Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Андрианова, Екатерина Павловна

• Андрианова, Екатерина Павловна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Андрианова, Екатерина Павловна

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Вирус ящура.

2. Вакцины против ящура.

2.1 Традиционная вакцина.

2.2 ДНК-вакцины.

2.3 Вакцины на основе ослабленных вирусов.

2.4 Пустые вирусные капсиды как основа для вакцины.

2.5 Субъединичные вакцины.

3. Антигенные сайты вируса ящура.

4. Гетерологичные системы экспрессии белков.

4.1 Бактериальная система экспрессии.

4.2 Растительная система экспрессии.

4.2.1 Трансгенные растения как система получения белков.

4.2.2 Получение белков в хлоропластах.

4.2.3 Транзиентная экспрессия белков в растениях.

5. Получение в растениях вакцинных белков вируса ящура.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Изучение возможности получения пустых капсидов ящура в растениях.

1.1 Экспрессия предшественника капсидных белков Р1-2А в растениях N. Ьеп1кат1апа.

1.2 Коэкспрессия предшественника Р1-2А и протеазы ЗСР'° в N. benthamiana.

1.3 Экспрессия индивидуальных капсидных белков вируса ящура в растениях N. Benthamiana.

2. Получение полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях и растениях.

2.1 Получение белка CBD-PE в клетках Е. coli.

2.2 Получение полиэпитопного белка НРЕ в Е. coli.

2.3 Получение белка НРЕ в растениях N. benthamiana.

2.4 Схема получения полиэпитопного белка НРЕ из клеток бактерий и растений.

2.5 Оценка иммуногенности НРЕ белка.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение рекомбинантных антигенов вируса ящура О/Тайвань/99, перспективных для разработки противоящурных вакцин, с использованием бактерий и растений»

Начиная с двадцатого столетия животноводство многих экономически развитых стран мира несет большие убытки от эпидемических вспышек ящура. Недавние инфекционные вспышки ящура в Тайване (1997) и Великобритании (2001) существенно усилили обеспокоенность производителей и потребителей мяса сельскохозяйственных животных во многих странах мира. Основным способом контроля возникновения вспышек заболевания ящуром в настоящее время является вакцинация сельскохозяйственных животных вакцинами на основе инактивированного вируса. Несмотря на то, что иммунизация препаратами инактивированного вируса достаточно эффективна, такие вакцины имеют ряд существенных недостатков. Наиболее серьезные из них - проблемы безопасности, связанные с возможной утечкой не полностью инактивированного вируса, а также сложность достоверного диагностического различия вакцинированного животного от заболевшего, необходимость использования специальных лабораторий для их получения и недостаточно высокая скорость получения в условиях возникновения очага заболевания.

В связи с этими недостатками предпринимаются попытки разработать альтернативные вакцины против вируса ящура. В настоящее время разрабатываются методы использования в качестве вакцины фрагментов структурных и неструктурных белков вируса, например структурного белка УР1 или пустых вирусных капсидов, ослабленных вирусов, например с делецией участка капсидного белка УР1 или протеиназы Ьрго. Такие вакцины не имеют некоторых недостатков традиционных вакцин, однако на сегодняшний день они менее эффективны по сравнению с вакцинами, созданными на основе инактивированного вируса. Поэтому задача получения альтернативной вакцины против ящура остается актуальной.

В настоящее время перспективной и представляющей огромный интерес для биотехнологических компаний системой получения белка является растение. Главными преимуществами использования растений для получения белка являются низкая конечная стоимость и биобезопасность продукта вследствие отсутствия у растений и животных общих патогенов. Рекомбинантные белки в растениях могут быть получены двумя методами: с помощью генетической трансформации или транзиентной экспрессии с помощью вирусных векторов. Создание трансгенного растения, а значит и получение белка из него, требует значительных временных затрат. Уровень экспрессии целевых белков трансгенными растениями обычно низок, что определяет высокую стоимость продукта вследствие сложности его очистки. Получение белка с использованием фитовирусной системы транзиетной экспрессии в растениях имеет ряд преимуществ; в первую очередь более высокий уровень экспрессии, биобезопасность и короткое время, необходимое для создания и тестирования экспрессионной системы.

Настоящая работа посвящена получению вакцинных белков вируса ящура, способных индуцировать иммунный ответ у лабораторных животных, способный защищать их от заболевания ящуром, и разработке систем экспрессии этих белков в бактериях и растениях.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Целью работы являлось конструирование рекомбинантных вакцинных белков вируса ящура и разработка систем их экспрессии в бактериях и растениях.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Создание систем транзиентной экспрессии предшественника капсидных белков Р1 и ЗС-протеазы или отдельных капсидных белков вируса ящура (изолята О/Тайвань/99) в клетках растений Nicotiana benthamiana с помощью фитовирусных векторов;

2. Конструирование рекомбинантного гена, кодирующего искусственный белок НРЕ, содержащий набор иммуногенных В- и Т-клеточных эпитопов вируса ящура О-серотипа

3. Создание систем экспрессии белка НРЕ в клетках Escherichia coli и в растениях Nicotiana benthamiana-,

4. Проверка иммуногенных свойств выделенных из клеток бактерий и растений препаратов белка НРЕ на лабораторных животных.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Вирус ящура

Первое письменное упоминание о болезни, похожей на ящур, появилось в шестнадцатом веке в Италии, где описывается заболевание крупного рогатого скота. На заре становления вирусологии, в конце девятнадцатого века, было показано, что, инфекционным агентом ящура является патоген, способный проходить через бактериальный фильтр. Впоследствии, было показано, что этим патогеном является вирус, названный вирусом ящура.

Серологическими методами удается различить семь серотипов вируса: А, О, С, Азия-1, SAT (Территории Южной Африки) -1, -2 и -3. Также установлено более 60 подтипов вируса. На территории стран СНГ обычно встречаются вирусы серотипов О и А.

Вирус ящура является типовым представителем семейства Picornaviridae, рода Aphtovirus. Его геном представлен одпонитевой линейной (+) РНК размером около 8500 нуклеотидов (схема генома вируса представлена на Рис. 1). Вирус имеет икосаэдрический капсид, составленный из четырех структурных белков - VP1, VP2, VP3 и VP4.

