Хроматографическая очистка гидролитических ферментов из поджелудочной железы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Царенко, Ольга Викторовна

• Царенко, Ольга Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Царенко, Ольга Викторовна

Введение.

1. Литературный обзор.

1.1. Ферменты поджелудочной железы. Свойства и применение в медицине.

1.2. Основные физико-химические методы, используемые для выделения и очистки ферментов.

1.3. Хроматографические методы очистки белков.

1.3.1. Полимерные носители для хроматографии.

1.3.2. Виды хроматографических процессов. Ионообменная и щдрофобная хроматография

1.4. Термодинамический и кинетико-динамический анализ сорбционнных процессов. Оптимизация хроматографического разделения БАВ.

2. Экспериментальная часть.а.

2.1. Объекты исследования.

2.1.1. Структура и свойства панкреатических ферментов.

2.1.2. Физико-химические характеристики сорбентов.

2.2. Методы исследования.

2.2.1. Определение концентрации белка по методу Лоури.

2.2.2. Метод определения углеводов.

2.2.3. Определение активности ДНК-азы.

2.2.4. Метод определения активности РНК-азы.

2.2.5. Определение протеолитичеекой активности.

2.2.6. Гельхроматографический анализ.

2.3. Методики проведения сорбционных экспериментов.

2.3.1 Исследование сорбции белков в статических условиях (рН -зависимость и изотермические процессы сорбции).

2.3.2. Исследование кинетики сорбции белков.

2.3.3. Проведение процесса сорбции и десорбции в динамических условиях.

2.4. Математические методы обработки результатов.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Изучение равновесных и кинетических параметров сорбции панкреатических ферментов на различных хроматографических носителях.

3.1.1. Сорбция панкреатических ферментов на ионогенных и молекулярных сорбентах с модифицированной и немодифицированной поверхностью.

3 .1.2. Сорбция панкреатических ферментов на сверхсшитых полиетирольных сорбентах Стиросорб.

3.2. Исследование динамических процессов сорбции и десорбции.

3.2.1. Теоретический анализ условий оптимизации. Изучение влияния скорости подвижной фазы на процесс сорбции ферментов из многокомпонентной смеси.

3.2.2. Изучение сорбции ферментов из экстракта поджелудочной железы на сорбентах с модифицированной поверхностью.

3.2.3. Изучение сорбции и десорбции ферментов в динамических условиях на сверхсшитых сорбентах Стиросорб.

3.3. Масштабирование хроматографического способа очистки РНК-азы.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Хроматографическая очистка гидролитических ферментов из поджелудочной железы»

Производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии. Ферментные препараты широко используются во многих отраслях промышленности: медицинской, микробиологической, парфюмерной, сельскохозяйственной и других. Особое значение в настоящее время приобретает получение лекарственных средств на основе ферментов из животного сырья, которые могут успешно заменить препараты аналогичного действия, производимые химическим и микробиологическим синтезом.

Гидролитические ферменты из поджелудочной железы крупного рогатого скота - рибонуклеаза (РЖ-аза), дезоксирибонуклеаза (ДНК-аза), трипсин и химотрипсин - обладают выраженным противовоспалительным и противоотечным действием и эффективны при лечении гнойно-воспалительных процессов различной локализации и этиологии. Кроме того, нуклеазьг являются природными регуляторами механизма противовирусной защиты, что позволяет рекомендовать их для лечения и профилактики вирусных инфекций. Поэтому, для использования гидролитических ферментов в медицинской практике путем внутримышечного и, в особенности, внутривенного введения степень очистки препаратов должна быть высокой.

Проблема повышения качества препаратов требует создания новых подходов к методам их выделения и очистки. Используемые в настоящее время промышленные методы выделения и очистки гидролитических ферментов недостаточно эффективны. Первичное концентрирование ферментов из экстракта поджелудочной железы крупного рогатого скота проводится по ионообменой технологии с использованием сульфокатионита КУ-23, однако дальнейшее получение ферментов проводят путем дробного фракционирования сульфатом аммония с последующей индивидуальной доочисткой каждого из ферментов. При этом используются одностадийные статические физико-химические методы (осаждение, диализ, экстракция, высаливание), которые не обеспечивают высокого выхода целевых продуктов, получения препаратов необходимой степени чистоты, связаны е использованием больших объемов органических растворителей и токсичных веществ (в частности, фенол), а также длительны по времени. 5

Вместе с тем, современное состояние развития препаративной хроматографии биологически активных веществ позволяет успешно решать вышеуказанные проблемы.

Целью работы являлось изучение закономерностей сорбции панкреатических ферментов на молекулярных и ионогенных носителях различной структуры и разработка на их основе хроматографического способа очистки. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучение равновесных, термодинамических и кинетических закономерностей сорбции ферментов на различных хроматографических носителях и выбор оптимального сорбента для препаративной хроматографии.

