Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка и определение их специфичности тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Савенко, Наталья Борисовна

• Савенко, Наталья Борисовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Савенко, Наталья Борисовна

Список условных сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Современные методы детекции прионов.

1.2. Синтетические фрагменты прионных пептидов; методики иммунизации животных.

1.3. Гибридизация соматических, миеломных и антителпродуцирующих клеток с целью получения моноклональных антител.

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы.

2.1.1. Культуры клеток, питательные среды.

2.1.2. Вирусные штаммы.

2.1.3. Получение конъюгатов пептидов.

2.1.4. Лабораторные животные.

2.1.5. Получение асцитной жидкости.

2.1.5. Определение титра антител методом ИФА в крови иммунизированных животных и в асците.

2.1.6. Иммуноцитохимическое исследование клеточных культур на наличие прионов.

2.1.7. Проведение Вестерн-блота.

2.1.8. Выявление прионов методом ИФА.

2.2. Результаты.

2.2.1. Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка. Оценка уровня антител в сыворотке крови иммунизированных животных в ИФА.

2.2.2. Иммуноцитохимическое исследование культур клеток, гистосрезов головного мозга и мазков крови.

2.2.3. Разработка метода выявления прионного протеина в белковом препарате «Бактивин» Вестерн-блот анализом.

2.2.4. Разработка методов иммуноферментного анализа для выявления прионного протеина.

2.3. Гибридизация соматических и миеломных клеток с антител продуцирующим и клетками мышей и кроликов, характеристика полученных культур и определение продукции моноклональных антител в культуральной среде.

3. Обсуждение.

4. Выводы.

5. Практические предложения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение поликлональных антител к синтетическому пептиду прионного белка и определение их специфичности»

Прионные болезни представляют группу нейродегенеративных расстройств человека (болезнь Крейцфельдта-Якоба (БКЯ), синдром Герштманна-Штройслера, куру) и животных (скрепи овец и коз, трансмиссивная энцефалопатия норок (ТЭН), хроническая изнуряющая болезнь диких оленей и лосей). Начиная с 1985 года прионные болезни идентифицированы еще у 12 видов представителей кошачьих и копытных: губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, антилопы, сернобыка, арабского сернобыка, большого куду, канны, кошки, муфлона, пумы, гепарда, криворогого сернобыка, оцелота). Из этих "новых" 12 болезней 11 связаны с появлением трансмиссивной губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (ТГЭ). Эти заболевания являются причиной нарушений в ЦНС и неизбежно ведут к гибели (S.B. Prusiner, 1992).

Диагностика прионных болезней до недавнего времени базировалась на выявлении характерных клинических признаков, а также патогистологическом исследовании головного мозга. Предложены методы иммуногистохимии, иммунохимии и др. для посмертной или послеубойной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота (BSE), скрепи овец и коз.

Существующие подходы для ранней диагностики ТГЭ основаны на клинических признаках, электроэнцефалографии, ядерном магнитном резонансе или на биопсии мозга. Подтверждение диагноза при подозрении на болезнь, тем не менее, основано на гистологическом и иммуногистохимическом (ИГХ) исследовании мозга.

Многочисленными исследованиями доказано, что прионы — возбудители коровьего «бешенства» могут служить причиной заболевания человека (Thackray A.M., Klein М.А., Aguzzi A., Bujdoso R., 2002). Это заболевание названо новым вариантом болезни Крейцфельдта - Якоба (вБКЯ), которое в отличие от ранее известного заболевания встречается в молодом возрасте. По сравнению со спорадической формой БКЯ, вБКЯ вызывается штаммами прионов, обладающими высокой лимфотропностью. Доказательством лимфотропизма прионов, вызывающих вБКЯ, стало обнаружение в Великобритании в ходе рутинного мониторинга в миндалинах и аппендиксах патогенного приона от людей, умерших в возрасте 10-50 лет (в их числе 70% молодых людей в возрасте 20-29 лет, т.е. среднем возрасте проявления вБКЯ). Высокий процент инфицирования людей инфекционнм прионом связывают с возможностью передачи вБКЯ путем гемотрансфузии (Llewelyn С.А., Hewitt Р.Е., Knight R.S. et al., 2004).

Учитывая сложную эпизоотическую ситуацию по ГЭП КРС в Англии, странах Евразии и других континентов, возможность заноса инфекции на территорию России, и длительный инкубационный период (до 2-13 лет) стала актуальна проблема доклинической диагностики прионных болезней крупного рогатого скота и овец с целью раннего выявления прионов и, впоследствии, проведения мероприятий по оздоровлению стада.

Не меньшее значение имеет раннее выявление зараженных животных до убоя, и для предотвращения поступления в продажу мяса и мясопродуктов от скрытых носителей инфекции. Для биотехнологии и производства биопрепаратов необходимо использовать свободные от агента скрепи (PrPSc) культуры клеток, сыворотки крови и продукты сыворотки крови животных.

