Получение и исследование свойств молекулярного комплекса на основе биспецифического антитела и интерферона-бета для таргетной терапии ErbB2-позитивных опухолей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.08, кандидат наук Рыбченко Владислав Сергеевич

• Рыбченко Владислав Сергеевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Рыбченко Владислав Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цель и задачи работы

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Методология исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности данных

Личный вклад автора

Связь с государственными программами

Апробация диссертации

Публикации

Структура и объем диссертации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Способы терапии ErbB2-позитивных опухолей

1.1.1 Роль рецептора ErbB2 в развитии онкологических заболеваний

1.1.2 Химиотерапевтический подход лечения ErbB2+ опухолей

1.1.3 Иммунотерапия и таргетная терапия ErbB2+ опухолей

1.2 Биспецифические антитела, их разнообразие и способы получения

1.2.1 Классификация биспецифических антител

1.2.2 Укороченные форматы биспецифических антител и их терапевтический потенциал

1.2.3 Полноразмерные биспецифические антитела и способы их получения

1.2.4 Способы обеспечения гетеродимеризации тяжелых цепей

1.2.5 Способы обеспечения корректного взаимодействия легких и тяжелых цепей в биспецифических антителах

1.2.6 Другие форматы биспецифических антител

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 РЕАКТИВЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

2.2 МЕТОДЫ

2.2.1 Выделение тотальной РНК

2.2.2 Получение нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные домены мышиных иммуноглобулинов

2.2.3 Амплификация фрагментов ДНК с помощью ПЦР

2.2.4 Объединение фрагментов ДНК методом SOE-PCR

2.2.5 Синтез генов вариабельных доменов антитела против рецептора ErbB2 из перекрывающихся олигонуклеотидов

2.2.6 Получение плазмидных конструкций для транзиентной экспрессии аналога гуманизированного антитела трастузумаб против рецептора ErbB2

2.2.7 Получение плазмидных конструкций для продукции химерных антител B10 и B16 против ИФН-ß

2.2.8 Получение плазмидных конструкций для продукции биспецифического антитела формата CrossMab против рецептора ErbB2 и ИФН-ß

2.2.9 Электрофорез НК в агарозном геле

2.2.10 Секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей

2.2.11 Приготовление химически компетентных клеток E. coli

2.2.12 Приготовление электрокомпетентных клеток E. coli

2.2.13 Другие методы генной инженерии

2.2.14 Получение плазмидной конструкции для экспрессии рекомбинантного белка ecdErbB2

2.2.15 Биосинтез рекомбинантных белков и антител в культуре клеток СНО

2.2.16 Электрофорез белков в ДНС-ПААГ

2.2.17 Иммунохимическая характеризация антител

2.2.18 Масс-спектрометрия антител

2.2.19 Хроматография

2.2.20 Выделение МПК из крови человека

2.2.21 Определение антипролиферативного действия ИФН-ß в присутствии МПК

2.2.22 Определение ИФН-ß нейтрализующей способности антител

2.2.23 Исследование биологической активности иммуноцитокинового комлекса in vivo

2.2.24 Моделирование структуры вариабельных доменов антител

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Получение экспрессионных плазмидных конструкций для продукции антитела-аналога гуманизированного антитела трастузумаб против рецептора ErbB2

3.2 Получение экспрессионных плазмидных конструкций для продукции химерных антител B10 и B16 против ИФН-ß

3.3 Биосинтез и выделение антител

3.4 Подтверждение функциональной активности антител

3.5 Получение экспрессионных плазмид для продукции биспецифического антитела против рецептора ErbB2 и ИФН-ß

3.6 Биосинтез и выделение биспецифических антител

3.7 Масс-спектрометрический aнализ биспецифических антител

3.8 Иммуноблотинг антител с ИФН-ß и рецептором ErbB2

3.9 Определение константы диссоциации комплексов ИФН^-антитело

3.10 Определение нейтрализующей способности химерных и биспецифических антител по отношению к ИФН-ß

3.11 Определение двойной специфичности биспецифических антител методом «сэндвич-ифа» с рецептором ErbB2 и ИФН-ß

3.12 Получение и характеризация рекомбинантного белка внеклеточной части рецептора ErbB2

3.13 Исследование противоопухолевой активности иммуноцитокинового комплекса B16/Tz-№H-P in vivo

3.14 Получение гуманизированного антитела humB16

3.15 Характеризация гуманизированного антитела B16

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А. о. - аминокислотный остаток АГ - антиген

АЗКЦ - Антитело-зависимая клеточная цитотоксичность БСА - бычий сывороточный альбумин бсАт - биспецифические антитела

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

Ил - интерлейкин

КЖ - культуральная жидкость

КЗЦ - комплемент-зависимая цитотоксичность

мАт - моноклональные антитела

миРНК - малые интерферирующие РНК

МПК - мононуклеары периферической крови

ПСА - простатоспецифический антиген

ФНО-а - фактор некроза опухоли альфа.

