Роль протеин киназы С в механизмах нарушения кальциевого гомеостаза в нейронах мозжечка и коры при гиперстимуляции глутаматных рецепторов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.13, кандидат биологических наук Персиянцева, Надежда Александровна

• Персиянцева, Надежда Александровна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Персиянцева, Надежда Александровна

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Научная новизна работы

1.4. Практическая ценность работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Физиологическая роль глутамата

2.2. Патологическая роль глутамата

2.2.1. Влияние глутаматного удара на внутриклеточную концентрацию кальция

2.2.2. Роль глутамата при ишемии 15 2.3 Протеин киназа С

2.3.1. Строение и функции ПКС

2.3.2. Активация ПКС

2.3.3. RACKs

2.3.4. ПКС и СаМ

2.3.5. "Down-regulation" ПКС

2.3.6. Активность ПКС в культурах нейронов, гибель клеток

2.3.7. Транслокация ПКС

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Реагенты

3.2. Приготовление первичных культур нейронов коры и мозжечка

3.3. Индукция гибели

3.4. Биохимические и флуоресцентные методы анализа жизнеспособности нейронов

3.4.1. Флуоресцентное окрашивание Hoechst 33342, Ethidium bromide, SYTO

3.4.2. MTT

3.5. Микрофлуориметрические исследования

3.5.1. Измерение [Са ],

3.5.2. Измерение относительного уровня Ау/т

3.5.3. Математический анализ

3.6. Определение активности ПКС

3.7. Трансфекция ПКСрП

3.8. Иммунофлуоресцентное окрашивание ПКС

3.9. Статистический анализ результатов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Исследование действия ФЭ и ингибиторов на активность ПКС

4.1.1. Влияние ингибиторов и ФЭ на активность ПКС в культивируемых нейронах

4.1.2. Активность ПКС при глутаматном воздействии

4.2. Влияние ингибиторов ПКС, ФЭ и окадаевой кислоты на индуцированные глутаматом изменения динамики [Са2+], и Д\|/т

4.2.1. Влияние ингибиторов ПКС и ФЭ на первую фазу индуцированного глутаматом изменения динамики [Са2*],

4.2.2. Влияние ингибиторов ПКС и ФЭ на вторую фазу индуцированного глутаматом изменения динамики [Са2т]

4.2.3. Влияние окадаевой кислоты на индуцированные глутаматом изменения динамики [Са2 ],

4.3. Транслокация ПКСрП в нейронах коры при стимуляции глутаматных рецепторов

4.4. Изучение перемещений изоформы ПКС(ЗП и белка RACK1 в нейронах коры и мозжечка при длительном действии глутамата

4.5. Оценка выживаемости молодых и старых культур нейронов после длительного глутаматного воздействия при действии активатора и ингибиторов ПКС

4.5.1. Влияние ингибиторов на гибель нейронов

4.5.2. Исследование гибели нейронов при глутаматном воздействии. Влияние ингибиторов и ФЭ

4.5.3. Исследование "down-regulation " ПКС и выживаемости нейронов

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль протеин киназы С в механизмах нарушения кальциевого гомеостаза в нейронах мозжечка и коры при гиперстимуляции глутаматных рецепторов»

Актуальность проблемы Заболевания центральной нервной системы являются одной из актуальных проблем медицины, что обусловлено их существенной долей в структуре заболеваемости и смертности населения, высокими показателями временной и стойкой утраты трудоспособности. Среди данных заболеваний ведущее место занимает ишемический инсульт. По данным ряда авторов он составляет около 80% общего числа инсультов [19].В ишемическом каскаде большую роль играют глутаматные рецепторы.При спазмах сосудов наблюдается снижение кровотока, гипоксия, что провоцирует выброс нейротрансмиттеров. Глутамат (Глу) активирует рецепторы, происходит мощный вход кальция и натрия внутрь клетки и выход калия [11, 101]. Обнаружено, что длительное воздействие Глу на нейроны приводит к увеличению концентрации внутриклеточного кальция ^ i 0-4-([Са" ],) и развитию так называемой отсроченной Са дизрегуляции (ОКД) [10, 11, 63, 83]. Стойкое повышение [Са ]j способно стимулировать активность Са -зависимых протеин киназ и протеин фосфатаз, в частности протеин киназы С (ПКС). Изменения активности ПКС при ишемии были отмечены в тканях многих органов: головного мозга, сердца, печени, почек [113].Несмотря на интенсивные исследования, вклад ПКС в механизмы повреждения нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов окончательно не установлен. Рядом исследователей показано, что предварительное уменьшение активности и содержания ПКС в нейронах защищает их от Глу нейротоксичности [48, 75, 76]. В то же время другие исследователи утверждают, что для защиты клеток необходимо противодействовать инактивации ПКС [23, 43, 44, 120].Со времени открытия ПКС в 1977 году было получено достаточное количество информации о биохимии и молекулярной биологии белков семейства ПКС. В понимании их регуляции и участия в различных сигнальных путях множества организмов, от дрожжей до млекопитающих, были достигнуты фундаментальные успехи. Однако остаётся не ясным, какой же вклад вносит ПКС в механизмы повреждения нейронов, вызванные гиперстимуляцией Глу рецепторов: активация ПКС или падение активности связаны с повреждающим действием Глу. До сих пор мало изучена функциональная роль отдельных изоформ ПКС, которые экспрессируются в одной и той же клетке; практически отсутствуют данные о том, что происходит с ПКС при длительном Глу воздействии, остаётся ли она при этом на плазматической мембране. Имеются данные о влиянии ПКС на Са?+ токи через NMDA каналы [18, 32], однако, совершенно не изучено влияние её активации или ингибирования на нарушение Са2+ гомеостаза, на развитие ОКД. Остаётся недостаточно изученным, принимает ли участие ПКС в особенностях действия Глу на нейроны разного возраста.1.2. Цель и задачи исследования Целью данной работы было исследовать роль протеин киназы С в механизмах нарушения кальциевого гомеостаза и гибели культивируемых нейронов мозжечка и коры при гиперстимуляции глутаматных рецепторов.Задачи исследования: 1. Определить особенности изменений активности ПКС при кратковременном и длительном глутаматном воздействии, при действии активатора — форболового эфира (ФЭ) и ингибиторов ПКС; 2. Изучить изменения [Са"+]} и трансмембранной разности потенциала внутренней мембраны митохондрий при длительном воздействии глутамата, ФЭ и ингибиторов ПКС; 3. Изучить поведение изоформы ПКСРП в нейронах коры при длительном действии глутамата, ФЭ, ингибитора ПКС и Са ионофора -иономицина; 4. Оценить выживаемость нейронов после длительного глутаматного воздействия при действии ФЭ и ингибиторов ПКС.