2. Теоретическое обоснование условий разделения компонентов смеси; оптимизация хроматогафического процесса по скорости подвижной фазы.

3. Выбор оптимальных физико-химических условий селективной элюции.

4. Масштабирование хроматографического процесса очистки для полупроизводственных условий.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Царенко, Ольга Викторовна

ВЫВОДЫ Показана возможность эффективного хроматографического выделения и очистки панкреатических ферментов на сорбентах с модифицированной поверхностью непосредственно из производственного экстракта поджелудочной железы: предварительная очистка от балластных примесей может осуществляться во фронтальном процессе на модифицированных молекулярных сорбентах Полисорб и СКН, а селективная сорбция и десорбция - на модифицированном КУ-23.

2. Впервые исследованы равновесные и кинетические параметры сорбции панкреатических ферментов сверхспштыми сорбентами Стироеорб, различающимися условиями синтеза, в частности, количеством катализатора. Показано, что наибольшей емкостью и улучшенными кинетическими характеристиками обладают Стиросорбы, полученные в присутствии 1-3 моль катализатора. Осуществлен выбор оптимального носителя - Стиросорба 1, который предложено использовать для индивидуальной доочистки ферментов на заключительных стадиях.

3. Установлен преобладающий вклад гидрофобных взаимодействий в изменение свободной энергии процесса сорбции гидролитических ферментов сверхспштыми сорбентами. Это учтено при выборе физико-химических условий элюции с обострением хроматограф ических зон целевых компонентов. Показано, что оптимальным элюирующим раствором является 30-50% этиловый спирт с рН=2-3.

4. Предложена теоретическая модель, позволяющая в зависимости от соотношений между равновесно-кинетическими параметрами сорбции прогнозировать оптимальную скорость хроматографического процесса, при которой возможно максимальное разделение компонентов или изменение порядка их выхода из хроматографической колонки. Получено экспериментальное подтверждение модели при разделении РНК-азы и ДНК-азы.

5. Разработан и запатентован новый способ очистки РНК-азы из производственного высола фермента с использованием сверхсшитого

110 сорбента Стнросорб 1, позволяющий повысить удельную активность в 1,5-2 раза, увеличить выход фермента с единицы сырья в 3,7-4 раза при сокращении времени технологического цикла очистки в 5 раз. Проведено масштабирование процесса хроматографической очистки РНК-азы для полупроизводственных условий и рассчитаны оптимальные параметры препаративной колонки.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Царенко, Ольга Викторовна, 2000 год

1. Банникова Т.Е., Варламов В.П., Самсонова О.Л., Рогожин C.B. Биоспецифическая хроматография нуклеаз.// В кн.: Нуклеазы. Биологическая роль и практическое использование. Киев: Наукова Думка, 1985. - С. 51-56.

2. Банникова Г.Е., Варламов В.П., Рогожин C.B. Способ вьщеления и очистки бактериальной эндонуклеазы из Serratia marcescens.//Авторское свидетельство СССР № 1392902. Опубл. 7.05.90.

3. Батурина И. Д., Бердыш ев Г. Д. Дезоксирибонуклеазы из внутренних органов карпа. Выделение и некоторые свойства.// В кн.: Разнокачественность онтогенеза у рыб. - Киев: Наукова Думка, 1980. - С. 114-128.

4. Башуро Г.С., Ляпунов H.A. К вопросу о применении катамина при создании готовых лекарственных средств.// Фармация, 1988. №1. - С.35-38.

5. Безбород ова С.И. Рибонуклеазы и родственные белки, а также ингибиторы рибонуклеаз.// Прикладная биохимия и микробиология, 1991. Т.27, №3. - С. 308-329.

6. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Пер. с англ., в 2 томах. М.: Мир, 1989. - Т.2. - 590 с.

7. Белякова Л.Д. Хроматографические и адсорбционные свойства сверхсшитых полистирольных адсорбентов «Стиросорб».// В сб.: Всероссийский симпозиум по теории и практике хроматографии и электрофореза. Самара: Самарский Университет, 1999.- С. 151-162.

8. Белякова Л.Д., Василевская О.В., Цюрупа М.П., Даванков В.А.

9. Адсорбционные и хроматографические свойства полимерных сорбентов типа «Стиросорб».// ЖФХ, 1995. Т.69, №4. - С. 696-700.

10. Белякова Л.Д., Василевская Ö.B., Цюрупа М.П., Даванков В.А.

11. Адсорбционные и хроматографические свойства микросферических полимерных сорбентов типа «Стиросорб».// ЖФХ, 1996. Т.70, №8. - С. 1476-1481.