CH - константный домен тяжелой цепи

CV - объем колонки (column volume)

ECD - внеклеточный домен (extracellular domain)

EGF - эпителиальный фактор роста

EGFR - рецептор эпителиального фактора роста

HAMA-ответ - (Human anti mouse antibody response) антивидовой иммунный ответ

IRES - внутренний сайт посадки рибосомы (Internal ribosome entry site) IFNAR - рецептор интерферонов I типа NK - естественные киллеры (natural killer cells) VH - вариабельный домен тяжелой цепи VL - вариабельный домен легкой цепи

SEED domain - Strand exchange engineered domain TCR - T-клеточный рецептор (T-cell receptor)

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и исследование свойств молекулярного комплекса на основе биспецифического антитела и интерферона-бета для таргетной терапии ErbB2-позитивных опухолей»

Актуальность темы исследования

Онкологические заболевания занимают 3 место по распространённости в мире и являются причиной ежегодной гибели около 10 млн человек [1]. Смертность от злокачественных новообразований зависит от множества факторов: типа опухоли, стадии заболевания, возраста пациента, наличия других сопутствующих заболеваний и варьирует от 3 до 100 и более смертей в год на 100 тыс. человек [2]. У женского населения планеты рак молочной железы занимает первое место по распространённости среди онкологических заболеваний, а количество смертельных исходов может достигать до 40 % от зарегистрированных случаев [3], среди них 15-20 % характеризуется наличием онкомаркера ЕгЬВ2 (Аёпеппе е1 а1., 2019). Повышение уровня экспрессии гена егЪЪ2 характерно и для других видов опухолей, к которым можно отнести рак лёгких, мочевого пузыря, прямой кишки и др. [4]. Снижению высокой смертности от онкологических заболеваний способствуют ранняя диагностика [5], незамедлительное начало лечения, а также разработка и внедрение в терапевтическую практику новых эффективных лекарственных средств [6, 7].

Среди существующих противоопухолевых препаратов, применяющихся для терапии ЕгЬВ2+ опухолей, таргетные препараты, представленные преимущественно моноклональными антителами, считаются наиболее эффективными, однако, их высокая стоимость ограничивает доступность для населения, а применение не может гарантировать ремиссии, что также является причиной обеспокоенности общественности и разработки новых лекарственных средств исследователями. Благодаря развитию биоинженерии стало возможным получать терапевтические антитела с усиленными характеристиками антителозависимой клеточной цитотоксичности, увеличенной эффективностью активации системы комплемента, а также биспецифические антитела и иммуноцитокины, открывающие совершенно новые стратегии для терапии, ранее недоступные учёным и врачам.

Степень разработанности темы исследования

На данный момент существует большое количество белковых молекул для терапии ErbB2+ опухолей. Первыми из появившихся и широко использующиеся по сей день являются мАт и их фрагменты [8]. Отлаженность технологий производства мАт и их высокая эффективность являются одной из важных причин столь широкого распространения и применения в медицине. С появлением технологий конъюгации антител на их основе стали получать «магические пули» -мАт, конъюгированные с высокотоксичными веществами, применение которых невозможно вследствие низкого терапевтического индекса [9]. Некоторые из цитокинов, в частности интерфероны I типа, также обладают выраженным противоопухолевым действием [10, 11], однако, как и многие используемые химиотерапевтические метки, характеризуются узким терапевтическим окном и не могут быть использованы в онкотерапии в достаточных дозировках.

Совершенно новый класс противоопухолевых белковых препаратов представлен биспецифическими антителами различных форматов [12]. Биспецифические антитела открывают целый ряд новых возможностей, например, впервые биспецифические антитела были применены для вовлечения Т-лимфоцитов в борьбу с раковыми клетками [13]. Биспецифические антитела также могут быть использованы для увеличения селективности по отношению к опухоли за счёт связывания с двумя онкомаркерами, либо для доставки различных веществ к опухоли [14]. Другой активно развивающийся и перспективный класс препаратов для онкотерапии - иммуноцитокины, состоящие из двух основных частей: антитела или его фрагмента и цитокина, присоединённого с помощью пептидного линкера. Такие молекулы совмещают в себе механизмы действия цитокинов и моноклональных антител. Благодаря наличию в составе иммуноцитокина компоненты антитела обеспечивается таргетность доставки цитокиновой компоненты, что позволяет достичь её высокой локальной концентрации и локализовать действие цитокина преимущественно сайтом опухоли, снижая при этом количество и тяжесть возникающих побочных эффектов.

Противоопухолевые свойства интерферона-бета, цитокина, относящегося к интерферонам I типа, известны из большого количества источников литературы [10, 11], однако его применение ограничено узким терапевтическим окном, из-за чего он не может быть использован в достаточных дозировках для онкотерапии. В данной работе было предложено создать молекулярный комплекс нейтрализующего биспецифического антитела к ИФН-Р и онкомаркеру ЕгЬВ2 в качестве нового таргетного терапевтического препарата и средства доставки ИФН-Р к сайту опухоли для лечения ЕгЬВ2+ солидных опухолей.

Цель и задачи работы

Цель данной работы заключалась в получении и изучении свойств молекулярного комплекса интерферона бета и нейтрализующего биспецифического антитела к рецептору ЕгЬВ2 и ИФН-Р в качестве средства доставки цитокина для терапии ЕгЬВ2+ опухолей.

Для достижения цели были поставлены задачи:

1. Получить гены аналога терапевтического антитела трастузумаб против онкомаркера ЕгЬВ2, экспрессировать их в клетках СНО, подтвердить биологическую активность в сравнении с оригинальным препаратом.

2. Сконструировать гены химерных нейтрализующих антител к ИФН-Р, экспрессировать их и провести иммунохимическую характеризацию целевых белков.

3. Произвести конструирования генов биспецифического антитела формата СгоБвМаЬ на основе химерных антител к ИФН-Р и аналога антитела трастузумаб, разработать систему экспрессии и очистки рекомбинантных белков.