1.3. Научная новизна работы В работе впервые было обнаружено, что транслокация изоформы ПКСрП происходит параллельно с изменениями [Са ]„ вызванными длительным Глу воздействием. Во время первой фазы повышения [Са2+]; ПКС перемещается из цитозоля на плазматическую мембрану нейронов.Обратная транслокация ПКСрП с плазматической мембраны в цитозоль (в органелло-подобные структуры в цитоплазме) происходит одновременно с развитием ОКД и осуществляется с помощью транспортного белка RACK1.Впервые было показано, что развитие ОКД с одной стороны, может быть причиной последующей гибели нейронов, с другой стороны, несмотря на ОКД, нейроны остаются живыми. Обнаружено, что в молодых нейронах ингибиторы ПКС защищают клетки от действия Глу, задерживают развитие ОКД и уменьшают количество клеток с дизрегуляцией кальция.Установлено, что 24 часовое действие ФЭ уменьшает активность ПКС до минимальных значений и приводит к развитию "down-regulation" ПКС. Впервые показано, что в этих условиях длительное воздействие Глу не вызывает гибели молодых нейронов, уменьшает число клеток с ОКД, замедляет время её наступления. Обнаружено, что ингибитор фосфатаз окадаевая кислота на фоне длительного действия Глу вызывает эффекты, подобные ФЭ, ускоряя развитие ОКД. В то же время в старых нейронах "down-regulation" ПКС не влияет на гибель нейронов после Глу воздействия.1.4. Практическая ценность работы Полученные в работе данные, раскрывающие вклад ПКС в механизмы нарушения Са гомеостаза и гибели нейронов, вызванные длительным Глу воздействием, важны для понимания процессов, лежащих в основе повреждения нейронов при ишемии/гипоксии мозга. Способность некоторых ингибиторов ПКС защищать нейроны от токсического действия Глу может иметь практический выход: это создание лекарственных препаратов, нацеленных на изменение активности ПКС. Очевидную практическую ценность имеют полученные в работе данные об изменениях активности ПКС и эффекты "down-regulation" на механизмы нарушения Са гомеостаза и повреждения нейронов. Это способствует выявлению причин повреждения нейронов при гиперстимуляции глутаматных рецепторов и, тем самым, поможет подойти к решению актуальной проблемы, направленной на профилактику и терапию ряда заболеваний центральной нервной системы.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Персиянцева, Надежда Александровна

6. выводы

1. Изменения активности ПКС, вызванные действием глутамата на культивируемые нейроны мозжечка и коры головного мозга, зависят от времени его воздействия. Кратковременное (15 мин) действие глутамата приводит к увеличению активности ПКС. В тоже время при длительной гиперстимуляция глутаматных рецепторов (45-60 мин) выявляется её уменьшение.

2. В опытах на нейронах коры и мозжечка показано, что при глутаматном воздействии происходит двухфазное увеличение [Ca2+]j, 2-ая фаза повышения [Ca2+]j сочетается с сильной митохондриальной деполяризацией — наступает отсроченная кальциевая дизрегуляция.

0 А

3. Во время 1-ой фазы увеличения [Са ]j выявлена транслокация ПКС|ЗП из цитозоля на плазматическую мембрану. Развитие ОКД сопровождается перемещением ПКС|311 с помощью транспортного белка RACK1 из мембраны в цитозоль, а затем в органелло-подобные структуры в цитоплазме.

4. В культивируемых молодых нейронах мозжечка и коры (7-9 ДВК) подавление активации ПКС ингибиторами в малых дозах замедляет развитие ОКД и защищает клетки от токсического действия глутамата. Высокие дозы ингибиторов ПКС являются токсичными и не оказывают защитного действия.

5. В молодых нейронах активатор ПКС форболовый эфир усиливает 1-ую фазу вызванного глутаматом повышения [Са" ]; и ускоряет развитие ОКД. При "down-regulation" ПКС, когда активность ПКС после 24 часовой аппликации форболового эфира падает до нуля, наблюдается задержка появления ОКД и повышается выживаемость молодых нейронов.

6. В старых нейронах мозжечка (14-16 ДВК) ингибиторы ПКС увеличивают глутамат-вызванную гибель нейронов, "down-regulation" ПКС не защищает нейроны от токсического глутаматного воздействия, в этих клетках нейропротекторным эффектом обладает форболовый эфир.

78

7. Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о том, что активация ПКС способствует нарушениям Са гомеостаза, развитию отсроченной Са2+ дизрегуляции, вызванной гиперстимуляцией Глу рецепторов. Представленные результаты показывают, что при действии глутамата ПКС принимает участие в каскаде сигнальных механизмов, приводящих к повреждению и последующей гибели нейронов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает признательность своему научному руководителю д.м.н. профессору Пинелису В. Г. за помощь в написании работы, за полученные знания, заботу, неусыпное внимание и руководство исследованиями. Особенно хочется поблагодарить к.б.н. Бирих К. Р. за ценные советы, плазмиду с nKC(3II-GFP и помощь в определении активности ПКС.