12. Березин A.B., Клячко H.K., Левашов A.B., Мартинек К., МожаевВ.В,, Хмельницкий Ю.Л. Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа, 1987. - 160 с.

13. Быченкова О.В., Ищенко Л.С., Глазова Н.В. Использование хроматографических методов для получения ферментного препарата «Рибонуклеаза».// Тез.Республиканской научной конференции молодых ученых медицинских вузов России. Самара, 1999,- С. 33.

14. Варламов В.П. Хроматографическое выделение гидролаз (нуклеаз, фосфатаз, хитиназ) и их использование в биотехнологических процессах.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени докт. хим. наук. Москва, 1994. -51с.

15. Глазова Н.В., Ефимова Т.Б., Игонина Л.М., Дмитренко Л.В.

16. Использование хроматографических методов для оценки эффективности очистки ферментных препаратов.// Тез. докладов Всесоюзной научной конференции "Технология ключевых соединений, используемых в синтезе БАВ*. Пенза, 1991,- С. 105-112.

17. Глазова Н.В. Сорбционное разделение смесей Б AB в квазиравновесных и неравновесных условиях.// Тезисы докладов Всерос. симпозиума «Биосепарация-96». СПб, 1996.- С. 11.

18. Глазова Н.В., Елькин Г.Э., Рудометова Н.В. Оптимизация ионообменных процессов с использованием ПЭВМ. СПХФИ, 1993. - 19 с.

19. Глухов Б.М. Об участии РНК-азы в механизме противовирусной защиты организма при клещевом энцефалите.// Журн. невропатологии и психиатрии, 1970. Т. 70, вып. 1. - С. 45-48.

20. Горчаков В. Д., Сергиеико В.И., Владимиров В.Г. Селективные гемосорбенты. М.: Медицина, 1989. - 224 с.

21. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М.: Агропромиздат, 1987. - 335 с.

22. Гуторов А.Н., Лесников Е.П., Салганик Р.И., Кривошеее Б.Н. ДНК-аза в терапии простого рецидивирующего герпеса.// Вестник дерматологии и венерологии, 1976. -№11. С. 75-78.

23. Дарбре А. Практическая химия бежа.// Пер. с англ.- М. : Мир, 1989. 623 с.

24. Демин A.A., Салганик Р.И. Терапевтическая активность ДНК-азы при инфекционном мононуклеозе.// Сов. Медицина, 1983. №8. - С. 91-92.

25. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты,- М.: Мир, 1992. 1117 с.

26. Елькин Г.Э. Концепция регулярности режима сорбции в теории и практике ионного обмена органических ионов.// Межвузовский сборник: Ионный обмен и ионометрия, 1990. Вып. 7. - С. 3-15.

27. Елькин Г.Э. Теоретические основы выбора оптимальных режимов сорбции и хроматографии БАВ.// Тезисы докладов Всерос.симпозиума «Биосепарация-96». -СПб, 1996, СЛ.

28. Елькин Г.Э., Глазова Н.В., Курдявка Л.В. Модификация свойств поверхности макропористых сополимеров путем адсорбции поверхностно-активных веществ.// ЖФХД994.-Т.68, №10,- С. 1782-1783.

29. Елькин Г.Э., Бабенко Г.А., Селезнева A.A., Самсонов Г.В. Кинетика сорбции белков ионообменными смолами. Сорбция химотрипсиногенакарбоксильными катионитами.// Коллоидный Журнал, 1972. Т.34, №2. -€.208-212.

30. Заинкова Н.В. Получение и сравнительный анализ свойств гиалуронидаз из различных источников.// Диссертация на соискание ученой степени канд.биол.наук. СПб: СПХФА, 1998. - 140с.

31. Игонина Л.М. Хроматографическое выделение и изучение свойств фермента гиалуронидазы из семенников крупного рогатого скота // Диссертация на соискание ученой степени канд.биол.наук. СПб: СПХФА, 1996.

32. Игонина Л.М., Глазова Н.В., Дмитренко Л.В., Заинкова Н.В. Применение сорбционно-хроматографических методов очистки ферментного препарата "Лидаза".// В кн.: Химия и технология лекарственных веществ.-СП6.-1994.-с.14.

33. Игонина Л.М., Глазова Н.В., Заинкова Н.В. Использование сорбентов для удаления примесей из инъекционного препарата "Лидаза"// Тез.докладов Международного симпозиума "Проблемы сорбционной детоксикации внутренней среды организма. "-Новосибирск,-1995.

34. Игонина Л.М., Д.Коррадини, Н.В.Глазова, Г.Э.Елькнн, Д.Канарса. Влияние ионов двухвалентных металлов на порядок следования белков при ионообменной ВЭЖХ. // Журнал прикладной химии, 1998. Т. 78, №7. -С. 1094—1098.

