Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно-синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, доктор биологических наук Забережный, Алексей Дмитриевич

• Забережный, Алексей Дмитриевич
• доктор биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации доктор биологических наук Забережный, Алексей Дмитриевич

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Применение обратной генетики в изучении РНК- 11 содержащих вирусов

1.1.1. Создание полноценных инфекционных геномов РНК- 11 содержащих вирусов

1.1.2. Создание дефектных мини-геномов РНК-содержащих 18 вирусов

1.2. Респираторно-синцитиальный вирус человека (PC- 22 вирус)

1.2.1. Биологическая характеристика вируса и структурно- 22 функциональная характеристика вирусного генома

1.2.2. Применение методов обратной генетики в отношении PC- 35 вирусов для изучения фундаментальных аспектов вирусного морфогенеза

1.2.3. Применение методов обратной генетики в отношении PC- 44 вирусов для решения задач специфической профилактики респираторных заболеваний

1.3. Вирус классической чумы свиней (КЧС)

1.3.1. Биологическая характеристика вируса и структурно- 55 функциональная характеристика вирусного генома

1.3.2. Локализация на геноме вируса КЧС участков, кодирующих 60 поверхностные антигенные детерминанты

1.3.3. Исследования, направленные на изучение вакцинного 62 штамма КС и разработку на его основе средств дифференциальной диагностики и специфической Ф профилактики КЧС

1.3.3.1. Анализ генома штамма КС, филогенетический анализ и 62 разработка теста для идентификации вакцинного штамма методом ПЦР и рестриктного анализа

1.3.3.2. Получение рекомбинантного поверхностного 70 гликопротеина Е2 из вакциного штамма КС, субъединичное вакцинирование и разработка иммуноферментного анализа для определения антител к вирусу КЧС

1.3.4. Применение методов обратной генетики для изучения 76 вируса КЧС

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение рекомбинантных вирусов классической чумы свиней и респираторно-синцитиального вируса человека на основе инфекционных копий их геномов»

Создание инфекционных рекомбинантных геномов представляет собой весьма актуальную задачу для изучения многих РНК-содержащих вирусов, т.к. этот современный подход позволяет выявлять и изменять генетические детерминанты, связанные с биологическими свойствами инфекционных агентов. Это создает теоретические и практические предпосылки для создания новых штаммов РНК-содержащих вирусов с полезными свойствами для диагностики и специфической иммунопрофилактики вирусных инфекций. Конструирование инфекционных вирусных геномов относится к области «обратной генетики». Термин "reverse genetics" появился в вирусологической литературе в последнее десятилетие. В четвертом издании «Fields Virology» этот термин связывают с внесением мутаций в РНК-геномы вирусов, для чего РНК переводится в форму кДНК (созвучно с «обратной транскрипцией»). Появился также термин «создание системы обратной генетики» для того или иного вируса. Подразумевается создание матрицы кДНК, в которую можно вносить изменения и получать полный или дефектный РНК-геном вируса. Таким образом, обратную генетику можно определить как методический прием, посвященный воссозданию, конструированию функционального генетического материала (полный или дефектный вирусный геном) и обеспечению экспериментальных условий для его функционирования. Такая модель позволяет вносить изменения в генетический материал, а также варьировать факторы, влияющие на его функции. Она представляет собой инструмент для прямой экспериментальной проверки рабочих гипотез о молекулярных механизмах наследственности и факторах патогенности. Это особенно важно для исследования РНК-содержащих вирусов. В последнее время продемонстрированы революционные возможности обратной генетики в области молекулярной вирусологии.

В настоящей работе поставлены задачи определения генетических детерминант вирулентности и создания рекомбинантных РНК-содержащих вирусов на примере двух объектов: респираторно-синцитиального (PC) вируса человека и вируса классической чумы свиней (КЧС).

PC вирус вызывет тяжелую инфекцию дыхательных путей (бронхо-легочный синдром) в основном у детей раннего возраста. Она особенно опасна для пожилых людей и страдающих иммунодефицитом (68). Заболевание относится к пока нерегулируемым вирусным инфекциям и встречается в развитых и развивающихся странах, а создание эффективной отечественной вакцины и методов диагностики остается важной социальной задачей здравоохранения. PC вирус относится к роду Pneumovirus (Семейство Paramyxoviridae), его геном представлен единственной одноцепочечной (минус-цепь) молекулой РНК.

На сегодняшний день не существует коммерческой вакцины против РС-вирусной инфекции человека. Разработка инактивированных вакцин на основе различных штаммов PC-вируса не принесла ожидаемого результата (153). В то же время живые вакцины на основе ослабленных штаммов других представителей семейства Paramyxoviridae (кори и паротита) эффективны и безопасны для человека. Поэтому предпринимаются попытки получить аттенуированные штаммы PC-вируса с использованием холодовой адаптации, химического (неспецифического) мутагенеза (164, 71-73, 109, 168), а в последнее время - методами обратной генетики.

Несмотря на разнообразие новых кандидатов в вакцинные штаммы РС-вируса, обладающих разной степенью иммуногенности и уровнем аттенуации, остается неясной природа самого явления аттенуации у PC-вирусов. Понимание молекулярных механизмов аттенуации позволило бы более целенаправленно конструировать новые вакцинные штаммы. Ряд исследований аттенуированных штаммов РС-вируса (70, 207) и вирусов парагриппа-3 (169) указывают на связь аттенуированных свойств с мутациями в гене РЖ-зависимой РНК-полимеразы. Это свидетельствует о том, что нарушения функций РНК-полимеразы (транскрипция и репликация вирусного генома) могут быть ответственны за аттенуацию.

Рабочая гипотеза, выдвигаемая в данной работе, состоит в том, что аттенуация PC-вирусов может быть связана со сниженной репродуктивной активностью из-за мутаций в генах РНК-полимеразы и других белков полимеразного комплекса, а также в регуляторных концевых промоторных последовательностях генома. Для проверки этой гипотезы были проанализированы геномные мутации у ослабленных вариантов РС-вируса, полученных адаптацией штамма дикого типа 2В к размножению в культуре клеток при сниженной температуре и претендующих на роль кандидатов в вакцинные штаммы. Для экспериментальной проверки роли найденных мутаций была создана модельная система (обратной генетики) на основе искусственных мини-репликонов PC-вируса, позволяющая вносить изменения в белки репликативного комплекса и в регуляторные элементы генома.

Другим объектом настоящего исследования является вирус КЧС, который распространен в разных регионах мира (включая Россию) и наносит огромный экономический ущерб во время массовых эпизоотий. Геном вируса КЧС (род Pestivirus) представлен единственной одноцепочечной (плюс-цепь) молекулой РНК. Для болезни характерно острое, хроническое или латентное течение, возможность трансплацентарной передачи вируса от матери к плоду, политропное поражение органов (включая систему иммуногенеза и клетки костного мозга, эндотелий сосудов). Вирус КЧС обычно не вызывает цитопатических изменений в культуре клеток, что определяет сложность его выявления и титрования.

Специфическая профилактика КЧС как правило осуществляется живыми вакцинами, приготовленными на основе китайского лапинизированного штамма

С или других аналогичных вакцинных штаммов, что защищает животных от заболевания (202). С целью профилактики КЧС возможно применение инактивированных, а также рекомбинантных субъединичных вакцин, которые уступают живым вакцинам по протективной активности (206, 110, 178, 147). Создание полноразмерного инфекционного клона вируса КЧС является важным инструментом для получения ответов на фундаментальные вопросы, касающиеся факторов вирулентности и патогенности, молекулярных механизмов, вовлечённых в процессы цикла репродукции вируса. Подобный подход был успешно применён к ряду вирусов с РНК геномом положительной полярности, включая вирус КЧС (150, 177, 36). Для настоящей работы представляет интерес создание инфекционной копии генома вакцинного штамма вируса КЧС, из-за необходимости создания отечественной маркированнной вакцины. Вакцинный штамм КС, взятый за прототип в данной работе, получен на основе вакцинного штамма Ж ВНИИВВиМ, который применялся в СССР на протяжении более 30 лет (В.А.Сергеев, 1993). В 19972000 гг. было проведено детальное изучение биологических свойств и молекулярных характеристик данного вакцинного штамма (Е.А.Непоклонов, 2000; А.Д.Забережный и др., 1999; 5, 3, 18): геном штамма КС был полностью секвенирован, разработан молекулярный тест на основе ПЦР (ТУ-9388-082-00008064-99, 18.01.99 г.), а также на основе ПЦР и рестриктного анализа для выявления и дифференциации вирулентного и вакцинного штаммов. Поверхностные гликопротеины вируса КЧС были синтезированы в бакуловирусной системе, на их основе создан иммуноферментный тест для выявления вирус-специфических антител (ТУ-9388-082-00008064-98, 08.12.98 г.). Таким образом, были созданы все предпосылки для создания новых аттенуированных штаммов на основе штамма КС, пригодных для разработки маркированной вакцины против КЧС.