Также хочу сказать спасибо. д.м.н. проф. Ходорову Б. И. за идею проведения исследований по изучению роли ПКС при глутаматной нейротоксичности.

Сениловой Я. Е. за обучение основам культивирования нейронов и моральную поддержку. д.б.н. Сторожевых Т. П. за своевременные подсказки. . .к.б.н. Горбачёвой JI. Р. за помощь в интерпретации данных. .к.б.н. Сорокиной Е. Г. за помощь в публикации материалов. .к.б.н. Большакову А. П. и к.б.н. Михайловой М. М. за эксперименты по трансфекции нейронов. к.б.н. Давыдовой О. Н. за советы по оформлению диссертации.

Как уже было отмечено, в литературе существуют противоречивые выводы о роли изменений активности ПКС в повреждении нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов. Имеются данные, что глутамат вызывает быстрое увеличение, а потом падение активности ПКС, ингибиторы ПКС значительно усиливают глутаматную нейротоксичность. На основании этих результатов было сделалано заключение, что быстрая потеря активности ПКС - характерная особенность ишемии мозга и всегда происходит при NMDA-индуцированной гибели нейронов [44, 120]. С другой стороны были получены данные, что при действии Глу активность ПКС увеличивается, её ингибиторы повышают выживаемость клеток и блокируют эффект Глу. Это позволило сделать вывод, что активация и транслокация ПКС вследствие стимуляции Глу рецепторов может способствовать отсроченному входу Са" , что провоцирует гибель клеток [25, 75, 76]. Для того, чтобы внести в этот вопрос ясность, в настоящей работе было оценено влияние активатора и ингибиторов ПКС на гибель нейронов при действии Глу.

В культивируемых нейронах мозжечка и коры часовая инкубация с Глу вызывала в среднем 25% гибель клеток. Ингибиторы ПКС в низких концен фациях способствовали снижению Глу нейротоксичности (гл. 4.4.2., рис. 24). При действии Глу ингибирование повышенной, по сравнению с интактными клетками, активности ПКС приводило к увеличению выживаемости нейронов. Полученные данные созвучны результатам Нага et al. [55], Manev et al.[75, 76] и др. Высокие дозы ингибиторов ПКС были токсичными и не оказывали защитного действия. Известно, что кальфостин С ингибирует клеточную пролиферацию и вызывает апоптоз [87], хелеритрин способствует разрушению гетеродимера Bax-BcL-XL, выходу цитохрома с из митохондрий, и, следовательно, апоптозу [31]. Jiang et al. [61] на культуре коры показали, что ингибирование ПКС, блокирование NMDARs и изъятие внеклеточного кальция способствует выживаемости нейронов при глутаматной эксайтотоксичности. Вышесказанное даёт право заключить, что именно активация ПКС способствует эксайтотоксичности. Это заключение было подтверждено нашими экспериментами с ФЭ.

На обеих культурах клеток, используя эффект "down-regulation" ПКС после 24 часовой инкубации с активатором киназы ФЭ, была проверена гипотеза [48, 55, 73, 75], что именно активация ПКС вносит вклад в нейротоксичность Глу. "down-regulation" ПКС сама по себе не способствовала гибели нейронов (гл. 4.4.2., рис. 25), возможно потому, что клетки включали компенсаторные механизмы, обеспечивающие достаточный уровень фосфорилирования для нормальной жизнедеятельности, в пользу этого заключения говорит тот факт, что геном человека содержит более 1 ООО генов протеин киназ [7]. При "down-regulation" ПКС наблюдалась полная защита нейронов от Глу эксайтотоксичности.

Активность ПКС при действии ФЭ увеличивалась в 2 раза по сравнению с контролем (гл. 4.1.1., рис. 7), такая активация длилась не менее часа, хотя согласно данным Favaron et al. [48], эффект ФЭ длится менее 15 минут. Однако то, что активность сохраняется, подтвердили эксперименты с нейронами коры, трансфецированными ПКСрП-GFP (гл. 4.3., рис. 19) и

73 окрашенными антителами к ПКСрП и RACK1 (гл. 4.3., рис. 21). Оказалось, что через час инкубации с ФЭ ПКСрП и RACK1 остаются на плазматической мембране клеток. В опытах с трансфецированными нейронами, ни Глу, ни иономицин не смогли повлиять на локализацию ПКСрП. Таким образом, форболовый эфир обеспечивает гораздо более сильное связывание ПКС с плазматической мембраной, чем естественный активатор DAG, который активирует ПКС путем увеличения ее сродства к

Са и фосфолипидам [7, 70, 98, 102]. Интересно, что при активации ПКСРП форболовым эфиром в астроцитах происходит её перемещение на плазматическую мембрану. Однако этот процесс не синхронен с транслокацией RACK1; количество RACKl-nKCpTI в мембране возрастает постепенно, что говорит о связывании RACK1 с активированной ПКСрП на плазматической мембране, а не в цитозоле. Существующее предположение, что в процессе транслокации ПКС на мембрану задействован цитоскелет, подтвердилось тем, что после разрушения его актиновой компоненты перемещение ПКСРП было прекращено [91].

Для того, чтобы изучить влияние ПКС на нарушение кальциевого гомеостаза, вызванного Глу, исследовали влияние ФЭ, окадаевой кислоты и ингибиторов ПКС на вход кальция во время первой фазы, на время возникновения ОКД и количество нейронов с ОКД. Активатор ПКС ФЭ и

Л t ингибитор фосфатаз окадаевая кислота на фоне Глу усиливали вход Са в первую фазу изменений [Са ]j. Хелеритрин резко уменьшал количество кальция, вошедшего в клетки (гл. 4.2.1., рис. 12). Таким образом, баланс фосфорилирования и дефосфорилирования сказывается уже на характере

24* первой фазы входа Са . Эти данные соответствуют литературным, согласно которым при активации ПКС происходило усиление входа кальция через NMDARs [15, 18, 36, 40, 71]. Глу также способствовал тому, что ПКС фосфорилировала автоингибиторный домен кальциевого насоса плазматической мембраны нейронов [46], тем самым, препятствуя откачке кальция. Таким образом, быстрая активация ПКС является одной из причин развития так называемой второй фазы [47].

