholipid. //J Biol Chem. - 2002. V.277. - P. 24851-24854.

121. Olney J.W. Role of excitotoxins in developmental neuropathology. // APMIS Suppl.- 1993. 40.-P. 103-12.

122. Ossovskaya V.S., Bunnett N.W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease. // Physiol Rev. - 2004. 84. - P. 579-621.

123. Panickar K.S., Norenberg. M.D. // Glia. Vol. 50. P. 287-298.

124. Renesto P., Si-Tahar M., Moniatte M., Balloy V., Van Dorsselaer A., Pidard D., Chignard M. Specific inhibition of thrombin-induced cell activation by the neutrophil proteinases elastase, cathepsin G, and proteinase 3: evidence for distinct cleavage sites within the aminoterminal domain of the thrombin receptor // Blood. - 1997. V. 89.-P. 1944-1953.

125. Riek-Burchardt M., Striggow F., Henrich-Noack P., et al. Increase of prothrombin-mRNA after global cerebral ischemia in rats, with constant expression of protease nexin-1 and protease-activated receptors // Neurosci Lett. -2002. 329. - P. 181-184.

126. Rezaie A.R. Exosite-dependent regulation of the protein C anticoagulant pathway // Trends in Cardiovascular Medicine. - 2003. V. 13. - P. 8-15.

127. Riewald M., Petrovan R.J., Donner A. et al.: Activation of endothelial cell protease activated receptor 1 by the protein C pathway // Science. - 2002. 296. - P. 1880-1882.

128. Riewald M., Ruf W. Protease-activated receptor-1 signaling by activated protein C in cytokine-perturbed endothelial cells is distinct from thrombin signaling // J Biol Chem. - 2005. 280. - P. 19808-19814.

129. Rohatgi T., Henrich-Noack, P., Sedehizade, F., Goertler, M., Wallesch, C. W., Reymann, K. G., Reiser, G. Transient focal ischemia in rat brain differentially regulates mRNA expression of protease-activated receptors 1 to 4 // J Neurosci Res. - 2004a. 75. - P. 273-279.

130. Ruf W., Dorfleutner A., Riewald M. Specificity of coagulation factor signaling// J Thromb Haemost. -2003. l.-P. 1495-1503.

131. Rumsh LD, Mikhailova AG, Mikhura IV, Prudchenko IA, Chikin LD, Mikhaleva II, Kaliberda EN, Dergousova N1, Mel'nikov EE, Formanovskii AA. Selective inhibitors of plasmepsin II from Plasmodium falciparum based on pepstatin // Bioorg Khim. - 2008. 34(6). - P. 739-46.

132. Russo A., Soh U.J.K., Trejo J. Proteases display biased agonism at protease-activated receptor: location matters. // Molecular interventions, Vol.9, issue2, pp. 87-96, 2009.

133. Saito T, Bunnett NW. Protease-activated receptors: regulation of neuronal function // Neuromolecular Med. - 2005. 7(1-2). - P. 79-99.

134. Schulte G., Shenoy S.K. Beta-arrestin and disheveled coordinate biased signaling. // PNAS Early edition, 2012.

135. Shahzad K., B. Isermann. The evolving plasticity of coagulation protease-dependent cytoprotective signaling. // Haemostaseologie - 2011.

136. Shapiro MJ, Weiss EJ, Faruqi TR, Coughlin SR. Protease-activated receptors 1 and 4 are shut off with distinct kinetics after activation by thrombin // J Biol Chem.- 2000. 275(33). - P. 25216-21.

137. Shenoy S.K., Lefkowitz R.J. Beta-arrestin -biased receptor trafficking and signal transduction. // Trends Pharmacol Sci. - 2011. 32. - P. 521-533.

138. Shibata E, Yoshida M, Kimura T, Kitaichi K, Suzuki R, Baba K, Matsushima M, Tatsumi Y, Takagi K, Hasegawa T, Takagi K. Induction of histamine release from rat peritoneal mast cells by histatins // Biol Pharm Bull.- 2001. 24(11).-P. 1267-70.

139. Skaper SD, Facci L. Mast cell-glia axis in neuroinflammation and therapeutic potential of the anandamide congener palmitoylethanolamide // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. - 2012. 5;367(1607). - P. 3312-25.

140. Smith-Swintosky VL, Cheo-Isaacs CT, D'Andrea MR, Santulli RJ, Darrow AL, Andrade-Gordon P. Protease-activated receptor-2 (PAR-2) is present in the rat hippocampus and is associated with neurodegeneration // J Neurochem. - 1997. 69(5).-P. 1890-6.

141. Soh U.J.K., Trejo J. Activated protein C promotes protease-activated receptor-1 cytoprotective signaling through beta-arrestin and disheveled-2 scaffolds. // Proc Natl Acad Sci USA.- 2011.108(50). - P. El 372-80..

142. Steinhoff M., Buddenkotte J., Shpacovitch V., Rattenholl A., Moormann C., Vergnolle N., Luger T.A., Hollenberg M.D. Proteinase-Activated Receptors: Transducers of Proteinase-Mediated Signaling in Inflammation and Immune Response // Endocr Rev. - 2005. 26(1). - P. 1-43.

