Использование С-концевого домена альфа-фетопротеина для адресной доставки противоопухолевых препаратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Годованный, Артем Витальевич

• Годованный, Артем Витальевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Годованный, Артем Витальевич

Содержание.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение. Проблемы современной химиотерапии опухолей и способы их преодоления.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Рецепторо-опосредованный транспорт противоопухолевых препаратов в опухолевые клетки с помощью белковых векторных молекул.

1.1.1. Преимущества и недостатки использования систем направленного транспорта.

1.1.2. Конъюгаты противоопухолевых препаратов с векторными молекулами.

1.2. Конъюгаты векторных молекул с наночастицами на основе биодеградируемых полимеров с включенными в их состав противоопухолевыми препаратами.

1.2.1. Способы получения и свойства наночастиц на основе сополимера молочной и глинолевой кислот.

1.2.2. Преимущества и недостатки использования биодеградируемых наночастиц.

1.2.3. Способы получения коньюгатов наночастиц с векторными молекулами.

1.2.4. Влияние размера наночастиц на их биологические свойства.

1.2.5. Преимущества наночастиц, конъюгированных с векторными молекулами.

1.3.1. Функции АФП.

1.3.2. Строение альфа-фетопротеина.

1.3.3. Биосинтез и регуляция АФП.

1.3.4. Ген АФП: регуляторный район.

1.3.5. АФП и клетки опухолей.

1.3.6. Рецепторы АФП.

1.3.7. С-концевой домен АФП и его использование в качестве векторного белка.

1.4. Использованные противоопухолевые препараты.

1.4.1. Цисплатин.

1.4.2. Паклитаксел и доцетаксел.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Выделение и очистка рАФПЗд.

2.1.1. Плазмидный вектор, экспрессирующий С-концевой домен АФП человека.

2.1.2. Получение штамма продуцента и оптимизация условий экспрессии рАФПЗд.

2.1.3. Отмывка телец включения.

2.1.4. Солюбилизация телец включения.

2.1.5. Рефолдинг С-концевого рекомбинантного домена АФП.

2.1.6. Концентрирование раствора после рефолдинга.

2.2. Анализ выделенного рекомбинантного С-концевого домена АФП.

2.2.1. Анализ взаимодействия рАФПЗд с рецептором in vitro.

2.2.2. Исследование специфичности связывания рАФПЗд с рецептором АФП.

2.3. Использование рекомбинантного С-концевого домена АФП в качестве векторной молекулы.

2.3.1. Синтез конъюгата рАФПЗд с цис-дихлордиаминплатиной (цис-платином).

2.3.2. Исследование цитотоксической активности конъюгата рАФПЗд с цисплатином.

2.4. Получение полимерных наночастиц с включением паклитаксела и доцетаксела.

2.4.1. Разработка и оптимизация метода включения паклитаксела методом простых эмульсий.

2.4.2. Подбор параметров процесса получения наночастиц.

2.4.4. Получение наночастиц с введенной флуоресцетной меткой.

2.5. Разработка метода связывания наночастиц с рекомбинантным С-концевым фрагментом АФП человека.

2.5.2. Ковалентное связывание белка с поверхностью НЧ.

2.5.3. Включение паклитаксела, доцетаксела и доксорубицина в состав полимерных НЧ с использованием модифицированного ПВС.

2.5.4. Изучение кинетики высвобождения паклитаксела, доцетаксела и доксорубицина из состава НЧ.

2.5.5. Получение НЧ, конъюгированных с рАФПЗд.

2.6.1. Исследование специфичности и уровня связывания наночастиц с рецептором АФП на поверхности клеток аденокарциномы молочной железы линии MCF-7.

2.6.2. Исследование эндоцитоза наночастиц, связанных с рАФПЗд, клетками аденокарциномы молочной железы человека линии MCF-7.

2.6.3. Распределение наночастиц и лекарственного препарата внутри опухолевых клеток.

2.7. Исследование цитотоксической активности наночастиц, связанных с рАФПЗд.

2.7.1. Исследование цитотоксической активности наночастиц с включением паклитаксела, связанных с рАФПЗд, для опухолевых клеток.

2.7.2. Исследование цитотоксической активности наночастиц с включением доцетаксела, конъюгированных с рАФПЗд, для опухолевых клеток.

2.7.3. Исследование накопления и токсичности наночастиц, связанных с векторным белком, для лимфоцитов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование С-концевого домена альфа-фетопротеина для адресной доставки противоопухолевых препаратов»

способы их преодоления.

Злокачественные новообразования представляют одну из основных причин смертности среди населения нашей планеты, особенно в старших возрастных группах. В последние годы, несмотря на значительный прогресс в области профилактики и лечения рака, наблюдается неуклонный рост заболеваемости этим серьезным недугом. По данным ВОЗ ежегодно заболевает раком свыше 5 млн. человек и умирает от злокачественных новообразований - более 2 млн.