4. Охарактеризовать биспецифические антитела формата СгоББМаЬ иммунохимическими методами, доказать их нейтрализующую способность по отношению к ИФН-Р, показать, что активность по отношению к ИФН-в и рецептору ЕгЬВ2 сосредоточена в составе одной молекулы.

5. Исследовать противоопухолевые свойства комплекса биспецифического антитела и ИФН-Р на мышиной модели опухолевых ксенографтов в сравнении с биспецифическим антителом и ИФН-р.

6. Провести гуманизацию мышиного нейтрализующего антитела против ИФН-Р с целью дальнейшей разработки гуманизированной версии биспецифического антитела.

Научная новизна

В данной работе впервые было предложено использовать биспецифическое антитело в качестве средства доставки цитокина ИФН-Р к опухоли для терапии ErbB2+ опухолей. Для конструирования биспецифического антитела было использовано новое моноклональное нейтрализующее антитело B16 против ИФН-р. Наличие нейтрализующих свойств у биспецифического антитела предотвращает взаимодействие ИФН-Р с его клеточным рецептором, что должно способствовать уменьшению количества побочных эффектов в процессе циркуляции комплекса в крови. Создана система экспрессии биспецифических антител формата CrossMab в культуре клеток СНО, показана её высокая продуктивность, продемонстрирована простота очистки биспецифических антител. В процессе выполнения исследований были разработаны две уникальные тест-системы: для определения ИФН-Р нейтрализующей способности антител и для подтверждения сосредоточения двух специфичностей в составе одной молекулы. Получен ген рекомбинантного белка внеклеточной части рецептора ErbB2, отработана методика его выделения и очистки, доказано что данный рекомбинантный белок пригоден для иммунохимической характеризации ErbB2-связывающих антител. Проведено испытание и показано противоопухолевое действие комплекса ИФН-Р и нейтрализующего биспецифического антитела B16/Tz. Создано гуманизированное нейтрализующее мышиное антитело B16 против ИФН-Р человека с целью уменьшения содержания мышиных аминокислотных последовательностей в биспецифическом антителе.

Теоретическая и практическая значимость

Полученное биспецифическое антитело формата CrossMab против онкомаркера ErbB2 и цитокина ИФН-ß может быть использовано для разработки инновационного препарата для терапии ErbB2+ опухолей и доставки к ним ИФН-ß. Представленные в работе результаты обладают ценностью при создании других терапевтических антител данного формата.

Методология исследования

В ходе выполнения диссертационной работы использован комплекс генно-инженерных, молекулярно-биологических, иммунохимических методов исследования, а также работа с культурами клеток.

Положения, выносимые на защиту

1. Подтверждена биологическая активность сконструированного аналога терапевтического антитела трастузумаб, показано отсутствие существенных различий в характере связывания с ErbB2 у полученного антитела и оригинального препарата. Получены гены двух новых химерных антител B10 и B16 против ИФН-ß, характеризующиеся значениями Kd 2,3*10-9 и 3,8*10-9 М-1, подтверждена нейтрализующая способность антитела B16.

2. Доказана подлинность структуры и биологическая активность созданных на основе химерных антител B10 и B16 и аналога антитела трастузумаб биспецифических антител B16/Tz и B10/Tz формата CrossMab. В ходе конструирования биспецифического антитела B16/Tz была сохранена нейтрализующая способность по отношению к ИФН-ß.

3. Молекулярный комплекс биспецифического антитела B16/Tz и ИФН-ß обладает противоопухолевой активностью в отношении ErbB2+ опухолевых ксенографтов у мышей.

4. В ходе гуманизации химерного антитела B16 аффинность и нейтрализующая способность по отношению к ИФН-ß не претерпели существенных изменений.

Степень достоверности данных

Достоверность результатов, представленных в диссертационной работе, определяется репрезентативным объёмом проведённых экспериментальных исследований, комплексным применением современных методов исследования и подтверждается статистической обработкой полученных данных.

Личный вклад автора

Автору диссертационного исследования принадлежит ключевая роль в постановке целей и формулировке задач, планировании и проведении экспериментов, статистической обработке данных, подготовке тезисов и публикаций по теме исследования.

Связь с государственными программами

Диссертационная работа выполнена при поддержке гранта Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (соглашение № 075-15-2020773)

Апробация диссертации

Основные результаты диссертации были представлены на 6 конференциях: the 44th FEBS Congress, Краков, Польша 2019; «Международный молодежный научный форум ЛОМОНОСОВ-2018», МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия, 9-13 апреля 2018 г.; международной конференции «Биотехнология: наука и практика», Россия, 17-21 сентября 2018 г.; международной конференции «Постгеном», Казань, 29 окт. - 2 ноя., 2018 г.; II Объединенном научном форуме, включающем VI Съезд физиологов СНГ, VI Съезд биохимиков России и IX Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Дагомыс, Россия, 1-6 октября 2019 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи, индексируемые Scopus и Web of Science.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 1 5 глав результатов собственных исследований и их обсуждений, заключения, выводов, благодарностей, списка литературы и приложения. Работа изложена на 156 страницах компьютерного текста, содержит 10 таблиц, 36 рисунков (4 в приложении). Список литературы включает 178 источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Способы терапии ЕгЬВ2-позитивных опухолей

1.1.1 Роль рецептора ErbB2 в развитии онкологических заболеваний

Онкологические заболевания являются одной из самых распространённых

причин смертей в мире и занимают 3 место по количеству летальных случаев среди

всех групп заболеваний. По данным ВОЗ ежегодно от них умирает около 9,6 млн.