Работа выполнена в ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии Медицинских Наук, в Научно-производственном объединении НАРВАК, г. Москва и в научно-исследовательской лаборатории Wyeth-Lederle, США. Автор приносит глубокую благодарность научному консультанту д.б.н. Е.А.Непоклонову, д.б.н. Т.И.Алиперу, к.б.н. Т.В.Гребенниковой, А.Н.Власовой, В.В.Грабовецкому, О.В.Елисеевой, д.б.н. Г.К.Воркуновой (ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского), заслуженному деятелю науки РСФСР, профессору В.А. Сергееву, М.М.Демкиной, М.А.Корицкой, к.б.н. М.И.Мусиенко (НПО НАРВАК), Jean Adamus, Dr. Joan Crowley (Wyeth-Lederle, Нью-Йорк) за разностороннюю научно-методическую и организационную помощь в работе.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Забережный, Алексей Дмитриевич

4. ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ первичной структуры полного генома вирулентного штама 2В респираторно-синцитиального вируса человека и двух его вариантов: аттенуированого термочувствительного (Ts) мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2B33F), и его ревертанта по Ts признаку (2В 33F TS+), обнаружено 23 нуклеотидных различия при сравнении геномов 2В и 2В 33F и 1 различие при сравнении геномов 2В 33F и 2В 33F TS+.

2. Показано, что в геноме Ts-мутанта при сравнении с геномом исходного вируса:

- 16 мутаций располагаются в области гена малого гидрофобного белка SH , все они представляют собой транзиции типа (A-G) и приводят к 6 аминокислотным заменам и заменам в 2 последовательных стоп-кодонах в положениях 66(Stop-Gln) и 81 (Stop-Gin), что увеличивает размер полипептида с 65 до 103 аминокислотных остатков;

- 2 мутации впервые обнаружены в консервативной промоторной области лидерной последовательности: замена 4-го нуклеотида (G-C) и включение дополнительного 7-го нуклеотида (U). Установлено, что обе мутации вместе и по отдельности приводят к 4-10 кратному усилению промоторных функций.

3. Установлено, что различие геномов аттенуированного штамма 2В 33F и его ревертанта по Ts -признаку (2В 33F TS+) заключается в одной нуклеотидной замене (U-C) в положении 9853. Эта мутация приводит к замене (Arg-Lys) в положении 451 в аминокислотной последовательности РНК-зависимой РНК-полимеразы и является главным событием, приводящим к потере Ts-признака.

4. Получено экспериментальное подтверждение связи мутаций в гене РНК-полимеразы и в лидерной последовательности с термочувствительностью и адаптацией PC-вируса к сниженной температуре. При помощи модельных систем (мини-геномов) установлено, что компоненты репликативного комплекса Ts-мутанта 2В 33F функционируют при пониженной температуре

32°С) и не функционируют при нормальной температуре (37°С), и что за термочувствительность и аттенуацию РС-вируса ответствена точечная мутация (Arg-Lys)45i в гене РНК-полимеразы.

5. На основании исследований роли обнаруженных мутаций в лидерной промоторной последовательности и в гене РНК-полимеразы установлена связь вирулентных свойств PC-вируса с функциональной активностью вирусного репликативного комплекса.

6. В опытах с мини-геномами PC-вируса установлено, что количество геномной и антигеномной РНК в зараженых клетках примерно одинаково и это соотношение не изменяется при изменении уровня экспрессии

Ф репортерного гена. Сделан вывод, что возрастание экспрессии репортерного гена связано в первую очередь с усилением репликации вирусного генома.

7. На основе полноразмерной ДНК-копии генома вируса КЧС получен инфекционный вирус, не отличающийся по ростовым и антигенным свойствам от родительского штамма КС. Генноинженерное происхождение вируса подтверждено молекулярным анализом его генома. Таким образом, создана базовая модель для экспериментов методами обратной генетики.

8. С целью получения маркированного вакцинного штамма, на основе инфекционного генома вакцинного штамма КС вируса КЧС получен

• гибридный рекомбинантный геном вируса КЧС, с замененным геном главного поверхностного гликопротеина Е2 на аналогичный ген вируса диареи крупного рогатого скота (ВД КРС) и на этой основе получен инфекционный гибридный вирус, способный к серийному размножению в культуре клеток свиного происхождения (линии клеток РК-15 и SK-6). Генноинженерное происхождение гибридного вируса подтверждено молекулярным анализом его генома.

9. Замена главного поверхностного гликопротеина Е2 вируса КЧС на ген Е2 из вируса ВД КРС сопровождалась появлением цитопатогенного действия нового гибридного вируса.

Ю.Полученный рекомбинантный геном вируса КЧС позволяет проводить его дальнейшие модификации для внесения изменений в маркированный вакцинный штамм. Для данного штамма созданы специфические средства диагностики на основе ИФА и ПЦР, что создает возможность разработки маркированной вакцины против КЧС и концепции ее применения.

1.4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

Вакцина против PC-вирусной инфекции человека до сих пор не внедрена в медицинскую практику. Создание убитых вакцин на основе различных штаммов PC-вируса не принесло желаемого результата (153). На основании всех накопленных данных при исследовании PC-вируса, определилась тенденция создания живой вакцины на основе аттенуированных штаммов. Поэтому в настоящее время не прекращаются исследования с целью получить ослабленные штаммы PC-вируса с использованием методик неспецифического мутагенеза (164; 71, 72, 73; 109; 168), а также специфического мутагенеза методами обратной генетики. Механизмы атгенуации у PC-вирусов остаются важным предметом для изучения. Понимание данных механизмов позволило бы конструировать новые вакцинные штаммы при помощи новых технологий рекомбинантных инфекционных геномов. Результаты исследований указывают • на связь аттенуированных свойств PC-вируса и вируса парагриппа 3 типа с мутациями в гене РНК-зависимой РНК-полимеразы (70; 207, 169), свидетельствуя о том, что нарушения функций РНК-полимеразы (транскрипция и репликация вирусного генома) могут быть ответственны за аттенуацию. Таким образом, представляет интерес проверка гипотезы о том, что аттенуация PC-вирусов может быть связана со сниженной репродуктивной активностью из-за мутаций в генах РНК-полимеразы и других белков полимеразного комплекса, а также в регуляторных концевых промоторных последовательностях генома. Для проверки этой гипотезы необходимо проанализировать геномные мутации у ослабленных вариантов PC-вируса, полученных адаптацией штамма дикого типа к размножению в культуре клеток при сниженной температуре и претендующих на роль кандидатов в вакцинные штаммы. Для экспериментальной проверки роли найденных мутаций необходимо создать модельную систему на основе искусственных мини-репликонов РС-вируса, позволяющую вносить изменения в белки репликативного комплекса и в регуляторные элементы генома.

Анализ литературы, посвященной исследованиям вируса классической чумы свиней, заставляет задуматься о создании новых вакцинных штаммов с измененными свойствами для целей маркированного вакцинирования против КЧС. В настоящее время вакцинация против КЧС успешно осуществляется живыми вакцинами, приготовленными на основе аттенуированных вакцинных штаммов (205). Установлено, что с целью профилактики КЧС возможно применение инактивированных, а также рекомбинантных субъединичных вакцин, которые менее эффективны в сравнении с живыми вакцинами. (206, 110, 178, 147). Актуальной задачей является создание отечественной маркированнной вакцины. За основу при создании такой вакцины целесообразно взять хорошо изученный вакцинный штамм КС, который получен на основе вакцинного штамма Ж ВНИИВВиМ, и применялся в СССР на протяжении более 30 лет (В.А.Сергеев, 1993). Ранее было проведено подробное изучение биологических свойств и молекулярных характеристик данного вакцинного штамма (Е.А.Непоклонов, 2000 А.Д.Забережный и др., 1999, Т.В.Гребенникова и др., 1998 А.Н.Власова и др. 1999, В.В. Цибезов и др. 2000) геном штамма КС был полностью секвенирован, разработан молекулярный тест на основе ПЦР и рестриктного анализа для выявления и дифференциации вирулентного и вакцинного штаммов. Поверхностные гликопротеины вируса КЧС были синтезированы в бакуловирусной системе, на их основе создан иммуноферментный тест для выявления вирус-специфических антител. Все перечисленные наработки позволяют поставить и решить задачу по созданию маркированного вакцинного штамма КС с замененным или модифицированным геном Е2 при помощи технологии инфекционных рекомбинантных геномов. На основе маркированного штамма возможна разработка маркированной вакцины и сопутствующей специфической тест-системы, что является актуальной задачей.