В последнее время все большее значение в лечении злокачественных новообразований приобретает так называемая химиотерапия, или воздействие на опухолевый процесс с помощью химических веществ с целью его замедления, остановки или обращения. При этом используются вещества весьма разнообразного строения и химической природы. Эти соединения могут оказывать на трансформированную клетку различные повреждающие воздействия. Они. модифицируют и повреждают клеточные мембраны, нарушают биосинтез белка, процессы клеточного метаболизма и деления, повреждают ДНК, и, в конечном счете, вызывают гибель опухолевой клетки.

При использовании современных фармакологических средств в большинстве случаев достигается лишь более или менее продолжительная ремиссия и некоторое улучшение качества жизни пациента со злокачественным новообразованием. Низкая эффективность химиотерапии зачастую связана с трудностями ранней диагностики злокачественных новообразований, а также с низкой избирательностью действия и, как следствие этого, с высоким уровнем побочных эффектов подавляющего большинства ПОП.

Одним из недостатков применяемых в настоящее время ПОП является их низкая селективность в отношении опухолевых клеток. Токсическое действие препарата обычно распространяется на клетки практически всех 7 органов и тканей, обладающие высоким пролиферативным индексом. Низкая избирательность действия ПОП приводит к многочисленным побочным эффектам, сопровождающим их терапевтическое действие.

Существенно ограничивает возможности химиотерапии злокачественных новообразований устойчивость опухолевых клеток к действию химических препаратов. Процесс развития устойчивости является мультифакторным и к его причинам можно отнести целый ряд изменений метаболизма опухолевой клетки. Одним из наиболее значительных является изменение липидного и белкового состава клеточной мембраны, которое ведет к снижению ее проницаемости для препарата. Этот феномен получил название множественной лекарственной устойчивости, поскольку проницаемость мембраны снижается для целого ряда структурно не связанных и различных по механизму действия препаратов природного происхождения и синтетических аналогов [1].

В основе развития множественной лекарственной устойчивости лежит гиперэкспрессия трансмембранных белков-насосов семейства АВС-транспортеров (ATP Binding Cassette transporters, АТФ-зависимые транспортеры), специализирующихся на выбросе малых гидрофобных молекул из цитоплазматической мембраны за счет энергии АТФ. В зависимости от структуры АТФ-связывающих доменов различают несколько подсемейств ABC-транспортеров: А, В, С, D, Е, F, и G, и в настоящее время различают около 50 белков. Наиболее известным представителем данного семейства является Р-гликопротеин [ 1 ].

Одним из наиболее эффективных подходов к повышению селективности действия противоопухолевых препаратов является разработка методов их направленной доставки к клеткам опухоли. Избирательность доставки в таком случае обеспечивается за счет связывания препарата с векторной молекулой, которая должна обладать специфическим сродством к поверхности опухолевых клеток. В качестве векторных молекул могут быть 8 использованы антитела, РНК-аптамеры к поверхностным белкам, а также лиганды рецепторов, специфических для опухолевых клеток, или их фрагменты.

При использовании в качестве векторных молекул лигандов рецепторов, экспрессия которых избирательно повышена в клетках опухолей, препарат будет проникать внутрь клетки посредством рецепторо-опосредованного эндоцитоза в составе окаймленного белком мембранного пузырька. Внутри такого пузырька препарат оказывается вне доступности для действия ассоциированных с клеточной мембраной ABC-транспортеров. Таким образом, данный подход является не только методом повышения селективности действия препарата, но и одним из способов преодоления множественной лекарственной устойчивости [29].

Преодоление множественной лекарственной устойчивости может быть достигнуто при использовании макромолекулярных носителей ПОП. Среди подобных конструкций можно отметить жидкие или твердые золи или гели различного состава, липосомы, полимерные наночастицы. При использовании подобной стратегии включенный в состав твердофазного носителя ПОП способен проникать в клетку опухоли посредством неспецифического эндоцитоза в составе окаймленного актином мембранного пузырька, за счет чего минует действие трансмембранных АВС-транспортеров [111].

Связывание макромолекулярных носителей ПОП с векторными молекулами способно привести к увеличению уровня эндоцитоза в клетках мишенях, и, соответственно, повышению эффективности ПОП [72-74].

Ранее было показано увеличение токсичности ПОП в результате конъюгирования с АФП [35-37]. Одной из таких перспективных векторных молекул, является используемый в данной работе рекомбинантный С-концевой домен альфа-фетопротеина человека (рАФПЗд). рАФПЗд эффективно связывается с рецепторами альфа-фетопротеина, специфичными для опухолевых клеток, и подвергается рецептор-опосредованному эндоцитозу [98].

В данной работе представлен новый метод выделения и очистки рАФПЗд. Разработка метода выделения рАФПЗд позволяет решить проблемы, возникающие при биотехнологическом получении рекомбинантного полноразмерного АФП. Методы выделения и очистки рекомбинантного АФП из бактериальных и дрожжевых культур были предложены ранее [114,115]. Предложенные методы отличаются относительно низким выходом, что объясняется невысоким уровнем экспрессии АФП, а также малоэффективным рефолдингом белка из денатурированного состояния. Рефолдинг полноразмерного АФП является сложной задачей, потому что в его состав входит большое количество (15) дисульфидных связей. Правильное образование всех дисульфидных связей является необходимым условием восстановления нативного функционального состояния белка. Во всех предложенных вариантах выход стадии рефолдинга не превышал 40% [115-117]. Для рефолдинга рАФПЗд необходимо правильное образование шести дисульфидных связей, что является предпосылкой для разработки схемы рефолдинга с более высоким выходом.