человек, рак становится причиной каждой 6-ой смерти на планете [15]. Рак -

неоднородная группа заболеваний, которые могут быть классифицированы по

локализации опухоли, степени поражения ткани и органа, молекулярным маркерам

и другим критериям [16]. Выделяют множество типов рака: рак молочной железы,

кожи, эндотелия почек, мочевого пузыря, печени, пищевода, желудка, кишечника,

лёгких, трахеи и бронхов, лейкозы, лимфомы, рак предстательной, щитовидной

железы и другие. Выживаемость пациентов зависит от типа рака, стадии

заболевания, возраста, наличия сопутствующих заболеваний и варьирует в

зависимости от перечисленных факторов от 6% до 95% [17]. Наиболее

распространёнными заболеваниями в онкологической практике и медицине

являются рак лёгких, простаты и молочной железы [18]. Ежегодно по всему миру

регистрируется около 2,09 млн. случаев рака молочной железы и 269 тыс. смертей

по причине данного заболевания [19] и сопоставимые величины для мужского

населения, страдающего от злокачественных опухолей предстательной железы.

Доля случаев рака молочной железы среди всех видов онкологических заболеваний

у женщин составляет 14%, данное заболевание также можно охарактеризовать как

наиболее часто встречаемое в группе [17]. Онкологи выделяют 3 типа опухолей

молочной железы: экспрессирующие прогестероновые или эстрогеновые

рецепторы, ЕгЬВ2-позитивные и трижды негативные. При наличии 1 % и более

клеток опухоли экспрессирующих эстрогеновые (ERa) или прогестероновые

рецепторы (PR), её классифицируют как ERa+/PR+. Трижды негативные опухоли

молочной железы не экспрессируют ни один из перечисленных маркеров и

14

являются наиболее агрессивными и рецидивирующими. Позитивные по маркеру ЕгЬВ2 опухоли встречаются в 20-30 % случаев и хорошо поддаются лечению на ранних стадиях при использовании иммунотерапевтических подходов, таргетных препаратов и других современных методов лечения [20]. Повышенный уровень экспрессии маркера ЕгЬВ2 характерен не только для опухолей молочной железы, но и для других злокачественных новообразований: рака лёгких [21, 22], шейки матки, почек, прямой кишки, уротелия [23].

Онкомаркер ЕгЬВ2 является одним из 4 белков, входящих в семейство рецепторов эпидермального фактора роста. Белки данного семейства играют важную роль в миграции клеток, их пролиферации и дифференцировке. Однако, повышенный уровень экспрессии гена егЪЪ2 ассоциирован с канцерогенезом, о чём свидетельствует ряд экспериментальных данных. Искусственное повышение уровня экспрессии гена егЪЪ2 у животных в мышиных моделях приводит к появлению и развитию опухолей у мышей [24]. Добавление к ЕгЬВ2-экспрессирующим опухолевым клеткам миРНК, комплементарных к мРНК егЪЪ2, приводит к уменьшению скорости их пролиферации, увеличению количества клеток, подвергшихся апоптозу, что в свою очередь влияет на рост опухоли [25]. Мутагенез гена егЪЪ2 сопряжён с повышенной вероятностью канцерогенеза. Так, у 32% пациентов с ЕгЬВ2+ опухолями наблюдаются мутации в гене егЪЪ2. Большинство замен, делеций и инсерций локализованы преимущественно в участках, кодирующих 1-11 домены внеклеточной части рецептора [26] и внутриклеточный тирозинкиназный домен [27]. Перечисленные факты свидетельствуют о важной роли рецептора ЕгЬВ2 в онкогенезе и развитии злокачественных новообразований.

Молекула рецептора ЕгЬВ2 состоит из 1225 аминокислот и обладает

молекулярной массой в 134.9 кДа. Структурно рецептор ЕгЬВ2 может быть

разделён на три части: внеклеточную, внутриклеточную и трансмембранную.

Трансмембранный участок представлен короткой а-спиралью, образованной

аминокислотными остатками 653-675 [28]. Внутриклеточная часть рецептора (а. о.

676-1255) образует тирозинкиназный домен, играющий ключевую роль в передаче

15

сигнала внутрь клетки. Внеклеточная часть ErbB2 (а. о. 24-653) состоит из 4

доменов с 25 дисульфидными мостиками и содержит несколько участков

гликозилирования [29]. У всех рецепторов семейства Erb, за исключением ErbB2,

домены I и III образуют лиганд-связывающий участок. Взаимодействие рецептора

с лигандом приводит к изменению его конформации и димеризации. В отличие от

остальных рецепторов семейства, лиганд для ErbB2 до сих пор не известен [30].

Согласно проведённым структурным исследованиям I и III домены рецептора

ErbB2 находятся в закрытой конформации, характерной для остальных белков

семейства erb, связанных с лигандом. Переход из открытой конформации в

закрытую сопровождается нарушением плотных контактов II и IV доменов, что

приводит к высвобождению на поверхности IV домена участка, учавствующего в

димеризации рецептора [31]. У ErbB2 нет четко выраженного перехода между

закрытой и открытой формой конформации, а нативная конформация имеет

стуктуру сильно похожую на закрытую конформацию остальных членов

семейства. В связи с этим его IV домен экспонирует участки, необходимые для

димеризации, а димеризация рецептора может считаться лиганд-независимой.

Хотя ErbB2 не способен связываться с лигандами, известными для остальных

рецепторов семейства, он может функционировать в качестве корецептора [32].