1.5.ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1. Выявить в геноме респираторно-синцинтиалъного вируса человека молекулярные детерминанты, связанные со свойствами аттенуации, термочувствительности и адаптации к снижению температуры, при помощи сравнения первичной структуры геномов вирулентного штамма и его аттенуированных производных,

• Определить полную первичную структуру геномов 3 штаммов РС-вируса группы В: вирулентного штамма 2В, его аттенуированого термочувствительного мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2B33F), а также ревертировавшего по признаку термочувствительности изолята (2В 33F TS+).

• Провести сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вирулентного штамма 2В и его аттенуированного термочувствительного мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2B33F) и на основе проведенного анализа определить потенциальные детерминанты аттенуации, термочувствительности и адаптации к сниженной температуре.

Провести сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей его аттенуированного термочувствительного мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2B33F), а также ревертировавшего по признаку термочувствительности изолята (2В 33F TS+) и на этой основе определить потенциальные детерминанты термочувствительности. 2.Применить экспериментальную модель, основанную на методах обратной генетики, для выявления функциональной роли обнаруженных генетических детерминант в формировании фенотипических изменений у PC-вирусов, а также для исследования гипотезы о связи уровней репликации и транскрипции генома с аттенуацией РС-вирусов.

Для изучения функциональной роли нетранслируемых концевых регуляторных (промоторных) областей PC-вируса сконструировать дефектные вирусные мини-геномы, содежащие репортерный ген хлорамфениколацетилтрансферазы и регуляторные области из вирулентного штамма 2В, его аттенуированного термочувствительного мутанта, адаптированного к сниженной температуре (2B33F), а также ревертировавшего по признаку термочувствительности изолята (2В 33F TS+).

Для моделирования репликазного комплекса каждого из трех изучаемых штаммов PC-вируса сконструировать для каждого из них экспрессирующие векторы, обеспечивающие синтез 4-х вирусспецифических белков: матриксного, нуклеопротеина, фосфопротеина, а также РНК-полимеразы, несущих в себе все особенности, обнаруженные при анализе геномов вирулентного и аттенуированных штаммов РС-вируса. На основе сконструированных мини-геномов получить дефектные РС-вирусы человека при одновременном заражении клеток различными штаммами вируса-помощника, исследовать их инфекционность, параметры репликации и транскрипции при нормальной (37°С) и сниженной (32°С) температурах.

На основе сконструированных мини-геномов, а также экспрессирующих векторов, получить дефектные PC- вирусы человека при одновременной трансфекции рекомбинантными плазмидами, исследовать их инфекционность, параметры репликации и транскрипции при нормальной (37°С) и сниженной (32°С) температурах.

Для выявления относительных уровней репликации и транскрипции мини-геномов при изменении в экспрессии репортерного гена провести анализ положительных и отрицательных цепей РНК мини-геномов. Для проверки гипотезы о связи уровня репликации и транскрипции генома PC-вирусов с атгенуированным фенотипом сравнить уровни экспрессии репортерного гена при использовании промоторных последовательностей и белков репликазного комплекса из вирулентных и аттенуированных штаммов.

З.Получить маркированный вакцинный штамм вируса классической чумы свиней на основе полноразмерной инфекционной копии генома данного вируса.

Разработать стратегию и осуществить сборку полноразмерной копии генома вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней в E.coli под контролем промотора фага Т7 и получить синтезированную in vitro геномную РНК данного штамма.

• Получить инфекционный вирус классической чумы свиней на основе его рекомбинантного генома и исследовать его ростовые и антигенные характеристики, наличие молекулярных маркеров. Подтвердить генно-инженерное происхождение гибридного вируса определением первичной структуры его генома.

• Сконструировать рекомбинантный вирус классической чумы свиней с замененным гликопротеином Е2 на гликопротеин из вируса диарреи крупного рогатого скота. Исследовать способность гибридного вируса заражать клетки свиного происхождения РК-15 и SK-6, несмотря на гетерологичный главный оболочечный гликопротеин Е2. Подтвердить генно-инженерное происхождение гибридного вируса определением первичной структуры его генома.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1.1. Материалы и методы при исследовании РС-вируса

Вирусы и клетки

Штаммы 2В и 18537 РС-вируса (30) были получены от д-ра R. Belshe (St. Louis University Medical Center, St. Louis, МО). Штамм В1 был получен от д-ра В. Murphy (NIH). Штамм 18537 был впервые охарактеризован в 1963 г. (55). Родительский штамм PC-вируса дикого типа 2В был выделен в 1987 г. в Западной Вирджинии от новорожденного ребенка с респираторным заболеванием верхних дыхательных путей. История адаптации штамма 2В к пониженным температурам описана в литературе (168). Вкратце, вирус пассировали 7 раз в первичной культуре клеток почки макаки резус при 35°С. Отбирали одну колонию и пассировали 6 раз (здесь и в дальнейшем в клетках Vero) при 36 °С, отбирали одну колонию и пассировали 12 раз при 36 °С. Вирус пассировали 7 раз при 26 °С, 6 раз при 22 °С, 20 раз при 20 °С. Отбирали одну

83 колонию и пассировали 7 раз при 32 °С. Этот этап биологического клонирования и наращивания повторяли еще дважды. Полученный вариант (2B33F) адаптирован к росту при пониженной температуре (32°С), а кроме того приобрел температурную чувствительность, т.е. его рост замедлен более чем в 10 раз при 39°С. Штамм 2B33F оказался аттенуированным для шимпанзе, хлопковых крыс и африканских зеленых мартышек, в частности, он размножался в 10 - 1000 раз медленнее в верхних и нижних дыхательных путях по сравнению с предшественником- штаммом 2В. Штамм 2B33F вызывал образование вирус-нейтрализующих антител и был способным защитить крыс от контрольного заражения вирулентным штаммом (168). Методом выращивания штамма 2B33F в клеточной культуре при рестриктивной температуре (39°С) получили мутантный клон 2B33F(TS+) с восстановленными ростовыми характеристиками. Этот мутант утерял свойство термочувствительности, поэтому является ревертантом по данному признаку. Его нельзя считать в полном смысле ревертантом к дикому типу, т.к. данный штамм сохраняет признаки адаптации к низким температурам, т.е. способен к нормальному росту при температуре 32°С. Вариант 2B20L получали параллельно аналогичным способом с меньшим колличеством пассажей на этапе холодовой адаптации (5 пассажей при при 26 °С, 5 при 22 °С, 10 при 20 °С).

Штамм PC-вируса дикого типа В1 был получен на основе первоначального изолята, полученного д-ром Belshe в Западной Вирджинии в 1985 г. от грудного ребенка с признаками бронхита и превмонии (bronchiolitis/pneumonia). История культивирования данного штамма описана в литературе (73). Вкратце, вирус был пассирован 3 раза в первичной культуре клеток зеленой африканской мартышки, затем его подвергли 7 пассажам в диплоидных фибробластах человека (MRC-5) и 4 пассажам в клетках Vero. Между 6 и 7 пассажами в клетках MRC-5 вирус трижды подвергся биологическому клонированию (plaque-purification) в тех же клетках.

Клеточная линия Vero была получена из коллекции АТСС. Все клетки выращивали в минимальной среде MEM, с добавлением несущественных аминокислот, фетальной сыворотки теленка, стрептомицина и неомицина.

История получения ослабленных штаммов 2B33F и 2B20L, а также их ревертировавших по признаку термочувствительности мутантов 2B33F(TS+) и 2B20L(TS+). т

Выделение и наращивание штамма 2В в клетках PRMK: 7 пассажей при 35-36°С

Адаптация штамма 2В к клеткам Vero: 2 пассажа при

35°С

Отбор одной колонии и наращивание в клетках Vero: 6 пассажей при 36°С i

Отбор одной колонии и наращивание в клетках Vero: 6 пассажей при 36°С

Отбор одной колонии и наращивание в клетках Vero: 12 пассажей при 36°С

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 5 пассажей при 26°С

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 5 пассажей при 22°С

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 10 пассажей при 20°С

2B20L

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 7 пассажей при 26°С

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 6 пассажей при 22°С

Выращивание при сниженной температуре в клетках Vero: 20 пассажей при 20°С

2B33F

Отбор одной колонии и наращивание в клетках Vero: 7 пассажей при 32°С

Отбор одной колонии и наращивание в клетках Vero: 7 пассажей при 32°С

То же еще 2 раза

То же еще 2 раза

Наращивание в клетках Vero: 3 пассажа при 32°С

Наращивание в клетках Vero: 3 пассажа при 32°С

Рис.7 Схема получения адаптированных к низкой температуре штаммов-производных от 2В.

