Получение и сравнительный анализ свойств гиалуронидаз из различных источников тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Заинкова, Наталья Вячеславовна

• Заинкова, Наталья Вячеславовна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Заинкова, Наталья Вячеславовна

Содержание

Введение

Обзор литературы

1.1. Источники получения ферментных препаратов

1.1.1. Растительное сырье

1.1.2. Органы и ткани животных и рыб

1.1.?. Микроорганизмы

1.2 Гиалуронидазы. Сравнительный анализ биологических

и физико-химических свойств гналуронидаз из различных

источников. Методы выделения и очистки гналуронидаз

1.2.1. Бактериальные гиалуронидазы

1.2.2. Гиалуронидазы из слюны пиявок и гельминта ые гиалуронидазы

1.2.3. Тестикулярные гиалуронидазы

1.2.4. Выделение и очистка гналуронидаз

13. Общие принципы и особенности выделения и очистки

ферментов из экстрактов и культуральных жидкостей

1.3.1. Хроматографические методы, применяемые на стадии концентрирования

1.3.2. Хроматографические методы, применяемые на стадии тонкой

очистки

2. Экспериментальная часть

2.1. Объекты исследования

2.1.1. Источники получения гиалуронидазы

2.1.2. Физико-химические характеристики сорбентов

2.2. Методы исследования

2.2.1. Твердофазное культивирование бактерий Рз.рийёа (36)

2.2.2 .Глубинное культивирование бактерии Рв.рийёа (36)

2.2.3. Определение бактериальных эндотоксинов по ЛАЛ-тесту

2.2.4. Определение концентрации белка по методу Лоури

2.2.5. Метод определения углеводов

2.2.6. Определение гиалуронидазной активности

2.2.7. Г ельхроматографический анализ

23. Использование сорбентов в работе

2.3.1. Кислотно-щелочная обработка сорбентов

2.3.2. Исследование сорбции белков в статических условиях (pH -зависимость

и изотермические процессы сорбции)

2.3.3. Исследование кинетики сорбции белков

2.3.4. Проведение процесса сорбции и десорбции в динамических условиях

2.4. Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.5. Капиллярный электорофорез

2.6. Гельэлектрофорез

2.7. Математические методы обработки результатов

3. Результаты и их обсуждение

Э.1. Разработка сорбционного метода выделения гиалуронидазы из

экстракта молок рыб и нативного раствора Pseudomonas putida (36)

3. LI. Изучение процесса экстракции гиалуронидазы из молок рыб

3.1.2. Гелъхромато графический анализ компонентного состава

экстракта молок осетровых рыб

1.3 3. Подбор штамма - продуцента гиалуронидазы и условий его

культивирования

3.1.4. Гельхроматографический анализ компонентного состава нативного

раствора Pseudomonas putida (36) на различных часах ферментации

3.1.5. Исследование равновесных и кинетических параметров сорбции гиалуронидазы из нативного раствора Pseudomonas putida (36) и экстракта молок рыб

3.1.6. Изучение сорбции гиалуронидазы из экстракта молок рыб в

динамических условиях на сульфакатионите КУ-23

3.1.7. Изучение процесса сорбции гиалуронидазы из нативного раствора

Pseudomonas putida (36)

3.2. Сравнительный анализ физико-химических и биологических свойств гиалуронидазы из бактерий Pseudomonas putida (36) и молок осетровых рыб

3.2.1. Изучение pH-оптимума действия и влияния pH на стабильность гиалуронидазы в растворе

3.2.2. Изучение температурного оптимума действия и влияния температуры

на стабильность гиалуронидазы в растворе

3.2.3. Определение кинетических параметров реакции гидролиза гиалуроновой кислоты гиалуронидазой

3.2.4. Изучение кинетических параметров реакции гидролиза гиалуроновой кислоты гиалуронидазой из Pseudomonas putida (36) в присутствии ингибитора

3.3. Изучение гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб современными аналитическими методами

Заключение

Выводы

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и сравнительный анализ свойств гиалуронидаз из различных источников»

ВВЕДЕНИЕ

В связи с расширением сферы применения ферментов в различных областях, таких как пищевая промышленность, сельское хозяйство, медицина, актуальной является проблема поиска новых дешевых источников сырья для их получения, особенно таких, которые являются отходами производств. Благодаря использованию новых современных методов, в том числе сорбционно хроматографических, в настоящее время стало возможным получение высокоочшценных биологически-активных веществ, в частности ферментов, с высокой удельной активностью, а применение современных аналитических методов исследования, таких как ВЭЖХ, капиллярный и гелъэлектрофорез позволило дать обоснованную оценку структуры и качества выделенных веществ.

На протяжении последних лет в СПХФА на кафедре биотехнологии проводятся исследования фермента гиалуронидазы. Выбор фермента гиалуронидазы в качестве объекта исследования основан на том, что в настоящее время этот фермент широко используется в медицине, косметологии, сельском хозяйстве — на станциях искусственного оплодотворения. Гиалуронидаза уменьшает вязкость межклеточного вещества, способствует увеличению проницаемости тканей и облегчает движение в межклеточных пространствах.