143. Strbian D., P.T. Kovanen, M.L. Karjalainen-Lindsberg, T. Tatlisumak, P.J. Lindsberg. An emerging role of mast cells in cerebral ischemia and hemorrhage. // Annals of Medicine - 2009. 41. - P. 438-450.

144. Striggow F., Riek M., Breder J., Henrich-Noack P., Reymann K. G., Reiser G. The protease thrombin is an endogenous mediator of hippocampal neuroprotection against ischemia at low concentrations but causes degeneration at high concentrations // Proc Nat Acad Sci USA. - 2000. 97. - P. 2264-2269.

145. Striggow F., Riek-Burchardt M., Kiesel A., et al. Four different types of protease-activated receptors are widely expressed in the brain and up-regulated in hippocampus by severe ischemia // Eur J Neurosci. - 2001. 14. - P. 595-608.

146. Strokin M, Sergeeva M, Reiser G. Role of Ca2+-independent phospholipase

A2 and n-3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid in prostanoid

136

production in brain: perspectives for protection in neuroinflammation // Int J Dev Neurosci. - 2004. 22(7). - P. 551-7.

147. Strukova S.M., Dugina T.N., Chistov I.V. Lange M., Markvicheva E.A., Kuptsova S., Zubov V.P., Glusa E. Immobilized thrombin receptor agonist peptide accelerates wound healing in mice // Clin. Appl. Thromb. Hemost. - 2001. V.7. - P. 325-329

148. Strukova S. Blood coagulation-dependent inflammation. Coagulation-dependent inflammation and inflammation-dependent thrombosis // Front Biosci. -2006. 11.-P. 59-80.

149. Scheffer G.L., Flens M.J., Hageman S., Izquierdo M.A., Shoemaker R.H., Scheper R.J. Expression of the vascular endothelial cell protein C receptor in epithelial tumour cells // Eur J Cancer. - 2002. V. 38. - P. 1535-1542.

150. Striggow F., Riek M., Breder J., Henrich-Noack P., Reymann K. G., Reiser G. The protease thrombin is an endogenous mediator of hippocampal neuroprotection against ischemia at low concentrations but causes degeneration at high concentrations // Proc Nat Acad Sci USA. - 2000. 97. - P. 2264-2269.

151. Strukova SM. Role of platelets and serine proteinases in coupling of blood coagulation and inflammation // Biochemistry (Mosc). - 2004. 69(10). - P. 106781.

152. Stubbs M.T., Bode W. A player of many parts: the spotlight falls on thrombin's structure // Thromb Res. - 1993. 69(1). - P. 1-58.

153. Suo Z., Wu M., Citron B. A., Palazzo R. E., Festoff B. W., Gao C. Rapid tau aggregation and delayed hippocampal neuronal death induced by persistent thrombin signaling. // J Biol Chem. - 2003. 278. - P. 37681-37689.

154. Sutherland BA, Minnerup J, Balami JS, Arba F, Buchan AM, Kleinschnitz C. Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside // Int J Stroke.-2012. 7(5).- P. 407-18.

155. Swift S., Leger A.J., Talavera J., Zhang L., Bohm A., Kuliopulos A. Role of the PARI Receptor 8th Helix in Signaling The 7-8-1 receptor activation mechanism // J Biol Chem. - 2006. V. 281, N. 7. - P. 4109-4116.

156. Taylor Jr. F.B., Peer G.T., Lockhart M.S., Ferrell G., Esmon C.T. Endothelial cell protein C receptor plays an important role in protein C activation in vivo // Blood. - 2001. V. 97. - P. 1685-1688.

157. Theoharides TC, Kempuraj D, Tagen M, Conti P, Kalogeromitros D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation // Immunol Rev. - 2007. 217:65. - P.78.

158. Thiyagarajan M, Fernández JA, Lane SM, Griffin JH, Zlokovic BV. Activated protein C promotes neovascularization and neurogenesis in postischemic brain via protease-activated receptor 1 // J Neurosci. - 2008. 28(48). - P. 12788-97.

159. Trejo J. Protease-Activated Receptors: New Concepts in Regulation of G Protein-Coupled Receptor Signaling and Trafficking // The journal of pharmacology and experimental therapeutics - 2003. Vol. 307, No. 2. - P. 437442.

160. Turgeon V.L., Lloyd E.D., Wang S., Festoff B.W., Houenou L.J. Thrombin Perturbs Neurite Outgrowth and Induces Apoptotic Cell Death in Enriched Chick Spinal Motoneuron Cultures through Caspase Activation // J Neurosci. - 1998. 18(17).-P. 6882-6891.

161. Vaughan P.J., Pike C.J., Cotman C.W., Cunningham D.D. Thrombin receptor activation protects neurons and astrocytes from cell death produced by environmental insults//J Neurosci. - 1995. 15.-P. 5389-5401.

162. Vergnolle N. Protease-activated receptors and inflammatory hyperalgesia // Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro. - 2005. Vol. 100(Suppl. I). - P. 173-176.