Очистка РНК PC-вируса и синтез кДНК

Клетки Vero заражали PC-вирусом с множественностью 0,1 (инфекционных частиц на клетку), затем инкубировали при 32°С, вирус пересевали после развития выраженного цитопатического эффекта (ЦПЭ). Для обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ГГЦР) при амплификации внутренних фрагментов генома, выделяли тотальную РНК (181). Для получения вирионной РНК проводили частичную очистку вирионов РС-вируса и их концентрирование согласно следующей процедуре: инфицированные клетки собирали с 2 матрасов (75 см ) после 48 часов инкубирования, после чего суспензию клеток охлаждали до -70°С. Вирус осветляли с помощью центрифугирования в течение 20 мин при 8000g и осаждали 50% раствором полиэтиленгликоля (4:1) в течение 16 ч. при 4°С. После центрифугирования в течение 1 ч. при 10000g, осадок ресуспендировали в 20% растворе сахарозы на буфере NTE (10 mM Tris-HCl, рН 8.0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) и наносили на ступенчатый сахарозный градиент (35-60% на буфере NTE). Вирус дважды очищали в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (вирус W концентрировался на границе плотностей 30-60%) в следующем режиме центрифугирования: 36 тыс. об/мин (ротор Ti40 Beckman) в течение 2 часов. Вирус переводили в буфер NTE методом диализа. Вирионную РНК экстрагировали фенолом и хлороформом, затем осаждали этанолом. Общую фракцию полиаденилированной РНК выделяли из клеток Vero, зараженых РС-вирусом, с использованием набора Librarian Kit (Invitrogen, США) на основе следующей аффинной цепи: "magnetic beads-streptoavidin-biotin-olido d(T)-poly (A) RNA". Комплементарную ДНК синтезировали при помощи олиготимидиновых праймеров oligo d(T)]2.i6.

Выделение и очистка мРНК.

Общая фракция полиаденилированной РНК была выделена из клеток Vero, зараженых PC-вирусом, с использованием набора Invitrogen (США) на основе следующей аффинной цепи: "magnetic beads-streptoavidin-biotin-olido d(T)-poly (A) RNA". Комплементарная ДНК была синтезирована при помощи олиготимидиновых праймеров oligo d(T) в составе набора Librarian Kit (Invitrogen, США).

Амплификация генома PC-вирусов методом ПЦР, клонирование и секвенирование.

Полный геном PC-вируса штамма 2В, за исключением концевых областей, был амплифицирован в виде ряда небольших перекрывающихся (с тем, чтобы праймеры не маскировали собой реальные последовательности) фрагментов. Из-за того, что олигонуклеотидные праймеры были изначально разработаны на основе опубликованных последовательностей геномов PC-вирусов, некоторые не сработали в реакции амплификации со штаммом 2В. Впоследствии, по мере накопления данных, все они были заменены на праймеры, специфичные к 2В. Стратегия амплификации вирусного генома приведена на рис.8.

Для клонирования смешивали 10 независимо полученных продуктов ПЦР для каждого фрагмента. Продукты ПЦР были очищены препаративно в гарозном геле и клонированы в плазмидном векторе pSK+ (Stratagene, США), в клетках Е. coli DH5a. Фрагменты были секвенированы на обеих цепях в составе очищенной плазмидной ДНК с использованием Т7 Sequenase или AmpliTaq polymerase (Applied Biosystems) при помощи универсальных праймеров М13 или специфических праймеров. Все фрагменты (за исключением концевых областей генома) были секвенированы из 5 независимых клонов.

NS-1 NS-2

SH

04 .53 .50 1.20 .91 .96 .41 .92

1.90

M2 .96 Ш

0.3

2.3

1.0

1.5

0.9 1.2

1.0

3.5

3.3

2.0

0.6

1.8

1.8

1.7

1.7

Рис.8.

Стратегия амплификации генома PC-вирусов

А. Фрагменты, полученные для клонирования и секвенирования генома штамма 2В Б. Фрагменты, использованные для прямого секвенирования геномов штаммов 2В, 2B33F, 2B33F (TS+)

484853235323532353235348535323

Продукты ПЦР секвенировали также напрямую, минуя стадию клонирования, также на 2 цепях, использую набор AmpliTaq FS kit (Applied Biosystems, США). Для получения усредненной (consensus) последовательности, каждый нуклеотид был подтвержден как минимум на основе последовательностей 3 независимых клонов на 2 цепях или на основе 1 клона и прямого сиквенса ПЦР-продукта (также на 2 цепях). Как только была получена полная последовательность генома штамма 2В, была принята новая стратегия секвенирования других штаммов подгруппы В. Все 3 генома РС-вирусов (штаммы 2В, В1 и 18537) были амплифицированы в виде 4 перекрывающихся фрагментов ПЦР с использованием набора GeneAmp" XL RNA PCR Kit (Perkin Elmer, США) и напрямую секвенированы на обеих цепях.

Определение первичной структуры концевых фрагментов генома из различных штаммов РС-вируса.

Детали анализа концевых последовательностей генома будут приведены отдельно. Вкратце, концевые последовательности генома (З'-лидерная и 5-трайлерная области) были сшиты между собой методом циркуляризации вирионной РНК в реакции лигирования с использованием РНК лигазы фага Т4 (Promega, США). Область сшивки концевых последовательностей была амплифицирована методом ОТ/ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров, специфичных к генам NS1 и L. Продукт ПЦР был клонирован в E.coli, после чего он был выделен из 15 независимых клонов и секвенирован. Для секвенирования 3'-концевой области генома был также применен метод, описанный у Mink et al. (1991), по которому вирионная РНК была полиаденилирована, и кДНК была получена с использованием праймера олиго-d(T). Лидерная последовательность была амплифицирована с использованием олиго^(Т) и NS-1 ген-специфических праймеров после оптимизации состава буфера для проведения реакции (Invitrogen, США).

Очистка вирионов PC-вируса для анализа концевых последовательностей генома.

Клетки Vero заражали PC-вирусом с множественностью 1 вирус на клетку. Инфицированные клетки не собирали, а аккуратно собирали ростовую среду через 72 часов инкубирования, т.к. она содержала достаточное количество высвободившихся вирусных частиц и содержала мало клеток. Вирус осветляли низкоскоростным центрифугированием при 10000 g в течение 20 мин . (ротор JA10, 8000 об/мин). Надосадочная жидкость смешивалась с 50% раствором ПЭГ (4:1) и выдерживали при +4°С в течение 16 часов с перемешиванием. Осадок собирали центрифугированием в течение 20 мин (ротор JA10, 10000 об/мин). Осадки растворяли в 20% растворе сахарозы на буфере NTE, после чего наносили на градиент плотности сахарозы 35%-60% в пробирках на 12 ml ротора Ti 40. Центрифугирование сахарозных градиентов проводили в течение 2 ч. при 36000 об/мин. Вирус образовывал зону на границе ступеней градента плотности. Препарат вируса собирали, прокалывая пробирку иглой шприца, затем охлаждали и хранили при -20°С.

Амплификация лидерной последовательности с использованием полиаденилирования.

РНК из штаммов 2В, 2B33F, 2B20L, 2B20L(TS+) и 2B33F(TS+) была полиаденилирована при помощи поли (А)-полимеразы в течение 30 мин при 37°С. Затем РНК была экстрагирована насыщеным фенолом (рН 4.7) и переосаждена холодным этанолом.

Комплементарная ДНК была синтезирована на РНК из каждого штамма РС-вируса при помощи праймера oligo d(T) и набора "cDNA-cycle" Kit (Invitrogen, США). Лидерная последовательность генома PC-вирусов была амплифицирована вместе с частью гена 1С с использованием праймера oligo d(T) и праймера, специфичного к гену 1С, что привело к образованию фрагмента ДНК размером 400 нукл. пар. Реакции амплификации проводили в объеме 50 р! с использованием 16 буферных растворов ("PCR Optimizer Kit" Invitrogen, США). Использованные растворы, обозначеные буквами от А до Р, имели характеристики, представленные в таблице 7:

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Забережный, Алексей Дмитриевич, 2003 год

1. Альберте Б., Д. Брей, Дж. Льюис и др.- Молекулярная биология клетки; М.: Мир. 1987.

2. Беляков И.М. Иммунная система слизистых. Иммунология, 1997, 4, 713.

3. Вишняков И.Ф. Результаты исследований по изучению особо опасных болезней животных и разработке мер борьбы с ними. Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России. М., 1999, 1, 67-74.

4. Кривонос А.В., Мусиенко М.И., Гибадулин Р.А., Забережный А.Д., Гребенникова Т.В., Алипер Т.И., Непоклонов Е.А. (2000). Синтез рекомбинатного гликопротеина Е2 вируса классической чумы свиней. Вопросы вирусологии, 1. с. 29-36.

