Получение и характеристика устойчивых к патогенам трансгенных растений с повышенной биобезопасностью тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Лебедева, Анна Александровна

• Лебедева, Анна Александровна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лебедева, Анна Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и механизм действия антимикробных пептидов

1.1.1. Классификация антимикробных пептидов

1.1.2. Механизм действия антимикробных пептидов

1.1.3. Терапевтическое применение антимикробных пептидов

1.1.4. Некоторые особенности антимикробного пептида цекропина Р1

1.2. Применение генов антимикробных пептидов для создания трансгенных растений

1.3. Стратегии создания биобезопасных безмаркерных растений

1.3.1. Котрансформация маркерного и целевого генов

1.3.2. Получение безмаркерных растений с использованием транспозонов

1.3.3. Применение систем сайт-специфической рекомбинации для эксцизии маркерных генов из генома трансгенных растений

1.3.4. Методы трансформации без использования селективных

маркеров

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования и оборудование

2.2. Реактивы, растворы и ферменты

2.3. Микробиологические среды

2.4. Среда для культивирования растений

2.5. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.6. Получение генетических конструкций для трансформации растений

2.7. Регенерация побегов рапса

2.8. Клональное микроразмножение и регенерация побегов каланхоэ

2.9. Агробактериальная трансформация растений

2.10. Трансформация растений методом вакуумной агроинфильтрации

2.11. Контроль наследования трансгенов

2.12. Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.13. Приготовление компетентных клеток А^оЪа^епит Ште/аЫет

и их трансформация

2.14. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле

2.15. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.16. Выделение суммарной растительной ДНК для ПЦР-анализа

2.17. Анализ геномной ДНК трансгенных растений методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.18. Выделение белка из растений

2.19. Электрофорез белка в трицин/8Б8 ПААГе

2.20. Вестерн-блот анализ

2.21. Элюция ДНК из агарозного геля

2.22. Элюция ДНК из полиакриламидного геля

2.23. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр из колоний на чашках

2.24. Получение радиоактивно меченых препаратов ДНК

2.25. Гибридизация на фильтрах по Саузерну

2.26. Колонизация трансгенных растений ассоциативными микроорганизмами

2.27. Тестирование растений на стабильность присутствия ассоциативных микроорганизмов после колонизации

2.28. Определение уровня экспрессии цекропина Р1 методом ингибирования роста клеток в жидкой среде

2.29. Определение антибиотической активности экстрактов трансгенных растений методом радиальной диффузии

2.30. Биотесты по определению устойчивости трансгенных растений к фитопатогенным микроорганизмам

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Получение генетических конструкций с искусственным геном антимикробного пептида цекропина Р1

3.2. Получение трансгенных растений с рекомбинантным вектором рОА482::сесР1 и их молекулярно-генетический анализ

3.2.1. Получение и анализ трансгенных растений рапса и картофеля

3.2.2. Получение и анализ трансгенных растений каланхоэ перистого с геном цекропина Р1

3.3. Получение трансгенных растений рапса с рекомбинантным вектором рРСУ91::сесР1 с четырехкратным промотором СаМУ 358

3.4. Получение безмаркерных трансгенных растений

с геном цекропина Р1

3.5. Исследование совместимости цекропин Р1-содержащих растений

с полезными ассоциативными микроорганизмами

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМП - антимикробные пептиды

Ы350 - половинная летальная доза (доза, приводящая к гибели 50%

испытуемых организмов за определенный срок)

кДа - килодальтон

ПААГ - полиакриламидный гель

п.н. - пара нуклеотидов

т.п.н., кЬ - тысяча пар нуклеотидов

ОПбоо - оптическая плотность при длине волны 600 нм

ПЦР - полимеразная цепная реакция

сесР1 - ген цекропина Р1

прШ - ген неомицинфосфотрансферазы II

МС - среда Мурасиге-Скуга

ЬВ - среда Ьина-ВеПаш

8Э8 - додецилсульфат натрия

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ДТТ - дитиотреитол

РМ8Б - фенилметилсульфонилфторид

БФС - бромфеноловый синий

ВМЦК - вирус мозаики цветной капусты

БСА - бычий сывороточный альбумин

ИУК - индолилуксусная кислота

ИМК - (З-индолил-З-масляная кислота

БАП - 6-бензиламинопурин

НУК - нафтилуксусная кислота

Тг - тиракциллин

Кш - канамицин

К^ - гигромицин

СГ - цефотаксим

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и характеристика устойчивых к патогенам трансгенных растений с повышенной биобезопасностью»

ВВЕДЕНИЕ

Современные методы генетической инженерии позволяют придавать растениям новые свойства, способствующие повышению устойчивости растений к фитопатогенным микроорганизмам. Устойчивые трансгенные растения повышают качество сельскохозяйственной продукции и одновременно снижают расход пестицидов, улучшая экологическую обстановку. Создавая такие растения необходимо, с одной стороны, обеспечить специфичность действующего начала и избежать развития

и и /П

устойчивости к нему у организмов-мишенеи. С другой стороны, вводимые в растения защитные факторы не должны снижать жизнеспособности и биологической продуктивности растений и тем самым нарушать агротехнические характеристики сортов. Эти задачи, являясь во многом взаимоисключающими, заставляют постоянно расширять спектр исследуемых генов, предназначенных для введения в растения путём трансгенеза. Поэтому создание трансгенных растений, экспрессирующих гены новых антимикробных пептидов, остается актуальной задачей. Цекропин Р1 никогда ранее не применялся для исследования возможности создания трансгенных растений устойчивых к микробным патогенам. В нашей работе впервые был использован искусственный ген, кодирующий зрелую форму цекропина Р1, для трансформации важных сельскохозяйственных культур рапса и картофеля, а также каланхоэ перистого, применяемого в фармакологии.

В развитии биотехнологий создания трансгенных растений остается немало нерешенных проблем. Наиболее серьезной из них является озабоченность широкой общественности проблемой биобезопасности трансгенных растений. Традиционный способ получения трансгенных растений основан на применении конститутивно экспрессируемых селективных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам или генов-репортеров. Однако после завершения скрининга трансгенных растений

присутствие в их геноме маркерных генов становится бесполезным и даже потенциально опасным. За счет переопыления и горизонтального переноса генетического материала возможно неконтролируемое распространение селективных генов в природных популяциях растений или микроорганизмов. Такая возможность переноса селективных генов в последние годы воспринимается как основная проблема потенциальной биологической опасности генетически модифицированных растений. В связи с этими рисками разработка эффективных подходов к созданию безмаркерных трансгенных растений с повышенной биобезопасностью представляет собой актуальную задачу генетической инженерии.