Ранние исследования вируса ящура с использованием обработанного трипсином вируса или химически очищенных вирусных белков показали важность капсидного белка VP1 в антигенной и иммуногенной активности вируса (Wild et al., 1969; Bachrach et al., 1975). В 80-х годах было установлено, что иммунизация морских свинок (Bittle et al., 1982; Pfaff et al., 1982) и крупного рогатого скота (Di Marchi et al., 1986) фрагментами белка VP1, которые соответствуют 141-160 (или 141-158) аминокислотным остаткам и находятся в так называемой G-H-петле, приводила к выработке антител и в некоторых случаях к защите от заболевания. Позднее было показано, что G-H-петля белка VP1 присутствует у всех серотипов вируса ящура (Borrego et al., 1995; Mateu et al., 1995), но является высоковариабельным участком, что объясняет низкую кросс-реакгивность между разными серотипами вируса (Feigelstock et al., 1992; Mateu et al., 1994). Эти данные позволили сформулировать утверждению, что G-H-петля белка VP1 является иммунодоминантным антигенным сайтом. Однако, системный иммунный ответ, вызываемый заболеванием или вакцинацией, никогда не исследовался достаточно тщательно, чтобы подтвердить это.

Для проникновения в клетку вирус использует два класса рецепторов на ее поверхности. Инициация трансляции вирусной РНК происходит на последовательности внутреннего сайта посадки рибосом (TRES) (Belsham et al., 1990; Kuhn et al., 1990). В результате трансляции образуется белок-предшественник 240-250 кД, который подвергается последовательному расщеплению до функционально активных структурных и неструктурных белков. Протеаза Lpro автокаталитически выщепляется из полипротеина-предшественника. После этого Lpro участвует в подавлении синтеза хозяйских белков в инфицированной клетке путем протеолиза клечочного фактора инициации трансляции, подавляя таким образом са/7-зависимую трансляцию (Devaney et al., 1988; Kirchweger et ai, 1994).

Область PI кодирует белки оболочки вируса: VP4, VP2, VP3 и VP1. Предшественник PI процессируется протеазой ЗСрГ0 с образованием 3 белков: VPO, VP3 и VP1. Расщепление VPO на VP4 и VP2 происходит при сборке капсида. Для этого необходимо взаимодействие структурных белков с вирусной РНК. Расщепление VPO на VP4 и VP2 происходт автокаталитически и необходимо для образования инфекционного вируса. Белки VP1, VP2 и VP3 стыкуясь между собой, образуют поверхность капсида, в то время как миристилированный по N-концу белок VP4 погружен внутрь капсида. Сборка капсида начинается с образования протомеров белками VPO, VP1 и VP3. 5 протомеров формируют пентамеры, а 12 пентамеров образуют капсид вируса. Вирус ящура, как и ряд других пикориовирусов, способен формировать пустые капсиды, идентичные по своим антигенным свойствам интактным не содержащим РНК вирионам. Такие частицы менее стабильны, при этом в составе капсида содержится непроцессированный белок УРО вместо белков УР2 и УР4 (Яшеуетати е1 а/., 1979; Ваэауарра ег а\., 1994).

3UTR

U 1 A(VP4j

2А звт t«*® 1B<VP2) 1C(VP3) 1D<VP1) 28 [ 2C ЗА

ЗО"01

ЛЛ

Р1

-А

РЗ ро?у f % J

0 Сантрасщепления и>к Структурные0елкн

О Фактор расщепления не установлен д Сантрасщепления ЗС«"0

Сантрасщепления 2А

И естр. ►турнмс: телки VP3 VP1 Шх^Щ

Рис. 1. Схема генома вируса ящура

Область Р2 кодирует неструктурные белки 2В и 2С и пептид 2А. Пептид 2А автокаталитически выщепляется из состава полипротеина Р2 и остается связанным с предшественником капсидных белков PI. Функция белка 2В достоверно не установлена, а белок 2С имеет нуклеозидтрифосфат-связывающие (Klein et al., 1999; Pfister et al., 1994) и хеликазные мотивы (Klein et al., 2000).

Область РЗ также кодирует ряд неструктурных белков, в числе которых протеаза ЗСргои РНК-зависимая РНК-полимераза вируса 3Dpo1.

После трансляции вирусная РНК служит матрицей для образования (-) цепи РНК, синтез которой происходит при помощи 3Dpo1. Затем происходит синтез (+) цепей РНК и образование вирионов (Harber et aL, 1991; Nugent et al., 1999). Зрелые вирионы освобождаются из клетки при ее разрушении путем лизиса.

Основной причиной распространения ящура является международная торговля домашними животными. Вспышки заболевания происходят во всех странах мира, где в сельском хозяйстве используется крупный рогатый скот. Болезни подвержены все домашние парнокопытные животные. Наиболее восприимчив к заболеванию ящуром крупный рогатый скот, менее восприимчивы свиньи, овцы, козы, более 70 видов диких животных и человек. Вирус передается от заболевших животных к здоровым воздушно-капельным путем. Первые признаки заболевания могут появляться через 2-3 дня после заражения. У зараженных животных появляется жар, нарушение походки, хромота, афтозное поражение слизистой оболочки ротовой полости, кожи, вымени и межкопытной щели конечностей. Несмотря на то, что заболевание ящуром не приводит к высокому уровню смертности среди взрослых животных, оно проявляется в потери веса, резком понижении молочной продуктивности. Смертельный исход чаще происходит у молодых животных с ослабленным иммунитетом. У них наблюдаются нарушения функций сердечно-сосудистой системы и скелетной мускулатуры. Крупный рогатый скот, а также овцы и козы могут быть бессимптомными носителями вируса, приобретая при этом способность заражать других животных в течение 2-3 лет.