35. Иониты. Черкассы: НПО "Пластмассы", 1980,- 32 с.

36. Каталог хроматографичееких материалов для научных исследований.// РАН, Главное Управление материально-технического обеспечения. М.: Наука, 1992.-63 с.

37. Кадолина И.Г. Разработка методов выделения и очистки бактериальных эндотоксинов.// Диссертация на соискание ученой степени канд.биол.наук. -СПб.: СПХФИ. -1995.

38. Коваленко Г.А. Влияние панкреатических рибонуклеаз на клетки и организм животных: клеточный механизм противовирусного действия.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук. Казань, 1986. -19 с.

39. Кокотов Ю.А., Золотарев П.П., Елькин Г.Э. Теоретические основы ионного обмена. Л: Химия, 1986. - 280 с.

40. Колбановская Е.Ю. Структурно-функциональный анализ рибонуклеазы А и родственных белков.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. хим. наук. Москва, 1996. - 22 с.

41. Коликов В.М., Мчедлишвили Б.В. Хроматография белков на макропористых кремнеземах. Л. .Химия, 1986. - 192 с.

42. Колодзейская М.В., Пилявская A.C. Пептидазы. Киев: Наукова Думка, 1982. - 176 с.

43. Кривошеев Б.Н., Мотовилова H.H., Салганик Р.И., Савиных Ж.М., Стадиик К.И. ДНК-аза в комплексной терапии герпетиформной экземы Капоши.// Вестник дерматологии и венерологии, 1987. №1. - С. 29-33.

44. Лапик A.C., Губенко U.C., Корочкин Л.И., Салганик Р.й.

45. Фармакологическая активность и токсичность нуклеаз.// Фармакология и токсикология, 1977. - Т.ЗЗ, №2. - С. 210-212.

46. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ. Типы режимов.// ЖФХ, 1995. Т.69, №6. - С. 1080-1084.

47. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ. Обращение порядка элюирования компонентов.// ЖФХ, 1997. Т.71, №6. - С. Ш7-1120.

48. Лещинская И.Б., Клейнер Г.И., Паэгле Б.Я., Знаменская Л.В., Михлин

49. Э.Д. Способ получения внеклеточной щелочной рибонуклеазы.// Авторское свидетельство СССР №1010125. Опубл. 7.04.83.

50. Лукьянова Ö.H., Писарев O.A., Муравьева Т.Д. и др. Десорбция противоопухолевого антибиотика даунорубицина с гелевых и гетероеетчатых карбоксильных катионитов.// ЖПХ, 1991. Т.64, №6. - С. 1361-1363.

51. Лурье A.A. Хроматографические материалы /справочник/. -М.: Химия. 1978. - 440 с.

52. Максимов В.И. Стабильность ферментов при очистке.// В кн.: Кристаллические ферменты: методы получения, их характеристика и использование. Вильнюс, 1975. - С.22-25.

53. Малиновекий H.H., Цацаниди К.Н., Пугаев A.B. и др. Применение панкреатической РНК-азы в комплексе консервативной терапии острого панкреатита.//Хирургия, 1982. Коб.-С. 8-17.

54. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971. - 404 с.

55. Мчедлишвшш Б.В., Коли ко в В.М., Черкасов А.Н. Трековые мембраны в процессах тонкой очистки.// Тезисы докладов Всерос. симпозиума «Биосепарация-96». С-Петербург, 1996. - С. 13.

56. Островский Д.Й., Дмитренко Л.В., Самсонов Г.В. Взаимодействие инсулина с полиэлектролитами макропористой структуры. // Изв. АН СССР. Сер.хим., 1973. №5. - С. 1145-1146.

57. Павлюченко H.H. Сравнительная биохимическая и физиологическая характеристика ферментных препаратов поджелудочной железы.// Автореферат диссертации на соискание ученой степени канд. мед. наук. -Ростов-на-Дону, 1987. 16 с.

58. Паскевич Й.Ф., Чиеханова М.А., Лиходед B.C. Исследование РНК-азы, связанной с гистонами печени и селезенки крыс.// Биохимия, 1972. - Т.37, №3. - С. 585-589.

59. Патент JP № 460031476. Способ выделения физиологически активных веществ из экстракта поджелудочной железы млекопитающих.// Amano pharm К.К. Опубл. 22.07.85.

60. Патент US № 4973554. Аффинный способ очистки и стабилизации трипсина.-Опубл. 27.11.90.

61. Пирогова О.В., Хохлова Т.Д., Петрова В.Н. Применение трековых мембран для разделения белковых смесей.// Тезисы докладов Всерос.симпозиума «Биоеепарация-96». С-Петербург, 1996. - С. 15.

