Посттрансляционная модификация малой ГТФазы Rab7: Механизм формирования стабильного тройного комплекса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Яковенко, Андрей Романович

• Яковенко, Андрей Романович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Яковенко, Андрей Романович

1. Оглавление

2. Список используемых сокращений

3. Введение

4. Обзор литературы

4.1. Rab-белки

4.1.1. Малые ГТФ-связывающие белки необходимы для мембранного транспорта у Saccharomyces cerevisiae

4.1.2. Обнаружение малых Гтфаз, родственных Yptl/Sec в клетках млекопитающих

4.1.3. Rab-белки - члены суперсемейства Ras малых

ГТФ-связывающих белков

4.1.4. Семейство Rab состоит из большого числа изоформ

4.1.5. Строение Rab-белков

4.1.6. Внутриклеточное распределение Rab-белков

4.2. Посттрансляционная модификация Rab-белков 21 4.2Л. Модификация С-концевых аминокислот 21 4.2.2. Фосфорилирование

4.3. Регуляция Rab-белков

4.3.1. Ингибиторы диссоциации гуанинового нуклеотида

4.3.2. Факторы обмена нуклеотида

4.3.3. Белки-активаторы ГТФазной активности

4.4. Рабаптин

4.5. Рабфилин-За

4.6. РабинЗ

4.7. ЕЕ Al

4.8. Функция Rab-белков

4.9. Rab-белки и механизм распознавания и слияния везикул

5. Материалы и методы

5.1. Материалы, использованные в работе

5.2. Стандартные молекулярно-биологические методы

5.2.1. Штаммы E.coli

5.2.2. Трансформация бактерий

5.2.3. Выделение плазмидной ДНК

5.2.4. Выделение вирусной ДНК

5.2.5. Рестрикция ДНК

5.2.6. ПЦР

5.2.7. Определение первичной структуры ДНК

5.2.8. Определение концентрации белка

5.2.9. Электрофорез белков

5.2.10. Культивирование клеток Spodoptera frugiperda

5.3. Конструкция плазмид и экспрессия рекомбинантных белков

5.3.1. Конструкция экспрессионных плазмид

5.3.2. Конструкция плазмиды и экспрессия Теу-протеазы

5.3.3. Конструкция плазмид и экспрессия Rab

5.3.4. Конструкция плазмид и экспрессия С-концевых мутантов Rab

5.3.5. Экспрессия Repl

5.3.6. Экспрессия RablTT

5.4. Очистка рекомбинантных белков

5.4.1. Выделение рекомбинантной Tev-протеазы

5.4.2. Выделение рекомбинантного Rab7 и его мутантов

5.4.3. Выделение рекомбинантного Repl

5.4.4. Выделение рекомбинантной RablTT

5.5. Прочие методы

5.5.1. Нуклеотидный обмен

5.5.2. Дансилированные производные Rab7 и его мутантов

5.5.3. Родаминовые производные Rab7 и его мутантов

5.5.4. Определение геранилгеранилпирофосфата

5.5.5. Приготовление RabFTT, свободной от ГГпф

5.5.6. Получение комплекса RablTT с ГГпф

5.5.7. Измерение ГТФазной активности

5.5.8. Преципитация белков на№2+ агарозе

5.5.9. Аналитическая гельфильтрация

5.5.10. Флуоресцентаная спектроскопия

5.5.11. Масс-спектрометрия

5.5.12. Математическая обработка результатов

6. Результаты

6.1. Доказательство существования комплекса Rab7*Rep 1 »RabrFT

6.2. Стехиометрия тройного комплекса и влияние пренилирования на его стабильность

6.3. Взаимодействие Rab7 и Repl

6.4. Определение аффинности RabriT к комплексу Rab7*Repl

6.5. Влияние нуклеотидной формы Rab7 на аффинность RabriT к комплексу Rab7*Repl

6.6. Значение С-концевой части Rab7 для распознавания RablTT

7. Обсуждение результатов

7.1. Взаимодействие Rab7 и Rep

7.2. Образование тройного комплекса Rab7*Repl•RabriT

8. Выводы