В данной работе предложены способы создания и исследована противоопухолевая активность in vitro ковалентного конъюгата рАФПЗд с противоопухолевым цитостатиком цисплатином, и конъюгата рАФПЗд с полимерными наночастицами с включенным противоопухолевым цитостатиком паклитакселом.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Годованный, Артем Витальевич

Заключение.

В данной работе был оптимизирован предложенный ранее метод выделения и отчистки рекомбинантного С-концевого домена альфа-фетопротеина человека. Эффективность рефолдинга рАФПЗд описанным методом значительно превышает максимальную заявленную эффективность рефолдинга полноразмерного рекомбинантного АФП с применением аналогичного метода. Это говорит о целесообразности разработки метода выделения и очистки рецепторсвязывающего домена АФП. Оптимизированный метод выделения и очистки рАФПЗд значительно превысил по продуктивности описанный ранее метод.

Очищенный белок эффективно взаимодействует с опухолевыми клетками, характеризующимися высоким уровнем экспрессии рецептора АФП. При этом рАФПЗд не взаимодействует с лимфоцитами, нормальными клетками организма, не экспрессирующими рецепторов АФП. Избирательность взаимодействия выделенного белка с опухолевыми клетками подтверждает целесообразность его использования в качестве векторной молекулы для доставки противоопухолевых препаратов к клеткам опухолей.

Полученный конъюгат рАФПЗд с противоопухолевым цитостатиком цисплатином проявил выраженную цитотоксичность по отношению к клеткам опухолей. В то же время токсичность конъюгата для лимфоцитов отсутствовала, что является важным практическим результатом. Целесообразным является дальнейшее исследование токсичности конъюгата для животных и испытание его противоопухолевой активности в экспериментах in vivo.

Связывание с рАФПЗд привело к увеличению уровня связывания НЧ на основе сополимера молочной и гликолевой кислот с опухолевыми клетками, несущими рецепторы АФП. Взаимодействие частично подавлялось в случае блокировки рецепторов АФП. Эти результаты подтверждают, что НЧ, связанные с рАФПЗд, взаимодействуют с опухолевыми клетками как специфично, посредством рецептора АФП, так и неспецифично.

Также, связывание НЧ, содержащих паклитаксел, с рАФПЗд, приводило к увеличению их цитотоксической активности для опухолевых клеток, и, что особенно важно, для опухолевых клеток резистентной линии.

Таким образом, продемонстрирован потенциал использования рАФПЗд в качестве векторной молекулы для создания систем направленной доставки противоопухолевых препаратов, в том числе препаратов в составе полимерных наночастиц.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Годованный, Артем Витальевич, 2012 год

1. Северин Е.С., Родина А.В. Проблемы и перспективы современной противоопухолевой терапии // Успехи биологической химии 2006. -Т.46 - С. 43-64.

2. Wu G.Y. Wu С.Н. Liver-directed gene delivery. // Adv. Drug Delivery Rev.1993. V. 12. P. 159.

3. Perales J.C., Ferkol Т., Beegen H., Ratnoff O. D., Hanson R.W. Gene transfer in vivo: Sustained expression and regulation of genes introduced into the liver by receptor-targeted uptake. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1994. V. 91. P. 4086.

4. Aboud-Pirak E., Hurwitz E., Bellot F., Schlessinger J., Sela M. Inhibition of human tumor growth in nude mice by a conjugate doxorubicin with monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. P. 3778.

5. Bomsel M., Mostov K. Sorting of plasma membrane proteins in epithelial cells. // Curr. Opin. Cell Biol. 1991. V. 3. P. 647.

6. Соболев А. С. Модульные нанотранспортеры противораковых лекарств, придающие им клеточную специфичность и большую эффективность. // Усп биол хим 2009 т. 49 с. 389-40.

7. Curiel D.T., Agarwal S., Wagner E., Gotten M. Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. V. 88. P. 8850.

8. Shimizu A., Kawashima S. Kinetic study of internalization and degradation131 * •of I-labeled follicle-stimulating hormone in mouse Sertoli cells and its relevance to other systems. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 13632.

9. Kato Y., Sugiyama Y. Binding, internalization, degradation, and mitogenic effect of epidermal growth factor in cultured rat hepatocytes. // STP Pharm. Sci. 1993. V. 3.P. 75.

10. Strom T.W., Anderson P.L., Rubin-Kelley V.E., Williams D.P., Kiyokawa Т., Murphy J.R. Immunotoxins and cytokine toxin fusion proteins. // Ann. NY Acad. Sci. 1991. V. 88. P. 233.

11. H. Ringsdorf. Structure and properties of pharmacologically active polymers. // J. Polym. Sci.: Polym.Symp. 1975. V. 51. P. 135-153.