163. Verkhratsky A. Butt A. // Glial neurobiology. John Wiley & Sons - 2007. - P. 230.

164. Wang H., Ubi J.J., Reiser G. Four subtypes of protease-activated receptors, co-expressed in rat astrocytes, evoke different physiological signaling // Glia. -2002. 37.-P. 53-63.

165. Wang Y., Richter-Landsberg C., Reiser G. Expression of protease-activated receptors (PARs) in OLN-93 oligodendroglial cells and mechanism of PAR-1-induced calcium signaling // Neuroscience. - 2004. 126(1). - P. 69-82.

166. Wang Y., Luo W., Reiser G. Activation of protease-activated receptors in astrocytes evokes a novel neuroprotective pathway through release of chemokines of the growth-regulated oncogene/cytokine-induced neutrophil chemoattractant family // Eur J Neurosci. - 2007a. 26. - P. 3159-3168.

167. Wang Y., Zhao Z., Chow N., Ali T., Griffin J.H., Zlokovic B. Activated protein C analog promotes neurogenesis and improves neurological outcome after focal ischemic stroke in mice via protease activated receptor 1. // Brain Research, 1507, pp. 97-104,2013.

168. Won S.J., Kim D.Y., Gwag B.J. Cellular and Molecular Pathways of Ischemic Neuronal Death // J Bioch Mol Biol. - 2002. Vol. 35, No. 1. - P. 67-86.

169. Xi G., Reiser G., Keep R.F. The role of thrombin and thrombin receptors in ischemic, hemorrhagic and traumatic brain injury: deleterious or protective? // J Neurochem. - 2003. 84. - P. 3-9.

170. Xu J., Qu D., Esmon N.L., Esmon C.T. Metalloproteolytic Release of Endothelial Cell Protein C Receptor // J Biol Chem. - 2000. 275(8):25. - P. 60386044.

171. Xue M., Thompson P., Kelso I., and Jackson C. Activated protein C stimulates proliferation, migration and wound closure, inhibits apoptosis and upregulates MMP-2 activity in cultured human keratinocytes // Exp Cell Res. -2004. V.299. - P. 119-127.

172. Xue M., Campbell D., Sambrook P. N., Fukudome K., and Jackson C. J. Endothelial Protein C Receptor and Protease-Activated Receptor-1 Mediate Induction of a Wound-ITealing Phenotype in Human Keratinocytes by Activated Protein C // J Invest Dermatol. - 2005. V. 125. - P. 1279-1285.

173. Xue M., Campbell D., Jackson C.J. Protein C is an autocrine growth factor for human skin keratinocytes //J Biol Chem. - 2007. 4;282(18). - P. 13610-6.

174. Yahagi N, Ichinose M, Matsushima M, Matsubara Y, Miki K, Kurokawa K, Fukamachi IT, Tashiro K, Shiokawa K, Kageyama T, Takahashi T, Inoue H, Takahashi K. Complementary DNA cloning and sequencing of rat enteropeptidase

and tissue distribution of its mRNA // Biochem Biophys Res Commun. - 1996. 219(3).-P. 806-12.

175. Yamashina I. The action of enterokinase on trypsinogen // Biochim Biophys Acta - 1956. 20(2). - P. 433-4.

176. Yuan, X., Zheng, X., Lu, D., Rubin, D.C., Pung, C.Y.M., Sadler, J.E. Structure of murine enterokinase (enteropeptidase) and expression in small intestine during development //Am. J. Physiol. - 1998. 274. - P.G342-G349.

177. Zhang Y.M., Bhavnani B.R. Glutamate-induced apoptosis in primary cortical neurons is inhibited by equine estrogens via down-regulation of caspase-3 and prevention of mitochondrial cytochrome c release BMC // Neurosci. - 2005. 6. - P. 13.

178. Zhao BQ, Wang S, Kim HY, Storrie H, Rosen BR, Mooney DJ, Wang X, Lo EH. Role of matrix metalloproteinases in delayed cortical responses after stroke // Nat Med. - 2006.12(4). - P. 441-5.

179. Zheng GQ, Wang XT, Wang XM, Gao RR, Zeng XL, Fu XL, Wang Y. Longtime course of protease-activated receptor-1 expression after intracerebral hemorrhage in rats //Neurosci Lett. - 2009. 459(2). - P. 62-5.

180. Zheng XL, Kitamoto Y, Sadler JE. Enteropeptidase, a type II transmembrane serine protease // Front Biosci (Elite Ed). - 2009.1. - P. 242-9.

181. Zlokovic B.V., Zhang C., Liu D., Fernandez J., Griffin J.H., Chopp M. Functional recovery after embolic stroke in rodents by activated protein C // Ann Neurol. - 2005. 58(3). - P. 474-7.

182. Zlokovic BV. Neurodegeneration and the neurovascular unit // Nat Med.-2010. 16(12).-P. 1370-1.

183. Zlokovic BV, Griffin JH. Cytoprotective protein C pathways and implications for stroke and neurological disorders // Trends Neurosci.- 2011. 34(4). - P. 198209.