Castilho et al. [27] в опытах па молодых гранулярных клетках мозжечка крыс обнаружили, что после 20-60 мин действия глутамата в этих клетках возникает вторичный подъём [Са" ];. Они показали также, что для индивидуальных молодых нейронов, в которых наблюдался двухфазный подъём [Са2+];, латентный период (между первой и второй фазами) значительно варьировал. В данной работе впервые было изучено влияние ПКС на развитие ОКД, Са" плато и митохондриальной деполяризации при действии Глу. White and Reynolds [126] показали, что нарушение работы митохондрий является первичным событием в глутаматной нейротоксичности. Митохондриальная деполяризация вовлечена в механизм нарушения нейронального кальциевого гомеостаза, вызванного глутаматом и всегда сопровождает появление кальциевого плато [10, 21, 22, 27]. I

Есть данные, что активная ПКС фосфорилирует сайты СаМ или Са" -СаМ-связывающих доменов множества клеточных субстратов. В него входят NR1 субъединицы NMDA рецептора [61, 100, 1.19] и автоингибирующий домен кальциевого насоса плазматической мембраны [46]. В первом случае фосфорилирование увеличивает активность рецептора-канала, в другом, наоборот, блокирует выброс кальция из клетки

С а

-насосом, что является ещё одной причиной того, что даже после удаления глутамата возникает кальциевая дизрегуляция [28, 18, 129]. Выведение Са2+ из клетки осуществляется преимущественно Са2+-насосом плазматической мембраны, поскольку обмен наружнего Na+ на цитоплазматический Са2+,

1 9+ осуществляемый Na /Са обменником, при действии глутамата- резко ослабляется или даже реверсирует вследствие как повышения [Na+]j , так и деполяризации плазматической мембраны [9].

При "down-regulation" ПКС наблюдалась задержка появления кальциевой дизрегуляции и значительно уменьшалось количество нейронов с ОКД (гл. 4.2.2., рис. 13 и 14). Несмотря на то, что в клетках наступала дизрегуляция, Глу не оказывал токсического эффекта на нейроны коры и мозжечка. Ингибиторы ПКС в высоких^ дозах хотя и замедляли развитие ОКД, но не защищали от действия Глу. В малых концентрациях, при использовании которых наблюдалась не полная инактивация ПКС (гл. 4.1.1., рис. 6) и отсутствие исходной токсичности (гл. 4.4.2., рис. 23), ингибиторы ПКС защищали клетки от гибели, вызванной Глу.

В молодых нейронах активатор ПКС форболовый эфир и окадаевая кислота ускоряли развитие ОКД. Полученные данные не противоречат описанным выше и позволяют сделать заключение, что чем больше Са2+ входит в нейроны при первой фазе, тем быстрее наступит вторая.

При анализе гибели нейронов было показано, что Глу вызывал в среднем 25% гибель нейронов (гл. 4.4.2., рис. 24). Количество же клеток с ОКД в культуре мозжечка было 83±7% и 63±9% в культуре коры. Это доказывает то, что ОКД является необходимым, но недостаточным условием для запуска механизма Глу нейротоксичности.

Для того, чтобы однозначно проследить за судьбой клеток с кальциевой дизрегуляцией, после её наступления нейроны оставлялись на несколько часов под микроскопом и затем окрашивались флуоресцентным красителем для определения количества живых клеток. Эксперименты выявили три популяции нейронов: (а) имеется только первая фаза и остаются живыми; (б) есть вторая фаза, живые; (в) есть кальциевая дизрегуляция, погибшие. При "down-regulation" ПКС, когда количество киназы в клетке сильно понижено, ОКД развивалась с задержкой и в меньшем числе нейронов, однако гибель практически отсутствовала. В этих экспериментах также была проанализирована первая фаза входа Са" . Оказалось, что ни количество вошедшего Са , ни длительность первой фазы во всех трёх популяциях нейронов друг от друга существенно не отличается. То есть по характеру первой фазы нельзя предсказать дальнейшую судьбу клетки, погибнет она или нет. В экспериментах с "down-regulation" ПКС длительность первой фазы была короче и составила 52±12 секунд (в контроле - 112±16 секунд), ОКД была выявлена в меньшем числе нейронов, это связано с тем, что активная ПКС способствовала усилению входа и торможению выброса Са" из клеток [15, 18, 29, 36, 46]. Можно предположить, что при "down-regulation" ПКС создаются условия для уменьшенного входа кальция, ОКД

76 развивается в меньшем числе нейронов, более интенсивно работает Са" насос плазматической мембраны, что, в конечном итоге, способствует защите клеток от Глу нейротоксичности.

Таким образом, можно выделить несколько обязательных факторов, наличие которых приведёт к гибели нейронов при действии Глу: (1) наличие ПКС в клетке; (2) активация ПКС; (3) появление ОКД; (4) наличие фактора, возможно генетического, связанного с соотношением про- и антиапоптических изоформ ПКС в нейроне [41, 62, 67]. То, что фактор 4 играет важную роль в гибели и выживаемости нейронов говорит тот факт, что погибают не все клетки с кальциевой дизрегуляцией.