Это имеет существенное значение, в частности для рецептора ErbB3, у которого

отсутствует тирозинкиназная активность, в связи с чем данный рецептор не может

передавать сигнал внутрь клетки без другого корецептора-партнера из семейства

Erb/EGFR. Димеризация ErbB2 с другой молекулой ErbB2 приводит к его

активации и трансфосфорилированию тирозинкиназных доменов. Данный процесс

запускает сигнальный каскад, индуцирующий аутокринную и паракринную

стимуляцию клеток, приводящую к их пролиферации и неконтролируемому росту

[33]. Согласно другим данным для злокачественного перерождения клеток

рецептору ErbB2 необходим партнер-корецептор ErbB3. Потеря функциональной

активности хотя бы одного из двух этих белков приводит к одинаково негативному

влиянию на темп клеточного роста и состоянию активности регуляторов

клеточного цикла и циклиновых киназ [34]. Основными путями, по которым

16

осуществляется передача сигнала внутрь клетки через ErbB2, являются PI3K-AKT и RAS-MAPK. Данные пути приводят к пролиферационным процессам в нормальных клетках человека, зависят от наличия EGF и других факторов роста и их взаимодействия с рецепторами семейства. В ErbB2+ опухолевых клетках запуск сигнального каскада осуществляется за счёт лиганд-независимой гомодимеризации ErbB2, что приводит к гиперстимуляции клеток и неконтролируемому росту их числа [35].

1.1.2 Химиотерапевтический подход лечения ЕгЬВ2+ опухолей

К основным способам лечения онкологических заболеваний можно отнести хирургию, лучевую терапию, химиотерапию, иммунотерапию и таргетную терапию. Хирургическое вмешательство, а также радиохирургия хорошо подходят для удаления и разрушения больших опухолей. Для этого также необходимо четко определить расположение опухоли, чтобы можно было воздействовать на неё физически. Однако, данные методы характеризуются высокой частотой рецедивирования и метастазирования. Химиотерапия является одним из наиболее развитых и распространённых методов терапии онкологических заболеваний и широко применяется на различных стадиях заболевания в комбинации с остальными способами лечения. При химиотерапевтическом лечении применяют цитостатические и антипролиферативные вещества, воздействующие на опухоль и другие активно делящиеся клетки организма, к которым можно отнести стволовые, клетки иммунной системы и другие. Такое лечение вызывает большое количество побочных эффектов, негативно влияет на иммунную систему и регенеративные способности тканей [36]. Цитостатики - одна из групп препаратов, использующихся в химиотерапевтическом подходе. Наиболее известным и широко используемым веществом, относящимся к данной группе, является метотрексат. Он может быть определен как антиметаболит, антагонист фолиевой кислоты. Метотрексат ингибирует дегидрофолатредуктазу, один из ключевых ферментов синтеза пуриновых оснований, что существенно замедляет скорость метаболизма

пуринов и приводит к приостановке синтетических процессов ДНК. Поскольку действие метотрексата не является специфическим по отношению к определенным тканям, он используется для терапии большого количества онкологических заболеваний: рака молочной железы, карционом, лимфом и других видов рака. К числу антиметаболитов также относят и другой широко применяемый препарат -фторурацил. Известно два основных механизма действия фторурацила: ингибирование тимидилатсинтазы, а также включение фторурацила в состав нуклеиновых кислот. Ингибирование тимидилатсинтазы, ключевого феремента синтеза ТМФ, приводит к нарушению синтеза пиримидиновых оснований и нарушает метаболизм нуклеиновых кислот. Фторурацил также может быть включен в состав мРНК, что может привести к преждевременной терминации транскрипции ДНК и абортивному синтезу мРНК, нарушению её вторичных структур, и в конечном итоге, негативно повлиять на синтез белка в клетке. Клетки опухолевых линий, культивируемые in vitro, активно реагируют на данные препараты, что выражается, в частности, значительном замедлении скорости клеточного роста [37] и гибели при высоких концентрациях веществ.

Некоторые из природных и синтетических антибиотиков обладают цитостатическим действием и используются для подавления роста опухолей. К ним относят доксорубицин, циклофосфамид, блеомицин и другие. Большинство антибиотиков данной группы связываются с ДНК и подавляют синтез нуклеиновых кислот. Вещества даннной группы, например, доксорубицин в частности, как и многие другие химиотерапевтические препараты, уступают по своей эффективности более современным таргетным лекарственным средствам. Так при терапии доксорубицином, уменьшение размера опухоли наблюдает лишь в 22-43% случаев [38, 39]. Ряд побочных эффектов, к которым можно отнести кардиотоксичноть, общую токсичность и другие, существенно ограничивают применение и дозирование цитостатиков и антибиотиков в онкологической практике [38].

Алкилирующие агенты являются третьей группой препаратов,

использующейся для химической терапии опухолей. К ним относят

18

циклофосфамид, нитрозомочевину, хлорамбуцил и ряд других веществ. Данные вещества в зависимости от механизма действия могут приводить к образованию ковалентных сшивок между цепями ДНК, одноцепочечных и двуцепочечных разрывов, а также модификации нуклеотиды. Наличие большого количества повреждений ДНК затрудняет репаративные процессы в клетке, в свою очередь это приводит к остановке репликативных процессов и может индуцировать проапоптотивные механизмы. Циклофосфамид и большинство других алкилирующих веществ обладают высоким уровнем кардиотоксичности, а также иммуносупрессивным действием, преимущественно по отношению к Р-клеткам [39].