62. Писарев O.A., Кручина-Богданов И.В., Глазова Н.В., Быченкова О.В. Кинетическое регулирование селективности сорбции в жидкостной хроматографии низкого давления.// ДАН, 1998. Т.362, №3. - С. 357-360.

63. Писарев O.A., Кручина-Богданов И.В., Глазова Н.В., Быченкова О.В. Хроматографические разделения БАВ в кинетически селективных режимах динамики сорбции.// ЖФХ, 1999. Т.73, №9. - С. 750-754.

64. Писарев O.A., Самсонов Г.В., Богданова Л.П., Муравьева Т.Д. Ионно-гидрофобное взаимодействие эремомицина с сетчатыми структурно сегрегированными биосорбентами.// ЖПХ, 1993. Т.66, №12. - С. 2825-2828.

65. Полянский Н.Г., Горбунов Г.В., Полянская Н.Л. Методы исследования ионитов. М.: Химия, 1976. - 208 с.

66. Радченко И.Г., Пономаренко М.Н., Глазова Н.В., Йозеп A.A. Исследование полимерных комплексов, включающих ферменты и растворимые полимеры.// ЖПХ, 1997. Т.70, №6. - С. 1040-1043.

67. Рудометова Н.В. Разработка сорбционного хроматографического выделения панкреатических ферментов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. - СПб.: СПбТИ, 1994.

68. Салганик Р.И., Тухачев A.A., Баталина Т.А. Противовирусное действие дезокеирибонуклеазы и рибонуклеазы.// В кн.: Ингибиторы вирусной активности. Рига: Зинатне, 1972. - С. 147-152.

69. Самсонов Г. В., Тростянекая Е.Б., Елькин Г.Э. Ионный обмен. Сорбция органических веществ. Л.: Наука, 1969. - 333 с.

70. Самсонов Г.В., Меленевский А.Т. Сороционно-хромато графические методы физико-химической биотехнологии. Л.: Наука, 1986.

71. Самсонов Г.В., Писарев O.A. Новые принципы ионообменной препаративной хроматографии и их применение для выделения, очистки и суперочистки антибиотиков.// Прикладная химия и микробиология, 1992. -Т.28,Ш.-С. 5-18.

72. Селезнева A.A., Бабенко Г.А., Елькин Г.Э. и др. Кинетика сорбции ферментов в поверхностном слое карбоксильных катионитов.// Коллоид. Журн, 1974. -Т.36,№3. -С.511-514.

73. Селезнева A.A., Дубинина H.H., Бабенко Г.А., Лукницкая 0.Ф., Самсонов Г.В. Особенности сорбции белков карбоксильным катионитом.// Коллоид. Журн., 1975. Т.37, №6. - С. 1138-1142.

74. Селеменев В.Ф. Обменные процессы и межмолекулярные взаимодействия в системе ионит-вода-аминокислота.// Автореферат диссертации на соискание степени доктора химических наук. Воронеж: В ГУ, 1993. - 49 с.

75. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. - 224 с.

76. Смирнов H.H., Аронова Е.Б., Беленький Б.Г., Наследов Д.Г. Экспериментальное исследование поведения белков на ионообменной хромато графической мембране.// Тезисы докладов Всерос.симпозиума «Биосепарация-96». С-Петербург, 1996. - С.22.

77. Стрелке В.В., Плаченов Т.Г., Картель Н.Г. Углеродные адсорбенты. М., Наука, 1983.- 170 с.

78. Таре A.A., Ярве В.Ю., Сийгур Ю.Р., Аавиксар В.А. Способ выделения эндонуклеазы из яда кобры.// Авторское свидетельство СССР № 1203902. Опубл. 30.11.90.

79. Тенникова Т.Б. Полимерные мембранные адсорберы. Высокоэффективная мембранная хроматография белков.// Тезисы докладов Всерос.симпозиума «Биосепарация-96». С-Петербург, 1996. - С. 13-14.

80. Троицкая В.Б. Электролиты и ферменты поджелудочного сока.// В кн.: Руководство по физиологии. Физиология пищеварения. Л.: Наука, 1974. -С.339-359,

81. Тугунов С.С., Константинов В.Л., Манойлов С.Е., Дмитриева В.А.

82. Заводское производство аморфных и кристаллических лечебных препаратовферментов трипсина, химотрипеина и РНК-азы из панкреатической железы.// Труды ЛХФИ, 1967. Вып.20. - С.9-18.

83. Федосов Ю.В., Кожемяко В.Б., Рассказов В.А. Способ получения кислой дезоксирибонуклеазы.// Авторское свидетельство СССР № 1100308. Опубл. 30.06.84.

84. Филимонова М.Н., Беиедик М.Дж., Уразов Н.Г., Лещинская И.Б.