Вспышки ящура наносят большой экономический ущерб промышленности и сельскому хозяйству. По данным Федерального Центра Охраны Здоровья Животных (Институт Ящура, г. Владимир) при эпизоотии вируса серотипа О на Тайване в 1997 г. возникло более 6 тыс. очагов заболевания, пало или было забито свыше 4 млн. свиней, общий экономический ущерб составил около 10 млрд. долларов США (http://www.zzr.ru/archives/200l/06/article3/article3.html). При возникновении очагов ящура А-22 в балканских странах в 1996 г. экономический ущерб превысил 300 млн. долларов. Ликвидация очага этого заболевания в Московской области в 1995 г. обошлась в 14,6 млрд. руб. в ценах того периода (около 3,2 млн. долларов), в Приморском крае в 2000 г. — в 8,7 млн. руб. (свыше 300 тыс. долларов).В результате вспышки ящура ссротипа А в 2010 году в Южной Корее, названной самой сильной в истории этой страны, уничтожено около 30% или 10 млн. голов свиней и 5% или более 3 млн. голов крупного рогатого скота. Стоит отметить что, Южная Корея счи талась свободной от ящура страной после последней вспышки ящура серотипа О в 2002 году. Эта эпидемия ящура стоила Южной Корее больше 1,8 млрд. долларов США. Япония в 2010 году также понесла многомиллионные убытки вследствие вспышки ящуре серотипа О, в ходе которой было забито около 300 тыс. животных.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Андрианова, Екатерина Павловна

ВЫВОДЫ

1. Созданы фитовирусные векторы для транзиентной ко-экспрессии в растениях предшественника капсидных белков вируса ящура серотипа О/Тайвань/99 Р1-2А, слитого с геном флуоресцентного белка uGFP и протеазы ЗСрго. Показано, что экспрессия гена предшественника Р1-2А в растениях приводит к образованию нерастворимых телец включения.

2. Сконструирован ген искусственного кандидатного вакцинного белка НРБ, содержащего набор В- и Т-клеточных эпитопов капсидных белков VP1, VP4, 2С и 3D вируса ящура изолята О/Тайвань/99.

3. Разработаны системы экспрессии и очистки белка НРЕ в клетках бактерий Е. coli и растений N. benthamiana, обеспечивающие получение высокоочищенных препаратов для иммунологических испытаний.

4. Рекомбинантный белок НРЕ обладает высокой иммуногенностью и индуцирует у лабораторных животных образование нейтрализующих антител к вирусу ящура О/Тайвань/99.

5. Однократная иммунизация морских свинок белком НРЕ индуцирует иммунный ответ, обеспечивающий полную защиту лабораторных животных от заражения вирусом ящура О/Тайвань/99.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Полиэпитопный белок вируса ящура, полученный в бактериях и растениях, вызывает протективный иммунитет в морских свинках / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Луговская H.H. и др. // Биохимия. -2011. -№ 3. - Т.76. - С. 415-424.

2. Состав полиэпитопного белка для индукции иммунного ответа против вируса ящура / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Борисов В.В., Эльдаров М.А., Фолимонов A.C. // Патент РФ № 2453557 от 20.06.2012, Бюл. № 17.

3. Андрианова Е.П., Эльдаров М.А., Фолимонов A.C. Полученный в растениях рекомбинантный белок, состоящий из эпитопов вируса ящура, как основа альтернативной вакцины // Биология - Наука XXI Века: Сб. тезисов 16-й Межд. Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино: Пущинский науч. Центр РАН. - 2012. - С. 245-246.

4. Андрианова Е.П., Фолимонов A.C. (2009). Получение белка, состоящего из эпитопов вируса ящура, в бактериях и растениях для изучения возможности разработки альтернативного метода вакцинирования // Горизонты нанобиотехнологии: сб. тезисов Всеросс. научной школы для молодежи - Звенигород: Центр «Биоинженерия» РАН. - 2009. С. 15-16.

5. Продукция полиэпитопного белка вируса ящура в бактериях и растениях с целью получения потенциальной вакцины / Андрианова Е.П., Кременчугская С.Р., Борисов В.В. и др. // Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова: сб. тезисов Междунар. научной конф. -М.: ИБХ РАН. - 2009. - С. 7-9.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Андрианова, Екатерина Павловна, 2012 год

1.Wild Т. F., Burroughs J. N., Brown F. Surface structure of foot-and-mouth disease virus //J. Gen. Virol. 1969. Apr. №4(3). P. 313-320.

2. Bachrach H. L., Moore D. M., McKercher P. D., Polatnick J. Immune and antibody responses to an isolated capsid protein of foot-and-mouth disease virus // J. Immunol. 1975. Dec. № 115(6). P. 1636-1641.

3. Pfaff E., Mussgay M., Bohm II. O., Schulz G. E., Schaller H. Antibodies against a preselected peptide recognize and neutralize foot and mouth disease virus // EMBO J. 1982. № 1(7). P. 869-874.

4. Di Marchi R., Brooke G., Gale C., Cracknell V., Doel Т., Mowat N. Protection of cattle against foot-and-mouth disease by a synthetic peptide // Science. 1986. № 232. P. 639-641.

5. Borreg O.B., Camarero J. A., Mateu M. G., Domingo E. A highly divergent antigenic site of foot-and-mouth disease virus retains its immunodominance // Viral. Immunol. 1995. № 8. P. 11-18.

6. Mateu M. G., Camarero J. A., Giralt E., Andreu D., Domingo E. Direct evaluation of the immunodominance of a major antigenic site of foot-and-mouth disease virus in a natural host // Virology. 1995. № 206. P. 298-306.

7. Devaney M. A., Vakharia V. N., Lloyd R. E., Ehrenfeld E., Grubman M. J. Leader protein of foot-and-mouth disease virus is required for cleavage of the p220 component of the cap-binding protein complex // J. Virol. 1988. № 62. P. 44074409.

8. Rweyemamu M. M., Terry G., Pay T. W. Stability and immunogenicity of empty particles of foot-and-mouth disease virus // Arch. Virol. 1979. № 59(1-2). P. 69-79.

9. Klein M., Eggers H. J., Nelsen-Salz B. Echovirus 9 strain Barty non-structural protein 2C has NTPase activity // Virus Res. 1999. № 65. P. 155-160.