5. Конструирование инфекционной копии генома вакцинного штамма вируса классической чумы свиней. Е.А.Непоклонов, Т.И.Алипер, В.А.Сергеев, А.Д.Забережный, Т.В.Гребенникова, А.Н.Власова, D. Rock, G. Risatti.

6. Орлянкин Б.Г. Классификация и номенклатура вирусов позвоночных; М.1998.

7. Ю.Понд У. Д., Хауит К.А. Биология свиньи. М., Колос, 1983, 161-170.

8. Притулин П.И.Диагностика свиней на комплексах. М., 1977.

9. Романенко В.Ф. Инфекционные желудочно-кишечные болезни свиней. М., Колос, 1984.

10. Сергеев В.А. Вирусные вакцины. Урожай, Киев, 1993, 292-294 Н.Сергеев В.А., Орлянкин Б.Г. Структура и биология вирусов животных.1. М., 1983.

11. Сингер М., Берг П.- Гены и геномы; М.: Мир, 1998, 2т.

12. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьёв Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. М.,1998.

13. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения в норме и патологии. Иммунология, 1997, 5, 4-7.

14. Ярилин А.А. Основы иммунологии. Медицина, М., 1999, 17-110.

15. Ahmadian G, Chambers Р, Easton AJ. Detection and characterization of proteins encoded by the second ORF of the M2 gene of pneumoviruses. J Gen Virol 1999;80:2011-2016.

16. Ahmadian G, Randhawa JS, Easton AJ, 2000. Expression of the ORF-2 protein of the human respiratory syncytial virus M2 gene is initiated by a ribosomal termination-dependent reinitiation mechanism. EMBO J; 19(11):2681

17. Alansari, H., Potgieter, L.N. (1994). Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of the ovine respiratory syncytial virus non-structural 1С and IB genes and the small hydrophobic protein gene. J. Gen. Virology 75, 401404.

18. Atreya, P., Grosfeld, H., Mink, M., and Collins, P. (1995). Mutational analysis of the 3'-leader RNA sequence of human respiratory syncytial virus (RSV). American Society for Virology 14th meeting, Abstr. W40-8, p. 195.

19. Atreya PL, Peeples ME, Collins PL. The NS1 protein of human respiratory syncytial virus is a potent inhibitor of minigenome transcription and RNA replication. J Virol 1998;72:1452-1461.

20. Barik S. Transcription of human respiratory syncytial virus genome RNA in vitro: Requirement of cellular factor(s). J Virol 1992;66:6813-6818.

21. Barclay, W.S., and Palese, P. 1995. Influenza В viruses with site-specific mutation introduced into the HA gene. J. Virol.69, 1275-1279.

22. Baron, M.D., and Barrett, T.1997. Rescue of rinderpest virus from cloned cDNA. J. Virol/l\, 1265-1271.

23. Bass, B.L., Weintraub, H., Cattaneo, R., Billeter, M.A. (1989). Biased hypermutation of viral RNA genomes could be due to unwinding/modification of double-stranded RNA. Cell 56(3), 331.

24. Berthiaume L, Joncas J, Pavilanis V. Comparative structure, morphogenesis and biological characteristics of the respiratory syncytial (RS) virus and the pneumonia virus of mice (PVM). Arch Gesamte Virusforsch 1974; 45:39-51.

25. Bjorklund H., Stadejek Т., Vilcek S., Belak S., 1997. Molecular characterization of the 3' noncoding region of classical swine fever virus vaccine strains. Virus Genes. 16, 307-312.

26. Bolin S. R. 1993. Immunogens of bovine viral diarrhea virus. Vet. Microbiol. Vol. 37. (3-4). P. 236-271.

27. Воуег, J-C., Haenni, A.-L. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses. Virology, 1994, 198, 415-426.

28. Bridgen, A., and Elliott, R.M.1996. Rescue of a stgmented negative-strand RNA virus entirely from cloned complementary DNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 15400-15404.

29. Brock, К.V., R. Deng, and S. M. Riblet. Nucleotide sequencing of 5' and 3' termini of bovine viral diarrhea virus by RNA ligation and PCR. 1992, Virol. Methods, 38,39-46.

30. Broughan, J.H., Randolph, V.B., Tatem, J.M. (1997). Biochemical characterization of two temperature-sensitive and attenuated strains of respiratory syncytial virus subgroup B. J. Virology, 71 (7), 4962-70.

31. Bukreyev A, Camargo E, Collins PL. Recovery of infectious respiratory syncytial virus expressing an additional, foreign gene. J Virol 1996;70:6634-6641.

32. Bukreyev A, Whitehead SS, Prussin C, Murphy BR, Collins PL. 2000. Effect of coexpression of interleukin-2 by recombinant respiratory syncytial virus onvirus replication, immunogenicity, and production of other cytokines. J Virol; 74(15):7151-7157.

33. Calder LJ, Gonzalez-Reyes L, Garcia-Barreno B, et al. Electron microscopy of the human respiratory syncytial virus fusion protein and complexes that it forms with monoclonal antibodies. Virology 2000;271:122-131.

34. Castrucci, M.R., and Kawaoka, Y.1995. Reverse genetics system for generation of an influenza A virus mutant containing a deletion of the carboxyl-terminal residue of M2 protein. J. Virol.69, 2725-2728.

35. Cartee TL, Wertz GW, 2001. Respiratory syncytial virus M2-1 protein requires phosphorylation for efficient function and binds viral RNA during infection. J Virol. 75(24): 12188-12197.

36. Cattaneo, R. Biased (A-I) hypermutation of animal RNA virus genomes. (1994). Current Opinion in Genetics & Development 4, 895-900.

37. Cattaneo, R., Schmid, A., Eschle, D., Baczko, K., ter Meulen, V., Billeter, M.A. (1988). Biased hypermutation and other genetic changes in defective measles viruses in human brain infections. Cell 55,255-265.

38. Chen M.D., Vazquez M., Buonocore L., Kahn J.S. Conservation of the respiratory syncytial virus SH gene. J Infect Dis. 2000 Oct; 182(4): 1228-33.

39. Clarke, D.K., Sidhu, M.S., Johnson, J.E., Udem, S.2000. Rescue of mumps virus from cDNA . J. Virol.74,4831-4838.

40. Coates, H.V., Kendrick, L. and Chanock, R. M. (1963). Antigenic differences between two strains of respiratory syncytial virus. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 112, 958-964.

41. Colijn E.O., Bloemraad M., Wensvoort G. (1997), An improved ELISA for the detection of serum antibodies directed against classical swine fever virus. Vet. Microbiol. 59, 15-25.

42. Collett M. S., Larson, R., Gold, C., Strick, D., Anderson, D. and Purchio, A.F. 1988. Molecular cloning and nucleotide sequence of the pestivirus bovine viral diarrhea virus. Virology, 165, 191-199.

43. Collins P.L., Camargo E, Hill M.G. Support plasmids and support proteins required for recovery of recombinant respiratory syncytial virus. Virology 1999;259:251-255.

44. Collins P.L., Hill M.G., Cristina J, et al. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93; 81-85.

45. Collins, P.L., Hill, M.G., Johnson, P.R. (1990a). The two open reading frames of the 22K mRNA of human respiratory syncytial virus: sequence comparisonof antigenic subgroups A and В and expression in vitro. J. Gen. Virology 71, 3015-3020.

46. Collins P.L., Huang Y.T., Wertz G.W. Nucleotide sequence of the gene encoding the fusion (F) glycoprotein of human respiratory syncytial virus. Proc Natl Acad Sci USA 1984; 81; 7683-7687.

47. Collins P.L., Mottet G. Membrane orientation and oligomerization of the small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus. J.Gen.Virol. 1993; 74:1445-1450.

48. Collins, P.,L., Olmsted Д.А., Johnson, P.R. (1990b). The small hydrophobic protein of human respiratory syncytial virus: comparison between antigenic subgroups A and B. J. Gen. Virology 71, 1571-1576.

49. Collins, P.L. (1991) The molecular biology of human respiratory syncytial virus (RSV) of the genus Pneumovirus. In "The Paramyxoviruses" (D.W. Kingsbury, Ed.), pp. 103-162. Plenum, New York.

50. Collins, P.L., Mcintosh, K., and Chanock, R.M. (1996). Respiratory syncytial virus. In "Virology" (B.N. Fields, D.M. Knipe et al. Eds.), 3rd ed., pp. 13131351. Raven Press, New York.

51. Collins, P.L., Wertz, G.W. (1985). The 1A protein gene of human respiratory syncytial virus: nucleotide sequence of the mRNA and a related polytranscript. Virology 141,283-291.