85. Полидисперсность нуклеазы Serratia marcescens при оптимальном значении pH.// Прикладная биохимия и микробиология, 1999. Т.35, №1. - С. 20-24.

86. Хмара М Е. Влияние РНК-азы на интерферирующие, интерферогенные и цитопатичеекие свойства некоторых РНК-содержащих вирусов.// Здравоохранение Белоруссии, 1977. №8. - С. 14-16.

87. Цюрупа М.П., Ослонович К). В., Нистратов А.И., Радченко Л.Г., Даванков В.А. Фазовое расслоение в условиях синтеза сверхсшитых полистирольных сеток в среде циклогекеана.// ВМС, 1995. Т.37А, №6. - С.964-968.

88. Цюрупа М.П., Даванков В.А., Кривоносова Л.Г., Селеменев В.Ф., Чикин Г.А. Поглощение окрашенных веществ из ферментационных растворов лизина сверхсшитым сорбентом.// Прикладная биохимия и микробиология, 1985. Т.21, ML - С.72-77.

89. Цюрупа М.П., Панкратов Е.А., Даванков В.А. Влияние среды синтеза на физико-химические свойства макросетчатых изопористых полимеров стирола.// ВМС, 1980. Т.22Б, №10. - С.746-748.

90. Цюрупа М.П. Структура и свойства полимерных сорбентов на основе сверхсшитого полистирола.// Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук. ~ Москва, 1988.

91. Черкасов А.Н., Пасечник В.А. Мембраны и сорбенты в биотехнологии. Л.: Химия, 1991.-240 с.

92. Чичкова Н.В., Пейсениекс В.Э., Залите Й.К. Способ получения рибонуклеазы из E.eoli.// Авторское свидетельство СССР № 1495377. Опубл. 23.07.89.

93. Шапот B.C. Нуклеазы. М.: Медицина, 1968. 212 с.

94. Шатаева Л.К., Кузнецова H.H., Елькин Г.Э. Карбоксильные катиониты в биологии. Л.: Наука, 1979. - 229 с.

95. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Р.: Зинанте, 1988. 104 е.

96. Шиманко И.И., Берелавичус В.Ю., Владимиров В.Г. Использование РНК-азы в терапии острого панкреатита.// Сов. медицина, 1981. №1. - С. 50-54.

97. Яскович Г.А., Кошева Е.П., Елькин Г.Э., Воробьева В.Я., Самсонов Г.В. Кинетика сорбции дезоксирибонуклеазы Actinomyces streptomycini из нативного раствора карбоксильным катионитом КМТ.// Хим.-фарм. Журнал, 1974. №10. - С.47-51.

98. Atkinson В., Mavituna F. Biochemical Engineering and Biotechnology Handbook.- England: Macmilan Publishes Ltd., 1983.

99. Aranyl P., Laszlo B. Sorption equilibria between proteins and cation exchangers.// J. Chromatogr., 1974. ¥.89. - P.239-250.

100. Bemtema J.J., Hofsteen J., Jwama M., Morita Т., Ohgi K., Irie M., Sugijama R.H., Schieven G.L. Amino-acid sequence of the nonsecretory ribonuclease.// Biochem., 1988. V.27. - P. 4530-4538.

101. Bell D.J., Hoare M., Dunniil P. Formation of Protein Precipitates and Their Centrifugal Recovery.// Adv. Biochem. Eng./ Ed. Fiechter A. Berlin, N. Y., 1983.- V.26. P. 2.

102. Ben-Naim A. Water aqueous solutions interactions to a molecular theory. N.Y., L.: Plenum Press, 1974. - 474 p.

103. Biotechnoiogical Applications of Proteins and Enzymes./ Ed. by: Zvi Bohak, Nathan Sharon. N. Y., San-Francisco, London: Academic Press, 1977. - 368 p.

104. Blackburn P., Moore S. The Enzymes./ Ed. P.O. Boyer, 1982. V.15. - P. 317433.

105. Brooks C.L. Proteins: A theoretical perspective of dynamics, structure and thermodynamics. N.Y. etc.: Wiley and Sons, 1988. - XIII, 259 p. - Advances in chem. Physics, ¥.71.

106. Bucke C. The biotechnology of enzyme isolation and purification.// In Principles of Biotechnology. Glasgow: Blackie and Son Ltd., 1983. - P. 151-171.

107. Cafaro V., Bracale A., Formiggini F., Notomista E., B'Alessio G., Di Donato A. Protein engineering of ribonucleases.// Biochemie, 1998.—¥.80, №11. P. 905909.

108. Comprehensive biotechnology./ Ed. Cooney C.L., Humphrey R.E. N.Y, L.: Pergamort Press, 1985. - V.2. - 632 p.

109. Corradini D, Filippetti, Corradini C. Salt mediated elution behavior of proteins on a silica-based stationary phase for size exclusion high performance liquid chromatography.// J. Liquid Chromatog., 1993. V. 16. - P.3393-3408.