Поэтому разработка чувствительных специфических методов детекции минимальных количеств PrPSc у животных, зараженных прионами, в инкубационном и раннем клиническом периодах болезни, в культурах клеток, сыворотках крови и других биологических жидкостях, приобретает особую значимость. Учитывая, что PrPSc адаптирован к развитию кроме нервной ткани, в лимфоцитах, фолликулярных дендритных клетках, рядом авторов предложены методы доклинического выявления прионов иммуногистохимическим методом в миндалинах, а также в лимфатических узлах конъюнктивы глаза овец (О" Rourke et al., 1998, 1999; Mackenzie А., 1983; Rubenstein R, Kascsak R, Meiz P. et al., 1986) с использованием моноклональных антител к синтетическому прионному пептиду. В России Вольпиной О.М.,

Рыбаковым С.С. и др., (2001), Рыбаковым С.С., Решетниковым Г.Г. и др., (2005) получены поликлональные антитела к различным синтетическим фрагментам прионного белка и показана их специфичность при иммуногистохимической детекции прионов в гистосрезах головного мозга больных BSE животных.

Необходимо также тестировать культуры клеток, полученные из органов и тканей сельскохозяйственных животных (овец, крупного рогатого скота) и используемых в биотехнологии и вирусологии, на присутствие прионов, а также создание клеточных линий, чувствительных к агенту скрепи, в качестве биопробы, наряду с лабораторными животными, и изучения различных аспектов взаимодействия прионов с клеткой.

Цель: получить поликлональные антитела к синтетическим пептидам прионного белка и проверить их специфичность к клеточной и инфекционной изоформам прионного протеина.

- провести иммунизацию лабораторных животных (кроликов, мышей) синтетическим пептидом прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду) и получить сыворотку, содержащую поликлональные антитела к пептиду прионного белка, способную специфически связываться с прионным белком,;

- получить гибридные культуры, продуцирующие моноклональные антитела к синтетическому пептиду прионного белка, отвечающие за специфическое связывание с прионным белком;

- изучить активность поли- и моноклональных антител к прионам в различных реакциях.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ

Задачи:

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Исследования проведены с использованием синтетического пептида прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 по бычьему пептиду; на лабораторных животных — мышах и кроликах. В работе использовались мутантные культуры клеток, хранящиеся в Криобанке ВИЭВ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА Получены поликлональные антитела на синтетический пептид прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду).

Определена способность иммунной поликлональной кроличьей сыворотки выявлять инфекционный прион в гистосрезах головного мозга животных, больных ТГЭ и культурах клеток, инфицированных агентом скрепи.

Впервые получены межвидовая гибридная культура спленоциты овцы х лимфоциты кролика (ПО ТК" х ЛК) и мышиная гибридома, продуцирующие моноклональные антитела к пептиду прионного белка. Культура ПО ТК-х ЛК чувствительна к вирусам инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Специфические кроличьи антитела к прионовому пептиду способны выявлять прионы в культурах клеток и гистосрезах головного мозга.

Получена гибридная культура почка овцы х лимфоциты кролика, чувствительная к вирусам ИРТ и ВД-БС КРС (заявка на патент принята Г-59, ГСП-5 18.08.2005г., № 2005126087).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Получение поликлональных иммунных кроличьих сывороток к пептиду прионного белка.

2. Иммуноцитохимический и иммуногистохимический методы выявления инфекционного приона в культурах клеток, инфицированных агентом скрепи и гистосрезах головного мозга животных, больных ТГЭ с применением иммунной поликлональной кроличьей сыворотки.

3. Получение, культурально-морфологическая и кариологическая характеристика гибридной культуры почки овцы и лимфоцитов иммунного кролика. Изучение ее чувствительности к вирусам инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, вирусной диареи — болезни слизистых, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной инфекции и их цитопатогенного действия.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференция "IEKBM - 80 лет на передовом рубеже ветеринарной науки". Харьков, 2002; Международной научной конференции «Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», Подольск, 2002; Научной конференции, посвященной 300- летию основания Санкт - Петербурга "Биологическая, медицинская и ветеринарно- медицинская наука и новейшие технологии на благо человека и человечества." Санкт-Петербург, 2003 г.; Международной научной конференции «Развитие ключевых направлений с/х науки в Казахстане: селекция, биотехнология, генетические ресурсы» г. Астана, 2004 г; на 45-ом Международном конгрессе Европейского общества тканевых культур (ETCS), г. Мюнстер 2004 г; международной научной конференции «Сохранение генетических ресурсов» г. Санкт-Петербург, 2004 г.; Международной научной конференции «Ветеринарная медицина» г. Ялта, 2005 г; на межлабораторном совещании ВИЭВ, 2005 г.

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ По теме диссертации опубликовано 8 работ.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Савенко, Наталья Борисовна

4. Выводы.

1. Разработана эффективная схема иммунизации кроликов синтетическими пептидами прионного белка с аминокислотной последовательностью 106-134 (по бычьему пептиду) -THGQWNKPSKPKTMNKHVAGAAAAGAWG и получены специфичные псшиклональные иммунные сыворотки в титре антител -lg 2,6-4,1.

2. Использованные схемы иммунизации мышей свободным синтетическим пептидом и его KLH-конъюгатом не вызывают иммунного ответа в титрах, достаточных для подтверждения положительной реакции.

3. Гибридома на основе мышиных спленоцитов способна вызывать . образование асцита, в котором обнаружены противопептидные антитела в титре -lg 2,1.