52. Connors, M., Crowe, J.E.Jr., Firestone, C.-Y., Murphy, B.R., and Collins, P.L. (1995). A cold-passaged, attenuated strain of human respiratory syncytial virus contains mutations in the F and L genes. Virology 208, 000-000.

53. Dahle, J., and Liess, B. Comparative study with cloned classical swine fever virus strains Alfort and Glentorf: clinical, pathological, virological and serological findings in weaner pigs. Wiwn. Tiearaerztl. Monatsschr., 1995, 83, 232-238.

54. Durbin, A.P., Hall, S.L., Siew, J.W., Whiteheard, S.S., Collins, P.L., and Murphy, B.R. 1997. Recovery of infectious human parainfluenza virus type 3 from cDNA. Virology 235, 323-332.

55. Enami, M., Luytjes, W., Krystal, M., and Palese, P. 1990. Introduction of site-specific mutations into the genome of influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3802-3805.

56. Ericson G.A. Hog Cholera (Swine fever). In: Vet. Diagn. Virology. Mosby year book. USA, Ed. A.E. Castro, W.P.Heushele, 1992, 228-230.

57. Fearns R, Collins PL. Role of the M2-1 transcription antitermination protein of respiratory syncytial virus in sequential transcription. J Virol 1999(b);73:5852-5864.

58. Fearns R, Collins PL, Peeples ME., 2000. Functional analysis of the genomic and antigenomic promoters of human respiratory syncytial virus. J Virol;74( 13):6006-6014.

59. Fearns R, Peeples ME, Collins PL. Increased expression of the N protein of respiratory syncytial virus stimulates minigenome replication but does not alter the balance between the synthesis of mRNA and antigenome. Virology 1997; 236:188-201.

60. Fearns R, Peeples ME, Collins PL. 2002. Mapping the transcription and replication promoters of respiratory syncytial virus. J Virol., Feb;76(4): 1663-72

61. Feldman SA, Hendry RM, Beeler JA. Identification of a linear heparin binding domain for human respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G. J Virol 1999;73:6610-6617.

62. Felsenstein J. 1978. The number of evolutionary trees, Syst. Zool., Vol. 27. -P. 27-33.

63. Felenstein, J., 1993. PHYLIP Inference Package Version 3.5. Department of Genetics, Univ. of Washington, Seattle, USA.

64. Flick, R., and Pettersson, R.F.2001. Reverse genetics system for Uukuniemi virus (Bunyaviridae): RNA polymerase I-catalyzed expression of chimeric viral RNAs. J. Virol.75, 1643-1655.

65. Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O.G., Palese, P., Brownlee, G.G., and Garcia-Sastre, A. 1999. Resuce of influenza A virus from recombinant DNA. J. Virol.73, 9679-9682.

66. Franki R.I. В., Faquet C.M., Knudson D.L., Brown F. (editors), 1991 . Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Archives of Virology. Supplementum 2, 223-233.

67. Gassen, U., Collins, F. M., Duprex, W. P., and Rima, В. K. 2000. Establishment of a rescue system for canine distemper virus. J.Virol. 14, 1073710744.

68. Hardy RW, Harmon SB, Wertz GW. Diverse gene junctions of respiratory syncytial virus modulate the efficiency of transcription termination and respond differently to M2-mediated antitermination. J Virol 1999; 73:170176.

69. Hardy RW, Wertz GW. The product of the respiratory syncytial virus M2 gene ORF1 enhances readthrough of intergenic junctions during viral transcription. J Virol 1998; 72:520-526.

70. Hardy RW, Wertz GW. The Cys (3)-His (1) motif of the respiratory syncytial virus M2-1 protein is essential for protein function. J Virol 2000; 74:58805885.

71. He, В., Paterson, R. G., Ward, C. D., and Lamb, R. A. 1997. Recovery of infectious SV5 from cloned DNA and expression of a foreign gene. Virology 237, 249-260.

72. Heminway, B.R., Yu, Y., Tanaka, Y., Perrine, K.G., Gustafson, E., Bernbstein, J.M., Galinski, M.S. (1994). Analysis of respiratory syncytial virus F, G, and SH proteins in cell fusion. Virology 200, 801-805.

73. Hendricks DA, Mcintosh K, Patterson JL. Further characterization of the soluble form of the G glycoprotein of respiratory syncytial virus. J Virol 1988;62:2228-2233.

74. Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y, Hobom, G., and Webster, R. G. 2000. A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6108-6113.

75. Hoffmann, E., and Webster, R. G. 2000. Unidirectional RNA polymerase 1-polymerase II transcription system for the generation of influenza A virus from eight plasmids. J. Gen. Virol. 81, 2843-2847.

76. Hoffman, M. A., and Banerjee, A K. (1997). An infectious clone of human parainfluenza virus type 3. J. Virol. 71, 4272-4277.

77. Hulst M. M., Westra D.F., Wensvoort G., Moormann R. J.M. Glycoprotein El of hog cholera virus expressed in insect cells protects swine from hog cholera. J. Virology, 1993, 67, 9, 5435-5442.

78. Jacques, J-P., Hausmann, S., and Kolakofsky, D. (1994). Paramyxovirus mRNA editing leads to G deletions as well as insertions. EMBO J. 13, 54965503.

79. Jameson B. A., Wolf H.The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants. Comput Appl Biosci. 1988 Mar;4(l):181-6.

80. Jin, H., Clarke, D., Zhou, H. Z., Cheng, X., Coelingh, K., Bryant, M., and Li, S.1998. Recombinant human respiratory syncytial virus (RSV) from cDNA and construction of subgroup A and В chimeric RSV. Virology 251, 206-214.

81. Jin H, Cheng X, Zhou HZ, et al. Respiratory syncytial virus that lacks open reading frame 2 of the M2 gene (M2-2) has altered growth characteristics and is attenuated in rodents. J Virol 2000; 74:74-82.

82. Johnson, P.R. and Collins,P.L. (1990). Sequence comparison of the phosphoprotein mRNAs of antigenicsubgroups A and В of human respiratory syncytial virus identifies a highly divergent domain in the predicted protein J. Gen. Virol. 71,481-485.

83. Johnson, P.R. and Collins, P.L. (1989). The 1B(NS2), 1C(NS1) and N proteins of human respiratory syncytial virus (RSV) of antigenic subgroups A and B: sequence conservation and divergence within RSV genomic RNA J. Gen. Virol. 70, 1539-1547.

84. Johnson, P.R. and Collins, P.L. (1988a). The fusion glycoproteins of human respiratory syncytial virus of subgroups A and B: Sequence conservation provides a structural basis for antigenic relatedness. J. Gen. Virol. 69, 26232628.

85. Johnson, P.R., and Collins, P.L. (1988b). The A and В subgroups of human respiratory suncytial virus: comparison of intergenic and gene-overlap sequences. J. Gen. Virol. 69, 2901-2906.

86. Johnson PR, Spriggs MK, Olmsted RA, et al. The G glycoprotein of human respiratory syncytial viruses of subgroups A and B: Extensive sequence divergence between antigenically related proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 1987; 84:5625-5629.

87. R. A.Karron, D. A. Buonagurio, A. F. Georgiu, S. S. Whitehead, J. E. Adamus, M. L. Clements-Mann, D. O. Harris, V. B. Randolph, S. A. Udem, B. R. Murphy, and M. S. Sidhu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:13,961» 13,966, 1997

88. Kalica AR, Wright PF, Hetrick FM, et al. Electron microscopic studies of respiratory syncytial temperature-sensitive mutants. Arch Gesamte Virusforsch 1973;41:248-258.

89. Koning M., Lengsfeld Т., Pauly Т., Stark R., Thiel H.J. Classical swine fever virus: independent induction induction of protective immunity by two structural glycoproteins. J. Virol. (1995), 69, 6479-6481

90. Kozak, M. The scanning model for translation: an update. 1989, J. Cell Biol., 108, 229-241

91. Kuo L, Fearns R, Collins PL. Analysis of the gene start and gene end signals of human respiratory syncytial virus: Quasi-templated initiation at position 1 of the encoded mRNA. J Virol 1997; 71: 4944-4953

92. Kuo L, Grosfeld H, Cristina J, et al. Effects of mutations in the gene-start and gene-end sequence motifs on transcription of monocistronic and dicistronic minigenomes of respiratory syncytial virus. J Virol 1996; 70: 6892-6901.

93. Kuo MYP, Sharmeen L, Dinter-Gottlieb G, Taylor J. Characterization of self-cleaving RNA sequences on the genome and antigenome of human hepatitus delta virus. J Virol 1988; 62: 4439^1444.