Как известно из литературных данных, гиалуронидазы различного происхождения выполняют разные биологические функции и могут отличатся друг от друга по своему строению и свойствам, поэтому изучение этого фермента, полученного из разных источников, представляет большой интерес, так как дает возможность проследить эволюционные изменения фермента. Кроме того, получение этого фермента в чистом виде важно для его практического использования. В медицине препарат "Лидаза", действующим началом которого является гиалуронидаза, применяют для ускорения всасывания лекарственных веществ, рассасывания рубцов, понижения вязкости эксудатов и отеков [42], а также для определения гиалуроновой кислоты. В промышленном масштабе его получают из семенников крупного рогатого скота методом фракционирования

органическими растворителями. Технология имеет ряд существенных недостатков, вследствие чего фермент загрязнен примесями и имеет низкую удельную активность. Кроме того, даже дальнейшая тонкая очистка от примесей не приводит к получению гомогенной формы фермента, так как гиалуронидаза из семенников крупного рогатого скота представлена совокупностью полимерных форм с разбросом по молекулярной массе от 10,7 до 200 кДа. Выделение протомера возможно, яо является трудной и дорогостоящей задачей.

В связи с этим, с одной стороны актуальным является как поиск новых, дешевых альтернативных источников сырья, в которых фермент является протомером, так и разработка сорбционно-хроматографических методов выделения гиалуронидазы, позволяющих получить очищенный фермент с высокой удельной активностью. С другой стороны, актуально проведение сравнительного анализа физико-химических и биологических характеристик ферментов, выделенных из различных источников, который дает возможность выявить особенности в структуре и механизме действия ферментов и определить область их применения.

Целью данной работы являлась разработка способа получения фермента гиалуронидазы из рыбного и микробного сырья, а также проведение сравнительного анализа физико-химических и биологических свойств ферментов, выделенных из источников, стоящих на разных ступенях эволюционного развития.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Оценить возможность получения гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб и бактерий Pseudomonas putida (36).

2. Изучить закономерности сорбции гиалуронидазы на ионитах различной структуры, а также подобрать оптимальный сорбент для выделения фермента из многокомпонентной смеси .

3. Разработать на основе полученных данных сорбционно-хроматографический метод выделения гиалуронидазы из нативного раствора Pseudomonas putida (36) и экстракта молок рыб.

4. Изучить свойства выделенных ферментов и дать сравнительную оценку физико-химических и биологических свойств гиалуронидазы из молок рыб и гиалуронидазы из бактерий Pseudomonas putida (36).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Заинкова, Наталья Вячеславовна

ВЫВОДЫ

1. Впервые исследованы в качестве источников гиалуронидазы молоки осетровых и лососевых рыб и бактерии рода Pseudomonas putida (36). Изучены процессы экстракции гиалуронидазы из молок рыб и биосинтеза гиалуронидазы бактериями Pseudomonas putida (36), установлено оптимальное время проведения процессов, при котором выход фермента максимален.

2. Изучены равновесные, кинетические и динамические параметры сорбции гиалуронидазы из экстракта молок рыб и нативного раствора Pseudomonas putida (36) и, на основе полученных данных разработан сорбционно-хроматографический метод выделения гиалуронидазы из экстракта молок рыб и нативного раствора на макропористом сульфокатионите КУ-23, позволяющий получить очищенные ферменты с высокой удельной активностью, превышающей удельную активность препарата «Лидаза» в 4-10 раз.

3. Использование сорбционно-хроматографического метода позволило выделить из нативного раствора Pseudomonas putida (36) ингибитор микробной гиалуронидазы. Показано, что выделенный ингибитор понижает скорость ферментативной реакции на порядок, рассчитана константа ингибирования и определен вид ингибирования (неконкурентный).

4. Проведен сравнительный анализ физико-химических и биологических свойств гиалуронидаз, полученных из молок рыб и бактерий Pseudomonas putida (36). Выявлены различия в молекулярных массах ферментов. Показано, что температурный и pH оптимум действия ферментов близки, однако гиалуронидаза из молок рыб стабильна в более широком диапазоне pH и температур. Изучена кинетика фермент-субстратных реакций и показано, что кинетика гидролиза гиалуроновой кислоты обоими ферментами - гиалуронидазой из молок рыб и микробной гиалуронидазой подчиняется теории Бригса-Холдейна, а кинетические кривые могут быть описаны уравнением Михаэлиса-Ментен.

5. Проведен анализ гиалуронидаз, полученных из молок осетровых и лососевых рыб с помощью современных методов анализа. Выявлено, что гиалуронидазы из молок осетровых и лососевых рыб идентичны друг другу, являются протомерами с молекулярной массой 12 кДа, состоят из 2 полипептидных цепей и имеют в своем составе углеводную часть (гликопротеид).