В старых нейронах мозжечка (14-16 ДВК) ингибиторы ПКС действовали, в отличие от молодых, иным образом: ингибиторы ПКС увеличивали глутамат-вызванную гибель нейронов, "down-regulation" ПКС не защищала их от токсического Глу воздействия, в этих клетках нейропротекторным эффектом обладал форболовый эфир (гл. 4.4.2., рис. 26). Полученные данные согласуются с результатами Durkin et al. [43, 44] и Tremblay et al. [120] для старых нейронов. Это может быть связано с тем, что в нейронах 14-16 ДВК экспрессия и степень фософрилированности субъединиц NMDA рецептора может отличаться от той, что наблюдается в молодых нейронах [16, 53]. Точные механизмы таких возрастных особенностей действия активатора и ингибитора ПКС не совсем понятны и требуется проведение специальных исследований, направленных на изучение процессов фосфорилирования NMDA каналов.

Полученные в настоящей работе данные свидетельствуют о важной роли ПКС в нарушениях кальциевого гомеостаза, развитии отсроченной кальциевой дизрегуляции и повреждении нейронов при гиперстимуляции Глу рецепторов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Персиянцева, Надежда Александровна, 2008 год

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Д. и др. Молекулярная биология клетки. — Т. 1.-М.: Мир, 1994.

2. Ашмарин A.JI. Биохимия мозга. Изд. С.-Петербургского университета, 1999. - 328 с.

3. Галактионов В.Г. Иммунология. -М.: Мир, 1998. С. 179-181.

4. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Коваленко А.В., Соколов М.А. Механизмы повреждения ткани мозга на фоне острой фокальной ишемии мозга//Журн. невропатологии и психиатрии им. С. С. Корсакова. —1999. -Т. 99.-№2.-С. 65-70.

5. Гусев Н.Б. Внутриклеточные Са-связывающие белки//СОЖ. — 1998. -№5. С. 2-9.

6. Зинченко В.П., Долгачева Л.П. Внутриклеточная сигнализация. — Пущино, 2003.

7. Зозуля Ю.А., Барабой В.А., Сутковой Д.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга. — М.: Знание-М., 2000. С. 344.

8. Сторожевых Т.П., Пинелис В.Г., Винская Н.П., Сурин A.M., Ходоров1. Л I

9. Б.И. Ведущая роль Са АТФазы плазматической мембраны в восстановлении Са2+ гомеостаза нейронов после глутаматного удара//Бюлл. Эксп. Биологии и Медицины. — 2003. — Т. 135. № 2. — С. 162-165.

10. П.Ходоров Б.И. Нарушение нейронального кальциевого гомеостаза при гиперстимуляции глутаматных рецепторов // Патогенез. 2003. - № 1. -С. 20-33. .

11. Adamec Е., Didier М., Nixon R. Developmental regulation of the recovery process following glutamate-induced calcium rise in rodent primary neuronal cultures/ZBrain Res Dev Brain Res. 1998. - V. 108. - № 1-2. - P. 101-110.

12. Akita Y. Protein kinase C-epsilon (PKC-epsilon): its unique structure and function/Л. Biochem. (Tokyo). 2002. - V. 132. - № 6. - P. 847-852.

13. Bartschat D.K., Rhodes Т.Е. Protein kinase С modulates calcium channels in isolated presynaptic nerve terminals of rat hippocampus//J. Neurochem. -1995. V. 64. - № 5. - P. 2064-2072.

14. Battaini F., Pascale A. Protein kinase С signal transduction regulation in physiological and pathological aging//Ann. N. Y. Acad. Sci. 2005. — V. 1057.-P. 177-192.

15. Baude A., Nusser Z., Roberts J.D. The metabotropic glutamate receptor (mGluRl alpha) is concentrated at perisynaptic membrane of neuronal subpopulations as detected by immunogold reaction // Neuron. 1993. - V. 11.-№4.-P. 771-787.

16. Bickler P.E., Fahlman C.S., Ferriero D.M. Hypoxia increases calcium flux through cortical neuron glutamate receptors via protein kinase C//J. Neurochem. 2004. - V. 88. - № 4. - P. 878-884.

17. Bright R. and Mochly-Rosen D. The Role of Protein Kinase С in Cerebral Ischemic and Reperfusion Injury//American Heart Association. — 2005. — V. 27. -№36. -P. 2781-2800.

18. Buchner K., Adamec E., Beermann M.L., Nixon R.A. Isoform-specific translocation of protein kinase С following glutamate administration in primary hippocampal neurons/ZBrain. Res. Mol. Brain. Res. 1999. — V.64.- № 2. — P. 222-235.

19. Budd S.L., Nicholls D.G. A revaluation of the role of mitochondria in neuronal Ca homeostasis//!. Neurochem. 1996. - V. 66. - № 1. — P.403-411.

20. Budd S.L., Nicholls D.G. Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells//J. Neurochem.- 1996.- V. 67. № 6.-P. 2282-2291.

21. Busto R., Globus M.Y., Neary J.T., Ginsberg M.D. Regional alterations of protein kinase С activity following transient cerebral ischemia: effects of intraischemic brain temperature modulation//!. Neurochem. 1994. — V. 63.- № 3. P. 1095-1103.

22. Candeo P., Favaron M., Lengyel I., Manev R.M., Rimland J.M., Manev H. Pathological phosphorylation causes neuronal death: effect of okadaic acid in primary culture of cerebellar granule cells//J. Neurochem. — 1992. V. 59. -№4.-P. 1558-1561.

23. Cardell M., Bingren H., Wieloch Т., Zivin J., Saitoh T. Protein kinase С is translocated to cell membranes during cerebral ischemia//Neurosci. Lett. — 1990. V. 119. - № 2. - P. 228-232.

24. Castilho R.F., Hansson O., Ward M.W., Budd S.L., Nicholls D.G. Mitochondrial control of acute glutamate excitotoxicity in cultured83cerebellar granule cells//J. Neurosci. 1998. - V. 18. - № 24. - P. 1027710286.

25. Chakravarthy В., Morley P., Whitfield J. Ca2+-calmodulin and protein kinase Cs: a hypothetical synthesis of their conflicting convergences on shared substrate domains//Trends Neurosci. 1999. - V. 22. - № 1. - P. 12-16.