10. Pfister T., Jones K. W., Wimmer. E. A cysteine-rich motif in poliovirus protein 2C (ATPase) is involved in RNA replication and binds zinc in vitro // J. Virol. 2000. №74 P. 334-343.

11. Klein M., Hadaschik D., Zimmermann H., Eggers H. J., Nelsen-Salz B. The picornavirus replication inhibitors HBB and guanidine in the echovirus-9 system: the significance of viral protein 2C //J. Gen. Virol. 2000. № 81. P. 895-901.

12. IIarber J. J., Bradley J., Anderson C. W., Wimmer E. Catalysis of poliovirus VPO maturation cleavage is not mediated by serine 10 of VP2 // J. Virol. 1991. № 65. P. 326-334.

13. Nugent C. I., Johnson K. L., Sarnow P., Kirkegaard K. Functional coupling between replication and packaging of poliovirus replicon RNA // J. Virol. 1999. № 73. P. 427-435.21 .http P. //www.zzr.ru/archives/2001/06/article3/article3.html 1

14. Rweyemamu M. M., Leforban Y. Foot-and-mouth disease and international development // Adv. Virus Res. 1999. № 53. P. 111-126.

15. Lewis P. J., Babiuk L. A. DNA vaccines: a review // Adv. Virus Res. 1999. № 54. P. 129-188.

16. Yang N. S., Wang J. IL, Lin K. F. Comparative studies of the capsid precursor polypeptide PI and the capsid protein VP1 cDNA vectors for DNA vaccination against foot-and-mouth disease virus // J. Gene Med. 2005. № 7(6). P. 708-717.

17. Ward G., Rieder E., Mason P. W. Plasmid DNA encoding replicating foot-andmouth disease virus genomes induces antiviral immune responses in swine // J. Virol. 1997. № 71(10). P. 7442-7447.

18. Bachrach H. L. Foot-and-mouth disease virus: properties, molecular biology and immunogenicity // Beltsville Symp. Agric. Res. 1977. № l.P. 3-32.

19. Brooksby, J. B. Portraits of viruses: foot-and-mouth disease virus // Intervirology. 1982. № 18. P. 1-23.

20. Mowat G. N., Brooksby J. B., Pay T. W. Use of BHK 21 cells in the preparation of mouse attenuated live foot-and-mouth disease vaccines for the immunization of cattle//Nature. 1962. № 196. P. 655-666.

21. Martin W. B., Edwards L. T. A field trial in south africa of an attenuated vaccine against foot-and-mouth disease // Research in Veterinary Science. 1965. № 6. P. 196-201.

22. Zhidkov S. A., Sergeev V. A. A study of the properties of attenuated cold variant of type O foot-and-mouth disease virus // Veterinariia. 1969. № 10. P. 29-31.

23. Mowat G. N., Barr D. A., Bennett J. H. The development of an attenuated foot-and-mouth disease virus vaccine by modification and cloning in tissue cultures of BHK21 cells // Archiv fur die gesamte Virusforschung. 1969. № 26(4). P. 341— 354.

24. McKenna T. S., Lubroth J., Rieder E., Baxt B., Mason P. W. Receptor binding site-deleted foot-and-mouth disease (FMD) virus protects cattle from FMD // J. Virol. 1995. № 69. P. 5787-5790.

25. Chinsangara M. J., Mason P. W., Grubman M. J. Protection of swine by live and inactivated vaccines prepared from a leader proteinase deficient serotype A12 foot-and-mouth disease virus//Vaccine. 1998. № 16. P. 1516-1522.

26. Mason P. W., Piccone M. E., McKenna T. S., Chinsangaram J., Grubman M. J. Evaluation of a live-attenuated foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate // Virology. 1997. № 227. P. 96-102.

27. Segundo F. D., Weiss M., Pérez-Martin E., Dias C. C., Grubman M. J., Santos T. L. Inoculation of swine with foot-and-mouth disease SAP-mutant virus induces early protection against disease//J Virol. 2012. Feb. № 86(3). P. 1316-1327.

28. Grubman M. J., Lewis S. A., Morgan D. O. Protection of swine against foot-and-mouth disease with viral capsid proteins expressed in heterologous systems // Vaccine. 1993. № 11(8). P. 825-829.

29. Roosien J., Belsham G. J., Ryan M. D., King A. M., Vlak J. M. Synthesis of foot-and-mouth disease virus capsid proteins in insect cells using baculovirus expression vectors//J. Gen. Virol. 1990. №71. P. 1703-1711.

30. Chinsangaram J., Beard C., Mason P. W., Zellner M. K., Ward G., Grubman M. J. Antibody response in mice inoculated with DNA expressing foot-and-mouth disease virus capsid proteins // Journal of Virology. 1998. № 72(5). P. 4454-4457.

31. Li Z., Yi Y., Yin X., Zhang Z., Liu J. Expression of foot-and-mouth disease virus capsid proteins in silkworm-baculovirus expression system and its utilization as a subunit vaccine // PloS One. 2008. № 3(5). P. e2273.

32. Sanz-Parra A., Blasco R., Sobrino F., Ley V. Analysis of the B and T cell response in guinea pigs induced with recombinant vaccinia expressing foot-and-mouth disease virus structural proteins // Archives of Virology. 1998. № 143(2). P. 389398.

33. Berinstein A., Tami C., Taboga O., Smitsaart E., Carrillo E. Protective immunity against foot-and-mouth disease virus induced by a recombinant vaccinia virus // Vaccine 2000. № 18(21). P. 2231-2238.

34. Ma M., Jin N., Shen G., Zhu G., Liu H. J., Zheng M., Immune responses of swine inoculated with a recombinant fowlpox virus co-expressing P12A and 3C of FMDV and swine IL-18 // Veterinary Immunology and Immunopathology. 2008. № 121. P. 1-7.

35. Mayr G. A., Chinsangaram J., Grubman M. J. Development of replication-defective adenovirus serotype 5 containing the capsid and 3C protease codingregions of foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate // Virology 1999.263(2). P. 496-506.