6. Выявлен ряд преимуществ гиалуронидазы из молок рыб перед микробной гиалуронидазой из Pseudomonas putida (36) и гиалуронидазой из семенников крупного рогатого скота, который дает возможность рекомендовать данное сырье для производства фермента в промышленном масштабе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основе данных литературы, а также собственных исследований, в заключение хотелось бы отметить, что несмотря на то, что гиалуронидазы, выделенные из источников, стоящих на разных ступенях эволюционного развития, таких как микроорганизмы, гельминты, насекомые, рыбы, млекопитающие и выполняющие различные биологические функции, имеют ряд общих свойств, а именно: проявляют высокую специфичность к гиалуроновой кислоте, близки, в большинстве случаев, по рН и температурному оптимуму действия, однако значительно различаются по таким параметрам, как удельная активность, стабильность, молекулярная масса и молекулярная гетерогенность. Сравнивая гиалуронидазу из молок рыб с гиалуронидазой из бактерий Рз.рийёа (36) и из семенников КРС можно отметить некоторые преимущества гиалуронидазы из молок рыб, а именно: фермент имеет высокую удельную активность, стабилен в более широком диапозоне рН и температур, имеет низкую молекулярную массу и является протомером. Кроме того, сами молоки рыб являются отходами производства, поэтому можно рекомендовать использовать данное сырье для производства гиалуронидазы разработанным сорбционным методом в промышленном масштабе и применять выделенный фермент в косметологии, сельском хозяйстве, для аналитических целей, а после проведения необходимых исследований, в качестве медицинского препарата. Разработанный метод выделения гиалуронидазы из молок был апробирован на заводе медицинских препаратов при АО «Самсон» в полупроизводственных условиях и получен акт апробации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Заинкова, Наталья Вячеславовна, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Азаренок К.С., Генералов И.И. Определение гиалуронидазной активности методом риванолового сгустка. // Клин. Лаб. Диагн. -1994. -N.5. -с.38-40.

2. Безбородое A.M., Родионова H.A. Очистка и характеристика арабинофуранозидазы из Geotrichum candidum ЗС. // тез.докл.Всерос.симпозиум «Биосепарация», СПб,-1996, с 8.

3. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология, М.: Агропромиздат, -1990, 334с.

4. Беленький Б.Г., Белов Ю.В., Касалайнен F.E. Высокэффективный капиллярный электрофорез биополимеров. // тез.докл. Всерос.симпозиум «Биосепарация», СПб,-1996, с 8.

5. Беленький Б.Г., Виленчик ЛЛ. Хроматография полимеров. М.: Химия, -1978г

6. Березин И.В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая школа,-1977,-267с

7. Биотехнология. Принципы и применение. / Под ред. Баева А. А. -М.: Наука.-1985, -479с.

8. Большая медицинская энциклопедия. М.: Советская энциклопедия, -1985.

9. Быков В.А., Манаков М.Н., Панфилов В.И. и др. Биотехнология. Производство белковых веществ. М.: Высшая школа, 1987, 140с

10. Бычков С.М., Кузьмина С.А. Свойства и методы выделения гиалуроновой кислоты. //Вопросы медицинской химии. -1986. -т.32. -N.1. -с. 19-32.

11. Волкова М.О., Костюкова Н.Ю., КветнаяА.С. Роль гаалуронидазы в генерализованной пневмококковой инфекции. // Микробиол. Эпидемиол. Иммуннобиология, -1994, с. 118-122.

12. Временная Фармакопейная Статья 42-188-72,- Рег.уд. N 71/145/13.

13. Глазова Н.В. Сорбционное разделение смесей БАВ в квазиравновесных и неравновесных условиях. // тез.докл. Веер. Симп. "Биосепарация", СПб, -1996,-ell.

14. Глазова II.В., Елькин Г.Э., Рудометова Н.В. Оптимизация ионообменных процессов с использованием ПЭВМ. СПХФИ, 1993, -с 19.

15. Глазова Н.В., Ефимова Т.Б., Игонина Л.\1., Дмитренко Л. В.

Использование хроматографических методов для оценки эффективности очистки ферментных препаратов.// тез.докл Всесоюз.науч.конфер. "Технология ключевых соединений, используемых в синтезе БАВ" - Пенза.-1991.-C.105-112

16. Горлина М.К., Костюкова Н.Н., Милдзикова И.Б., Черникова Т.Ф., Мишина А.И., Скирда Т.А., Кайти X. Серотипы и субтипы Neiseria meningitidis, циркулирующие среди бактерионосителей в Москве (1989-1991), // Микробиол Эпидимиол. Иммунобиол. -1994, с44-48.

17. Государственная Фармокопея. Х.-в. 1 .-с.89.

18. Грачева И.М. Технологии ферментных препаратов // 2-е изд., перераб.и доп. -М.: Агропромиздат, -1987, -335с.