26. Chauhan V.P., Chauhan A., Deshmukh D.S., Brockerhoff H. Lipid activators of protein kinase C//Life Sci. 1990. - V. 47. - № 12. - P. 981986.

27. Chan S.L., Lee M.C., Tan K.O., Yang L.K., Lee A.S., Flotow H., Fu N.Y., Butler M.S. Identification of chelerythrine as an inhibitor of BclXL function//! Biol. Chem. 2003. - V. 278. - № 23. - P. 20453-20456.

28. Chihab R., Bossenmeyer C., Oillet J., Daval J.L. Lack of correlation between the effects of transient exposure to glutamate and those of hypoxia/reoxygenation in immature neurons in vitro//J. Neurochem. 1998. -V. 71.-№3.-P. 1177-1186.

29. Chinopoulos C., Gerencser A.A., Doczi J., Fiskum G., Adam-Vizi V. Inhibition of glutamate-induced delayed calcium deregulation by 2-APB and La3+ in cultured cortical neurons//J. Neurochem. — 2004. V. 91. - № 2. - P. 471-483.

30. Choi D.W. Calcium: still center-stage in hypoxic-ischemic neuronal death//Trends Neurosci. 1995. - V. 18. - № 2. - P. 58-60.

31. Choi D.W., Rothman S.M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death//Annu. Rev. Neurosci. 1990. -V. 13. - P. 171182.

32. Choi D.W. Ionic dependence of glutamate neurotoxicity//! Neurosci. -1987. V. 7. - № 2. - P. 369-379.

33. Codazzi F., Teruel M.N., Meyer T. Control of astrocyte Ca(2+) oscillations and waves by oscillating translocation and activation of protein kinase C//Curr. Biol. 2001. - V. 11. - № 14. - P. 1089-1097.

34. Crumrine R.C., Dubyak G., LaManna J.C. Decreased protein kinase С activity during cerebral ischemia and after reperfusion in the adult rat//J. Neurochem. 1990. -V. 55. - № 6. - P. 2001-2007.

35. Danysz W., Wroblewski J.T. Concanavalin A increases N-methyl-D1. Л1aspartate-induced Ca influx in cerebellar granule cells in culture//Pol. J. Pharmacol. 1995.-V. 47. -№ l.-P. 31-36.

36. Dempsey E.C., Newton A.C., Mochly-Rosen D., Fields A.P., Reyland M.E., Insel P.A., Messing R.O. Protein kinase С isozymes and the regulation of diverse cell responses//Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2000. - V. 279. -№3.- P. 429-438.

37. Didier M., Mienville J.M., Soubrie P., Bockaert J., Berman S., Bursztajn S., Pin J.P. Plasticity of NMDA receptor expression during mouse cerebellar granule cell development//Eur. J. Neurosci. 1994. - V. 6. - № 10. — P. 1536-1543.

38. Emaus R.K., Grunwald R., Lemasters J.J. Rhodamine 123 as a probe of transmembrane potential in isolated rat-liver mitochondria: spectral and85metabolic properties//Biochim. Biophys. Acta. 1986. - V. 850. - № 3. - P. 436-448.

39. Faux M.C., Scott J.D. Regulation of the AKAP79-protein kinase С interaction by Ca2+/Calmodulin//J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - № 27. -P. 17038-17044.

40. Gerendasy D.D., Sutcliffe J.G. RC3/neurogranin, a postsynaptic calpacitin for setting the response threshold to calcium influxes//Mol. Neurobiol. — 1997.-V. 15.-№2.-P. 131-163.

41. Gopalakrishna R., Anderson W.B. Reversible oxidative activation and inactivation of protein kinase С by the mitogen/tumor promoter periodate//Arch. Biochem. Biophys. 1991. - V. 285. - № 2. - P. 382-387.

42. Gopalakrishna R., Anderson W.B. Susceptibility of protein kinase С to oxidative inactivation: loss of both phosphotransferase activity and phorbol diester binding//FEBS Lett. 1987. - V. 225. - № 1-2. - P. 233-237.

43. Gray M.O., Karliner J.S., Mochly-Rosen D. A selective epsilon-protein kinase С antagonist inhibits protection of cardiac myocytes from hypoxia-induced cell death//J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - № 49. - P. 3094530951.

44. Hara H., Onodera H., Yoshidomi M., Matsuda Y. Staurosporine, a novel protein kinase С inhibitor, prevents postischemic neuronal damage in the gerbil and rat//J. Cereb. Blood Flow Metab. 1990. - V. 10. - № 5. - P. 646-653

45. Hartley D.M., Kurth M.C., Bjerkness L., Weiss J.H., Choi D.W. Glutamate receptor-induced 45Ca2+ accumulation in cortical cell culture correlates with subsequent neuronal degeneration//J. Neurosci. 1993. - V. 13. - № 5. — P. 1993-2000.

46. Hisatsune C., Umemori H., Inoue Т., Michikawa Т., Kohda K., Mikoshiba K., Yamamoto T. Phosphorylation-dependent regulation of N-methyl-D-aspartate receptors by calmodulin//J. Biol. Chem. 1997. - V. 212. - № 33. -P. 20805-20810.

47. Huwiler A., Fabbro D., Pfeilschifter J. Comparison of different tumour promoters and bryostatin 1 on protein kinase С activation and down-regulation in rat renal mesangial cells//Biochem. Pharmacol. — 1994. — V. 48.-№4.-P. 689-700.

48. Inoue M., Kishimoto A., Takai Y., Nishizuka Y. Studies on a cyclic nucleotide-independent protein kinase and its proenzyme in mammalian tissues//J. Biol. Chem. 1977. -V. 252. - № 21. - P. 7610-7616.