36. Abrams C. C., King A. M., Belsham G. J. Assembly of foot-and-mouth disease virus empty capsids synthesized by a vaccinia vims expression system // J. Gen. Virol. 1995. № 76. P. 3089-3098.

37. Grubman M. J., Moraes M. P., Schutta C., Barrera J., Neilan J., Ettyreddy D. Adenovirus serotype 5-vectored foot-and-mouth disease subunit vaccines: the first decade//Future Virol. 2010. № 5(1). P. 51-64.

38. Zhang Y. L, Guo Y. J., Wang K. Y, Lu K., Li K., Zhu Y, Sun S. H. Enhanced immunogenicity of modified hepatitis B virus core particle fused with multiepitopes of foot-and-mouth disease virus // Scand J Immunol. 2007. № 65(4). P. 320-328.

39. Strohmaier K., Franze R., Adam K. H. Location and characterization of the antigenic portion of the FMDV immunizing protein // J. Gen. Virol. 1982. № 59. P. 295-306.

40. Kit M., Kit S., Little S. P., Di Marchi R. D., Gale C. Bovine herpesvirus-1 (infectious bovine rhinotracheitis virus) -based viral vector which expresses foot-and-mouth disease epitopes // Vaccine. 1991. № 9(8). P. 564-572.

41. Taboga O., Taini C., Carrillo E. A large-scale evaluation of peptide vaccines against foot-and-mouth disease: lack of solid protection in cattle and isolation of escape mutants //J. Virol. 1997. № 71(4). P. 2606-2614.

42. Wang C. Y, Chang T. Y, Walfield A. M. Effective synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine // Vaccine. 2002. № 20(19-20). P. 2603-2610.

43. Beignon A. S., Brown F., Eftekhari P. A peptide vaccine administered transcutaneously together with cholera toxin elicits potent neutralising anti-FMDV antibody responses // Vet. Immunol. Immunopathol. 2005. № 104(3-4). P. 273280.

44. Mulcahy G., Gale C., Robertson P., lyisan S., DiMarchi R. D., Doel T. R. Isotype responses of infected virus-vaccinated and peptide-vaccinated cattle to foot-and-mouth disease virus // Vaccine. 1990. № 8, P. 249-256.

45. Mulcahy G., Pullen L. A., Gale C., DiMarchi R. D., Doel T. R. Mouse protection test as a predictor of the protective capacity of synthetic foot-and-mouth disease vaccines//Vaccine. 1991. №9, 19-24.

46. Cartwright B., Chapman W. G., Brown F. Serological and immunological relations between the 146S and 12S particles of foot-and-mouth disease virus // J. Gen. Virol. 1980. № 50(2). P. 369-375.

47. Rowlands D. J., Sangar D. V., Brown F. A comparative chemical and serological study of the full and empty particles of foot-and mouth disease virus // J. Gen. Virol. 1975. № 26(3). P. 227-238.

48. Pay T. W. F., Hingley P. J. Con-elation of 140S antigen dose with the serum neutralising antibody response and the level of protection induced in cattle by foot-and-mouth disease vaccines // Vaccine. 1987. № 5, P. 60-64.

49. Dunn C. S., Samuel A. R., Pullen L. A., Anderson J. The biological relevance of virus neutralisation sites for virulence and vaccine protection in the guinea pig model of foot-and-mouth disease // Virology. 1998. № 247. P. 51-61.

50. McCullough K. C., Desimone F., Brocchi E., Capucci L., Crowther J. R., Kihm U. Protective immune response against foot-and-mouth disease virus // J. Virol. 1992. №66. P. 1835-1840.

51. Aktas S., Samuel A. R. Identification of antigenic epitopes on the foot and mouth disease virus isolate O/Manisa/Turkey/69 using monoclonal antibodies // Revue Scientifique et Technique Office International des Epizooties. 2000. № 19. P. 744753.

52. Baxt B., Vakharia V., Moore D. M., Franke A. J., Morgan D. O. Analysis of neutralising antigenic sites on the surface of type-A12 foot-and-mouth disease virus//J. Virol. 1989. № 63. P. 2143-2151.

53. Bolwell C., Clarke B. E., Parry N. R., Ouldridge E. J., Brown F., Rowlands D. J. Epitope mapping of foot-and-mouth disease virus with neutralizing monoclonal-antibodies // J. Gen. Virol. 1989. № 70. P. 59-68.

54. Mahapatra M., Seki C., Upadhyaya S., Barnett P. V., La Torre J., Paton D. J. Characterisation and epitope mapping of neutralising monoclonal antibodies to A(24) Cruzeiro strain of FMDV // Veterinary Microbiology. 2011. № 149. P. 242247.

55. Thomas A. A. M., Woortmeijer R. J., Puijk W., Barteling S. J. Antigenic sites on foot-and-mouth disease virus type-AlO // J. Virol. 1988a. № 62. P. 2782-2789.

56. Crowther J. R., Rowe C. A., Butcher R. Characterization of monoclonal antibodies against a type SAT 2 foot-and-mouth disease virus // Epidemiol. Infect. 1993a. № 11 LP. 391-406.

57. Klein J. Understanding the molecular epidemiology of foot-and-mouth-disease virus//Infect. Genet. Evol. 2009. № 9(2). P. 153-161.

58. Knowles N. J., Samuel A. R. Molecular epidemiology of foot-and-mouth disease virus //Virus Res. 2003. № 91(1). P. 65-80.

59. Rweyemamu M., Roeder P., Mackay D., Sumption K., Brownlie J., Leforban Y, Valarcher J. F., Knowles N. J., Saraiva V. Epidemiological patterns of foot-and-mouth disease worldwide // Transbound Emerg. Dis. 2008. № 55(1). P. 57-72.

60. Doel T. R., Williams L., Barnett P. V. Emergency vaccination against foot-and-mouth disease: rate of development of immunity and its implications for the carrier state // Vaccine. 1994. № 12(7). P. 592-600.

61. Xie Q. C., McCahon D„ Crowther J. R., Belsham G. J., McCullough K. C. Neutralization of Foot-and-Mouth-Disease Virus Can Be Mediated through Any of at Least 3 Separate Antigenic Sites // J. Gen. Virol. 1987. № 68. P. 1637-1647.