19. Дарбре А. Практическая химия белка. Пер. с англ.- М.: Мир,- 1989623 с.

20. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты.- М.: Мир, -1992, -с. 1117.

21. Дмитренко Л.В. Исследование взаимодействия полиэлектролитов с органическими ионами (антибиотиками, нуклеотидами и их производными, белками и модельными соединениями): Автореф. дис. докт.хим.наук.-Л.-ИВС АН СССР, 1974.-40 с.

22. Доис Э. Количественные проблемы биохимии. -М. -1983. -с.373.

23. Дубинина Н.И. Исследование взаимодействия белков с карбоксильными катеонитами.: Диссер. на соиск. ст.к.х.н. - Л.-ВНИИТИАФ,- 1980.-179 с.

24. Блинов Н.П. Основы биотехнологии. -СПб.: Наука, -1995г

25. Елькин Г.Э. Иониты в химической технологии, под. Ред. Никольского, Л: Химия, -1982, стр.307.

26. Елькин Г.Э. Теоретические основы выбора оптимальных режимов сорбции и хроматографии БАВ. / / Всер.симп. Биосепарация, -СПб, 1996, -с.11

27. Ефимова Т.Б., Рудометова ЕВ., Елькин Г.Э., Дмитренко Л.В. Постадийный аналитический контроль технологических процессов получения белковых препаратов. // тез.докл Всесоюз.науч.конфер. "Технология ключевых соединений, используемых в синтезе БАВ" - Пенза.-1991.-с.45-47.

28. Игонина Л.М., Глазова Н.В., Дмитренко Л.В., Заинкова Н.В. Применение сорбционно-хроматографических методов очистки ферментного препарата "Лидаза"./ кн. Химия и технология лекарственных веществ.-СПб.-1994.-c.14.

29. Игонина Л.М., Глазова П. В., Заинкова Н.В. Использование сорбентов для удаления примесей из инъекционного препарата "Лидаза" //Тез.докл. Междунар. Симп. "Проблемы сорбционной детоксикации внутренней среды организма. "-Новосибирск,-1995.

30. Игонина Л.М., Д.Коррадини, Н.В.Глазова, Г.Э.Елькин, Д.Канарса. Влияние ионов двухвалентных металлов на порядок следования белков при ионообменной ВЭЖХ. / / Прикладная химия.-1996

31. Игонина Л.М. Хроматографическое выделение и изучение свойств фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота // диссер. к.б.н. СПб: СПХФА, -1996.

32. Иониты: каталог / НИИ Пластмассы НПО "Пластмассы" - изд.2-е перер.и доп.-Черкассы,-1980.- 32 с

33. Ионообменные материалы для процессов гидрометаллургии, очистки сточных вод и водоподготовки: справочник /ВНИИХТ. Госком. по исп. атом, энергии. (4-е изд.)-М.,-1989.-149 с.

34. Кадолина И.Г. Разработка методов выделения и очистки бактериальных эндотоксинов.: Диссерт. к.б.н. -СПб .: СПХФИ. -1995

35. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия, М.: Высшая школа, -1992, 415с.

36. Кокотов Ю.А., Золотарев П.П., £лькин Г.Э. Теоретические основы ионного обмена.-Л: Химия,-1986-280 с.

37. Колешан М.И. Быстрая очистка гиалуронидазы. //ВюсИет^ Ь1орЫ8.ак1а, ^ 1,- 1963.

38. Комов В ЛI., Кириллова Н.В., Стрелкова М.А., Троицкая JI.A. Вьщеление и очистка некоторых биологически - активных веществ из культуры растительных клеток, //тез.докл. Всерос.симпозиум «Биосепарация», СПб,-1996,-с 14.

39. Корииш-Боудеи Э. Основы ферментативной кинетики. -М.: Мир. -1979. -43с.

40. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии . М.: Высшая школа, -1980, -271с.

41. Лурье А.А. Хроматографические материалы./справочник/ -М.: Химия-1978,-440с

42. Машковский М.Д. Лекарственные средства.-М.: Изд.1Х -1984- 2 т.

43. Миканадзе Ю.С., Шанидзе К.Г., Турманидзе Ц.С. Сравнение свойств нативной и иммобилизованной гиалуронидазы Staphylococcus aureus 0-15. It тез.докл. 4-ой Всесс. Конф. Биосинтез ферментов., Ташкент, 1988,-с.220-221.

44. Мусил Я., Новакова О.» Кунц К. Современная биохимия в схемах,- пер. с англ. -М.: Мир.-1984- с. 162-172.

45. Никольский Б.М. Иониты в химической технологии, Л., Химия, -1982, -с.305.

46. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Хоулта Д., Крига Н., 9-ое изд. Пер. с анг. Под ред. Звягинцева Г.А,- М.: Мир, -1987г, -с. 161

47. Пархоменко Л.В., Ковальчук В.К., Опенько Л. В. "Патогенетические аспекты гиалуронидазной активности Proteus mirabilis // Микоробиол. Эпидем. Иммунобиол. -1993, с. 14-18.

48. Полторак О.М., Чухрай Е.С. Физико-химические основы ферментного катализа. -М.: Высшая химия, -1971, -с.75.

49. Прист Ф. Внеклеточные ферменты микроорганизмов. Пер. с анг. Плакунова -М.: Мир, -1987, -с. 11

50. Промышленная микробиология., под ред. Егорова Н.С., М: Высшая школа, -1989, 359с.

51. Радченко И.Г. Взаимодействие гиалуронидазы с гентамидином и полимерами различной структуры.: Диссерт. к.б.н. -СПб.: СПХФА. -1997

52. Радченко И.Г., Глазова Н.В. Изучение взаимодействия гиалуронидазы с полимерными биологически активными веществами в растворе.// Всерос.симпозиум «Биосепарация», тез.докладов, СПб,-1996,с 21.

53. Рошою Н., Танасеску М., Лолеску М. Гиалуронидаза из некоторых видов рыб румынского побережья черного моря. // БАВ морских организмов — 2е раб. Совещание, Констанца, -1988, вып.1, М.: с.131-132.

54. Рудом его в a FI.B., Глазова И.В., Елькин Г.Э., Дмитренко Л.В. Использование препаративной хроматографии для выделения и очистки биологически активных веществ на молекулярных и ионогенных сорбентах.// тез. докл.: Семин. "Препаративная и масштабируемая хроматография биологически активных веществ и альтернативные методы. "-Л. 1991.-е. 27.

55. Рудометова II.B., Дмитренко Л .В., Глазова Н.В. Использование сорбционных методов для очистки гидролаз, продуцируемых Вас. subtilis и Asp. oryzae.// Тез. докл. Всесоюз. конф Технология ключевых соединений используемых в синтезе БАВ.:-Пенза,-1995. -с. 18-19.

56. Рудометова Н.В., Ефимова Т.Б., Глазова Н.В. и др. Исследование процесса сорбции на макропористых сорбентах. // тез.докл. VII Всесоюз. конф. "Применение ионообменных материалов в промышленности и аналитической химии": -Воронеж-1991.-с.202-203.

57. Рудометова Н.В. Разработка сорбционного хроматографического выделения панкреатических ферментов. Диссер. К.х.н. СПб.: СПбТИ, -1994.

58. Самсонов Г.В., Меленевский А.Т. Сорбционно-хроматографические методы физико-химической биотехнологии. -JI.: Наука.,-1986

59. Самсонов Г. В., Тростянская Е.Б., Елькин Г.Э. Ионный обмен. Сорбция органических веществ. JI.: Наука1969,-333с

60. Самсонов Г.В., Писарев O.A. ДАН СССР, -1991, т.319, №2, 548с

61. Самсонов Г.В., Писарев O.A. Новые принципы ионообменной препаративной хроматографии и их применение для выделения, очистки и суперочистки антибиотиков.// Прикладная химия и микробиология. Т.28, М.: Наука, -1992г.

62. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. М.: Мир, -1987, 165с

63. Селезнева A.A., Бабенко Г.А., Елькин Г.Э. и др. Кинетика сорбции ферментов в поверхностном слое карбоксильных катионитов. // Коллоид. Журн. - 1974.-T.36.-C.511-514.

64. Ситников АЛ ., Глазова Н.В., Травина Л.А., Багирова В.Л. ЛАЛ-тест. Современные подходы к определению пирогенности. СПб АО «ТЕХ-БИОМ», -1994

65. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, -1985, 224с..

66. Слабосницкая А.Т. Гиалуроиидазиая активность споровых аэробных бактерий, выделенных из различных биологических источников. //Микробиологический журнал, -1985, 647, №4, с.71-74.

67. Стекольников Л.И., Рыльцев В.В., Филатов В.И. "Способ получения гиалуронидазы / Авт.свид., Бюл. №12, -1992.

68. Стекольников Л.И., Рылыдов В.В., Игнатюк Т.Е., Кутукова И.М. Способ получения ронидазы/ Авт.свид. СССР №1666534, кл. С12, №9/26, -1989, II бюл. №28, -1991.

69. Турманндзе Ц.С., Шанидзе К.Г., Миканадзе Ю.С. Получение, биологическое действие и структурно-функциональная организация стафилококковой гиалуронидазы // Всерос. Конф. "Химия белков", 21-26 мая, Пущине,-1990г.,-. 77.

70. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. Пер. с англ. -М.: Мир. -1981. -с. 1489-1491.

71. Убандуллаев А.М., Ливерко И.В., Черник М.Б. Прогноз исхода воспалительного процесса при хроническом бронхите // Тег-АгкЬ. -1992. -У.64. -N.3. -Р.34-36.