4. Специфичность полученных поликлональных сывороток крови кроликов подтверждена в экспериментах по иммунохимическому выявлению прионного белка в инфицированных агентом скрепи гибридных культурах клеток ПО ТК" х ЛО, ПО ТК" х СО, гистосрезах головного мозга BSE positive и Scrapie positive.

5. Интенсивное иммуноцитохимическое окрашивание после' автоклавирования мазков крови лимфоцитов овцы с нервными расстройствами при использовании поликлональных антител указывает ^на возможность присутствия инфекционного приона в клетках крови в терминальный период заболевания.

6. Способ предварительной фиксации мазков крови (формалин, ацетон, метанол) не оказывает влияния на чувствительность иммуноцитохимического метода.

7. Получена межвидовая гибридная культура клеток почка овцы х лимфоциты иммунного кролика (ПО-ЛК-3), в культуральной жидкости которой методом ИФА выявлена продукция противопептидных антител в титре -lg 1,9.

8. Межвидовая гибридная культура ПО-ЛК-3 чувствительна к вирусам ИРТ КРС и ВД-БС КРС.

5. Практические предложения.

Кроличьи поликлональные антитела к синтетическому пептиду прионного белка рекомендуются к использованию для создания i диагностикумов и детекции инфекционного и клеточного прионов в белковых препаратах, биологических жидкостях (сыворотка и плазма крови). . Гибридная культура ПО ТК' х J1K рекомендуется для культивирования вирусов ИРТ КРС и ВД-БС КРС, для создания вакцин и диагностикумов (заявка на патент принята Г-59, ГСП-5 18.08.2005г., №2005126087).

100

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Савенко, Наталья Борисовна, 2005 год

1. Алексанян Ю.Т., Давтян Т.К. О проблеме получения человеческих моноклональных антител // «Иммунология», 1991., №3, с.10-13.

2. Баев А.А Биотехнология. М: Наука,1984, 318с.

3. Байтубаев Н.Г. Получение моноклональных антител для диагностики гриппа лошадей. Автореф. канд. дисс. М., 1992.

4. Белкина Н.М. Сравнительное изучение морфологических изменений в культуре клеток под действием вирусов группы герпеса // Бюлл. ВИЭВ, в. 14., 1972, с.25-28.

5. Верховский О.А. Иммуноферментный метод тестирования гибридом, проуцирующих моноклнальные антитела к IgM свиньи // Тезис, докл., Бюлл. ВИЭВ., вып. №69, М., 1989, с.3-6.

6. Верховский О.А. Моноклональные антитела в ветеринарии // Труды ВИЭВ "Иммунитет с/х животных", вып. № 67, с. 11-22 , М.1989.

7. Верховский О.А. Поли- и моноклональные антитела в анализе гуморального иммунного ответа, структуры и функциональных свойств иммуноглобулинов животных Дисс. докт. биолог, наук., М., 1998.

8. Глебов O.K., Абрамян Д.С. Природа фенотипической изменчивости соматических клеток в культуре: нестабильные фенотипические изменения // «Цитология», 1984, т.24., стр.236-251.

9. Дагданова А.В. Биологические свойства клеточного (РгРс) и инфекционного (PrPSc) прионного протеина in vitro и его иммуноцитохимическая детекция в культурах клеток Дисс. докт. биол.наук.,М.2002.

10. Н.Дагданова А.В. Прионы и их цитопатогенное действие. В кн.: "Животная клетка в культуре", под редакцией Л.П.Дьяконова, В.И.Ситькова. М."Спутник", 2000, 315-332.

11. Дагданова А.В. Роль клеток лимфоцитарно-макрофагального пула в патогенезе прионовых инфекций // Вестник РАСХН, 2001,8 , 67-70.

12. Дагданова А.В., Дьяконов Л.П. Клеточные системы in vitro в изучении прионов // «С/х биология», 2000,6, 3-10.

13. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Блюмкин В.Н., Илинецкий В.В. Культуры клеток щитовидной железы-продуценты тиреоидных гормонов // «Цитология», 1992т.34.№9, стр.60.

14. Дьяконов Л.П. Гибридные и генетически трансформированные культуры клеток в биотехнологии и ветеринарной медицине // «С/х биология», 4, 1994, стр. 26-31.

15. Дьяконов Л.П. Основные достижения и перспективы развития клеточной биотехнологии // Труды ВИЭВ, 1998, т.71, с.149-161.

16. Дьяконов Л.П., Белоусова Р.В., Лобунцова Д.В. и др. Штамм клеток почки теленка, используемый в качестве продуцента активатора плазминогена. //

17. Авт. Свидетельство №1212043.,1985.

18. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Симонова А.С., Сафина А.Н., Савенко Н.Б. Гибридные культуры клеток животных в вирусологии и биотехнологии // Труды международной научной конференции «Ветеринарная медицина» г. Ялта, 2004 г., стр. 48-51.

19. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Щекалева И.В., Антипова Т.А., Ярных Е.В. Внутривидовая гибридная культура клеток СПЭВ ТК" х лимфоциты свиньи // «С.х. биология», 1996, №2, с. 25-30.