49. Jiang Q., Gu Z., Zhang G. Activation, involvement and nuclear translocation of c-Jun N-terminal protein kinase 1 and 2 in glutamate-induced apoptosis in cultured rat cortical neurons//Brain Res. 2002. - V. 956. - № 2. - P. 194201.

50. Kawakami Т., Kawakami Y., Kitaura J. Protein kinase С beta (PKC beta): normal functions and diseases//.!. Biochem. 2002. - V. 132. - № 5. - P. 677-682.

51. Khodorov B. Glutamate-induced deregulation of calcium homeostasis and mitochondrial dysfunction in mammalian central neurons//Prog. Biophys. Mol. Biol. 2004. - V. 86. - № 2. - P. 279-351.

52. Khodorov В., Pinelis V., Vergun O., Storozhevykh Т., Vinskaya N. Mitochondrial deenergization underlies neuronal calcium overload following a prolonged glutamate challenge//FEBS Lett. 1996. - V. 397. - № 2-3. - P. 230-234.

53. Kikkawa U., Matsuzaki H., Yamamoto T. Protein kinase С delta (PKC delta): activation mechanisms and functions//! Biochem. 2002. — V. 132. -№ 6. - P. 831-839.

54. Koponen S., Kurkinen K., Akerman K.E., Mochly-Rosen D., Chan P.H., Koistinaho J. Prevention of NMDA-induced death of cortical neurons by inhibition of protein kinase Czeta//J. Neurochem. — 2003. — V. 86. № 2. — P. 442-450.

55. Kunishima N., Shimada Y., Tsuji Y. Structural basis of glutamate recognition by a dimeric metabotropic glutamate receptor//Nature. 2000. — V. 407. - № 6807. - P. 971-977.

56. Legendre P., Rosenmund C., Westbrook G.L. Inactivation of NMDA channels in cultured hippocampal neurons by intracellular calcium//J. Neurosci. 1993. -V. 13. - № 2. - P. 674-684.

57. Lester D.S., Brumfeld V. Ligand-induced conformational changes in cytosolic protein kinase C//Int. J. Biol. Macromol. 1990. - V. 12. - № 4. -P. 251-256.

58. Lu W.Y., Jackson M.F., Bai D., Orser B.A., MacDonald J.F. In CA1 pyramidal neurons of the hippocampus protein kinase С regulates calcium-dependent inactivation of NMD A receptors//J. Neurosci. 2000. — V. 20. -№ 12.-P. 4452-4461.

59. Macdonald R.D., Wallace M.C., Coyne T.J. The effect of surgery the severity of vasospasm//J. of Neurosurg. 1994. - Vol. 80. - №3. - P. 433439.

60. Maher P. How protein kinase С activation protects nerve cells from oxidative stress-induced cell death//J. Neurosci. — 2001. V. 21. № 9. — P. 2929-2938.

61. Manev H., Favaron M., Guidotti A., Costa E. Delayed increase of Ca influx elicited by glutamate: role in neuronal death//Mol. Pharmacol. 1989. -V.36.l.-P. 106-112.

62. Manev H., Favaron M., Vicini S., Guidotti A. Ganglioside-mediated protection from glutamate-induced neuronal death//Acta Neurobiol. Exp. — 1990. V. 50. - № 4-5. - P. 475-488.

63. Manev H., Candeo P., Favaron M., Lengyel I., Manev R.M., Rimland J.M. Pathological phosphorylation causes neuronal death: effect of okadaic acidin primary culture of cerebellar granule cells//J. Neurochem. 1992. - V. 59. -№4.-P. 1558-1561.

64. Mochly-Rosen D., Gordon A.S. Anchoring proteins for protein kinase С: a means for isozyme selectivity//FASEB J. 1998. -V. 12. - № 1. - P. 35-42.

65. Mochly-Rosen D. Localization of protein kinases by anchoring proteins: a theme in signal transduction//Science. 1995. - V. 268. - № 5208. - P. 247251.

66. Newton A.C. Protein kinase C: structure, function, and regulation//.!. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - № 48. - P. 28495-28498.

67. Nicholls D., Attwell D. The release and uptake of excitatory amino acids//Trends Pharmacol. Sci. 1990. - V. 11. - № 11. - P. 462-468.

68. Nicholls D.G., Budd S.L. Mitochondria and neuronal survival//Physiol. Rev. -2000. — V. 80.-№ l.-P. 315-360.

69. Nishizuka Y. The molecular heterogeneity of protein kinase С and its implications for cellular regulation//Nature. 1988. - V. 334. - № 6184. - P. 661-665.

70. Parekh D.B., Ziegler W., Parker P.J. Multiple pathways control protein kinase С phosphorylation//EMBO J. 2000. - V. 19. - № 4. - P. 496-503.90

71. Parsons C.G., Danysz W., Quack G. Glutamate in CNS disorders as a target for drug development: an update//Drug News Perspect. 1998. - V. 11. - № 9.-P. 523-569.

72. Pascale A., Alkon D.L., Grimaldi M. Translocation of protein kinase C-betall in astrocytes requires organized, actin cytoskeleton and is not accompanied by synchronous RACK1 relocation//Glia. — 2004. V. 46. - №2.-P. 169-182. •

73. Pellegrini-Giampietro D.P., Chtrici Alesiani M. Excitatory amino acid release and free radical formation may cooperate in the genesis of ischemia — induced neuronal damage // J. Neurosci.- 1990. — Vol. 10. — P. 10351041.

74. Pin J.P., Duvoisin R. The metabotropic glutamate receptors: structure and • functions//Neuropharmacology. 1995. - V.34. - № 1. - P. 1-26.

75. Popp R.L., Velasquez O., Bland J., Hughes P. Characterization of protein' kinase С isofonns in primary cultured cerebellar granule cells//Brain Res. — 2006.-V. 1083.-№ l.-p. 70-84.