72. Уваркина Т.П., Матюшкова Т.А. Новый материал для обесцвечивания водных растворов пигментов. М.; Достижения промышленной энзимологии,-1988, с.70-75.

73. Уэстли Дж. Ферментативный катализ. Пер с ант. Яковлева В.А., М.: Мир, -1972, -с.67

74. Фармакопейная статья 42-2606-88 .

75. Фармакопейная статья 42-2606-93.

76. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. М.: -1980, -с.492.

77. Шатаева JI.K., Кузнецова Н.П., Елькин Г.Э. Карбоксильные катиониты в биологии. J1 Наука, -1979, 29с.

78. Шату В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Р.: Зинанте, -1988.,-с. 104

79. Borders СХ., Raftery A.M. Purification and partial characterization of testicular hyaluronidase // Biol. Chem., -1968, -v.243, -p.3756-3762.

80. Budds M., Eduards J. Olavesen A.H., Gacesa P. // A comparison of the properties of hyaluronidase from a temperate and a tropical species of leech // Comp. Biochem. And Physiol., -1987, -v.87, -№3, -p.497-500.

81. Canard В., Garnier T., Saint-Joanis В., Cole S. Molecular genetic analysis of the nagH gene encoding a hyaluronidase from Clostridium perfringens. //Mol.Gen.Genet -1994,243:215-224.

82. Corradini D., G.Cannarsa, L.Igonina. Evaluation of interaction between proteins and ionic species in solution by capillary electrophoresis, in Proteine4 96, Siena, 1996, P. 91.

83. Corradini D, Filippetti, Corradini C. Salt mediated elution behavior of proteins on a silica-based stationary phase for size exclusion high performance liquid chromatography. IIJ. Liquid Chromatorg., -1993, 16, p.3393-3408.

84. Dimenna G.P., Segall H.J.II J.Liqu.Chromatogr., 4, 638, -1981.

85. Dorfman A. Mucopolysaccharidases. / Metods Enzymol. 1995. - V.I.- P. 166-173.

86. Fiszer-Scafarz B. Hyaluronidase polymorfism detected by polyaciylamide gel electroforesis. Application to hyaluronidases from bacteria, slime molds, bee and snake venoms, bovine testes, rat liver lysosomes, and human serum.// Analyt. Biochem. 1984. -V.143. -P.76-81.

87. Fiszer-Scafarz B, Scafaz D. Polimorphizm of hyaluronidase in serum from man, various mouse stains and other vertebróte species revealed by electrophoresis // Biol. Cell., -1990, -v. 68, -№2, -p.95-100.

88. Fitzgerald T.J., and Gannon E.M./I Can.J.Microbiol, -1983 ,-29, p. 1507-1513.

89. Forsberg N., Gustafson S. Characterization and purification of the hualuronan receptor on liver endothelial cells // Biochen, Biophys. Acta., -1991, -v. 1078, -p. 1218.

90. GmachI M., Kreil G. Bee venom hyaluronidase is homologous to a membrane protein of mamalian sperm // Proc.Natl. Acad.Ski. USA, -1993, -v.90, №8, -p.3569-3573

91. GmachI M., Sagan S., Ketter S., Kleil G. The human sperm protein pH-20 has hyaluronidase activity IIFEBS Lett, -1993, -v.336, p.545-548.

92. Grenier D., Michaud J. Evidence for the absence of hyaluronidase activity in Porphyromonas gingivalis.// J.Clin.Microbiol.- 1993.-V.31 .-N.7.-P. 1913-1915.

93. Hamai A., Morirawa K. Purification and characterization of hyaJuronidase from Str.disgalactiar, //Agr. And Biol. Chem.,-1989, №8, p.2163-2168.

94. Harrison R.A. Preliminary characterization of forms of hyaluronidase from ram sperm// Biocliem. K„ -1988, -v.252, -№3, -p.875-882.

95. Harrison R.A. Hyaluronidase in ram semen. // Biohem. -1988,-v252,-p 865-874

96. Hatae Y. And Makita A. Colorimetric Determination of Hyalyronidase. // Anal. Biochem. -64, -30, -1975.

97. Helger D.N., High Performance Capillary Electrophoresis - An Introduction, Hewlett-Packard Company (France), 1992, 136 P.

98. Hennequin J.R., Steck P., Roncucci R. / Biofutur №4, 1994, 11-176.

99. Henschen, K.P. Hupe, F. Lottspeich, W. Voelten High Performance Liquid Chromatography in Biochemistry, пер. с англ., под ред. JI.B. Березина, М.: Мир, 1988, 687 с.

100. Hotez P., Cappello М., Hawdon J., Bechers С., Saranari J. Hyaluronidases of the gastrointestinal invasive nematodes Ancylostoma caninum and Anisaris simplex: possible function in the pathogenesis of human zoonoses // J. Infect, Dis. -1994, v. 170, №4, p.918-926.