20. Дьяконов Л.П., Гальнбек Т.В., Щекалева И.В., Антипова Т.А., Ярных Е.В. Внутривидовая гибридная культура клеток СПЭВ ТК"х лимфоциты свиньи (А4хС) как модельная система для культивирования герпесвирусов лошадей // «С.х. биология», 1996, № 2, с. 25-30.

21. Дьяконов Л.П., Кущ А.К., Тугизов Ш.М., Майджи Е.В. Методические рекомендации по гибридизации соматических клеток сельскохозяйственных животных М., 1988 г.

22. Дьяконов Л.П., Миронова Л.Л., Конюшко О.И. Методические указания по контролю перевиваемых культур клеток из органов и тканей овец на отсутствие агента скрепи, М., 1996 г.

23. Дьяконов Л.П., Миронова Л.Л., Конюшко О.И. Методические указания по контролю перевиваемых культур клеток из органов и тканей овец на отсутствие агента скрепи, М., 1996.

24. Дьяконов Л.П., Ситьков В.И. "Животная клетка в культуре" М., 2000, 400 с.

25. Ездакова Н.Ю. Получение и характеристика моноклональных антител к иммуноглобулину класса М рогатого скота Дисс. канд. биол. наук., М., 1994.

26. Кетти Д. Антитела. Методы. // М., Мир, 1991,287с.

27. Конюшко О.И., Миронова Л.Л., Дьяконов Л.П. Метод контроля клеточных субстратов на присутствие агента скрепи, Бюлл. ВИЭВ, М., № 77, 1996, стр. 31-33.

28. Копровский X., Виктор Т. Моноклональные антитела к вирусу бешенства. В кн.: Моноклональные антитела. М., Мир, 1983, стр. 341-357.

29. Короев Д.О., Котельникова О.В., Вольпина О.М. и др. Индукция противоменингитного иммунитета с помощью синтетических пептидов // «Биоорганическая химия», 2000, том 26, № 5, с. 323-329.

30. Коромыслов Г.Ф., Караваев Ю.Д., Шуляк А.Ф. Медленные инфекции овец. Распространение, этиология, клиническое проявление и патоморфологические изменения // Труды ВИЭВ, том.64, М., 1987, с.4-13.

31. Куликова И.Л., Гальнбек Т.В., Дьяконов Л.П., Симонова А.С. Цитоморфологическая характеристика новых мутантных культур клеток почки овцы и внутривидовых гибридных культур с лимфоцитами и спленоцитами // доклады РАСХН, №5, 2001, с. 39-41.

32. Куликова И.Л., Гальнбек Т.В., Дьяконов Л.П., Симонова А.С., Шуляк А.Ф., Ярных Е.В. Мутантная линия клеток почки овцы Ovis aries L, дефектная по тимидинкиназе ПО-ЮО-ТК, для гибридизации клеток животных in vitro -Патент № 2184776, 2002.

33. Ларина Г.Н. Сравнительная эффективность методов трансформации клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ, СПЭВ ТК") генами ИС-а2 интерферона человека, pSV2neo, pAGO ТК Авт. канд. диссертации. М.,1992 г.

34. Майджи Е.В. Гибриды соматических клеток сельскохозяйственных животных и их чувствительность к некоторым вирусам Дисс. канд. биолог, наук, М., 1987.

35. Майджи Е.В. Гибриды соматических клеток сельскохозяйственных животных и их чувствительность к некоторым вирусам Дисс. канд. биолог, наук, М., 1987.

36. Майджи Е.В., Тугизов Ш.М., Дьяконов Л.П. Количественный хромосомный анализ сублиний гибридных клеток некоторых сельскохозяйственных животных в связи с чувствительностью к различным вирусам // «С.х. биология», № 6, 1990, с.52-57.

37. Майджи Е.В., Ш.М. Тугизов, Л.П. Дьяконов и др. Оптимизация условий гибридизации мутантных клеток свиньи и лимфоцитов лошади // «С.х. биология», 1990, №2, с. 182-187.

38. Макаров В.В. Вирусная диарея крупного рогатого скота. В сб. Карантинные и малоизвестные болезни животных М. Колос, 1983. С.85-90.

39. Малоголовская С.А., Васильев Д.А., Макаров В.В. Моноклональные антитела // (Учебное пособие), Ульяновск, 1998 г., 30с.

40. Маршак М.И., Варшавер Н.Б. Спонтанный темп возникновения мутаций резистентности к 8-азагуанину в диплоидных и анеуплоидных клетках человека // «Генетика», 1970 г., т.7, с.130-138.

41. Методические рекомендации по диагностике медленных инфекций овец Шишков В.П., Шубин В.А., Суворов B.C., Кувшинов В.Л., Бобоженов М.М., Кунаков А.А., Архипов Н.И., Брагин Г.И., М., 1988.

42. Методические рекомендации по получению генетически трансформированных геном прионного протеина (Prnp-ген) моноцитов мыши // Изданы РАСХН, май 2002,16 стр.

43. Методические рекомендации по получению мутантных штаммов перевиваемых линий клеток с/х животных, пригодных для гибридизации М., 1984, 16 с. (Авторы: Л.П. Дьяконов, А.А. Кущ, Ш.М. Тугизов).

44. Монкс О., Костелло А., Вивере Э., Авилов В.М., Рыбаков С.С. Контроль губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в Ирландии //«Ветеринария», 1998, 1,стр. 16-22.