Целью настоящей работы явилось получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных растений рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, в том числе с повышенной биобезопасностью, экспрессирующих искусственный ген зрелой формы антимикробного пептида цекропина Р1.

Для достижения указанной цели решали следующие задачи:

1. Создание векторных конструкций для переноса искусственного гена зрелой формы антимикробного пептида цекропина Р1 в растения.

2. Получение трансгенных растений рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующих ген цекропина Р1.

3. Сравнение уровня экспрессии цекропина Р1 в трансгенных растениях под контролем различных промоторов.

4. Получение биобезопасных трансгенных растений с повышенной устойчивостью к микробным фитопатогенам без применения селективных генов для скрининга трансформантов.

5. Молекулярно-генетический и физиолого-биологический анализ полученных трансгенных растений.

6. Исследование экологической безопасности полученных трансгенных растений.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Лебедева, Анна Александровна

выводы

1. Сконструирован рекомбинантный вектор pPCV91::cecPl для экспрессии зрелой формы пептида цекропина PI под промотором 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S) с четырьмя энхансерами.

2. Получены трансгенные растения рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующие ген антимикробного пептида цекропина PI под различными промоторами CaMV 35S.

3. В растениях уровень экспрессии гена цекропина PI под промотором CaMV 35S с четырьмя энхансерами был более чем в 10 раз выше, чем под этим одинарным промотором.

4. С целью повышения биобезопасности трансгенных растений получен рекомбинантный вектор рВМ::сесР1 и разработан метод получения безмаркерных растений, основанный на иммунологической детекции пептида цекропина PI.

5. Проведен молекулярно-генетический и физиолого-биологический анализ полученных трансгенных растений. Показана повышенная устойчивость трансгенных растений к бактериальным (Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae) и грибным {Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium sporotrich, Phytophthora infestans) фитопатогенам.

6. Проведено исследование экологической безопасности полученных трансгенных растений. Показано сохранение способности трансгенных растений к колонизации полезными ассоциативными микроорганизмами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные методы генетической инженерии позволяют придавать растениям новые свойства, способствующие повышению их устойчивости к фитопатогенным микроорганизмам. В развитии методологии повышения устойчивости трансгенных растений важное место занимают гены антимикробных пептидов. Однако, использовавшиеся ранее для этой цели гены АМП, до сих пор имели ограниченный успех. Поэтому создание трансгенных растений, экспрессирующих гены новых антимикробных пептидов, остается актуальной задачей. Цекропин Р1 никогда ранее не применялся для исследования возможности создания трансгенных растений устойчивых к микробным патогенам. В нашей работе впервые был использован искусственный ген, кодирующий зрелую форму цекропина Р1, для трансформации важных сельскохозяйственных культур рапса и картофеля, а также каланхоэ перистого, применяемого в фармакологии.

Для трансформации растений были сконструированы генетические конструкции с целевым геном цекропина Р1 под различными промоторами: рекомбинантный вектор рРСУ91::сесР1, в котором ген сесР1 клонирован под модифицированный промотор 358 РНК вируса мозаики цветной капусты СаМУ 358 с четырьмя энхансерами, и рекомбинантный вектор рВМ::сесР1, не содержащий селективных генов для скрининга трансформантов, в котором ген сесР! клонирован под контролем одинарного промотора СаМУ 358.

Кроме того, в работе для трансформации растений использовали ранее полученную в лаборатории конструкцию рОА482::сесР1, содержащую ген сесР! под одинарным промотором СаМУ 358 и маркерный ген неомицинфосфотрансферазы II {прй1) (Захарченко и др., 2005).

Трансформацию проводили двумя методами: кокультивацией эксплантов с агробактериями и с помощью вакуумной агроинфильтрации семян. Было показано, что использование метода агроинфильтрации приводило к более высокой эффективности трансформации растений. Так частота трансформации рапса вектором pGA482::cecPl с помощью метода кокультивации составляла 7% от общего числа культивируемых эксплантов, в то время как с помощью вакуумной агроинфильтрации была на уровне 14%. Для увеличения уровня экспрессии гена цекропина PI в растениях рапса использовали векторы с разным содержанием проморных областей. Уровень синтеза цекропина PI в растениях с геном cecPl под 4-х кратным промотором CaMV 35S был более чем в 10 раз выше, чем под этим одинарным промотором и составил 0.03% от общего содержания белка листьев.

Трансгенные растения с геном cecPl под промотором CaMV 4x35S обладали более высокой устойчивостью к штаммам Е. carotovora В15, Р. syringae, S. sclerotiorum по сравнению с растениями с геном cecPl под промотором CaMV 1X35S, что связано с более высоким уровнем синтеза антимикробного пептида цекропина PI.

В настоящее время в большинстве конструкций для трансформации растений в качестве маркерных последовательностей используются гены устойчивости к антибиотикам и гербицидам, которые позволяют производить селекцию генетически модифицированных растений. Такие конструкции представляют существенную потенциальную биологическую и экологическую опасность, связанную с неконтролируемым переносом этих генов другим растениям и микроорганизмам. Совершенствование методов генетической инженерии позволяет получать трансгенные растения с повышенной биобезопасностью, без селективных маркерных генов.

С целью повышения биобезопасности трансгенных растений в настоящей работе разработан способ получения безмаркерных трансгенных растений, содержащих ген cecPl. Скрининг трансгенных растений проведен на основе прямой иммунологической детекции цекропина PI в клеточных экстрактах, что значительно сокращает время получения трансгенных растений. По результатам безмаркерного скрининга трансформантов рапса с помощью прямой иммунодетекции цекропина PI максимальная частота трансформации безмаркерным вектором рВМ с геном цекропинаР1 выше, чем при трансформации другими векторами, и составила 17.6%. Вероятно, это связано с тем, что переносимая в растения область Т-ДНК рекомбинантного вектора рВМ::сесР1 укорочена на 2600 п.н. за счет элиминации гена nptll вместе с его промотором и сигналом полиаденилирования, что дает преимущества при трансформации растений. Это может снизить нежелательный эффект длинных векторных последовательностей на плотность их упаковки в хроматин и, соответственно, на экспрессию целевого гена. Имеются данные о повышении экспрессии трансгенов в случае трансформации клеток безвекторными генетическими конструкциями (Etchberger & Hobert, 2008).