62. Fowler V. L., Paton D. J., Rieder E., Barnett P. V. Chimeric foot-and-mouth disease viruses: Evaluation of their efficacy as potential marker vaccines in cattle // Vaccine. 2008. № 26. P. 1982-1989.

63. Fowler V. L., Knowles N. J., Paton D. J., Barnett P. V. Marker vaccine potential of a foot-and-mouth disease virus with a partial VP1 G-H loop deletion // Vaccine. 2010. №28. P. 3428-3434.

64. Rieder E., Baxt B., Lubroth J., Mason P. W. Vaccines prepared from chimeras of foot-and-mouth disease virus (FMDV) induce neutralizing antibodies and protective immunity to multiple serotypes of FMDV // J. Virol. 1994. № 68. P. 7092-7098.

65. Samuel A. R. Genetic and antigenic studies on foot-and-mouth disease virus type O. PhD Thesis. University of HertfordshirE. UK, 1997.

66. Aggarwal N., Barnett P. V. Antigenic sites of foot-and-mouth disease virus (FMDV): an analysis of the specificities of anti-FMDV antibodies after vaccination of naturally susceptible host species // J. Gen. Virol. 2002. № 83. P. 775-782.

67. Thomas A. A. M., Woortmeijer R. J., Barteling S. J., Meloen R. H. Evidence for more than one important neutralising sites on foot-and-mouth disease virus // Archives of Virology. 1988b. № 99. P. 237-242.

68. Mahapatra M., flamblin P., Paton D.J. FMD virus epitope dominance in the antibody response of vaccinated animals // J. Gen. Virol. 2012. № 93. P. 488-493.

69. Collen T. Cell mediated immunity in ruminants: Foot-and-mouth disease (aphthovirus): viral T cell epitopes / CRC Press Inc.; B. M. L. Goddeevis and I. Morrison (ed.): Boca Raton Fla. 1994. PP. 173-197.

70. Collen T., Doel T. R. Heterotypic recognition of foot-and-mouth disease virus by cattle lymphocytes//J. Gen. Virol. 1990. № 71. P. 309-315.

71. Garcia-Briones M. M., Blanco E., Chiva C., Andreu D., Ley V., Sobrino F. Immunogenicity and T cell recognition in swine of foot-and-mouth disease virus polymerase 3D // Virology. 2004. № 1.322(2). P. 264-275.

72. Cox S. J., Barnett P. V., Dani P., Salt J. S. Emergency vaccination of sheep against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission//Vaccine. 1999. № 17. P. 1858-1868.

73. Parida S., Fleming L., Mahapatra M., Hamblin P., Gloster J., Paton D. J. Emergency vaccination of sheep against foot-and-mouth disease: significance and detection of subsequent sub-clinical infection // Vaccine. 2008. № 26. P. 34693479.

74. Francis M. J., Hastings G. Z., Syred A. D., McGinn B., Brown F., Rowlands D. J. Non-responsiveness to a foot-and-mouth disease virus peptide overcome by addition of foreign helper T-cell determinants // Nature. 1987. № 12-18.330(6144). P. 168-170.

75. Collen T., Di Marchi R., Doel T. A., A T cell epitope in VP1 of foot-and-mouth disease virus is immunodominant for vaccinated cattle // J. Immunol. 1991. № 146. P. 749-755.

76. Rodn'guez A., Dopazo J., Sa'iz J.C., Sobrino F., Immunogenicity of nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus: differences between infected and vaccinated swine//Arch. Virol. 1994a. № 136, P. 123-131.

77. Rodrfguez A., Sa'iz J. C., Nombela I. S., Andreu D., Sobrino F., Antigenic specificity of porcine T cell response against foot-and-mouth disease virus: identification of T helper epitopes in YP1 // Virology. 1994b. № 205. P. 24-33.

78. Glass E. J., Oliver R. A., Collen T., Doel T. R., Di Marchi R., Spooner R. L. MHC Class II restricted recognition of FMDV peptides by bovine T cells // Immunology. 1991. № 74. P. 594-599.

79. Beck E., Feil G., Strohmaier K. The molecular basis of the antigenic variation of foot-and-mouth disease virus // EMBO J. 1983. № 2. P. 555-559.

80. Gerner W., Hammer S. E., Wiesmuller K. H., Saalmiiller A. Identification of major histocompatibility complex restriction and anchor residues of foot-and-mouth disease virus-derived bovine T-cell epitopes // J. Virol. 2009. № 83(9). P. 40394050.

81. Blanco E., Garcia-Briones ML, Sanz-Parra A., Gomes P., De Oliveira E., Valero M. L., Andreu D., Ley V., Sobrino F. Identification of T-cell epitopes in nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus // J. Virol. 2001. № 75(7). P. 3164-3174.

82. Berger H. G., Straub O. C., Ahl R., Tesar M., Marquardt O. Identification of foot-and-mouth disease virus replication in vaccinated cattle by antibodies to nonstructural virus proteins // Vaccine. 1990 № 8(3). P. 213-216.

83. Studier F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures //Protein Express Purif. 2005. № 41. P. 207-234.

84. Fischer R., Hoffmann K., Schillberg A., Emans N. Antibody production by molecular farming in plants // J Biol Regul Hemeost Agents. 2000. № 14. P. 8392.

85. Liénard D., Sourrouille C., Gomord V., Faye L. Pharming and transgenic plants // Biotechnol Ann. Rev. 2007. № 13. P. 115-147.

86. Streatfield S. J. Mucosal immunization using recombinant plant-based oral vaccines // Methods. 2006. № 38(2). P. 150-157.

87. Tacket C. O. Plant-derived vaccines against diarrheal diseases // Vaccine. 2005. № 23 P. 1866-1869.

88. Bevan M. W., Flavell R. B., Chilton M. D. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation // Nature. 1983. № 304. P. 184— 187.

89. Hiatt A., Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants // Nature. 1989. № 342. P. 76-78.

90. Barta A., Sommengruber K., Thompson D., Hartmuth K., Matzke M. A., Matzke A. J. M. The expression of a napoline synthase human growth hormone chimeric gene in transformed tobacco and sunflower callus tissue // Plant. Mol. Biol. 1986. № 6. P. 347-357.