Большое количество побочных эффектов, токсичностей и значительное ухудшение качества жизни пациентов являются лишь частью тех факторов, что приводят к значительным ограничениям в применении химиотерапии. Другой сложностью является низкая эффективность данного типа препаратов: частота ответа согласно разным исследованиям варьирует от 21 до 60 %, а частота полного исчезновения опухоли редко превышает 29% [40]. Кроме того, опухоли могут выработать механизмы резистентности к определённому классу препаратов, что приводит к необходимости полного изменения стратегии лечения. В такой ситуации для терапии могут быть использованы более новые препараты, относящиеся к ряду таксанов, например, паклитаксел и доцетаксел. Данные вещества воздействуют на структуру микротрубочек и ингибируют процесс их полимеризации и деполимеризации. Поскольку роль данных структурных элементов цитоскелета является очень важной в процессе клеточного деления, нарушение процессов их сборки и деполимеризации может привести к остановке клеточного деления. Современные протоколы лечения с помощью химиотерапевтических препаратов подразумевают комбинацию из нескольких препаратов, поскольку их совместное действие оказывается более эффективным [41]. В частности, комбинация доксорубицина и паклитакселя при терапии рака молочной железы приводит к увеличению на 11 -13% частоты ответа на терапию, по сравнению с монотерапией каждым из препаратов [42].

Отдельным классом химиотерапевтических агентов являются ингибиторы тирозинкиназ. Терапию с помощью данных препаратов можно также отнести к таргетной, поскольку новейшие из препаратов обладают специфичностью к определённому типу рецепторов. Ингибиторы тирозинкиназ препятствуют трансфосфорилированию тирозинкиназных доменов и передачи сигнала внутрь клетки по Р13К-АКТ и RAS-MAPK сигнальным путям. Таргетные химиотерапевтические прараты вызывают меньшее количество побочных эффектов и токсичностей чем таксаны и другие цитостатики [43]. Лапатиниб, специфический ингибитор тирозинкиназы рецепторов ЕгЬВ1 и ЕгЬВ2, относится к данному классу препаратов и на данный момент широко используется для терапии ЕгЬВ2+ опухолей как в качестве моноагента, так и в комбинированной терапии. Его применение также распространяется на опухоли, резистентные к препаратам моноклональных антител [44].

Недостатком химической терапии любыми из перечисленных веществ остаётся высокая токсичность, высокая степень снижения качества жизни, а также недостаточная эффективность по сравнению с более современными методами лечения, такими как иммунотерапия и таргетная терапия. И хотя при химиотерапии наблюдается высокая частота ответа, полная ремиссия достигается в небольшом количестве случаев. В связи с этим на практике химиотерапевтический метод лечения комбинируется с другими существующими способами терапии онкологических заболеваний.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Рыбченко Владислав Сергеевич, 2021 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1) https: //rosstat.gov.ru/folder/13721

2) Siegel R. L., Miller K. D., Fuchs H. E., Jemal A. Cancer Statistics, 2021 // CA Cancer J Clin. - 2021. - T. 71 С. 7-33.

3) Barchuk A., Bespalov A., Huhtala H., Chimed T., Laricheva I., Belyaev A., Bray F., Anttila A., Auvinen A. Breast and cervical cancer incidence and mortality trends in Russia 1980-2013 // Cancer Epidemiology. - 2018. - Т. 55. С. 73-80.

4) Cappuzzo F., Varella-Garcia M., Shigematsu H., Domenichini I., Bartolini S., Ceresoli G.L., Rossi E., Ludovini V., Gregorc V., Toschi L., Franklin W.A., Crino L., Gazdar A.F., Bunn P.A., Hirsch F.R. Increased HER2 Gene Copy Number Is Associated With Response to Gefitinib Therapy in Epidermal Growth Factor Receptor-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer Patients // Journal of clinical oncology. - 2005. - Т. 23. С. 5007-5018.

5) McPhai S., Johnson S., Greenberg D., Peake M., Rous B. Stage at diagnosis and early mortality from cancer in England // British Journal of Cancer. - 2015. - T. 112, - C.108-115.

6) Narod S. A., Iqbal J., Miller A. B. Why have breast cancer mortality rates declined? // Journal of Cancer Policy. - 2015. - Т. 5, - С. 8-17.

7) Howlader N.,Forjaz G., Mooradian M.J., Meza R., Kong C-Y., Cronin K.A., Mariotto A.B., Lowy D.R., Feuer E.J. The Effect of Advances in Lung-Cancer Treatment on Population Mortality // Th e new england journal o f medicine. -2020. - Т. 383. - С. 640-649.

8) Поляновский О. Л., Лебеденко Е. Н., Деев С. М. ErbB-Онкогены -Мишени Моноклональных Антител // БИОХИМИЯ. - 2012. -Т. 77, № 3. -С. 289-311.

9) Verma S., Miles D., Gianni L., Krop I. E., Welslau M., Baselga J., Pegram M., Oh D.-Y., Dieras V., Guardino E., Fang L., Lu M. W., Olsen S., Blackwel K. Trastuzumab Emtansine for HER2-Positive Advanced Breast Cancer // The New England Journal of Medicine. - 2012. -T. 367, № 19. - C. 1783-1791.

10) SanceÄau J., Poupon M-F., Delattre O., Sastre-Garau X., Wietzerbin J. Strong inhibition of Ewing tumor xenograft growth by combination of human interferon-alpha or interferon-beta with ifosfamide // Oncogene. - 2002. - T. 21, - C. 7700 - 7709.