94. Langedijk JP, Schaaper WM, Meloen RH, et al. Proposed three-dimensional model for the attachment protein G of respiratory syncytial virus. J Gen Virol 1996;77:1249-1257.

95. Laude, H. Virus de la peste porcine classique: isolement d'une souche cytolytique a partir de cellules IB-RS2. 1978, Ann. Inst. Psteur Microbiol. 129A: 553-561.

96. Levine S, Klaiber-Franco R, Paradiso PR. Demonstration that glycoprotein G is the attachment protein of respiratory syncytial virus. J Gen Virol 1987;68:2521-2524.

97. Levorban Y., Edwards S., Ibata G., Vannier P. (1990), A blocking ELISA to differentiate hog cholera virus antibodies in pig sera from those due to other pestivirus. Ann. Rech. Vet. 21, 119-129.

98. Liess B. (ed.) 1988. Classical swine fever and related viral infections. Developments in Veterinary Virology, Boston: Martinus Nijhoff Publishing.

99. Lopez J.A., Bustos R., Orvell C., et al. Antigenic structure of human respiratory syncytial virus fusion glycoprotein. J. Virol. 1998; 72:6922-6928.

100. Lowings, P., Ibata, G., Needham, J., Paton, D. (1996): Classical Swine Fever Virus Diversity And Evolution. J. Gen. Virology 77, 1311-1321.

101. Martinez I, Dopazo J, Melero JA. Antigenic structure of the human respiratory syncytial virus G glycoprotein and relevance of hypermutationevents for the generation of antigenic variants. J Gen Virol 1997;78:2419-2429.

102. Marriott AC, Smith JM, Easton AJ. 2001, Fidelity of leader and trailer sequence usage by the respiratory syncytial virus and avian pneumovirus replication complexes. J Virol; 75(14): 6265-6272.

103. Mebatsion T, Verstegen S, De Vaan LT, Romer-Oberdorfer A, Schrier CC A recombinant newcastle disease virus with low-level V protein expression is immunogenic and lacks pathogenicity for chicken embryos. J Virol 2001 Jan; 75(l):420-428.

104. Melero JA, Garcia-Barreno B, Martinez I, et al. Antigenic structure, evolution and immunobiology of human respiratory syncytial virus attachment (G) protein. J Gen Virol 1997;78: 2411-2418.

105. Mena, I., Vivo, A, Perez, E., and Portela, A. 1996. Rescue of a synthetic chloramphenicol acetyltransferase RNA into influenza virus-like particles obtained from recombinant plasmids. J. Virol. 70, 5016-5024.

106. Meyers G., Rumenarf Т., Thiel H.J. (1989): Molecular cloning and nucleotide sequence of the genome of hog cholera virus. Virology 171, 555567.

107. Mink, M.A., Stec, D.S., and Collins, P.L. (1991). Nucleotide sequences of the 3' leader and 5' trailer regions of human respiratory syncytial virus genomic RNA. Urology 185, 615-624.

108. Moenning V. Characteristics of the virus. (1988), In: Liess B. (Ed.) Classical swine fever and related infections. Martinus Nijhoff Publishing, Djston Dordrecht Lancaster, h. 55-80.

109. Moening V., Schageman G., Dahle J., Greiser-Wilke I., Leder L. (1990), A new approach for the diagnosis of hog cholera. Dtsch. Tieratztl, Wsch. 97, 9193.

110. Moormann, R. Live attenuated pseudorabies virus expressing envelope glycoprotein El of hog cholera virus protects swine both against pseudorabies and hog cholera. J. Virol. 1991, 65, 2761-2765.

111. Moorman R. J. M., Warmerrdam P. A. M., van der Meer В., Hulst M. M. 1990 Nucleotide sequence of hog cholera virus RNA: properties of the polyprotein encoded by the open reading frame spanning the viral genomic RNA. Vet. Microbiol. Vol. 23. P. 185-191.

112. Moormann R. J. M., Van Gennip H. G. P., Miedema G. K. W., Hulst M. M., Van Rijn P. A. (1996): Infection RNA transcribed from an engineered full-length cDNA template of the genome of a pestivirus. J. Virol. 70, 763-770.

113. Muller A., Depner K.P., Liess B. (1996), Evaluation of a gp55 (E2) recombinant-based ELISA for the detection of antibodies induced by classical swine fever virus. Dtsch. Tieratztl, Wsch. 103, 451-453.

114. Nepoklonov, E.A., Aliper, T.I., Sergeev, V. A., Dudnikov, L. A., Sologub, V.K., Tsibesov, V.V., Grebennikova, T.V., Zaberezhny, A. D. (2000).

115. Development of tools for eradication of classical swine fever. Oxford, England, 23-28 July, p. 61.

116. Neumann, G., Watanabe, T, Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P.A Hughes, M., Perez, D., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., and I Kawaoka, Y. 1999. Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 9345-9350.

117. Pastey, M.K., Samal, S.K. (1995). Nucleotide sequence analysis of the nonstructural NS-1 (1С) and NS-2 (IB) protein genes of bovine respiratory syncytial virus. J. Gen. Virol. 76, 193-197.

118. Peeples ME, Collins PL. 2000. Mutations in the 5' trailer region of a respiratory syncytial virus minigenome which limit RNA replication to one step. J Virol; 74(1): 146-55.

119. Peeters BP, de Leeuw OS, Verstegen I, Koch G, Gielkens AL Generation of a recombinant chimeric Newcastle disease virus vaccine that allows serological differentiation between vaccinated and infected animals. Vaccine 2001 Feb 8; 19(13-14): 1616-1627.

120. Pekosz, A, He, В., and Lamb, R. A. 1999. Reverse genetic of negative-strand RNA viruses: Closing the circle. Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 8804-8806.

121. Pleschka S, Jaskunas R, Engelhardt OG, et al. A plasmid-based reverse genetics system for influenza A virus. J Virol 1996;70:4188-4192.

122. Poch, О., Souvaget, I., Delarue, M., and Tordo, N. (1989). Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements. EMBO J. 8, 3867-3874.

123. Pringle, C.R., Filipiuk, A.H., Robinson, B.S., Watt, P.J., Higgins, P., and Tyrrell, D.A.J. (1993). Immunogenecity and pathogenecity of a triple temperature-sensitive modified respiratory syncytial virus in adult volonteers. Vaccine 11,473-478.

124. Purchio A. F., Larson R., Collet M. 1984. Characterization of bovine viral diarrhea viral proteins J. Virol. Vol. 189. P. 666-669.

125. Qi F., Ridpath J. F., Lewis T. et al. 1992. Analysis of the bovine viral diarrhea virus genome for possible cellular insertion. Virology. Vol.189. P. 285-292.

126. Radecke, F, Spielhofer, P., Schneider, H., Kaelin, K., Huber, M., Dotsch, C., Christiansen, G., and Billeter, M. A. 1995. Rescue

127. Randolph, V.B., Kandis, M., Stemler-Higgins, P., Kennelly, M.S., McMullen, Y.M., Speelman, D.J., and Weeks-Levy, C. (1994). Attenuated temperature-sensitive respiratory syncytial virus mutants generated by cold adaptation. Virus Res. 33,241-259.

128. Rixon HW, Brown C, Brown G, Sugrue RJ. 2002. Multiple glycosylated forms of the respiratory syncytial virus fusion protein are expressed in virus-infected cells. J Gen Virol; 83:61-6

129. Roberts SR, Compans RW, Wertz GW. Respiratory syncytial virus matures at the apical surfaces of polarized epithelial cells. J Virol 1995;69:2667-2673.

130. Roberts SR, Lichtenstein D, Ball LA, et al. The membrane-associated and secreted forms of the respiratory syncytial virus attachment glycoprotein G are synthesized from alternative initiation codons. J Virol 1994;68:4538-4546

131. Roberts, A, and Rose, J. K. 1998. Recovery of negative-strand RNA viruses from plasmid DNAs: A positive approach revatilizes a nega-tive field. Virology 247, 1-6.

132. Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, Т., Buchholz, U. J., and Mettenleiter, Т. C. 1999. Generation of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J. Gen. Virol. 80, 2987-2995.

133. Ruggli N., Tratschin J.-D., Mittelholzer C., Hofmann M. A. (1996): Nucleotide sequence of classical swine fever virus strain Alfort/187 and transcription of infectious RNA from stably cloned full-length cDNA. J. Virol. 70, 3478-3487.

134. Rumenapf Т., Stark R., Meyers G., Thiel H.-J. Structural proteins of hog cholera virus expressed by vaccinia virus: futher characterization and induction of protective immunity. Journal of Virology, 1991, 65, 589-597.

135. Rumenapf, Т., Unger, G., Strauss, J.H., Theil, H.-J. Processing of the envelope glycoproteins of pestiviruses. 1993, J.Virol., 67, 3288-3294.