12. Bross P.F., Beitz J., Chen G. et al. Approval summary: gemtuzumab ozogamicin in relapsed acute myeloid leukemia. // Clin Cancer Res. 2001 V.7 N.6 P.1490.

13. Nan A., Ghandehari H., Hebert C. et al. Water-soluble polymers for targeted drug delivery to human squamous carcinoma of head and neck. // J Drug Target. 2005 V.13N.3 P. 189

14. Vorhies J.S., Nemunaitis J.J. Nucleic acid aptamers for targeting of shRNA-based cancer therapeutics. // Biologies. 2007 V.l N.4 P.367.

15. Strom T.W., Anderson P.L., Rubin-Kelley V.E., Williams D.P., Kiyokawa Т., Murphy J.R. Immunotoxins and cytokine toxin fusion proteins. // Ann. NY Acad. Sci. 1991. V. 88. P. 233.

16. Sanyal G., Marquis-Omer D., Gress J.O., Middaugh C.R. A transforming growth factor-a-Pseudomonas exotoxin hybrid protein undergoes pH134dependent conformational changes conducive to membrane interaction. // Biochemistry 1993. V. 32. P. 3488.

17. Mesri E.A., Kreitman R.J., Fu Y., Epstein S.E., Pastan I. Heparin-binding transforming growth factor a-pseudoinonas exotoxin A. // J. Biol. Chem. 1993. 268. P. 4853.

18. Seymour L.W., Ulbrich K., Wedge S.R., Hume I.C., Strohalm J., Duncan R. N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers targetted to the hepatocyte galactose receptor: pharmacoldnetics in DBA2 mice. // Br. J. Cancer 1991. V. 63. P. 859.

19. Francisco J.A., Cerveny C.G., Meyer D.L. et. al. cAC 10-vcMMAE, an anti-CD30-monomethyl auristatin E conjugate with potent and selective antitumor activity. // Blood. 2003 V.102 N.4 P. 1458.

20. Kratz F., Beyer U., Collery P, Lechenault F., Cazabat A., Schumaher P., Falken U., Unger C. Preparation, characterisation and in vitro efficacy of albumin conjugates of doxorubicin. // Biol. Pharm. Bull. 1998. V. 21. P. 56.

21. Kratz F., Beyer U., Roth T., Shutte M.T., Unold A., Fiebig H.H., Unger C. Albumin conjugate of the anticancer drug chlorambucil: synthesis, characterisation and in vitro efficacy. // Arch. Pharm. Pharm. Med. Chem. 1998. V. 331. P. 47.

22. Beyer U., Roth T., Schumaher P., Maier G., Unold A., Frahm A.W., Fiebig H.H., Unger C., Kratz F. Synthesis and in vitro efficacy of transferrin135conjugate of the anticancer drug clorambucil. // J.of Med. Chem. 1998. V. 41. P. 2701.

23. Jaracz S., Chen J., Kuznetsova L.V., Ojima I. Recent advances in tumortargeting anticancer drug conjugates. // Bioorg Med Chem. 2005 V. 13 N.17 P. 5043.

24. Takahashi N., Asakura Т., Ohkawa K. Pharmacokinetic analysis of protein-conjugated doxorubicin (DXR) and its degraded adducts in DXR-sensitive and -resistant rat hepatoma cells. // Anti-cancer drugs. 1996. V. 7. P. 687.

25. Wu G.Y., Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo. // J Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 14621.

26. Shapiro J.T., Leng M., Felsenfeld G. Deoxyribonucleic acid-polylysine complexes. Structure and nucleotide specificity. // Biochemistry. 1969.V. 8. P. 3219.

27. Wu C.H., Wilson J.M., Wu G.Y. Targeting genes: Delivery and persistent expression of a foreign gene driven by mammalian regulatory elements in vivo. // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 16985.

28. Yoshikawa Т., Pardridge W.M. Biotin delivery to brain with a covalent conjugate of avidin and a monoclonal antibody to the transferrin receptor. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1992. V. 263. P. 897.

29. Schreiber G.Methods for Studying the Interaction of Barnase with Its Inhibitor Barstar // Methods Mol Biol. 2001 V.160 P. 213-26.

30. Severin SE, Posypanova GA, Sotnichenko AI, et al. Anti-tumor activity of a covalent conjugate of the endiene antibiotic esperamicin Al with human alpha-fetoprotein. Dokl Acad Nauk 1999; V. 366 N.4 P. 561.

31. Branco M.C., Schneider J.P. Self-assembling materials for therapeutic delivery // Acta Biomaterialia 2009 V.5 P. 817.

32. Kshirsagar S.J., Bhalekar M.R., Patel J.N. et al. Preparation and characterization of nanocapsules for colon-targeted drug delivery system. // Pharm Dev Technol. 2011 Mar 23

33. Chellampillai В., Pawar A.P. Improved bioavailability of orally administered andrographolide from pH-sensitive nanoparticles. // Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 2011 V. 35 N.3-4 P. 123.

34. Chasin E. M., Langer R. Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems

35. Malmsten M. Surfactants and Polymers in Drug Delivery. // New York, Marcel Dekker Inc., Drugs and The Pharmaceutical Sciences, V. 122 P.294.