110. Cramer J.A., Bailey L.C. A reversed-phase ion-pair high-performance liquid chromatography method for bovine testicular hyaluronidase.// Anal. Bioehem.,1991. V.196, №1. - P. 183-191.

111. Curling J.M. Methods of plasma protein fractionation. N.Y.: Academic Press, 1980. - 532 p.

112. Davankov V.A., Tsyurupa M.P. Structure and properties of porous hypercrosslinked polystyrene sorbents styrosorb.// Pure and Appl. Chem., 1989. -V.61.-P. 1881-1888.

113. Davankov V.A., Tsyurupa M.P. Structure and properties of hypercrosslinked polystyrene the lsl representative of a new class of polymer networks.// Reactive Polymers, 1990. - V. 13. - P. 27-42.

114. Desifets C.P., Rounds M.A., Regnier F.E. Semipermeable-surface reversed-phase media for high-performance liquid chromatography.// J. Chromatogr., 1991. -Y.544. P.25.

115. Desnuelle P. In the Enzymes.// 2nd Ed. Academic Press, New York, 1960. V.4. -P.93.

116. Engelhardt H. Hochdruck-flussigkeits-chromatographie. Berlin: Springer. -Verlag, 1977.

117. Fritz J.S. et al. Ion chromatography. Heidelberg etc.: Huthig, 1982. - X, 203 p.

118. Glazova N.V., fgonina L.M., Elkiii G.E. Chromatographic purification of enzyme medicines from macromolecular impurities.// Macromolecular Symposia. -Bratislava, 1995.

119. Glazova N.V. Sorption technology protein medicines including of non-equilibrium chromatographic effects. // 10-th International Symp. of Chromatography in Industry.-Bratislava, 1996. P. 173-174.

120. Glukhov V.M., Jerusalimsky A.P., Canter V.M., Salganik R.I. Ribonuclease treatment of tick-born encephalitis.// Arch. Neurol., 1976. - V.33. - P. 598-603.

121. Gomes E., SerzedeHo A., Da SHva R. Purification and physico-chemical properties of a ribonuclease produced by Aspergillus flavipes.// Microbiol., 1998. -V.96,№383. P. 39-50.

122. Gozzinf L., Moiitecucclii P.C. High performance liquid chromatography in protein and peptide chemistry. Berlin, N.Y.: Walter de Gruyter, 1981. - 365 p.

123. Grabender G.C., Giafz C.E. Protein precipitation: analysis of particle size distribution and kinetics.// Chem. Eng. Commun., 1981. V. 12. - P. 203.

124. Hagglund I. Development of new and modified stationary phases in chromatography: Doctoraithesis. Stockholm, 1994. - 102 p.

125. Henschen, K.P. Hupe, F. Loitspeieh, W. Voelten High Performance Liquid Chromatography in Biochemistry, пер. с англ., под ред. JI.B. Березина. М.: Мир, 1988. - 687 с.

126. Janca J. Size exclusion chromatography.// J. of Liquid Chromatogr. V.13, № 9. -P. 1669.

127. Jansen J.C., fled man P. Large scale chromatography of proteins.// Advances in Biochemical Engineering, 1982. V.25. - P. 43-49.

128. Josic D., Reutter W., Molnar I. Practical aspect of modern HPLC. Berlin, N.Y.: Waiter de Gruyter, 1982. - 123 p.

129. Karlstom В., Vincent J., Jochansson В., Bryno C. A simple purification method of squeezed krill for obtaining high levels of hydrolytic enzymes.// Prep.Biochem. -1991. -V.21, т.- P. 237-256.

130. Kato Y. High-performance hydrophobic interaction chromatography of proteins. Advances in chromatography// Eds. Giddings J.C., Grashka E., Brown P.K. New York, Basel: Marcel Dekker Inc., 1987. - V.26. - P.97-115.

131. Khng Hwee Peng, Cimfiffe В., Davies S., Turner N.A., Vulfson E.N. Hie synthesis of sub-micron magnetic particles and their use for preparative purification of proteins.// Biotechnol. and Bioeng., 1998. V.60, №4. - P. 419-424.

132. Kolbanovskaya E.Yu., Satfryanarayana B.K., Wlodaver A., Karpeisky M.Ya. Intramolecular interactions in pancreatic ribonucleases.// Protein Science, 1992. -V.l.-P. 1050- 1060.

133. Melander W., Horvath C. Salts effects on hydrophobic interaction in precipitation and chromatography of proteins.// Arch. Biochem. Biophys., 1977. V.183. -P.200-215.