11) Murata M., Nabeshima S., Kikuchi K., Yamaji K., Furusyo N., Hayashi J. A comparison of the antitumor effects of interferon-a and b on human hepatocellular carcinoma cell lines // Cytokine. - 2006. - T. 33, - C. 121-128.

12) Andreev J., Thambi N., Perez Bay A. E., Delfino F., Martin J., Kelly M. P., Kirshner J. R., Rafique A., Kunz A., Nittoli T., MacDonald D., Daly C., Olson W., Thurston G. Bispecific Antibodies and Antibody-Drug Conjugates (ADCs) Bridging HER2 and Prolactin Receptor Improve Efficacy of HER2 ADCs // Mol Cancer Ther. -2017. - T. 16, № 4. - C. 681 - 693.

13) Li B., Meng Y., Zheng L., Zhang X., Tong Q., Tan W., Hu S., Li H., Chen Y., Song J., Zhang G., Zhao L., Zhang D., Hou S., Qian W., Guo Y. Bispecific Antibody to ErbB2 Overcomes Trastuzumab Resistance through Comprehensive Blockade of ErbB2 Heterodimerization // Cancer Res. - 2013. - T. 73, № 21. - C. 6471-6483.

14) Lee C. G., Kim T., Hong S., Chu J., Kang J. E., Park H. G., Choi J. Y., Song K., Rha S. Y., Lee S., Choi J.-S., Kim S. M., Jeong H. M., Shin Y. K. Antibody-Based Targeting of Interferon-Beta-1a Mutein in HER2-Positive Cancer Enhances Antitumor Effects Through Immune Responses and Direct Cell Killing // Frontiers in Pharmacology. - 2021. -T. 11, - C. 608774.

15) https: //www.who .int/ru/news-room/fact-sheets/detail/cancer

16) Srivastava S., Koay E. J., Borowsky A.D., De Marzo A. M., Ghosh S., Wagner P. D., Kramer B. S. Cancer overdiagnosis: a biological challenge and clinical dilemma // Nature Reviews Cancer. - 2019. -T. 19, № 6. - C. 349-358.

17) DeSantis C. E., Lin C. C., Mariotto A. B., Siegel R. L., Stein K. D., Kramer J. L., Alteri R., Robbins A. S., Jemal A. Cancer Treatment and Survivorship Statistics, 2014 // CA: A Cancer Journal for Clinicians. - 2014. - T. 64, - C. 252-271.

18) Torre L. A., Siegel R. L., Ward E. M., Jemal A. Global Cancer Incidence and Mortality Rates and Trends—An Update // Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. -2016. - T. 25, № 1. - C. 16-27.

19) https://www.who .int/news-room/fact-sheets/detail/cancer

20) Waks A. G., Winer E. P. Breast Cancer Treatment A Review // JAMA. -2019. -T. 321, № 3. - C. 288-300.

21) Cappuzzo F., Varella-Garcia M., Shigematsu H., Domenichini I., Bartolini S., Ceresoli G. L., Rossi E., Ludovini V., Gregorc V., Toschi L., Franklin W. A., Crino L., Gazdar A. F., Bunn Jr P. A., Hirsch F. R. Increased HER2 Gene Copy Number Is Associated With Response to Gefitinib Therapy in Epidermal Growth Factor Receptor-Positive Non-Small-Cell Lung Cancer Patients // Journal of Clinical Oncology. - 2005.

- T. 23, № 22. - C. 5007-5018.

22) Engelman J. A., Cantley L. C. The Role of the ErbBFamilyMembers in Non-Small Cell Lung Cancers Sensitive to Epidermal Growth Factor Receptor Kinase Inhibitors // Clin Cancer Res. - 2006. -T. 12, - C. 4372s-4376s.

23) The human protein atlas: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000141736-ERBB2/pathology [4]

24) Ursini-Siegel J., Schade B., Cardiff R. D., Muller W. J. Insights from transgenic mouse models of ERBB2-induced breast cancer // Nat. Rev. Cancer. - 2007.

- T. 7, % 5. - C. 389-397.

25) Yang G., Cai K. Q., Thompson-Lanza J. A., Bast R. C., Liu J. Inhibition of Breast and Ovarian Tumor Growth through Multiple Signaling Pathways by Using Retrovirus-mediated Small Interfering RNA against Her-2/neu Gene Expression // The Journal of Biological Chemistry. - 2004. - T. 279, № 6. - C. 4339-4345.

26) Ross J. S., Fakih M., Ali S. M., Elvin J. A., Schrock A. B., Suh J., Vergilio J.-A., Ramkissoon S., Severson E., Daniel S., Fabrizio D., Frampton G., Sun J., Miller V. A., Stephens P. J., Gay L. M. Targeting HER2 in Colorectal Cancer: The Landscape of Amplification and Short Variant Mutations in ERBB2 and ERBB3 // Cancer. - 2018.

- T. 124, № 7. - C. 1358-1373.

27) Hyman D. M., Piha-Paul S. A., Won H., Rodon J., Saura C., Shapiro G. I., Juric D., Quinn D. I. et al. HER kinase inhibition in patients with HER2- and HER3-mutant cancers // Nature. - 2 0 1 8. - T. 5 5 4. - C. 1 8 9-195.