76. Raulli R., Alho H., Wroblewski J.T. yV-Methyl-D-aspartate receptor-induced ' translocation of protein kinase С to the nucleus in rat cerebellar slices//Neurochem. -1994. V. 24. - P. 209-214.

77. Rechsteiner M., Rogers S.W. PEST sequences and regulation by proteolysis//Trends Biochem. Sci. 1996. - V. 21. - № 7. - P. 267-271.

78. Ron D., Jiang Z., Yao L., Vagts A., Diamond I., Gordon A. Coordinated movement of RACK1 with activated betall PKC//J. Biol. Chem. 1999. -V. 274. - № 38. - P. 27039-27046.

79. Ron D., Kazanietz M.G. New insights into the regulation of protein kinase С and novel phorbol ester receptors/ZFASEB J. 1999. - V. 13. - № 13. - P. 1658-1676.

80. Ron D., Luo J., Mochly-Rosen D. C2 region-derived peptides inhibit translocation and function of beta protein kinase С in vivo//J. Biol. Chem. — 1995. V. 270. - № 41. - P. 24180-24187.

81. Rosenmund С., Feltz A., Westbrook G.L. Calcium-dependent inactivation of synaptic NMDA receptors in hippocampal neurons//J. Neurophysiol. 1995. - V. 73. - № 1. - P. 427-430.

82. Rothman S.M., Thurston J.H., Hauhait R.E. Delayed neurotoxicity of excitatory amino acids in vitro//Neuroscience. — 1987. — V. 22. № 2. - P. 471-480. ' .

83. Ryves W.J., Evans A.T., Olivier A.R., Parker P.J., Evans F.J. Activation of the PKC-isotypes alpha, beta 1., gamma, delta and epsilon by phorbol esters of different;biological activities//FEBS Lett. 1991. - V. 288. -№ 1-2.-P. 5-9. - P 4

84. Saito N., Shirai Y. Protein kinase С gatnma (PKC gamma): function of neuron specific isotype//J. Biochem. 2002. - V. Л32. - №,5. - P. 683687.

85. Sano K. Acute ishemic and delayed ishemic neurological deflcite as ~ the causes of bad grading in aneurismal .subarachnoid hemorrhage // Neurolog. Res. 1994: - Vol. 16. - P. 35-39. < "< ^ f

86. Schechtman D., Mochly-Rosen D. Adaptor proteins in protein kinase • C-mediated signal transduction//Oncogene. 2001. - V. 20. - № 44. — P. 6339-6347.

87. Schinder A.F., Olson E.C., Spitzer N.C., Montal M. Mitochondrial dysfunction is a primary event in glutamate neurotoxicity//!. Neurosci. -1996. V. 16. - № 19.-P. 6125-6133.

88. Shigemoto R., Kinoshita A., Wada E. Differential presynaptic localization of metabotropic glutamate receptor subtypes in the rat hippocampus//! Neurosci. 1997. V. 17. - № 19. - P. 7503-7522.

89. Shigemoto R., Kulik A., Roberts J.D. Target-cell-specific concentration of a metabotropic glutamate receptor in the presynaptic active zone //Nature. 1996. -V. 381. - № 6582. - P. 523-525.

90. Smart T.G. Regulation of excitatory and inhibitory neurotransmitter-gated ion channels by protein phosphoiylation//Curr.: Opin. Neurobiol. —1997.-V. 7.-№3.-P. 358-367. " '

91. Souroujon M.C., Mochly-Rosen' D. Peptide-modulators of protein-' protein interactions in intracellular signaling//Nat. Biotechnol. — 1998. — V. 16.-№ 10.-P. 919-924.

92. Speechly-Dick M.E., Mocanu M.M., Yellon D.M. Protein kinase C. It's role in ischemic preconditioning in the rat//Circ. Res. — 1994. V. 75. —■ P. 586-590.

93. Spillson A.B., Russell J.W. Metabotropic glutamate receptor' regulation of neuronal cell death//Exp. Neurol. 2003. - V. 184. - № 1. - P. 97-105.

94. Stoll G., Jander S., Schroeter M. Inflammation and glial responses in ischemic brain lestions // Progr. in Neurobiol. 1995. - Vol. 46. - P. 607636.

95. Takai Y., Yamamoto M., Inoue M., Kishimoto A., Nishizuka Y. A proenzyme of cyclic nucleotide-independent protein kinase and its activation by calcium-dependent neutral protease from rat liver//Biochem. Biophys.

96. Vergun O., Keelan J., Khodorov B.I., Duchen M.R. Glutamate-• induced mitochondrial depolarisation i and perturbation of calcium homeostasis in cultured rat hippocampal neurons//J. Physiol. 1999. — V. 519.-№2.-P. 451-466.

97. Webb B.L., Hirst S.J., Giembycz M.A. Protein kinase С isoenzymes: a review of their structure, regulation and role in regulating airways smooth muscle tone and mitogenesis/ZBritish J. of Pharmacology. — 2000. — V. 130. -P. 1433-1452.

98. Westermann P., Knoblich M., Maier O., Lindschau C., Haller H. Protein kinase С bound to the Golgi apparatus supports the formation of constitutive transport vesicles//J Biochem.1996. V. 320. - P. 651-658: .;

99. White R.J., Reynolds I.J. Mitochondrial .depolarization; in glutamate-, stimulated neurons: an early signal specifici to excitotoxin: exposure//J.! Neurosci.-1996.-V. 16.-№ 18.-P. 5688-5697. i

100. Yaka R., Thornton C., Vagts A J., Bonci A., Ron. D. NMDA receptor function is regulated by the inhibitory scaffolding protein, RACK1//PNAS. — 2002. — V. 99.-№8.-P. 5710-5715 .-'2002: У. - .Ч-г -7;u57

101. Zidovetzki R., Lester D.S. The. fmechanism, of activation of protein kinase C: a biophysical perspective//Biochim. Biophys. Acta.;;— 1992. — V.1134.-№3.-P. 261-272.