101. Hotez P, Narasimhan S., Haggerty J., Mil tone L., Btopale V., Schad G., Richards F. Hyaluronidase from infective Ancilostoma hoomworm larve and its possible function as a virulence factor in tissue invasion and in cutaneous larve migrans // Infect. Human. -1992., v.60, №3, p. 1018-1023.

102. Hynes W.L., Ferretti J.J. Assays for hyaluronidase activity. // Methods.Enzymol.-1994.-V.235.-P.606-616.

103. Jacobson R.S., Hoffman D.K., Kemeny D.M. The cross-reactivity between bee and vespid hyaluronidases hos a structural basis. -1992 // J.Allergy Clin Immunob. V.89, -p.292.

104. Joy M., Dodson K., Obavesen A., Gacesa P. Purification and characterization of human serum hyaluronidase // -1993, Arch. Biochem. Biophys, -v.305, -p.434-441

105. Kehl M., Lottspeich F., Heshen A. Hoppe-Seylcrs. // . Physical. Chem., -1990,363.

106. Ketsugo J. // Connect Tissue, -1992, -v.32, -№3-4.

107. Kojima K., Manabe T., Okuyama T., Tomono T., Suzuki T., Tokunaga E. //

J.Chromatogr., 239, 567, 1982.

108. Komeny D.M., Dalton N., Lawrence A.J., Pearce F.L., Vernon C.A. The

purification and characterization of hyaluronidase from the venom of honey bee (Apis mellifera) // Eur. J.Biochem, -1984, -v. 139, -p.217-23.

109. Kreil G. Hyaluronidases - a group of neglected enzymes - Science, -1995, -v4, -pi666-1669.

110. Lace D., Anthony H., Olavcsen., Gacesa P. The effect of deglycosylation on properties of native and biotinylated bovine testicular hyaluronidase. // Carbonhydrate Research ,-1990,-208,- p.306-311.

111. Laurent T.C. Chemistry and Molecular Biology of the .Intercellular matrix. Ed. E.ABalazs. -London. -1970. -V.2. -P.703-732.

112. Li G., Kochoumian L., Koing T.P. Sequence identify and antigenic cross-reaklivity of white face hornet venom allergen, also a hyaluronidase, with other proteins. //J.BioI.Chem., -1995, -v.270, -p.4457-4465.

113. Li S.F.Y., Capillary Electrophoresis - principles, practice and applications. // J. Chromatogr., 1992, V. 52, charter 1-2.-P. 1-35.

114. Li Shun, Liang Song-Ping. // Chin.Biochem.J., -1995, -v. 11, №2, -p. 155.

115. Lin Y., Mahan K., Lathrop W.F., Myles D.G., Primaroff P. A hyaluronidase activiti of the sperm plasma membrane protein pH-20 enables sperm to penetrate the cumules cell layer surrounding the egg // J.Cell Biol., -1994, -v. 125, -p. 1157-1163.

116. Meyer K. Hyaluronidases/ In Boyer P.D. The enzymes/ -1971, -p307-320..

117. Michalski J.-C., Olavesen A.H., Winterburn P.J., Pope D.J., Strecker G. The structure of the major oligosaccharide unit of bovine testicular hyaluronidase.// Biochemical society transactions. 607th meeting, London, 1984. - P. 657-658

118. Nakamura T., Tanaka K., Daidouji K., Takagaki K., Saito Y., Enndo M. Serum hyaluronidase assay with fluorogenic hyaluronate as a substrate.//Connect.Tissue.(Japan)-1994.- V.25.-N.4.-P.237-242.

119. Ozegowsky J.M., Gunter E., Reichadi W. Purification and characterization of hyaluronidase from Streptococcus agalactie// JntJ.Med.Microbiol. Viros. Parasitol. Infect. Dis. -1994, -v.280., №4, p.497-506.

120. Park Y., Cho S., Linhardt R. Exploration of the action pattern of Streptomyces hyaluronate lyase using high - resolution capiltaiy electrolhoresis // Biochim -Biophys Acta, -1997, -v. 1337, -p.217.

121. Poh C.H., Yuen R., Chung M.C., Kroc H.E. Purification and partial characterization of hyaluronidase from stonefish (Sunaceja horrida) venom // Comp. Biochem. Physiol. B. -1992, v.101, №1-2, -p.159-163,

122. Primakoff P., Lathrop W., Wooiman L., Cowan A., Myles D.G. Fully effective contraception in male and female guinea pigs immunized with the sperm protein pH-20 // J.Nature, -1988, -v.335, -p.543-546.

123. Ragnar O., Audny J., Bjornar M. Process. Biochem. -1990, -25, №2, 67-67c.

124. Ramanaiah M., Parthasarathy P.R., Vankaiah B. Isolation and characterization of hyaluronidase from scorpion ( Heterometrus fulvipes) venom. // Biochem Inf (Australia), -1990, v.20, №2, p.302-310.