Разработанный метод позволяет снизить продолжительную антибиотическую или гербицидную стрессовую нагрузку на растения в процессе отбора трансформантов на селективных средах. У растений, подвергнутых селективному стрессу, ДНК подвергается гиперметилированию, что может приводить к "замолканию" или снижению экспрессии целевых генов (Shmit et al., 1997; Захарченко и др., 2000). Известно, что процесс генетической трансформации растений с отбором трансформантов в условиях селективного стресса сопровождается "замолканием" трансгенов с частотой до 30-60% (Kim et. al., 1998). Скрининг трансгенных растений на бесстрессовой среде (без добавления антибиотиков) создает условия для нормального роста и развития растений без аномального метилирования их генома. Следует отметить, что при использовании метода прямой детекции целевого продукта в трансгенных растениях возможен одновременный отбор линий с его максимальным синтезом. Это подтверждалось наследованием признака в Т]-поколении с расщеплением 3:1, что свидетельствует о встраивании одной копии гена. Показан стабильный синтез цекропина Р1 в растениях поколения Т, Кроме того, данный метод не требует удаления селективных маркерных генов в потомстве, поэтому он пригоден для получения растений, размножающихся вегетативно, а также для древесных растений с длительным циклом развития.

Полученные трансгенные растения рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующие синтетический ген цекропина PI обладали повышенной устойчивостью против бактериальных - Erwinia carotovora, Pseudomonas syringae и грибных - Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium sporotrich фитопатогенных микроорганизмов.

Проведенное исследование устойчивости экстрактов трансгенных растений каланхоэ к высокой температуре и длительному хранению показало сохранение антибактериальной активности после 5-15 минут кипячения и хранения экстрактов в течение месяца при +4°С.

В целях изучения экологической безопасности полученных растений и исследования их способности к колонизации ассоциативными полезными микроорганизмами проведена колонизация растений штаммами Pseudomonas putida и Methylovorus mays. Ранее мы исследовали взаимодействие с растениями этих бактерий. Они устанавливают с растениями прочную ассоциативную связь и сохраняют ее на протяжении многократных пассажей при клональном микроразмножении, благоприятно влияя на ростовые и другие физиологические параметры растений (Захарченко и др., 2012). Микробиологический анализ тканей трансгенных растений, экспрессирующих ген cecPl, показал, что такие растения сохраняют способность к колонизации бактериями Р. putida и М. mays и образованию с ними стабильной ассоциации. Различный эффект содержания цекропина PI в трансгенных растениях на их взаимодействие с фитопатогенными и полезными ассоциативными микроорганизмами, по-видимому, связан с локализацией псевдомонад и метилобактерий в растении. Ассоциативные микроорганизмы находятся в межклетниках и не разрушают растительную клеточную мембрану, в отличие от фитопатогенных микроорганизмов, которые обладают ферментативным комплексом для разрушения растительных клеток. Поэтому синтезируемый в растительных клетках цекропин Р1 не контактирует с ассоциативными бактериями и не вызывает их лизис. Трансгенные растения, высаженные в теплицу, сохраняли все признаки контрольных растений и давали фертильные семена.

Таким образом, в данной работе получены трансгенные растения рапса масличного, картофеля и каланхоэ перистого, экспрессирующих ген антимикробного пептида цекропина Р1, в том числе растения не содержащие селективных маркерных генов устойчивости к антибиотикам и гербицидам. Безмаркерные цекропин Р1-содержащие растения удовлетворяют требованиям повышенной биобезопасности и могут найти практическое применение в сельском хозяйстве.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лебедева, Анна Александровна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бурьянов Я.И., Захарченко Н.С., Юхманова A.A., Пиголева C.B., Рукавцова Е.Б., Чеботарева E.H., Гаязова А.Р. Рекомбинантная плазмида рВМ и способ получения с ее использованием безмаркерных трансгенных растений, синтезирующих целевые продукты. Патент № 2410433 (РФ) // Б.И. 2011. №3.

2. Доронина Н.В., Кудинова Л.В., Троценко Ю.А. Methylovorus mays-новый вид аэробных облигатных метилобактерий, ассоциированных с растениями//Микробиология. 2000. Т. 69. С. 712-716.

3. Захарченко Н.С., Каляева М.А., Бурьянов Я.И. Техника генетической трансформации разных сортов сахарной свеклы // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 79-85.

4. Захарченко Н.С., Рукавцова Е.Б., Гудков А.Т., Бурьянов Я.И. Использование синтетического гена антимикробного пептида цекропина PI для повышения устойчивости растений к фитопатогенным бактериям // Генетика. 2005. Т. 41. № 11. С. 1445-1452.

5. Захарченко Н.С., Пиголева C.B., Кочетков В.В., Чепурнова М.А., Дьяченко О.В., Лебедева A.A., Захарченко A.B., Пунтус И.Ф., Воронин A.M., Бурьянов Я.И. Влияние ассоциативных псевдомонад и метилобактерий на рост и устойчивость растений к фитопатогенам и ксенобиотикам // Физиология растений. 2012. № 1. Т. 59. С. 89-98.

6. Зверева С.Д. и Романов Г.А. Репортерные гены для генетической инженерии растений: характеристика и методы тестирования // Физиология растений. 2000. Т. 47. С. 479-488.

7. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Мордухова Е.А., Воронин A.M. Плазмиды биодеградации нафталина в ризосферных бактериях рода Pseudomonas // Микробиология. 1997. Т. 66. С. 211-216.

8. Лазарев В.Н., Говорун В.М. Антимикробные пептиды и их применение в медицине // Биотехнология. 2010. № 3. С. 11-25.

108

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир. 1984. 480 с.

10. Рукавцова Е.Б., Захарченко Н.С., Пиголева С.В., Юхманова А.А., Чеботарева Е.Н., Бурьянов Я.И. Получение безмаркерных трансгенных растений // Доклады Академии наук. 2009. Т. 426. № 2. С. 261-264.

11. Сахно Л.А., Гочева Е.А., Комарницкий И.К., Кучук Н.В. Стабильная экспрессия беспромоторного гена bar в трансформированных растениях // Цитология и генетика. 2008. Т. 42. № 1. С. 21-28.

12. Степанова А.Ю., Терешонок Д.В., Гладков Е.А., Долгих Ю.И. Осипова Е.С. Получение трансгенных растений пшеницы {Triticum aestivum L.) методом агробактериальной трансформации // Биотехнология. 2006. № 2. С. 20-27.

13. Agerberth В., Boman A., Andersson М., Jornvall Н., Mutt V., Boman H.G. Isolation of three antibacterial peptides from pig intestine-gastric inhibitory polypeptide (7-42), diazepam-binding inhibitor (32-86) and a novel factor, peptide- 3910 //Eur. J. Biochem. 1993. V. 216. P. 623-629.

14. An G., Watson B.D., Stachel S. et al. New cloning vehicles for transformation of higher plants // EMBO J. 1985. V. 4. P. 277-288.

15. Angenon G., Dillen W., van Montagu M. Antibiotic-resistance markers for plant transformation // Plant molecular biology manual / Eds. Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1994. CI. P. 1-13.