136. Saitou N., Nei, M. (1987): The Neighbos-Joining Method: A New Model For Reconstructing Phylogenetic Trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406-425.

137. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

138. Schnell, M. J., Mebatsion, Т., and Conzelmann, К. K.1994. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13, 4195-4203.

139. Schroder A, van Loon AA, Goovaerts D, Teifke JP, Mundt E VP5 and the N terminus of VP2 are not responsible for the different pathotype of serotype I and II infectious bursal disease virus. J Gen Virol 2001 Jan; 82(Pt 1):1 p. 5969

140. V. Sergeev, L. Dudnikov, K. Gruzdev, T. Grebennikova and E. Nepoklonov. Some Aspects of Hog Cholera Virus Cultivaton. Proceedings of the Third ESW Symposium on Pestivirus Infections, ID-DLO, Lelystad, The Netherlands, 1996, p. 132.

141. V.A. Sergeev, K. N. Gruzdev, E. A. Nepoklonov, Т. I. Aliper New Efficacious Live Vaccine Against Classical Swine Fever and its Application Strategy to Fight the Disease without Depopulation of Swine. Тезисы на

142. Международное координационное совещание ФАО по проблемам классической чумы свиней, Birmingham,июль 1998 г.

143. Stark R., Rumenapf Т., Meyers G., Thiel H.-J. 1990 Cenomic localization of hog cholera virus glycoproteins. Virology. Vol. 174. P. 286-289.

144. Stec, D.A., Hill, M.G. Ill, and Collins, P.L. (1991). Sequence analysis of the polymerase L gene of human respiratory syncytial virus and predicted phylogeny of nonsegmented negative strand viruses. Virology 183, 273-297.

145. Subbarao, E. K., Kawaoka, Y, and Murphy, B. R.1993. Rescue of influenza A virus wild-type PB2 gene and a mutant derivative bearing a site-specific temperature-sensitive and attenuating mutation. J. Virol. 67, 7223-7228.

146. Sullender WM., 2000. Respiratory syncytial virus genetic and antigenic diversity. Clin Microbiol Rev.: 13(1), 1-15.

147. Sutherland KA, Collins PL, Peeples ME, 2001. Synergistic effects of gene-end signal mutations and the M2-1 protein on transcription termination by respiratory syncytial virus. Virology, 288(2): 295-307.

148. Techaarpornkul S, Barretto N, Peeples ME. (2001). Functional analysis of recombinant respiratory syncytial virus deletion mutants lacking the small hydrophobic and/or attachment glycoprotein gene. J Virol. 75(15):6825-6834.

149. Teng MN, Collins PL. Identification of the respiratory syncytial virus proteins required for formation and passage of helper-dependent infectious particles. J Virol 1998; 72:5707-5716.

150. Teng M.N., Collins P.L. Altered growth characteristics of recombinant respiratory syncytial viruses which do not produce NS2 protein. J Virol 1999; 73:466-473.

151. Teng M.N., Whitehead S.S., Collins P.L. 2001. Contribution of the respiratory syncytial virus G glycoprotein and its secretedand membrane-bound forms to virus replication in vitro and in vivo. Virology; 289(2): 283296.

152. Terpstra C., Wensvoort G. (1988), The protective value of vaccine-induced neutralising antibody titers in swine fever. Vet. Microbiol. 16, 123-128

153. Thiel H.J., Stark R., Weiland E., Rumenapf Т., Meyer G. Hog Cholera Virus: Molecular Composition of virions from a pestivirus. 1991, J. Of Virology, 65, 9, 4705-4712.

154. Terpstra С. 1991. Hog cholera: an update of present knowlege. Br. Vet. J., 147, 397-406

155. Terpstra, C., and G. Wensvoort. 1988. The protective value of vaccine-induced neutralizing antibody titers in swine fever. Vet. Microbiol., 16: 123128.

156. Terpstra C., Woortmeyer R., Barteling S.J. Development and properties of a cell culture produced vaccine for cholera based on the Chinese strain. Dt. Tierarottl. Woch., 1990, 97, 2, 77-79.

157. Yount B, Curtis KM, Baric RS Strategy for systematic assembly of large RNA and DNA genomes: transmissible gastroenteritis virus model. J.Virol 2000 Nov; 74(22): 10600-11

158. Yuan S, Mickelson D, Murtaugh MP, Faaberg KS. Complete genome comparison of porcine reproductive and respiratory syndrome virus parental and attenuated strains. Virus Res 2001 Apr;74(l-2):99-l 10 : Virus Res 2001 Apr;74( 1 -2):99-110

159. Van Oirschot J.T., Terpstra C. Hog cholera virus Virus infections of porcines. Amsterdam, 1989. -P.l 13-130.

160. Van Oirschot, J.T. Description of the virus infection, in: B. Liess (ed.), Classical Swine fever and related virus infections, Martinus Nijhoff Publishing, Boston, 1988, p. 1-25.

161. Van Rijn, P.A., Miedema, G.K.W., Wensvoort, G., vanGennip, H.G.P., Moormann, R.J.M. Antigenic structure of envelope glycoprotein El of hog cholera virus. 1994, Journal of Virology, 68, 3934-3942.

162. Van Rijn, P.A., Bossers, A., Wenswoort, G., Moormann, R.J.M. Classical swine fever virus (CSFV) envelope protein E2 containing one structural antigenic unit protects pigs fromlethal CSFV infection. 1996, Virology, 77, 2737-2746.

163. Vilcek S., Belak S. 1998. Classical Swine Fever Virus: Discrimination Between Vaccine Strains and European Field Viruses by Restriction Endonuclease Cleavage of PCR Amplicons. Acta Vet. Scand., 39, 395-400.

164. Vilcek S., Stadejek Т., Ballagi-Pordany A., Lowings J.P., Paton D.J., Belak S. 1996. Genetic variability of classical swine fever virus. Virus Research, 43, 137-147.

165. Walsh EE, Falsey AR, Sullender WM. Monoclonal antibody neutralization escapes mutants of respiratory syncytial virus with unique alterations in the attachment (G) protein. J Gen Virol 1998; 79: 479-487

166. Walsh EE, Hruska J. Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus proteins: Identification of the fusion protein. J Virol 1983;47: 171-177

167. Weber E, Humbert B, Streckert HJ, et al. Nonstructural protein 2 (NS2) of respiratory syncytial virus (RSV) detected by an antipeptide serum. Respiration 1995; 62:27-33.

168. Weiland E., Ahl R., Stark R., Weiland F., Thiel H.J. (1992), A second envelope glycoprotein mediates neutralization of a pestivirus, hog cholera virus. J. Virol. 66, 3677-3682

169. Wengler G. Flaviviridae. Arch, of Virology, 1991 (Suppl. 2), 223-233.

170. Wensvoort G., Bloemraad M., Terpstra C. (1988), An enzyme immunoassay employing monoclonal antibodies and detecting specifically antibodies in classical swine fever virus. Vet. Microbiol. 17, 129-140

171. Wensvoort, G., Terpstra, C., deKluijver, E.P., Kragten, C., Warnaar, J.C. Antigenic differentiation of pestivirus strains with monoclonal antibodies against hog cholera virus. Vet. Microbiol., 1989, 21, 9-20.

172. Whelan, S. P., Ball, L. A, Barr, J. N., and Wertz, G. T. 1995. Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8388-8392.

173. Whitehead S.S., Bukreyev A., Teng M.N., et al. Recombinant respiratory syncytial virus bearing a deletion of either the NS2 or SH gene is attenuated in chimpanzees. J Virol 1999;73:3438-3442

174. Wu HN, Lai MM. Reversible cleavage and ligation of hepatitis delta virus RNA. Science 1989;243:652-654.

175. Zaberezhny, A.D., P. S. Paul and Young S. Lyoo (1994) Prevalence of P Types among Porcine Rotaviruses using Polymerase Chain Reaction generated Subgenomic VP4 Gene Probes. Vet. Microbiology. 39. 1-2. p. 97110

176. Zaberezhny, A.D., S. Tzall, S.W.Harnish, V. Randolph and Crowley, J.C. (1994) Molecular Characterization of Respiratory Syncytial Virus Subgroup В Strain, American Society for Virology, 13th Annual Meeteng , Madison WI, p. 176 (English) .

177. Zamora, M., Samal, S.K. (1992). Gene junction sequences of bovine respiratory syncytial virus. Virus Res. 24, 115-121.

178. Zheng, H.Q., Randolph, V.B., and Anderson, L.J. Genetic variability in envelope-associated protein genes of closely related group A strains of respiratory syncytial virus. Virus Res. 1999 Jan;59(l):89-99.