45. Моноклональные антитела. Гибридомы: новый уровень биологического анализа. (Ред. Р.Г. Кеннет, Т.Дж. Мак-Керн, К.Б. Бехтол), М., Медицина, 1983, с. 416.

46. Мусиенко М.И. Культуры клеток трансгенных животных и тестирование физиологически активных веществ (соматотопин, интерферон) иммуноферментным методом Дисс. канд. биол. наук. М., 1992.

47. Мусиенко М.М., Макаревич А.В., Эрнст JT.K. и др. Культура клеток из ткани трансгенного кролика продуцент гормона роста крупного рогатого скота. - Докл. ВАСХНИЛ, 1991, №1 стр.28-32.

48. Пинаев Г.П. Методы культивирования клеток // Сборник научных трудов. Л., Наука, 1988, 319 с.

49. Решетников Г.Г. Создание синтетических антигенов для лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота и классической чумы свиней. Дисс. канд. биол. наук, Владимир, 2005.

50. Рингерц Н., Р. Сэвидж. Гибридные клетки. М., Мир, 1979, 416 с.

51. Ройхель В.М. Патогенез и диагностика некоторых медленных прионовых инфекций. Дисс., доктора медиц. наук, М., 1997.

52. Суворов B.C. Патоморфологические изменения, вопросы патогенеза и диагностика скрепи овец. Диссертация кандидата ветеринарных наук, М., 1987.

53. Третьякова И.А. Чувствительность культур клеток к парвовирусу крупного рогатого скота // Бюлл. ВИЭВ., вып. 68, М., 1988, с.43-44.

54. Трофимова М.Н., Новиков В.В., О.М.Сандова и др. Наработка моноклональных антител в асцитной форме и методы их очистки // «Биотехнология», 1987, 3, 6, с.735-737.

55. Тугизов Ш.М. Мутантные и гибридные клетки крупного рогатого скота и свиньи для вирусологических исследований. Дисс.канд. биол.наук. М., 1985.

56. Тугизов Ш.М. Мутантные и гибридные клетки крупного рогатого скота и свиньи для вирусологических исследований. Дисс. канд. биол. наук. М., 1985.

57. Тугизов Ш.М. Структурно-функциональный анализ мембранных белков вирусов в генетически трансформированных клетках. Автореф. дисс. докт. биол. наук, М., 1996.

58. Федоров Ю.Н., Верховский О.А. Достижения и перспективы развития ветеринарной иммунологии II Труды ВИЭВ., 1998, т.71., с. 114-124.

59. Феоктистова Т.А., Федоров Ю.Н., Ездакова И.Ю. Количественный метод определения IgM рогатого скота в биологических жидкостях с использованием моноклональных антител // Бюлл. ВИЭВ, вып.68, с.3-5., М., 1988.

60. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). Методы культивирования клеток: Сб. научн. тр. Л.: Наука, 1988, с. 194-205.

61. Чевелев С.Ф., Пичугин Л.М., Архипов Н.И. Цитологические изменения в культуре клеток почки телят, зараженных вирусом инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота // Вопросы ветер, вирусол., микробиологии, эпизотологии. Покров, 1973, с.40.

62. Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н., Игнатенко С.Н. и др. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы, М., "Канон", 1995, стр. 381.

63. Barry R.A. & Prusiner S.B. Monoclonal antibodies to the cellular and scrapie prion proteins. - J. Inf. Dis., 1986, 3, 518-521.

64. Beekes M., Baldauf E., Cassens S, Diringer H., Keyes P., Scott A.C., Wells

65. Behrens A., Genoid N., Naumann H., Rulicke Т., Janett F., Heppner F.L., Ledermann В., Aguzzi A. Absence of the prion protein homologue Doppel causes male sterility. - EMBO, vol. 25, no 14, pp. 3652-3658, 2002.

66. Bolton D.C., McKinley M.P., Prusiner S.B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. - Science, 1982; 218; 1309-1311.

67. Borchelt D.R., Koliatsos V., Guarneri M. et al. Rapid anterograde axonal transport of the cellular prion glicoprotein in the peripheral and CNS. - J. Biol. Chem., 1994, 269, 14711-14714.

68. Brandler S., Isenmann S., Raeber A. et al. Normal host prion protein necessary for scrapie-induced neurotoxicity. - Nature, 1996, 379, 339-343.

69. Broun D.R., Schmidt B. and Kretzschmar H.A. Prion protein fragment Interacts with PrP-Deficient Cells. - J. Neuroscience research, 1998, 52; 260-267.

70. Broun D.R., Schmidt B. and Kretzschmar H.A. A neurotoxic prion protein fragment enchanges proliferation of microglia but not astrocytes in culture. - Glia 18, 1996-b, 59-67.

71. Broun D.R., Schmidt В., Groseschup M.H., Kretzschmar H.A. Replication of scrapie in spleens of SCID mice follows reconstitution with wild-tipe mouse bone marrow. - Europan J Cell Biol., jan. 1998, 75, p. 29-37.

72. Brown D.R. PrPSc-like prion protein peptide inhibits the function of cellular prion protein. - Biochem., 2000, 352, 511-518.