16. Balestrazzi A., Botti S., Zelasco S., Biondi S. et al. Expression of the PsMTAl gene in white poplar engineered with the MAT system is associated with heavy metal tolerance and protection against 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine mediated-DNA damage // Plant Cell Rep. 2009. V. 28. P. 1179-1192.

17. Bechinger B. Structure and functions of channel-forming peptides: magainins, cecropins, melittin and alamethicin // J. Membr. Biol. 1997. V. 156. № 3. P. 197-211.

18. Bechtold D., Ellis J., Pelletier G. In planta agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants // C.R. Acad. Sci., LifeSci. 1993. V. 316. P. 1194-1199.

19. Bhatnagar M., Prasad K., Bhatnagar-Mathur P., Narasu M.L., Waliyar F., Sharma K.K. An efficient method for the production of marker-free transgenic plants of peanut (Arachis hypogaea L.) // Plant Cell Rep. 2010. V. 29 P. 495502.

20. Boekaert W.F., Terras F.R., Cammue B.P., Osborn R.W. Plant defensins: nove antimicrobial peptides as components of the host defense system // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1353-1358.

21. Boman H.G. Cecropin: antibacterial peptides from insects and pigs // In J. Hoffman and S. Natori (ed.). Phylogenetic Perspectives in Immunity: The Insect Host Defense. Austin. 1994. P. 24-37.

22. Boman H.G. Peptides antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev. Immunol. 1995. V. 13. P. 61-92.

23. Boman H.G. Innate immunity and the normal microflora // Immunol. Rev. 2000. V. 173. P. 5-16.

24. Bradford M.M. A rapid and sensitive method of the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

25. Bulet P., Dimarcq J.L., Hetru C., Lagueux M. et al. A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosylated substitution // Journal of Biological Chemistry. 1993. V. 268(20). P. 14893-15897.

26. Cao B., Huang Z., Chen G., Lei J. Restoring pollen fertility in transgenic male-sterile eggplant by Cre//oxP-mediated site-specific recombination system // Genet. Mol. Biol. 2010. V. 33. P. 298-307.

27. Charity J.A., Holland L., Donaldson S.S., Grace L., Walter C. Agrobacterium-mediated transformation of Pinus radiata organogenic tissue using vacuum-infiltration // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 2002. V. 70. P. 51-60.

28. Chen L., Marmey P., Taylor N.J. et al. Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants // Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 1060-1064.

29. Chiang Y.C., Kiang Y.T. Genetic analysis of mannose-6-phopsphate isomerase in soybeans // Genome. 1988. V. 30. P. 808-811.

30. Coppoolse E.R., Vroomen M.J., Roelofs D. et al. Cre recombinase expression can result in phenotypic aberrations in plants // Plant Mol. Biol. 2003. V. 51. P. 263-279.

31. Cotsaftis O., Sallaud C., Breitler J.C., Meynard D., Greco R., Pereira A., Guiderdoni E. Transposon-mediated generation of T-DNA and marker-free rice plants expressing a Bt endotoxin gene // Mol. Breeding. 2002. V. 10. P. 165180.

32. Cuellar W., Gaudin A., Solorzano D. et al. Self-excision of the antibiotic resistance gene nptll using a heat inducible Crq-IoxP system from transgenic potato // Plant Mol. Biol. 2006. V. 62. P. 71-82.

33. Cui M., Takayanagi K., Kamada H., Nishimura S., Handa T. Efficient shoot regeneration from hairy roots of Antirrhinum majus L. transformed by rol type MAT vector system // Plant Cell. Rep. 2001. V. 20. P. 60-66.

34. Dagan A., Efron L., Gaidukov L., Mor A., Ginsburg H. In vitro antiplasmodium effects of dermaseptin S4 derivatives // Antimicrob. Agents Chemother. 2002. V. 46. P. 1059-1066.

35. Damgaard O., Jensen L.H., Rasmussen O.S. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Brassica napus winter cultivars. Transgenic Research. 1997. V. 6. P. 279-288.

36. Dale E. and Ow D. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991. V. 88. P. 10558-10562.

37. Dale P.J., Clarke B., Fontes E.M.G. Potential for the environmental impact of transgenic crops // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. P. 567-574.

38. Daley M., Knauf V.C., Summerfelt K.R., Turner J.C. Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a

ill

method for producing marker-free transgenic plants // Plant Cell. Rep. 1998. V. 17. P. 489-496.

39. DeBlock M., Debrouwer D. Two T-DNA's co-transformed into Brassica napus by a double Agrobacterium tumefaciens infection are mainly integrated at the same locus // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 82. P. 257-263.

40. Depicker A., Herman L., Jacobs A., Schell J., Van Montagu M. Frequencies of simultaneous transformation with different T-DNAs and their relevance to the Agrobacterium/plant cell interaction // Mol. Gen. Genet. 1985. V. 201. P. 477^184.

41. De Vetten N., Wolters A.M., Raemakers K., van der Meer I. et al. A transformation method for obtaining marker-free plants of a cross-pollinating and vegetatively propagated crop // Natur Biotechnol. 2003. V. 21. P. 439-442.

42. Diamond G, Beckloff N, Weinberg A, Kisich K.O. The roles of antimicrobial peptides in innate host defense // Curr. Pharm. Des. 2009. V. 15. №21. P. 2377-2392.

43. Dong Y, Zhang Y., Yi L., Lai H., Zhang Y, Zhou L., Wang P. Transformation of antimicrobial peptide fusion gene of cecropin B and rabbit NP-1 to Houttuynia cor data // Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2010. V. 35. P. 1660-1665.

44. Draper J., Scott R., Hamil J. Plant genetic transformation and gene expression. A laboratory manual // Eds Draper J., Scott R., Armitage P., WaldenR. Oxford: Blackwell Sci. Publ. 1988. P. 69-160.

45. Durell S.R., Raghunathan G., Guy H.R. G., Guy H.R. Modeling the ion channel structure of cecropin // Biophys. J. 1992. V. 63. P. 1623-1631.

46. Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E., Yamakado M. Selection of markerfree transgenic plants using the isopentyl transferase gene // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997a. V. 94. P. 2117-2121.

47. Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E., Yamakado M., Komamine A. Principle of MAT vector // Plant Biotechnol. 1997b. V. 14. P. 133-139.

48. Ebinuma H., Komamine A. MAT (multiauto-transformation) vector system. The oncogenes of Agrobacterium as positive markers for regeneration and selection of marker-free transgenic plants // In Vitro Cell Dev. Biol.-Plant. 2001. V. 37, P. 103-113.

49. Ebinuma H., Sugita K., Matsunaga E., Endo S., Yamada K., Komamine A. Systems for the removal of a selection marker and their combination with a positive marker // Plant Cell. Rep. 2001. V. 20. P. 383-392.