91. Hood E. E., Witcher D. R., Maddock S., Meyer T., Baszczynski C., Bailey M. Commercial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant production, processing, extraction and purification // Mol. Breed. 1997. №3 P. 291-306.

92. Mason H. S., Warzecha H., Mor T., Arntzen C. J. Edible plant vaccines: applications for prophylactic and therapeutic molecular medicine // Trends Mol. Med. 2002. № 8 P. 324-329.

93. Tiwari S., Verma P. C., Singh P. K., Tuli R. Plants as bioreactors for the production of vaccine antigens // Biotechnol. Adv. 2009. № 27(4). P. 449-467.

94. Horn M. E., Woodard S. L., Howard J. A. Plant molecular farming: systems and products // Plant Cell Rep. 2004. № 22. P. 711-720.

95. Sijmons P. C., Dekker B. M., Schrammeijer B., Verwoerd T. C., van den Elzen P. J., Hoekema A. Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants//Biotechnology. 1990. № 8. P. 217-221.

96. Edelbaum O., Stein D., Holland N., Gafni Y., Livneh O., Novick D., Rubinstein M., Sela I. Expression of active human interferon-b in transgenic plants // J. Interferon Res. 1992. № 12. P. 449-453.

97. Kusnadi A. Production of recombinant proteins in transgenic plants: practical considerations // Biotechnology and Bioengineering. 1997. № 56. P. 473-484.

98. Nandi S., Yalda D., Lu S., Nikolov Z., Misaki R., Fujiyama K., Huang N. Process development and economic evaluation of recombinant human lactoferrin expressed in rice grain // Transgenic Res. 2005. № 4(3). P. 237-249.

99. Rybicki E. P. Plant-produced vaccines: promise and reality // Drug Discov. Today. 2009. № 14(1-2). P. 16-24.

100. Meyers B., Zaltsman A., Lacroix B., Kozlovsky S. V., Krichevsky A. Nuclear and plastid genetic engineering of plants: comparison of opportunities and challenges // Biotechnol. Adv. 2010. № 28(6). P. 747-756.

101. Molina A., Veramendi J., Herväs-Stubbs S. Induction of neutralizing antibodies by a tobacco chloroplast-derived vaccine based on a B cell epitope from canine parvovirus // Virology. 2005. № 25.342(2). P. 266-275.

102. Bally J., Nadai M., Vitel M., Rolland A., Dumain R., Dubald M. Plant physiological adaptations to the massive foreign protein synthesis occurring in recombinant chloroplasts // Plant Physiol. 2009. № 150. P. 1474-1481.

103. Singh A. K., Verma S. S. Plastid transformation in eggplant (Solatium melongena L.) // Transgenic Res. 2010. № 19. P. 113-119.

104. Kapila J., De Rycke R., van Montagu M., Angenon G. An agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves // Plant Sci. 1997. № 122. P. 101-108.

105. Marillonnet S., Thoeringer C., Kandzia R., Klimyuk V., Gleba Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants //Nat. Biotechnol. 2005. № 23. P. 718-723.

106. Gleba Y, Klimyuk V., Marillonnet S. Viral vectors for the expression of proteins in plants // Curr. Opin. Biotechnol. 2007. № 18(2). P. 134-141.

107. Turpen T. IT, Reinl S. J., Charoenvit Y, Hoffman S. L., Fallarme V., Grill L. K. Malarial epitopes expressed on the surface of recombinant tobaccomosaic virus // Biotechnol. 1995. № 13. P. 53-57.

108. Klimyuk V., Marillonnet S., Knaeblein J., McCaman M., Gleba Y. Modem Biopharmaceuticals: Production of recombinant proteins in plants / Edited by Knaeblein J; WILEY-VCH P. Verlag: GmbH & Co. KGaA, 2005.PP. 893-917.

109. Gils M., Kandzia R., Marillonnet S., Klimyuk V., Gleba Y. High-yield production of authentic human growth hormone using a plant virus-based expression system // Plant Biotechnol. J. 2005. № 3. P. 613-620.

110. Dorokhov Y. L., Sheveleva A. A., Frolova O. Y., Komarova T. V., Zvcreva A. S., Ivanov P. A., Atabekov J. G. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves//Tuberculosis (Edinb). 2006. №61. P. 342-541.

111. Yusibov V., Hooper D., Spitsin S., Fleysh N., Kean R., Mikheeva T., Deka D., Karasev A., Cox S., Randall J., Koprowski H. Expression in plants and immunogenicity of plant virus-based experimental rabies vaccine // Vaccine. 2002. №20. P. 3155-3164.

112. Massa S., Franconi R., Brandi R., Muller A., Mett V., Yusibov V. Anti-canccr activity of plant-produced HPV16 E7 vaccine // Vaccine. 2007. № 25. P. 30183021.

113. Yusibov V., Rabindran S., Commandeur U., Tvvyman R. M., Fischer R. The potential of plant virus vectors for vaccine production. Drugs R. D. 2006. № 7(4). P. 203-217.

114. Brennan F. R., Gilleland L. B., Staczek J., Bendig M. M., Hamilton W. D., Gilleland II. E. Jr. A chimaeric plant virus vaccine protects mice against a bacterial infection//Microbiology. 1999. № 145. P. 2061-2067.

115. Franconi R., Massa S., Illiano E., Mullar A., Cirilli A., Accardi L. Exploiting the plant secretory pathway to improve the anticancer activity of a plant-derived HPV16 E7 vaccine // Int. J. Immunopathol. Pharmacol. 2006. № 19. P. 187-197.

116. Pogue G. P., Lindbo J. A., Garger S. J., Fitzmaurice W. P. Making an ally from an enemy: plant virology and the new agriculture // Annu. Rev. Phytopathol. 2002. № 40. P. 45-74.

117. Hamilton A. J., Baulcombe D. C. A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants // Science. 1999. № 286. P. 950-952.