73. Brown D.R., Herms J. and Kretzschmar H.A.- Mouse cortical cells lacking cellular PrP survive in culture with a neurotoxic PrP fragment. Neuroreport, 1994, 5, 2057-2060.

74. Butler D.A., Scott M.R.D., Bockman J.M. et al. Scrapie infected murine neuroblastoma cells produce protease-resistent prion protein. - J. Of Virology, 1988, 62, 1558-1564.

75. Call К., Thilly W. 5-azacytidine inhibits the induction of transient TK-deficient cells by 5-bromodeoxyuridine. - Mutat. Res., 1991, Vol.248., p. 101-114.

76. DeArmond S.J., Mobley W.C., DeMott D.L. et al. Changes in the localization of brain prion protein during scrapie infection. - Neurology, 1987, 37, 1271-1280.

77. Earley E.M., Osterling M.C. Fusion of mouse-mouse cells to produce hibridomas secreting monoclonal antibody. - J. Tussue Cult. Meth.,1985, v.9., n3., p.141-146.

78. ECACC Cell Line Catalogue, 5-Edition, Salisbury, UK, 1997.

79. Europan Comission. The evaluation of tests for the diagnosis of transmissible spongiform encephalopathy in bovines. 8 july 1999, p. 4325-4328.

80. Forloni G., Angeretti N., Chiesa R. et al. Neurotoxicity of prion protein fragment. - Nature, 1993, 362, 543-546.

81. Forloni G., Del Bo K., Angeretti N. et al. A neurotoxic prion protein fragment induces rat astroglial proliferation and hypertrophy. - Eur. J. Neurosci., 1994, 6, 1415-1422.

82. Gajdusek D.C. Unconventional viruses and the origin and disappearance of kuru. - Science, 1977, 197, 943-960.

83. Giese A., Groschup M.H., Hess B. and Kretzschmar H.A. Neuronal cell death in scrapie-infected mice is due to apoptosis. - Brain Pathol., 1995, 5, 213221.

84. Goldmann W., Hunter N., Martin Т., Dawson M., Hope J. PrP-dependent association of prions with splenic but not circulating lymphocytes of scrapie-infected mice. - J. Gen. Virol. 1991. v. 72, p. 201-204.

85. Granthwohl-KUD, Horiuchi-M., Ishiguro-N., Shinigawa-M. Sensitiveenzyme-linked immunosorbent assay for detection of PrPSc in crude tissue extracts from scrapie-infected mice. Journal-of-Virological-Methods.- 1997,V.64, №2, P.205-216.

86. Harmeyer S., Pfaff E., Groschup M.N. Scrapie pathogenesis in subclinically infegted B-cell-deficient mice. - J. Gen. Virol. 1998. v. 79, p. 937-945.

87. Harris D.A. Cellular biology of prion diseases. - Clinical Microbiol. Rev., 1999, 12, 427-444.

88. Hill A.F., Zeidler M., Ironside J., Collinge J. Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. - Lancet, 1997; 349; 99-100.

89. Hope J., Shearman M.S., Baxter H.C. et al. Cytotoxicity of prion protein peptide (PrP106-126) differs in mechanism from the cytotoxic activity of the Alzheimer's disease amyloid peptide A25-55. - Neurodegeneration, 1996, 5, 1- 11.

90. Huang Z., Prusiner S.B. and Cohen F.E.- Structures of prion proteins and conformational models for prion diseases. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1996, 207, 49-67.

91. J.-Y. Madec, S. Simon, S. Lezmi, A. Bencsik, J. Grassi and T. Baron. -Abnormal prion protein in genetically resistant sheep from a scrapie-infected flock. -J Gen Virol 85 (2004), 3483-3486.

92. Kascsak R.J., Rubinstein R., Merz P.A., Tonna-DeMasi M., Fersko R., Carp R.I., Diringer H. Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scrapie-associated fibril proteins. - J Virology, dec. 1987, p. 3688-3693.

93. Katz J.B., Pedersen J.C., Jenny A.L., Taylor W. Assessment of western immunoblotting for the confirmatory diagnosis of ovine scrapie and bovine spongiform encephalopathy (BSE). - J. Vet. Diagn. Invest. 1992, V.4, №4, p.447

94. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody predefined specificity. - Nature, 1975, 256,55, 17, 495-497.

95. Korth C., Streit P., Oesch B. Methods in Enzymology, vol. 309, 1999, p. 110.

96. Krasemann S., Groschup M.H., Harmeyer S. et al.- Generation of monoclonal antibodies against human prion protein in PrP0/0 mice. Mol. Med., 1996, 6, 725-734.

97. Kretzschmar H.A., Prusiner S.B., Stowring L.E. and DeArmond S.J. -Scrapie prion protein are synthesized in neurons. Am. J. Pathol., 1986, 122, 1-5.

98. Ktibler E., Oech В., Raeber A.J. Diagnosis of prion protein. - British Medical Bulleten, 2003, 66; pp. 267-279.

99. Kubosaki A., Yusa S., Nasu Y. et al. Distribution of cellular isoform of prion protein in T-lymphocytes and bone marrow, analyzed by wild-type and prion protein gene - deficient mice. - Biochem. Biophis. Res. Commun. 2001, mar. 23; 282(1); p. 103-107.