36. Corrigan О. I., Li X. Quantifying drug release from PLGA nanoparticulates // Eur J Pharm Sci. 2009 V. 37 P. 477.

37. Danhier F., Lecouturier N., Vroman B. et al. Paclitaxel-loaded PEGylated PLGA-based nanoparticles: in vitro and in vivo evaluation. // J Control Release. 2009 V.133N.1 P. 11-7

38. O'Donnell P. B. McGinity J. W. Preparation of microspheres by the solvent evaporation technique. // Advanced drug delivery reviews, 1997, V. 28 N.l, P. 25.

39. Гельперина С.Э. Разработка подходов к созданию лекарственных форм антибиотиков на основе полимерных наночастиц. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук. Москва, 2010.

40. Zhang X.Y., Chen J., Zheng Y.F. et al. Follicle-stimulating hormone peptide can facilitate paclitaxel nanoparticles to target ovarian carcinoma in vivo. // Cancer Res. 2009 V. 69 N. 16 P. 6506.

41. Musumeci Т., Ventura C.A., Giannone I. et al. PLA/PLGA nanoparticles for sustained release of docetaxel. // Int J Pharm. 2006 V. 325 N.l-2 P. 172.

42. Govender Т., Stolnik S., Garnett M.C., Ilium L., Davis S.S. PLGA nanoparticles prepared by nanoprecipitation: drug loading and release studies of a water soluble drug. // J Control Release. V. 57 N.2 P. 171.

43. Lee L.Y., Wang C.H., Smith K.A. Supercritical antisolvent production of biodegradable micro- and nanoparticles for controlled delivery of paclitaxel. // J Control Release. 2008 V. 125 N.2 P. 96.

44. Kim T.Y., Kim D.W., Chung J.Y. Phase I and pharmacokinetic study of Genexol-PM, a cremophor-free, polymeric micelle-formulated paclitaxel, in patients with advanced malignancies. // Clin Cancer Res. 2004 V.10 N.l 1 P. 3708.

45. Yoo H.S., Lee K.H., Oh J.E., Park T.G. In vitro and in vivo anti-tumor activities of nanoparticles based on doxorubicin-PLGA conjugates. // J Control Release. 2000 V.68 N.3 P. 419.

46. Yoo H.S., Oh J.E., Lee K.H., Park T.G. Biodegradable nanoparticles containing doxorubicin-PLGA conjugate for sustained release. // Pharm Res. 1999 V. 16N.7P. 1114-8.

47. Liebmann J., Cook J.A., Mitchell J.B. Cremophor EL, solvent for paclitaxel, and toxicity. // Lancet. 1993 V. 342 N.8884 P. 1428.

48. Vinogradov S.V., Bronich Т.К., Kabanov A.V. Nanosized cationic hydrogels for drug delivery: preparation, properties and interactions with cells. // Adv.Drug Deliv.Rev. 2002 V. 54 P. 135-147.138

49. Hobbs S.K., Monsky W.L., Yuan F. et al. Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment. // PNAS. 1998 V. 95P.4607-4612.

50. Pluen A., Boucher Y., Ramanujan S., et al. Role of tumor-host interactions in interstitial diffusion of macromolecules: cranial vs. subcutaneous tumors. // PNAS. 2001 V. 98, 4628-4633.

51. Panyam J., Zhou W.Z., Prabha S., Sahoo S.K., Labhasetwar V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. // Faseb J 2002 V.16 P. 1217-26.

52. Moghimi S.M., Hunter A.C., Murray J.C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. // Pharmacol Rev. 2001 V. 53 N.2 P. 283-318.

53. Moghimi S.M., Hunter A.C., Murray J.C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. // Pharmacol Rev. 2001 V. 53 N.2 P. 283-318.

54. Grayson A.C, Doody A.M., Putnam D. Biophysical and structural characterization of polyethylenimine-mediated siRNA delivery in vitro. // Pharm Res. 2006 V.23 N.8 P. 1868-76.

55. Уласов A.B. Исследование трансфекции клеток наночастицами полиплексов на основе полиэтиленимина. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 2011.

56. Owens D.E. 3rd, Peppas N.A. Opsonization, biodistribution, and pharmacokinetics of polymeric nanoparticles. // Int J Pharm. 2006 V. 307 N.l P. 93-102.

57. Kreuter J., Hekmatara Т., Dreis S., Covalent attachment of apolipoprotein A-I and apolipoprotein B-100 to albumin nanoparticles enables drug transport into the brain. J Control Release. 2007 V. 118 N.l P. 54-8.

58. Kocbek P, Obermajer N., Cegnar M., Kos J., Kristl J. Targeting cancer cells using PLGA nanoparticles surface modified with monoclonal antibody. // J Control Release. 2007 V. 120 N.l-2 P. 18-26.

59. Chang J., Jallouli Y., Kroubi M. et al. Characterization of endocytosis of transferrin-coated PLGA nanoparticles by the blood-brain barrier. // Int J Pharm. 2009 V. 379 N.2 P.285-92.