125. Ratge D., Wisser H. / J.Chromatorgr., 185, 453, -1982.

126. Roshoi N., Sebran M. Comparative biochemical studies between the purificed hyaluronidase from Engraulis engrassidolus ponticus viscera and the bovine testis hyaluronidase // Rev. Roum. Biochem., -1989, -v.26, -№2, -p. 145-151.

127. Rush R.S., Karger B.L., Sample injection with P/PACE System 2000: Importance of temperature control with respect to quantition. Technical Bulletin T1BC-104, Beckman Instruments, 1990.

128. Senn A., Germond M., De-Grandi P. Immunofluorescence study of actin, acrosin, dynein, tubulin and hyaluronidase and their impact on in vitro fertilization // Hum.Reprod. (Eng), -1992, -v.7, №6, -p.841-849.

129. Shimizy M.T., Almeida N.Q., Fantinato V. Unterriroher CS. Studies on hyaluronidase, chindroitin sulfatase, proteinase and phosholipase secreted by Candida species // Germany. Mycoses, -1996, -v.36, -pl61.

130. Steiner В., Cruce D. A zymographic assay for detection of hyaluronidase activity on polyacrylamide gels and its application to enzymatic activity found in bacteria.//Anal.Biochem.-1992.-V.200.-N.2.-P.405-410.

131. Stern M., Stern R. An ELISA-like assay for hyaluronidase and hyaluronidase inhibitors.//Matrix.(Germany).-1992.-V.12.-N.5.-P.397-403.

132. Sting R., Shaufiiss P., Blodel M. Isolation and characterization of hyaluronidases from Streptococcus dysgalactiae, Str. Zooepidermicus, Str. Equi// Med. Microbiol (Germany), -1990, -v.272, №3, p.276-282

133. Taragaki K, Naramatura T., Jzumi J., Saiton H. Characterization of hydrolysis and tran sglycosy 1 ation by testicular hyaluronidase using ion-spray mass spectroscopy. //J. Biochemistry,-1994,33:6503-6507.

134. Telfer N.R., Chalmers R.J., Whale K., Colman G. The role of streptococcal infection in the initiation of quttate psoriasis. It Arch Dermatol, -1992, -v. 128, №1, -p.39-42.

135. Thaler C., Cardullo R. Biochemystri characterisation of glucosylphoshotidialinositol-hyaluronidase of mouse sperm // J.Biocbemistry., -1995, -v.34., №24, -p.7788-7795.

136. Tu A.T., Hendon R.R. Characterization of lizard venom hyaluronidase and evalute for its action as spreading factor. // Comp.Biochem. Physiol. B., -1983, -v. 76, -p.377-383.

137. Van der Rest M, Fietzer P. // Eur.J., Biochem, 125, 419, 1982.

138. Van Rocy P., Rao V., Plummer T.H., TarentinoAX. Crystal structure of endo-p-N-acetulglucosaminidase Fl, an alpha/beta barrel enzyme adapted for a complex substrate //J.Biochemistry, -1994., -v.33, -p. 13989-13996.

139. Vatanade M., Hayashi S. Porcine hver hyaluronidase polimorphism detected in poliacrylamide gel electrophoresis // Connect Tissue, -990, -v.21,-№3, -p. 141-142.

140. Yakahashi N., Takahashi Y., Putnam F. Complete amino acid sequence of human hemopexin, the heme-binding protein of serum // Proc. Nute. Acad. Sci., USA, -1995, -v.82., -p.73-77.

¿! о I ^ А'^Д

(}'-! Ддр^рр йр<р0з£одства медицинских ^препар^срв Ш^йСамсон>> •¿^;^70.В.Чайка

V,

АКТ

АО «СЛМСОН» ПРО И 3 В О /л С Т Г? О МЕДИЦИНСК^Х ПРЕПАРАТОВ

г. Со к кт~ Л ггсрбу рг

апробации получения фермента гиалуронидазы из молок лососевых"рБГб7~--------

Настоящий акт составлен в том ,что на участке производства ферментных препаратов были проведены производственные испытания технологии получения гиалуронидазы из молок лососевых рыб с использованием экстракции,фильтрации,ионообменного выделения гиалуронидазы на сорбенте КУ-23 из экстракта с последующей лиофильной сушкой.

По данной технологии было проведено три производственные загрузки на промышленном оборудовании и экспериментальной ионообменной колонне ДкН 0,05 х0,2 м и получена субстанция фермента с удельной активностью 16 Ед\мг. Показано ,что сорбционная технология является перспективной ,т.к позволяет исключить стадию осажДения органическим растворителем и получать гиалуронидазу из отходов рыбоперерабатывающего производства с удельной активностью ,в 4 раза превышающей удельную активность препарата "Лидаза "

К.х.н. доцент СПХФА '

Технический руководитель ПМП ^^^¿¿^¿^

Глазова Н.В. Шенгер А. А.