100. Lane H.C. Human monoclonal antikeyhole limpet hemocyanin antibody - secreting hybridomas produced from peripheral blood В lymphocytes of a keyhole limpet hemocyanin immune individual. - J. Exp. Med. 1982. 133. 155.

101. Littlefield J.W. Selection of hybrids from mating of fibroblasts in vitro and their presumed recombinants. - Science, 1964, Vol. 41, p. 190-196.

102. Littlefield J.W. The use of drug resistant markers to study the hybridization of mouse fibroblasts. - Exp. cell res., 1966, Vol. 41, p. 88-95.

103. Llewelyn С.A., Hewitt P.E., Knight R.S., Amar K., Cousens S., Mackenzie J., Will R.G. vCJD may be the first case of human prion disease transmitted by blood diffusion. - Lancet 363, pp. 417-421, 2004.

104. Loo D.T., Copani A., Pike C.J. et al. Apoptosis is induced by B-amyloid in cultured central nervous system neurons. - Proc. Natl. Acad. U.S.A., 1993,90, 7951-7955.

105. Lopez G.F., Zahn R., Riek R., Wuthrich K. Prion protein expression in human leukocyte differentiation. - PNAS. 2000, v. 97, p. 8334-8339.

106. Mackenzie A. Immunohistochemical demonstration of glial fibrillary acid protein in scrapie. - J. Сотр. Pathol., 1983, 93, 251-259.

107. Matsushita K., Horiuchi H., Furusawa S., Horiuchi M., Shinagawa M., Matsuda H. Prions prevent neuronal precursor cell-line death. - J. Vet. Med. Csi. 1998, v. 60, p. 777-779.

108. Matsuya Y., Yamane I. Cell hybridization and cell agglutination. I. Enhancement of cell hybridization by lectins. - J. Cell Sci. 1985. V.78. p. 236-271.

109. Merz P.A., Sommerville R.A., Wisniewski H.M., Igbal K. — Abnormal fibris from scrapie-infected brain.- ActaNeuropathol., 1981., v.54., p.63-74.

110. Moser M., Colello R.J., Pott U., Oesch В.- Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron, 1995, 14, 509-517.

111. Mueller W., Ushijima H., Schroder H. et al. Cytoprotective effect of NMDA receptor antagonists on prion protein (PrPSo)-induced toxicity in rat cortical cell cultures. - Eur. J. Pharmacol, 1993, 246, 261-267.

112. Nabholz M.et al. Hybridoma technology special reference to parasitic disease. - UNDP, World Banc. WHO, 1979.

113. Neari К., Caughey В., Ernst D. Protease Sensitivity and Nuclease Resistance of the Scrapie Agent Propagated in vitro in Neuroblastoma cells. -J.Virologi. 1991, vol.65, N2, p. 1031-1034.

114. Nguyen J., Baldwin M.A., Cohen F.E., Prusiner S.B. Prion protein peptides induce alpha-helix to beta sheet conformation transitions. - Biochemistry, 1995. v. 34, p. 4186-4192.

115. O'Rourke K.I., Baszler T.V., Miller J.M. et al. Monoclonal antibody F89/160.1.5 defines a conserved epitope on the ruminant prion protein. - J. Clin. Microbiol., 1998a, 36, 1750-1755.

116. O'Rourke K.I., Baszler T.V., Parish S.M. and Knowles D.P. -Preclinical detection of PrPSc in nictitating membrane lymphoid tissue of sheep. -Vet. Rec., 1998b, 142, 486-491.

117. Oesch В., Westaway D., Walchli M. et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. - Cell, 1985, 40, 735-746.

118. Okada Y., Murayama F. Fusion of cells by HVJ: Requirement of concentration of virus particles at the site of contact of two cells for fusion. - Exp, cell res., 1968, Vol. 52. p. 34-42.

119. Pan K.-M., Baldwin M., Nguyen J. et al. Conversion of a-helices into |3-sheets features in the formation of the scrapie prion protein. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 10962-10966.

120. Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases. - Science, 1991, 252, 1515-1522.

121. Prusiner S.B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. -Science, 1982,216, 136-144.

122. Prusiner S.B.- Genetic and infectious prion diseases. Arch. Neurol., 1993, 50, 1129-1153.

123. Prusiner S.B. Prion disease and BSE crisis. Science. 1977, v. 278, p. 245-251.

124. Prusiner S.B., Groth D., Bolton D.C., Kent S.B., Hood L.E. Purification and structural studies of major screpie prion protein. - Cell. - 1994., v.38., p. 127-134.

125. Prusiner S.B., Groth D., Serban A. et al. Ablation of the prion protein gene in mice prevents scrapie and facilitates of anti-PrP antibodies. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90,10608-10612.

126. Prusiner-S.B. Prions. - Encyclopedia of molecular biology and molecular medicine, Volume-5: Plasmids to synthetic peptide and nonpeptide combinatorial libraries. 1996, p. 57-73.

127. Race R.E., Fadness L.H., Chesebro B, Characterisation of screpie infection in mouse neuroblastoma cells. - J.gen. Virology, 1987, 68, 1391-1399.

128. Reicl H., Balen A., Jansen C.A.M. Prion transmission in blood and urine: what are the implications for recombinant and urinary-derived gonadotropins? - Human Reproduction, vol. 17, no. 10, pp. 2501-2508, 2002.