60. Esmaeili F., Ghahremani M.H., Ostad S.N. et al. Folate-receptor-targeted delivery of docetaxel nanoparticles prepared by PLGA-PEG-folate conjugate. // J Drug Target. 2008 V. 16 N.5 P. 415-23.

61. Patil Y.B., Toti U.S., Khdair A. Ma L., Panyam J. Single-step surface functionalization of polymeric nanoparticles for targeted drug delivery. // Biomaterials. 2009 V. 30 N.5 P. 859-66.

62. Yang L., Mao H., Wang Y.A. et al. Single chain epidermal growth factor receptor antibody conjugated nanoparticles for in vivo tumor targeting and imaging. // Small. 2009 V. 5 N.2 P. 235-43.

63. McCarron P.A., Marouf W.M., Quinn D.J. et .al. Antibody targeting of camptothecin-loaded PLGA nanoparticles to tumor cells. // Bioconjug Chem. 2008 V. 19 N.8 P. 1561-9.

64. Sahoo S.K., Ma W., Labhasetwar V. Efficacy of transferring-conjugated paclitaxel-loaded nanoparticles in a murine model of prostate cancer // Int.J.Cancer, 2004, V. 112, P. 335-340.

65. Chuda C. et al. ICAM-1 Targeting of Doxorubicin-Loaded PLGA Nanoparticles to Lung Epithelial Cells // Eur J Pharm Sci. 2009 V.37 N.2 P. 141-150.

66. Farokhzad O. C., Cheng J., Teply B. A., Sherifi I., Jon S., Kantoff P. W., Richie J. P., Langer R. Targeted nanoparticle-aptamer bioconjugates for cancer chemotherapy in vivo. // PNAS 2006 V. 103 P.6315-6320.

67. Shen W.C., Ballou B., Ryser H.J., Hakala T.R. Targeting, internalization, and cytotoxicity of methotrexate-monoclonal anti-stage-specific embryonicantigen-1 antibody conjugates in cultured F-9 teratocarcinoma cells. 11 Cancer Res 1986 V.46 P. 3912.

68. Cohen S. Isolataion of a mous submaxillary gland protein accelerating incisor eruption and eylid opening in the new-born animal. // J. Biol. Chem. 1962. V. 273. P. 1555-1562.

69. Gregory H. Isolation and structure of urogastrone and its relationship to epidermal growth factor. //Nature. 1975. V. 257. P. 325-327.

70. Savage Jr C.R., Hash G.H., Cohen S. Epidermal growth factor, location of disulfide bonds. //J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 7669-7672.

71. Savage Jr C. R., Inagami Т., Cohen S. The primary structure of epidermal growth factor. // J. Biol. Chem. 1972. V. 247. P. 7612-7621.

72. Никольский H. H., Соркин А. Д., Сорокин А. Б. Эпидермальный фактор роста. 1987. Л.: Наука. 200 с.

73. Brock J.H. Metalloproteins, Part2: Metall Proteins with Nonredox Roles. 1985. VCH: Weinheim. P. 183-263.

74. M. J. Poznansky, R. L. Juliano. Biological approaches to the controlled delivery of drugs: a critical review. // Pharm. Rew. 1984. V. 36. P. 277-333.

75. Terentiev A, Moldogazieva N. Structural and functional mapping of a-fetoprotein. //Biochem. 2006 V.71 N.2 P. 120-32.

76. Абелев Г. И. Альфа-фетопротеин взгляд в биологию развития и природу опухолей, Соросовский образовательный журнал, 1998, №9.

77. Решетников С.С. Иммуноферментный анализ альфа-фетопротеина, использование в диагностике заболеваний человека. НОВОСТИ "Вектор-Бест" N6 Декабрь 1997.141

78. Mizejewsky G. Alfa-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes and conformational variants. Exp Biol Med, 2001, 226 N.5 P.377-408.

79. Terentiev A, Moldogazieva N. Cell adhesion proteins and a-fetoprotein. similar structural Motifs as prerequisites for common functions. Biochemistry, 2007, V. 72 N.9 P. 920-35.

80. Dudich I, Tokhtamysheva N, Semenkova L, Dudich E, Hellman J, Korpela T. Isolation and Structural and Functional Characterization of Two Stable Peptic Fragments of Human R-Fetoprotein. Biochemistry, 1999, 38, 1040614.

81. Алексеева M.JI. АФП: Использование в онкологии и перинатологии (обзор литературы). // Проблемы репродукции, 2000, №4.

82. Villacampa, M.J., Мою, R., Naval, J., Failly-Crepin, С., Lampreave, F. and Uriel, J. AFP receptors in a human breast cancer cell line. Bioch. Biophy. Res. Comm. 122: 1322-1327, 1984.

83. Esteban C., Geuskens M., Uriel J. Activation of an alpha-fetoprotein (AFP)/receptor autocrine loop in HT-29 human colon carcinoma cells. Int J Cancer. 1991 V. 49 N.3 P.425-30.

84. Uriel J., Failly-Crepin C., Villacampa M.J., Pineiro A., Geuskens M. Incorporation of alpha-fetoprotein by the MCF-7 human breast cancer cell line. // Tumor Biology. 1984. V. 5. P. 41-46.

85. Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Receptor-mediated endocytosis and recycling of alpha-fetoprotein in human B-lymphoma and T-leukemia cells. // Int. J. Cancer. 1991. V. 47. P. 110-117.

86. Suzuki Yuji, Zeng Q.Y., Alpert E. Isolation and partial characterization of a specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes. // J. Clin. Invest. 1992. V. 90. P. 1530-1536.

87. Torres J.M., Naval J., Laborda M. Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-lymphocytes during blastic transformation. // Mol. Immunol. 1989. V. 26. P. 851-857.

88. Line B. R. et al. Scintigraphic Detection of Breast Cancer Xenografts with Tc-99m Natural and Recombinant Human Alpha-Fetoprotein // Cancer biother. radiopharm. 1999 V.14 N.6 P.485-494.

89. B. Rosenberg et al. Platinum Compounds: a New Class of Potent Antitumour Agents //Nature 1969 V. 222 P. 385 386.

90. Jamieson E., Lippard S. Structure, Recognition, and Processing of Cisplatin-DNA Adducts // Chem. Rev. 1999 V. 99 N.9 P. 2467—2498.

91. Hermanson G.T. Bioconjugate techniques. 2nd edition. San Diego; New York; Boston; London; Sydney; Tokyo; Toronto: Academic Press, 2008.

92. Hay R., Porter D. The reaction of sulphur and nitrogen nucleophiles with Pt(dien)Cl. . // Transit. Met. Chem. 1999. V. 24, P. 186 188.

93. Wall M.E., Wani M.C. Camptothecin and taxol: discovery to clinic— thirteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture // Cancer Res. 1995 V. 55 N.4 P. 753-60.

94. Jordan M.A., Leslie W. Microtubules as a target for anticancer drugs // Nat. Rev. Cancer 2004. V. 4 N.4 P. 253-65.

95. Ganguly A., Yang H., Cabral F. Paclitaxel-dependent. cell lines reveal a novel drug activity // Mol Cancer Ther. 2010. V. 9 N.l 1 P. 2914-23.

96. Alava M.A., Iturralde M., Lampreave F., Pineiro A. Specific uptake of alpha-fetoprotein and albumin by rat Morris 7777 hepatoma cells // Tumour Biol 1999 V. 20 P. 52-64.

97. Sahoo S.K., Labhasetwar V. Enhanced Antiproliferative Activity of Transferrin-Conjugated Paclitaxel-Loaded Nanoparticles Is Mediated via Sustained Intracellular Drug Retention // Mol Pharm 2005. V. 2. P. 373.

98. Panyam J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for Drug and gene delivery to cells and tissue. AdV. Drug DeliV. ReV. 2003, V. 55, P. 329-347.

99. Brigger I., Dubernet C., Couvreur P. Nanoparticles in Cancer therapy and diagnosis. // AdV. Drug Deliv. Rev. 2002 V.54 P. 631- 651.

100. Sahoo S. K., Labhasetwar V. Nanotech approaches to Drug delivery and imaging. // Drug Discovery Today 2003 V.8 P. 1112-1120.

101. Boismenu R., Semeniuk D., Murgita R.A. Purification and characterisation of human and mouse recombinant alpha-fetoprotein expressed in Escherichia coli // Protein. Expr. Purif. 1997 V.10 N.l P. 10-26.

102. Yamamoto R., Sakamoto T., Nishi S. et. al. Expression of human alpha-fetoprotein in yeast // Life. Sci. 1990 V. 46 N. 23 P. 1679-1686.

103. Leong S.S., Midleberg A.P. A simplified bioprocess for human alpha-fetoprotein production from inclusion bodies // Biotechnol. Bioeng. 2007 V.97N. 1 P. 99-117.

104. Leong S.S., Midleberg A.P. The refolding of different a-fetoprotein variants // Protein. Sci. 2006. V.15 N9 P.2040-2050.144

105. Саватеева JI.B. Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым эффектом. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 2007.

106. Martinez-Alonso М. et al. Learning about protein solubility from bacterial inclusion bodies // Microb. Cell Fact. 2009 V. 8 P. 4.

107. Tsumoto K. et al. Solubilization of active green fluorescent protein from insoluble particles by guanidine and arginine. // Biochem Biophys Res Commun 2003 V. 312 P. 1383-1386.

108. Ницветов М.Б., Родина A.B., Москалева Е.Б. и др. Характеристика моноклональных антител к рецептору АФП в сравнении с АФП по их взаимодействию с опухолевыми клетками человека // Вопр. Биол. Мед. Фармац. Химии. 2001. Т. 3. С. 19

109. Carlsson J., Drevin Н., Axen R. Protein thiolation and reversible protein protein conjugation. N-Succinimidyl 3(2-pyridyldithio)propionate, a new heterobifunctional reagent. // Biochem. J. 1978. V. 173. P. 723-737.

110. Drewinko В., Brown B.W., Gottlieb J.A. The effect of cis-diamminedichloroplatinum(ll) on cultured human lymphoma cells and its therapeutic implications. // Cancer Res 1973 V. 33 P. 3091-5.