50. Edwards K., Johnstone C., Thompson C. A Simple and Rapid Method for the Preparation of Plant Genomic DNA for PCR Analysis // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

51. Endo S., Sugita K., Sakai M., Tanaka H., Ebinuma H. Single-step transformation for generating marker-free transgenic rice using the ipt-type MAT vector system // Plant J. 2002. V. 30. P. 115-122.

52. Etchberger J.F., Hobert O. Vector-free DNA constructs improve transgene expression in C. elegans II Nat. Methods. 2008. V. 5. P. 3.

53. Fladung M., Becker D. Targeted integration and removal of transgenes in hybrid aspen {Populus tremula L. x P. tremuloides Michx.) using site-specific recombination systems // Plant Biol. (Stuttg). 2010. V. 12. P. 334-340.

54. Florack D., Allefs S., Bollen R., Bosch D., Visser B., Stiekema W. Expression of giant silkmoth cecropin B genes in tobacco // Transgenic Res. 1995. V. 4. P. 132-141.

55. Frank R.W., Gennaro R., Schneiderr K., Przybylski M., Romeo D. Aminoacid sequences of 2 proline-rich bactenecins - antimicrobial peptides of bovine neutrophils // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 18871-18874.

56. Frisch D.A., Harris-Haller L.W., Yokubaitis N.T. et al. Complete sequence of the binary vector Bin 19 // Plant Mol. Biol. 1995. V. 27. P. 405-409.

57. Gallie D.R., Kado C.I. A translational enhancer derived from tobacco mosaic virus is functionally equivalent to a Shine-Dalgarno sequence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 129-132.

58. Ganz T., Lehrer R.I. Antibiotic peptides from higher eukaryotes: biology and applications // Mol. Med. Today. 1999. V.5. P.292-297.

59. Ganz T. Immunology. Versatile defensins. // Science. 2002. V. 298. № 5595. P. 977-979.

60. Ganz T. Antimicrobial polypeptides in host defense of the respiratory tract // J. Clin. Invest. 2002. V. 109. P. 693-697.

61. Gao A.G., Hakimi S.M., Mittanck C.A., Wu Y., Woerner B.M., Stark D.M., Shah D.M., Liang J., Rommens C.M. Fungal pathogen protection in potato by expression of a plant defensin peptide // Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 13071310.

62. Gazit E., Lee W.J., Brey P.T., Shai Y. Mode of action of the antibacterial cecropin B2: a strectrofluorometric study // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 10681-10692.

63. Gazit E., Boman A., Boman H.G., Shai Y. Interaction of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI with phospholipid vesicles // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 11479-11488.

64. Gazit E., Miller I.R., Biggin P.C., Sansom M.S.P., Shai Y. Structure and orientation of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI within phospholipids membranes // J. Mol. Biol. 1996. V. 258. P. 860-870.

65. Gennaro R., Zanetti M. Structural features and biological activities of the cathelicidin-derived antimicrobial peptides // Biopolymers. 2000. V. 55. № 1. P. 31-49.

66. Gergen J.P., Stern R.H., Wensink P.S. Filter replicas and permanent collections of recombinant DNA plasmids // Nucleic. Acids Res. 1979. V. 7. P. 2115-2136.

67. Gleave A.P., Mitra D.S., Mudge S.R., Morris B.A. Selectable marker-free transgenic plants without sexual crossing: transient expression of ere recombinase and use of a conditional lethal dominant gene // Plant Mol. Biol. 1999. V. 40. P. 223-235.

68. Goldsbrough A.P., Lastrella C.N., Yoder J.I. Transposition mediated repositioning and subsequent elimination of marker genes from transgenic tomato //Biotechnology. 1993. V. 11. P. 1286-1292.

69. Gorbunova V., Levy A.A. Analysis of extrachromosomal Ac/Ds transposable elements // Genetics. 2000. V..155. P. 349-359.

70. Gordon Y.J., Romanowski E.G., McDermott A.M. A review of antimicrobial peptides and their therapeutic potential as anti-infective drugs // Curr. Eye. Res. 2005. V. 30. P. 505-515.

71. Hadi M.Z., McMullen M.D., Finer J.J. Transformation of 12 different plasmids into soybean via particle bombardment // Plant Cell. Rep. 1996. V. 15. P. 500-505.

72. Hanahan D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids // J. Mol. Biol. 1983. V. 166. P. 557-80.

73. Hancock R.E. Antibacterial peptides and the outer membranes of gramnegative bacilli // J. Med. Microbiol. 1997. V. 46. P. 1-3.

74. Hancock R.E., Lehrer R. Cationic peptides: a new source of antibiotics // Trends Biotechnol. 1998. V. 16. P. 82-88.

75. Hare P.D., Chua N.-H. Excision of selectable marker genes from transgenic plants // Nat. Biotechnol. 2002. V. 20. P. 575-580.

76. Hererra-Estrella L., Leon P., Olsson O., Teeri T.H. Reporter genes for plants // Plant molecular biology manual / Eds. Gelvin S.B., Schilperoort R.A. Dordrecht: Kluwer Acad. Publ., 1994. V. 1. P. 1-32.

77. Hoa T.T.C., Bong B.B., Huq E., Hodges T.K. Cre-lox site-specific recombination controls the excision of a transgene from the rice genome // Theor. Appl. Genet. 2002. V. 104. P. 518-525.

78. Hoff T., Schnorr K.M., Mundy J. A recombinase-mediated transcriptional induction system in transgenic plants // Plant Mol. Biol. 2001. V. 45. P. 41-49.

79. Hohn B., Levy A.A., Puchta H. Elimination of selection markers from transgenic plants // Curr. Opin. Biotechnol. 2001. V. 12. P. 139-143.

80. Honma M.A., Baker B.J., Waddell C.S. High-frequency germinal transposition of DsALS in Arabidopsis II Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1993. V. 90. P. 6242-6246.

81. Jia H., Pang Y., Chen X., Fang R. Removal of the selectable marker gene from transgenic tobacco plants by expression of Cre recombinase from a tobacco mosaic virus vector through agroinfection // Transgenic Res. 2006. V. 15. P. 375-384.

82. Kapila J., Riet De Rycke, Marc Van Montagu, Geert Angenon. An Agrobacterium-mediatQd transient gene expression system for intact leaves // Plant Science. 1997. V. 122. P. 101-108.

83. Kay E., Vogel T.M., Bertolla F., Nalin R., Simonet P. In situ transfer of antibiotic resistance genes from transgenic (transplastomic) tobacco plants to bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2002. V. 68. P. 3345-3351.