134. Moore S., Stein W.H. Chemical structure of pancreatic ribonuclease and deoxyribonuclease.// Science, 1973. V. 180, № 4085,- P. 458-464.

135. Morita T., Sanda A., Takizava Y., Ohgi K., Irie M. Distribution of a kidney acid-ribonuelease-like enzyme and the other ribonucleases in bovine organs and body fluids.//Agr. Biol. Chem., 1987. V.51. - P. 2751-2761.

136. Net Kenneth E. Cooperativity in enzyme function: equilibrium and kinetic aspects.// Meth. in Enzymol.,1980. -V.64. -P. 139-192.

137. Norde W., Zouugrana T. Surface-induced changes in the structure and activity of enzymes physically immobilized at solid/liquid interfaces.// Biotechnol. and Appl. Biochem., 1998. V.28, №2. - P. 133-143.

138. Optimization of Chromatographic Selectivity.// Ed. Peter G. Schoenmakers. -Amsterdam etc., 1986.

139. Paul A.B., Cussler E.L. Bioseparations: Downstream processing for biotechnology. N.Y. etc.: Wiley and Sons, 1988. - XVI, 368 p.

140. Petebauer Z., Lukas J., Svec F., Kadal J. Morphology of polymeric sorbents based on glyeidyl methacrylate copolymers.// J. Chromatogr., 1979. V. 171, №1. -P. 101-107.

141. Proteases and antiproteases.// American J. of respiratory and critical care medicine. V. 150, №6. - P.2.

142. Protein Missassemhly.// Ed. by R.Wetzel. San Diego etc.: Academic Press, 1997. - XX, 282 p.

143. Ravindranath B. Principles and practice of chromatography. Chichester: Horwood; N.Y. etc.: Halsted Press, 1989. - 502 p.

144. Recovery and Purification of Byproducts.// Ed. M.-R.Kula, Steven M. Cramer. -N.Y. etc.: Wiley, 1995. P. 301-427, 429-555.

145. Richards F.M., Wichoff H.G. Bovine pancreatic ribonuclease.// The Enzymes/ Ed. Boyer P.D. New York: Academic Press, 1971. - V.4. - P. 647-806.

146. Richards F.M., Wichoff H.G. Atlas of molecular structures in biology. Oxford: Clarendon Press, 1973. - V. 1. - 369 p.

147. Sewell P.A., Clarke B. Chromatographic separations. London: Chichester etc.: Wiley and sons on behalf of ACOL, Thames Polytechnic, 1987. - XX, 333 p.

148. Svec F., Frechet J.M.J. Modified poiy(glycidyl methaciylate-co-ethylene dimethaeiylate) continuous rod columns for preparative scale ion-exchange chromatography of proteins.// J. Chromatogr., 1995. V.702A. - P.89-95.

149. Tanford C. The hydrophobic effect. Formation of micelles and biological membranes. N. Y.: Willey-Interscience, 1973. - 200 p.

150. Tennfkova T.B., Svec F.// J. Chromatogr., 1992. V.590. - P.353.

151. Ultrafiltration, Membranes and Application.// Ed. by A. Cooper. N.Y.: Plenum Press, 1980. -705 p.

152. Wang Q.C., Svec I ., Frechet J.M.J. Rod of macroporous polymers stationary phase as continuous separation medium for reversed phase chromatography.// Anal. Chem., 1993. V.65. - P.2243-2248.

153. Wang Q.C., Svec F., Frechet J.M.J. Reversed-phase chromatography of small molecules and peptides on a continuous rod of macroporous poly(styrene-co-divinylbenzene).// J. Chromatogr., 1994. V.669. - P.230-235.

154. Wfodawer A. In: Biological Macromolecules and Assemblies. V.2: Nucleic Acids and Interactive Proteins./ Ed. A. McPherson, F. Jurnak. N.Y.: Wiley and Sons, 1985.-P. 395-439.

155. Wolf M., Ransberger K. Enzyme-therapy.- New York: Vantage Press, 1972. -232 p.

156. Zegers I., Maes D., Dao-TM M.-H., Poortmans F., Palraer R., Wyns L. Thestructures of Rnase A complexed with 3-CMP and d(CpA): active site conformation and conserved water molecules.// Protein Sci., 1994. V.3. - P. 2322-2339.

157. По данной технологии получена субстанция фермента с удельной активностью 15000-18000 Ед/мг.

158. Показано , что сорбционная технология является перспективной .так как:

159. Уменьшается время технологического цикла очистки производственного высола рибонуклеазы в 5 раз;

160. Сокращаются потери целевого продукта и увеличивеатся съем фермента с единицы сырья в 3.7-4 раза;

161. Увеличивается удельная активность препарата в 2 раза.

162. К.х.н.,доцент СПХФА Глазова Н.В.1. Шенгер А.А.