111. Bergerat J.P., Barlogie В., Drewinko B. Effect of cis-dichlorodiammineplatinum(II) on human colon carcinoma cells in vitro. // Cancer Res 1979 V. 39 P. 1334-8.

112. Kenichiro Ikedal Pharmacokinetics of Cisplatin in Combined Cisplatin and 5-Fluorouracil Therapy: A Comparative Study of Three Different Schedules of Cisplatin Administration. // Jpn J Clin Oncol 1998 V.28N.3 P. 168-175

113. Severin S.E. et al. Antitumor activity of conjugates of oncofetal protein alpha-fetoprotein and phtalocyanines in vitro // Biochem Mol Biol Int 1997 V. 43 N.4P. 873-881.

114. Sharapova O. A., Severin E. S. et al. High-efficient expression, refolding and purification of functional recombinant C-terminal fragment of human alpha-fetoprotein // Protein. Expr. Purif. 2010 V. 73 N.l.

115. Khalil I. A., Kogure K., Akita H., Harashima H. Uptake Pathways and Subsequent Intracellular Trafficking in Nonviral Gene Delivery // Pharm Rev 2006 V. 58 N.l P. 132-45.

116. Laemmli U.K. Cleavage of stryctural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. // Nature (London). 1970. V. 277. P. 680685.

117. Jobbagy A., Kiraly K. Chemical characterization of fluorescein isothiocyanate-protein conjugates // Biochim. Biophys. Acta. 1966. - Vol. 124N.l P.166.

118. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. // Arch. Biochem. Biophys. 1959. V. 82. P. 70-77.

119. Church F.C., Swaisgood H.E., Porter D.H., Catignani G. L. Spectrophotometric assay using o-phthaldialdehyde for determination of proteolysis in milk and isolated milk proteins // J Dairy Sei 1983 V. 66 N. 6 P. 1219-1227.

120. Carlsson J., Drevin H., Axen R. Protein thiolation and reversible protein protein conjugation. N-Succinimidyl 3(2-pyridyldithio)propionate, a new heterobifimctional reagent. // Biochem. J. 1978. V. 173. P. 723-737.

121. Mossman T. // J. Immunol. Meth. 1983. V. 65. № 1-2. P. 55.

122. Liggins R. T., Hunter W. L., Burt H. M. Solid-state characterization of paclitaxel. // J. Pharm. Sei. 2000 V. 86 N. 12, P. 1458 1463.

123. Panyam J., Williams D., Dash, A. et al. Solid-state solubility influences encapsulation and release of hydrophobic drugs from PLGA/PLA nanoparticles. // J. Pharm. Sei. 2004 V.93 P. 1804-1814.

124. Cheng J., Teply B.A., Sherifi I. et al. Formulation of Functionalized PLGA-PEG Nanoparticles forln Vivo Targeted Drug Delivery. // Biomat 2007 V.28 N.5 P. 869-876.146

125. Sahoo S. К., Panyama J., Prabhaa S. et al. Residual polyvinyl alcohol associated with poly (D,L-lactide-coglycolide) nanoparticles affects their physical properties and cellular uptake. // J Control Release 2002 V. 82 P. 105.

126. Changa J., Jallouli Y., Kroubi M. et. al. Characterization of endocytosis of transferrin-coated PLGA nanoparticles by the blood-brain barrier. // Int. J. Pharmaceut. 2009. V. 379 P. 285.

127. Jiang Y.P., Guo X., Tian X. Synthesis and NMR structural analysis of O-succinyl derivative of low-molecular-weight k-carrageenan. // Carbohydrate Polymers 2005 V.61 P. 399-406.

128. Larsen A. K., Escargueil A. E., A. Skladanowski. Resistance mechanisms associated with altered intracellular distribution of anticancer agents. // Pharm Ther 2000 V.85 P. 217-229.

129. Karukstis K.K., Thompson E. H., Whiles J. A. Deciphering the fluorescence signature of daunomycin and doxorubicin. // Biophys Chem 1998 V. 73 N3 P. 249-263.

130. Гельперина С.Э., Смирнова 3.C., Халанский A.C. с соавт. Исследование наносомальной лекарственной формы доксорубицина. // Рос биотерапевт ж 2004 Т.З С. 56-64.

131. Partha R., Lackey М., Hirsch A. et al. Self assembly of amphiphilic C60 fullerene derivatives into nanoscale supramolecular structures// Nanobiotech 2007 V.5 P.6.

132. Alexis F. et al. Factors Affecting the Clearance and Biodistribution of Polymeric Nanoparticles // Mol Pharm. 2008 V. 5 N.4 P. 505-515.

133. Егоров A.M., Осипов А.П. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа, Москва: Высш.шк., 1991.

134. Sambrook J., Fritch Е. F., Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed. 2, 1989).

135. Fundueanu G., Constantin M., Ascenzi P. Poly (vinyl alcohol) microspheres with pH- and thermosensitive properties as temperature-controlled drug delivery // Acta Biomater. 2010 V.6 N.10 P.3899-907.1. Благодарности.