118. Kasschau K. D., Carrington J. C. A counterdefensive strategy of plant viruses: suppression of posttranscriptional gene silencing // Cell. 1998. № 95. P. 461-470.

119. Rouwendal G. J., Mendes O., Wolbert E. J. II., Boer A. D. Enhanced expression in tobacco of the gene encoding green fluorescent protein by modification of its codon usage // Plant Mol. Biol. 1997. № 33(6). P. 989-099.

120. Kawabe A., Miyashita N. T. Patterns of codon usage bias in three dicot and four monocot plant species. // Genes Genet Syst. 2003. № 78(5). P. 343-352.

121. Sullivan M. L., Green P. J. Post-transcriptional regulation of nuclear-encoded genes in higher plants: the roles of mRNA stability and translation // Plant Mol. Biol. 1993. № 23 (6). P. 1091-1104.

122. Mishra S., Yadav D. K., Tuli R. Ubiquitin fusion enhances cholera toxin B subunit expression in transgenic plants and the plant-expressed protein binds GM1 receptors more efficiently // J. Biotechnol. 2006. № 127. P. 95-108.

123. Usha R., Rohll J. B., Spall V. E., Shanks M., Maule A. J., Johnson J. E., Lomonossoff G. P. Expression of an animal virus antigenic site on the surface of a plant virus particle//Virology. 1993. № 197(1). P. 366-374.

124. Wu L., Jiang L., Zhou Z., Fan J., Zhang Q, Zhu H., Han Q, Xu Z. Expression of foot-and-mouth disease virus epitopes in tobacco by a tobacco mosaic virus-based vector//Vaccine. 2003. № 1.21(27-30). P. 4390-4398.

125. Carrillo C , Wigdorovitz A , Oliveros J. C. Protective immune response to foot-and-mouth disease virus with VP1 expressed in transgenic plants // J. Virol. 1998. №72. P. 1688-1690.

126. Wigdorovitz A., Carrillo C., Trono K. Induction of a virus-specific antibody response to foot and mouth disease virus using the structural protein VP1 expressed in transgenic potato plants // Virol. Immunol. 2001. № 14. 49-57.

127. Wang D. M., Zhu J. B., Peng M., Zhou P. Induction of a protective antibody response to FMDV in mice following oral immunization with transgenic Stylosanthes spp. as a feedstuff additive // Transgenic Res. 2008. № 17. P. 63-70.

128. Li Y., Sun M., Liu J., Yang Z., Zhang Z., Shen G. High expression of foot-and-mouth disease virus structural protein VP1 in tobacco chloroplasts // Plant Cell Rep. 2006. № 25(4). P. 329-333.

129. Sun M., Qian K., Su N., Chang IT, Liu J., Shen G. Foot-and-mouth disease virus VP1 protein fused with cholera toxin B subunit expressed in Chlamydomonas reinhardtii chloroplast // Biotechnol Lett. 2003. № 25(13). P. 1087-1092.

130. Wang Y., Shen Q., Jiang Y., Song Y., Fang L., Xiao S., Chen FI. Immunogenicity of foot-and-mouth disease virus structural polyprotein PI expressed in transgenic rice//J. Virol Methods. 2012. № 181(1). P. 12-17.

131. Folimonov A. S., Folimonova S. Y., Bar-Joseph М., Dawson W. О. A stable RNA virus-based vector for citrus trees //Virology. 2007. № 10.368(1). P. 205-216.

132. Grubman M. J., Morgan D. O., Kendall J., Baxt B. Capsid intermediates assembled in a foot-and-mouth disease virus genome RNA-programmed cell-free translation system and in infected cells//J. Virol. 1985. №56(1). P. 120-126.

133. Chayen N. E. Turning protein crystallisation from an art into a science // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. № 14(5). P. 577-583.

134. Schein C. PI. Production of soluble recombinant proteins in bacteria // Biotechnology. 1989. №7. P. 1141-1148.

135. Arnau J., Lauritzen C., Petersen G. E., Pedersen J. Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins // Protein Expr. Purif. 2006. № 48(1). P. 1-13.

136. Определение протективного действия полученного в растительной системе экспрессии рекомбинантного полиэпитопного белка вируса ящура на морских свинках.1. Тестируемый препарат

137. Препарат кандидатной вакцины ГПЭ растворен в 10 мл буфера A4 (10 мМ Tris-HCl pH 8.0; 4M мочевина) в концентрации 0,8 мг/мл. Визуально кандидатная вакцина представляет собой прозрачную жидкость. Условия хранения температура минус 20°С.

138. Способ введения препарата и доза

139. Четвертая группа из 8 морских свинок, которым белок не вводили, была контрольной. Морских свинок иммунизировали однократно.

140. Заражение морских свинок вирусом ящура

141. Для оценки достоверности полученных результатов иммунизации использовали биномиальный тест с уровнем значимости (а) равным 0,005.1. РЕЗУЛЬТАТЫ

142. Однократная иммунизация морских свинок выделенным из растений препаратом рекомбинантного полиэпитопного белка вируса ящура обеспечивает защиту животных от заражения вирусом ящура О/Тайвань/99 при использовании дозы препарата 120 и 350 мкг.

143. Тестирование протективного действия полученного в бактериальной системе экспрессии рекомбинантного полиэпитопного белка вируса ящура на морских свинках.1. Тестируемый препарат

144. Препарат кандидатной вакцины ГПЭ растворен в 5 мл буфера А4 (10 мМ Tris-HCl рН 8.0; 4М мочевина) в концентрации 1,4 мг/мл. Визуально кандидатная вакцина представляет собой прозрачную жидкость. Условия хранения температура минус 20°С.

145. Способ введения препарата и доза

146. Четвертая группа из 8 морских свинок, которым белок не вводили, была контрольной. Морских свинок иммунизировали однократно.

147. Заражение люрских свинок вирусом ящура

148. Для оценки достоверности полученных результатов иммунизации использовали биномиальный тест с уровнем значимости (а) равным 0,005.1. РЕЗУЛЬТАТЫ

149. ГД5о -доза, вызывающая гибель 50% чувствительных клеток in vitro7