84. Kebrach S., Lorz H., Becker D. Site-specific recombination in Zea mays // Theor. Appl. Genet. 2005. V. 111. P. 1608-1616.

85. Khan R.S., Nakamura I., Mii M. Development of disease-resistant markerfree tomato by R/RS site-specific recombination // Plant Cell Rep. 2011. V. 30. P. 1041-1053.

86. Kilby N.J., Davies G.J., Snaith M.R. FLP recombinase in transgenic plants: constitutive activity in stably transformed tobacco and generation of marked cell clones in Arabidopsis // Plant J. 1995. V. 8. P. 637-652.

87. Kim Y.S., Lee M.H., Min S.R., Yoo O.J., Liu J.R. Frequent occurrence of transgene deletion in transgenic plants // Molecules a. Cells. 1998. V. 8. P. 705708.

88. Komari T., Hiei Y., Saito Y., Murai N., Kumashiro T. Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation for higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers // Plant J. 1996. V. 10. P. 165-174.

89. Koncz C., Shell J. The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector // Mol.Gen.Genet. 1986. V. 204. P. 383-396.

90. Kondrak M., van der Meer I.M., Banfalvi Z. Generation of marker- and backbone-free transgenic potatoes by site-specific recombination and a bi-functional marker gene in a non-regular one-border agrobacterium transformation vector // Transgenic Res. 2006. V. 15. P. 729-737.

91. Kopertekh L., Broer I., Schiemann J. Developmentally regulated site-specific marker gene excision in transgenic B. napus plants // Plant Cell Rep. 2009. V. 28. P. 1075-1083.

92. Kopertekh L., Schulze K., Frolov A., Strack D., Broer I., Schiemann J. Cremediated seed-specific transgene excision in tobacco // Plant Mol. Biol. 2010. V. 72. P. 597-605.

93. Kouzayha A., Nasir M.N., Buchet R., Wattraint O., Sarazin C., Besson F. Conformational and interfacial analyses of K3A18K3 and alamethicin in model membranes // J. Phys. Chem. B. 2009. V. 113. P. 7012-7019.

94. Kumar S., Arul L., Talwar D. Generation of marker-free Bt transgenic indica rice and evaluation of its yellow stem borer resistance // J. Appl. Genet. 2010. V. 51. P. 243-257.

95. Lamblin F., Aime A., Hano C., Roussy I., Domon J.M., Van Droogenbroeck B., Laine E. The use of the phosphomannose isomerase gene as alternative selectable marker for Agrobacterium-medl&tQd transformation of flax (Linum usitatissimum) // Plant Cell Rep. 2007. V. 26. № 6. P. 765-772.

96. Landon C., Meudal H., Boulanger N., Bulet P., Vovelle F. Solution structures of stomoxyn and spinigerin, two insect antimicrobial peptides with an alpha-helical conformation // Biopolymers. 2006. V. 81(2). P.92-103.

97. Lee J.Y., Boman A., Chuanxin S., Andersson M., Jornvall H., Mutt V., Boman H.G. Antibactrial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 9159-9162.

98. Lee J., Park C., Park S.C., Woo E.R. et al. Cell selectivity-membrane phospholipids relationship of the antimicrobial effects shown by pleurocidin enantiomeric peptides // J. Pept. Sci. 2009. V. 15. № 9. P. 601-606.

99. Lehrer R.I., Ganz T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes // Ciba Foundation Symposia. 1992. V. 171. P. 276-290.

100. Lehrer R.I., Lichtenstein A.K., Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells // Annu. Rev. Immunol. 1993. V. 11. P. 105-128.

101. Li Z., Xing A., Moon B.P. et al. A Crdlox P mediated self-activating gene excision system to produce marker gene free transgenic soybean plants // Plant Mol. Biol. 2007. V. 65. P. 329-341.

102. Li B., Li N., Duan X., Wei A., Yang A., Zhang J. Generation of marker-free transgenic maize with improved salt tolerance using the FLP/FRT recombination system // J. Biotechnol. 2010. V. 145. P. 206-213.

103. Lloyd A.M., Davis R.W. Functional expression of the yeast FLP/FRT site-specific recombination system in Nicotiana tabacum // Mol. Gen. Genet. 1994. V. 242. P. 653-657.

104. Lucca P., Ye X., Potrykus I. Effective selection and regeneration of transgenic rice plants with mannose as selective agent // Mol. Breed. 2001. V. 7. P. 43-49.

105. Ludtke S.J., He K., Wu Y., Huang H.W. Cooperative membrane insertion of magainin correlated with its cytolytic activity // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1190. P. 181-184.

106. Luo H., Lyznik L.A., Gidoni D., Hodges T.K. FLP-mediated recombination for use in hybrid plant production // Plant J. 2000. V. 23. P. 423-430.

107. Lyznik L.A., Rao K.V., Hodges T.K. FLP-mediated recombination of FRT sites in the maize genome // Nucleic. Acids Res. 1996. V. 24. P. 3784-3789.

108. Ma B.G., Duan X.Y, Niu J.X, Ma C., Hao Q.N., Zhang L.X., Zhang H.P. Expression of stilbene synthase gene in transgenic tomato using salicylic acid-

inducible Crq/IoxP recombination system with self-excision of selectable marker//Biotechnol. Lett. 2009. V. 31. P. 163-169.

109. Masterson R.V., Furtek D.B., Grevelding C., Schell J. A maize Ds transposable element containing a dihydrofolate reductase gene transposes in Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana II Mol. Gen. Genet. 1989. V. 219. P. 461^166.

110. Matsunaga E., Sugita K., Ebinuma H. Asexual production of selectable marker-free transgenic woody plants, vegetatively propagated species // Mol. Breeding. 2002. V. 10. P. 95-106.

111. Matzke M.A., Matzke A.J.M., Mittelsten-Scheid O. Inactivation of repeated genes: DNA-DNA interaction? // Homologous Recombination in Plants. / Ed. Paszkowski J. Amsterdam: Kluwer Acad. Publ. 1994. P. 271-307.

112. McCormac A.C., Fowler M.R., Chen D.F., Elliot M.C. Efficient co-transformation of Nicotiana tabacum by two independent T-DNAs, the effect of T-DNA size and implications for genetic separation // Trans. Res. 2001. V. 10. P. 143-155.

113. McKnight T.D., Lillis M.T., Simpson R.B. Segregation of genes transferred to one plant cell from two different Agrobacterium strains // Plant Mol. Biol. 1987. V. 8. P. 439-445.

114. Miki B., McHugh S. Selectable marker genes in transgenic plants: applications, alternatives and biosafety // J. Biotechnol. 2004. V. 107. P. 193232.

115. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

116. Nielsen K.M., Bones A.M., Smalla K., Van Elsas J.D. Horizontal gene transfer from transgenic plants to terrestrial bacteria - a rare event? // FEMS Microbiol. Rev. 1998. V. 22. P. 79-103.

117. Normark S., Boman H.G., Matsson E. Mutant of Escherichia coli with anomalous cell division and ability to decrease episomally and chromosomally

mediated resistance to ampicillin and several other antibiotics // J. Bacteriol. 1969. V. 97. P.1334-1342.

118. Ohshima M., Mitruhara I., Okamoto M., Sawano S., Nishiyama K., Kaku H., Natori S., Ohashi Y. Enhanced resistance to bacterial diseases of transgenic tobacco plants overexpressing Sarcotoxin IA, a Bactericidal peptide of insect // J. Biochem. 1999. V. 125. P. 431-435.

119. Onouchi H., Nishihama R., Kudo M., Machida Y., Machida C. Visualization of site-specific recombination catalyzed by a recombinase from Zygosaccharomyces rouxii in Arabidopsis thaliana 11 Mol .Gen. Genet. 1995. V. 247. P. 653-660.

120. Ostberg N., Kaznessis Y. Protegrin structure-activity relationships: using homology models of synthetic sequences to determine structural characteristics important for activity // Peptides. 2005. V. 26. № 2. P. 197-206.

121. Osusky M., Zhou G., Osuska L., Hancock R.E., Kay W.W., Misra S. Transgenic plants expressing cationic peptide chimeras exhibit broad-spectrum resistance to phytopathogens // Nat. Biotechnol. 2000. V. 18. P. 1162-1166.

122. Osusky M., Osuska L., Kay W., Misra S. Genetic modification of potato against microbial diseases: in vitro and in planta activity of a dermaseptin B1 derivative, MsrA2 // Theor. Appl. Genet. 2005. V. 111. P. 711-722.

123. Ow D.W., Medberry S.L. Genome manipulation through site-specific recombination // Crit. Rev. Plant Sci. 1995. V. 14. P. 239-261.

124. Ow D.W. Recombinase-directed plant transformation for the post-genomic era // Plant Mol. Biol. 2002. V. 48. P. 183-200.

125. Ow D.W. GM maize from site-specific recombination technology, what next? // Curr. Opin. Biotechnol. 2007. V. 18. P. 115-120.

126. Palffy R., Gardlik R., Behuliak M., Kadasi L., Turna J., Celec P. On the physiology and pathophysiology of antimicrobial peptides // Mol. Med. 2009. V. 15. P. 51-59.

127. Portieles R., Ayra C., Gonzalez E. et al. NmDef02, a novel antimicrobial gene isolated from Nicotiana megalosiphon confers high-level pathogen

120

resistance under greenhouse and field conditions // Plant Biotechnol. J. 2010. V. 8. P. 678-690.

128. Que Q., Wang H.Y., Jorgensen R.A. Distinct patterns of pigment suppression are produced by allelic sense and antisense chalcone synthase transgenes in petunia flowers // Plant J. 1998. V. 13. P. 401-409.

129. Qiu C., Sangha J., Song F., Zhou Z., Yin A., Gu K., Tian D., Yang J., Yin Z. Production of marker-free transgenic rice expressing tissue-specific Bt gene // Plant Cell Rep. 2010. V. 29. P. 1097-1107.

130. Ramana Rao M.V., Parameswari C., Sripriya R., Veluthambi K. Transgene stacking and marker elimination in transgenic rice by sequential Agrobacterium-mediated co-transformation with the same selectable marker gene //Plant Cell Rep. 2011. V. 30. P. 1241-1252.

131. Saberwall G., Nagaraj R. Cell Lytic antibacterial peptides that act by pertubing the barrier function of membranes: facets of their conformational features, structure - function correlations and membrane perturbing abilities // Biochimica et Biophisica Acta. 1994. V. 1197. P. 109-131.

132. Scaramelli L., Balestrazzi A., Bonadei M., Piano E., Carbonera D., Confalonieri M. Production of transgenic barrel medic (Medicago truncatula Gaernt.) using the ipt-type MAT vector system and impairment of Recombinase-mediated excision events // Plant Cell Rep. 2009. V. 28. P. 197211.

133. Sengupta S., Chakraborti D., Mondal H.A., Das S. Selectable antibiotic resistance marker gene-free transgenic rice harbouring the garlic leaf lectin gene exhibits resistance to sap-sucking planthoppers // Plant Cell. Rep. 2010. V. 29. P. 261-271.

134. Schagger H., Von Jagow G. // Tricine-sodium dodecyl syfate-polyacrilamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa // Analytical biochemistry. 1987. V. 166. P. 368-379.

135. Shi J., Rross C.R., Leto T.L., Blecha F. PR-39, a proline-rich antibacterial peptide that inhibits phagocyte NADPH oxidase activity by binding to Src

121

homology 3 domains of p47 phox // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 6014-6018.

136. Shmit F., Oakeley E.J., Jost J.P. Antibiotics induce genome-wide hypermethylation in cultured Nicotiana tabacum plants // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 1534-1540.

137. Shiva Prakash N., Bhojaraja R., Shivbachan S.K. et al. Marker-free transgenic corn plant production through co-bombardment // Plant Cell Rep. 2009. V. 28. P. 1655-1668.

138. Simmaco M., Mignorna G., Barra D., Bossa F. Novel antimicrobial peptides from skin secretion of the Europian frog Rana esqulenta II FEBS Lett. 1993. V. 324. P. 159-161.

139. Simmaco M., Mignogna G., Canofeni S. et al. Temporins, antimicrobial peptides from the European red frog Rana temporaria // Eur. J. Biochem. 1996. V. 242. P. 788-792.

140. Sipos D., Andersson M., Ehrenberg A. The structure of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI in solution, determined by proton-NMR // Eur. J. Biochem. 1992. V. 209. P. 163-169.

141. Smalla K., Heuer H., Gotz A. et al. Exogenous isolation of antibiotic resistance plasmids from piggery manure slurries reveals a high prevalence and diversity of IncQ-like plasmids // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 4854-4862.

142. Smeianov V., Scott K., Gregor R. Activity of cecropin PI and FA-LL-37 against urogenital microflora // Microbes and Infection. 2000. V. 2. P. 773 -777.

143. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 503-517.

144. Sreekala C., Wu L., Gu Wang D., Tian D. Excision of a selectable marker in transgenic rice (Oryza sativa L.) using a chemically regulated Cre-loxP system // Plant Cell Rep. 2005. V. 24. P. 86-94.

145. Sripriya R., Raghupathy V., Veluthambi K. Generation of selectable markerfree sheath blight resistant transgenic rice plants by efficient co-transformation

122

of a cointegrate vector T-DNA and a binary vector T-DNA in one Agrobacterium tumefaciens strain // Plant Cell Rep. 2008. V. 27. P. 1635-1644.

146. Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity // Nature. 1981. V. 292. P. 246-248.

147. Strizhov N., Keller M., Mathur J. et al. A synthetic crylC gene, encoding a Bacillus thuringiensis d-endotoxin, confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 15012-15017.

148. Swathi Anuradha T., Divya K., Jami S.K., Kirti P.B. Transgenic tobacco and peanut plants expressing a mustard defensin show resistance to fungal pathogens // Plant Cell Rep. 2008. V. 27. P. 1777-1786.

149. Sugita K., Matsunaga E., Ebinuma H. Effective selection system for generating marker-free transgenic plants independent of sexual crossing // Plant Cell. Rep. 1999. V. 18. P. 941-947.

150. Sugita K., Kasahara T., Matsunaga E., Ebinuma H. A transformation vector for the production of marker-free transgenic plants containing a single copy transgene at high frequency // Plant J. 2000. V. 22. P. 461-469.

151. Sundar I.K., Sakthivel N. Advances in selectable marker genes for plant transformation//J. Plant Physiol. 2008. V. 165. P. 1698-1716.

152. Tamang D.G., Saier M.H. Jr. The cecropin superfamily of toxic peptides // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 11. P. 94-103.

153. Tytler E.M., Anantharamaiah G.M., Walker D.E., Mishra V.K., Palgunachari M.N., Segrest J.P. Molecular basis for prokaryotic specificity of magainin-induced lysis // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 4393-4401.

154. Tran D., Tran P., Roberts K., Osapay G. et al. Microbicidal properties and cytocidal selectivity of rhesus macaque theta defensins // Antimicrob Agents Chemother. 2008. V. 52. № 3. P. 944-953.

155. Urban C., Mariano N., James J., Rahal J.J. et al. Polymyxin B-resistant Acinetobacter baumannii clinical isolate susceptible to recombinant BPI2i and cecropin PI // Antimicrob. Agents Chemotherapy. 2001. V. 45. P. 994-995.

123

156. Uzarski J.R., Tannous A., Morris J.R., Mello C.M. The effects of solution structure on the surface conformation and orientation of a cysteine-terminated antimicrobial peptide cecropin PI // Colloids Surf. B. Biointerfaces. 2008. V. 67. P. 157-165.

157. Vaara M. Evolution of pathogenic micro-organisms as a challenge for medicine // Duodecim. 2009. V. 125. № 18. P. 2001-2006.

158. Vergunst A.C., Schrammeijer B., den Dulk-Ras A., de Vlaam C.M.T. Regensburg-Tuink T.J.G., Hooykaas P.J.J. VirB/D4-dependent protein translocation from Agrobacterium into plant cells // Science. 2000. V. 290. P. 979-982.

159. Verhoef J. Antibiotic resistance: the pandemic // Adv. Exp. Med. Biol. 2003. V. 531. P. 301-313.

160. Wachinger M., Kleinschmidt A., Winder D. et al. Antimicrobial peptides melittin and cecropin inhibit replication of human immunodeficiency virus 1 by suppressing viral gene expression // Journal of General Virology. 1998. V. 79. P. 731-740.

161. Wang W.C., Menon G., Hansen G. Development of a novel Agrobacterium-mediated transformation method to recover transgenic Brassica napus plants 11 Plant Cell Rep. 2003. V. 22. P. 274-281.

162. Wang Y., Chen B., Hu Y., Li J., Lin Z. Inducible excision of selectable marker gene from transgenic plants by the Cre-lox site-specific recombination system // Transgenic Res. 2005. V. 14. P. 605-614.

163. Woo H.J., Cho H.S., Lim S.H. et al. Auto-excision of selectable marker genes from transgenic tobacco via a stress inducible FLP/FRT site-specific recombination system // Transgenic Res. 2009. V. 18. P. 455-465.

164. Wright M., Dawson J., Dunder E. et al. Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) using the phosphomannose isomerase gene, pmi, as selectable marker // Plant Cell Rep. 2001. V. 20. P. 429-436.

165. Wu L., Nandi S., Chen L., Rodriguez R.L., Huang N. Expression and inheritance of nine transgenes in rice // Trans. Res. 2002. V. 11. P. 533-541.

124

166. Yang L., Harroun T.A., Weiss T.M., Ding L., Huang H.W. Barrel-stave model or toroidal model? A case study on melittin pores // Biophys. J. 2001. V. 81. P. 1475-1485.

167. Yevtushenko D.P., Romero R., Forward B.S., Hancock R.E., Kay W.W., Misra S. Pathogen-induced expression of a cecropin A-melittin antimicrobial peptide gene confers antifungal resistance in transgenic tobacco // J. Exp. Bot. 2005. V. 56. P. 1685-1695.

168. Yevtushenko D.P., Misra S. Comparison of pathogen-induced expression and efficacy of two amphibian antimicrobial peptides, MsrA2 and temporin A, for engineering wide-spectrum disease resistance in tobacco // Plant Biotechnol. J. 2007. V. 5. P. 720-734.

169. Yuan Y., Liu Y. J., Wang T. A new Cre/lox system for deletion of selectable marker gene // Acta. Bot. Sin. 2004. V. 46. P. 862-866.

170. Zhang Y.Y., Li H.X., Ouyang B., Lu Y.E., Ye Z.B. Chemical-induced autoexcision of selectable markers in elite tomato plants transformed with a gene conferring resistance to lepidopteran insects // Biotechnol Lett. 2006. V. 28. P. 1247-1253.

171. Zuo J., Niu Q.-W., Moller S.G., Chua N.-H. Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19. P. 157-161.

172. Zutch H.D., Raida M., Adermann K., Magert H.G., Forssman W.G. Casocidin-I: a casein-aS2 derived peptide exhibits antibacteial activity // FEBS Lett. 1995. V. 372. P. 185-188.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность научным руководителям заведующему лабораторией биотехнологии растений д.б.н., профессору Ярославу Ивановичу Бурьянову и к.б.н. Наталье Сергеевне Захарченко за внимательное руководство, консультации, постоянную и разностороннюю помощь в работе. Хочется выразить благодарность к.х.н. Ивану Андреевичу Кашпарову за помощь в проведении экспериментов по гельфильтрации, к.х.н. Игорю Леонидовичу Родионову за синтез пептида цекропина Р1 и к.х.н. Александру Георгиевичу Ламану за получение антител к цекропину Р1. Искренние слова благодарности д.б.н. Елене Борисовне Рукавцовой за ценные советы и всем сотрудникам лаборатории биотехнологии растений ФИБХ РАН за создание рабочей атмосферы и поддержку.