129. Rubenstein R., Deng H., Scalici C.L. et al. Alterations in neurotransmitter-related enzyme activity in scrapie-infected PC 12 cells. - J. Gen. Virol., 1991,72, 1279-1285.

130. Rubenstein R., Kascsak R., Merz P. et al.- Detection of scrapie-associated fibrils proteins using anti-SAF antibody in non-purified tissue preparations. J. Cen. Virol., 1986, 67, 671-681.

131. Sauer H., Dagdanova A., Hescheler J. and Wartenberg M. Redox-regulation of intrinsic prion expression in multicellular prostate tumor spheroids. -Free Radical Biology & Medicine, 1999, 27, 1276-1283.

132. Schaetzl H.M., Laszlo L., Holtzmann D.M. et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. - J. Virology, 1997, 71, 8821-8831.

133. Schmerr M.J., Cutlip, Jenny A.L. Capillary isoelectric focusing of the scrapie prion protein. - J. Chromatography A, 802 (1998), p. 135-141.

134. Schreuder B.E., Keulen L.J., Vromans M.E. et al.- Preclinical test for prion diseases. Nature, 1996, 381, 563.

135. Schultz H.M., Laszlo L., Holtzmann D.M., Tatzelt J., de Armond S.J. el al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with Scrapie prions exhibits apoptosis. - J. of Virology, 1997, 71, 8821-8831.

136. Schulz-Schaeffer W.J., Tschoeke S., Kranefuss N. et al.- The paraffin-embedded tissue blot detects PrPSc early in the incubation time in prion diseases. -Am. J. Pathol., 2000,156, 51-56.

137. Scott M.R., Butler D.A. — Prion protein gene expression in cultured cells Bibliogr. P.76 vol. 2 1988 № 2.

138. Serban A., Legname G., Hansen K., Kovaleva N., Prusiner S.B. -Immunoglobulins in urine of hamsters with Scrapie. J. Biol. Chem., vol. 279, no. 47, nov 19, pp. 48817-48820, 2004.

139. Shaked M. Gedeon, Shaked Yuval, Zehavit Kariv-Inbol, Mishele Halimi, and Ruth Yabizon. A Protease-resistent Prion protein isoform present inurine of Animals and Humans affected with Prion Diseases J. Biol. Chem., vol. 276, №34, pp. 31479-31482, 2001.

140. Shaked Y., Rosnmann H., Talmor G., Gabizon R. A. C-terminal PrP isoform is present in mature sperm. — J. Biol. Chem., vol. 274, 45, 32153-32158, November 5, 1999.

141. Sigurdson C.J., Williams E.S., Miller M.W., Spraker T.R., O'Rourke K.I., Hoover E.A. Oral transmission and early lymphoid tropism of chronic wasting disease PrPRES in mule deer fawns (Odocoileus hemionus). - J Gen Virol, 1999; 80; 2757-64.

142. Smith С J., Drace A.F., Banfield B.A., Bloomberg G.B., Palmer M.S., Clarke A.R., Collinge J. PrP-expressing tissue required for transfer of scrapie infectivity from spleen to brain. - FEBS Lett. 1997, v. 405, p. 378-384.

143. Somerville R.A., Birkett C.R., Farquhar C.P., Hunter N. -Immunodetection of PrPSc in spleens of some scrapie-infected sheep but not BSE-infected cows. J. Gen. Virol., 1997, V.78, № 9, p. 2389-2396.

144. Taraboulos A., Raeber A.J., Borchelt D.R. et al. Synthesis and trafficking of prion proteins in cultured cells.- Mol. Biol. Cell., 1992, 3, 851-863.

145. Taraboulos A., Scott M., Semenov A. et al.- Cholesterol depletion and modification of COO-terminal targeting sequence of the prion protein inhibit formation of the scrapie isoform. J. Cell. Biol., 1995, 129, 121-125.

146. Thackray A.M., Klein M.A., Aguzzi A., Bujdoso R. Ghronic subclinical prion disease induced by low-dose inoculum. - J. Virol., p. 2510-2517, vol. 76, no 5, march 2002.

147. Vorberg I., Groschup M.H., Pfaff E., Priola S.A. Multiple amino residues within the rabbit prion protein inhibit formation of its abnormal isoform. - J Vorol., pp. 2003-2009, vol. 77, no. 3, feb. 2003.

148. Yokoyama Т.- The immuno detection of theabnormal isoform of prion protein. Histochem J., 1999, V.31, P.209-212.

149. Yokoyama Т., Itohara S., Yuasa N. Detection of species specific of mouse and hamster prion protein (PrPs) by anti-peptide antibodies. Arch. Virology (1996) 141:763-769.

150. Yokoyama Т., Kimura K., Tagawa Y., Yuasa N. Preparation and characterisation of antibodies against mouse prion protein (PrP) peptides. - Clin. Diagn. Lab. Immun., mar., 1995, p. 172-176.

151. Yokoyama Т., Momotani E., Kimura K, Yuasa N.- Immunoreactivity of specific epitopes of PrPSc is enhanced by pretreatment in a hydrated autoclave. -Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1996, V.3, №4, P.470-471.