28) Mineev K. S., Bocharov E. V., Pustovalova Y. E., Bocharova O. V., Chupin V. V., Arseniev A. S. Spatial Structure of the Transmembrane Domain Heterodimer of ErbB1 and ErbB2 Receptor Tyrosine Kinases // J. Mol. Biol. - 2010. - T. 400, - C. 231-243.

29) UniProt database: https://www.uniprot.org/uniprot/P04626 [6]

30) Klapper l. N., Glathe S., Vaisman N., Hynes N. E., Andrews^G. C., Sela M., Yarden Y. The ErbB2/HER2 oncoprotein of human carcinomas may function solely as

a shared coreceptor for multiple stroma-derived growth factors // PNAS - 1999. - t. 96,

- c. 4995-5000.

31) Cho H-S., Mason K., Ramyar K. X., Stanley A. M., Gabelli S. B., Denney D. W., Leahy D. J. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab // Nature. - 2003. - T. 421, - C. 765-760.

32) Fitzpatrick V. D., Pisacane P. I., Vandlen R. L., Sliwkowski M. X. Formation of a high affinity heregulin binding site using the soluble extracellular domains of ErbB2 with ErbB3 or ErbB4 // FEBS Letters. - 1998. - T. 431, - C. 102106.

33) Press M. F., Lenz H-J. EGFR, HER2 and VEGF Pathways // Drugs. - 2007.

- T. 67, № 14. - C. 2045-2075.

34) Holbro T., Beerli R. R., Maurer F., Koziczak M., Barbas C. F., Hynes N. E. The ErbB2/ErbB3 heterodimer functions as an oncogenic unit: ErbB2 requires ErbB3 to drive breast tumor cell proliferation // PNAS. - 2003. - T. 100, № 15. - C. 8933-8938.

35) Weigelt B., Lo A. T., Park C. C., Gray J. W., Bissell M. J. HER2 signaling pathway activation and response of breast cancer cells to HER2-targeting agents is dependent strongly on the 3D microenvironment // Breast Cancer Res Treat. - 2010. -T. 122, - C. 35-43.

36) Jolivet J., Cowan K. H., Curt G. A., Clendeninn N. J., Chabner B. A. The pharmacology and clinical use of methotrexate // The new England journal of medicine. - 1983. - T. 309, № 18. - C. 1094-1104.

37) Diasio R. B., Harris B. E. Clinical Pharmacology of 5-Fluorouracil // Clinical Pharmacokinetics. - 1989. - T. 16. - C. 215-237.

38) Neidhart J. A., Gochnour D., Roach R., Hoth D., Young D. A Comparison of Mitoxantrone and Doxorubicin in Breast Cancer // Journal of Clinical Oncology. -1986. - T. 4, № 5. - C. 672-677.

39) Batist G., Ramakrishnan G., Rao Ch. S., Chandrasekharan A., Gutheil J., Guthrie T., Shah P., Khojasteh A., Nair M. K., Hoelzer K., Tkaczuk K., Park Y. C., Lee L. W. Reduced Cardiotoxicity and Preserved Antitumor Efficacy of Liposome-Encapsulated Doxorubicin and Cyclophosphamide Compared With Conventional Doxorubicin and Cyclophosphamide in a Randomized, Multicenter Trial of Metastatic Breast Cancer // Journal of Clinical Oncology. - 2001. - T. 19, № 5. - C. 1444-1454.

40) Perez E. A. Paclitaxel in Breast Cancer // The Oncologist. - 1998. - T. 3. -C. 373-389.

41) Crivellari D., Bonetti M., Castiglione-Gertsch M., Gelber R. D., Rudenstam C-M., Thurlimann B., Price K. N., Coates A. S., Hu'rny C., Bernhard J., Lindtner J., Collins J., Senn H-J., Cavalli F., Forbes J., Gudgeon A., Simoncini E., Cortes-Funes H., Veronesi A., Fey M., Goldhirsch A. Burdens and Benefits of Adjuvant Cyclophosphamide, Methotrexate, and Fluorouracil and Tamoxifen for Elderly Patients With Breast Cancer: The International Breast Cancer Study Group Trial VII // Journal of Clinical Oncology. - 2000. - T. 18, № 7. - C. 1412-1422.

42) Sledge G. W., Neuberg D., Bernardo P., Ingle J. N., Martino S., Rowinsky E. K., Wood W. C. Phase III Trial of Doxorubicin, Paclitaxel, and the Combination of Doxorubicin and Paclitaxel as Front-Line Chemotherapy for Metastatic Breast Cancer: An Intergroup Trial (E1193) // Journal of Clinical Oncology. - 2003. - T. 21, № 4. - C. 588-592.

43) Bilancia D., Rosati G., Dinota A., Germano D., Romano R., Manzione L.

Lapatinib in breast cancer // Annals of Oncology. - 2007. - T. 18, 6. - C. vi26-vi30.

132

44) Nahta R., Yuan L. X. H., Du Y., Esteva F. J. Lapatinib induces apoptosis in trastuzumab-resistant breast cancer cells: effects on insulin-like growth factor I signaling // Mol Cancer Ther. - 2007. - T. 6, № 2. - 667-674.

45) Gresser I., Bourali C.,Levy J. P., Fontaine-Brouty-Boye D., Thomas I. T. Increased survival in mice inoculated with tumor Cells and treated with interferon preparations // Physiology. - 1969. -T. 63, - C. 51-57.

46) SanceAau J., Poupon M-F., Delattre O., Sastre-Garau X., Wietzerbin J. Strong inhibition of Ewing tumor xenograft growth by combination of human interferon-alpha or interferon-beta with ifosfamide // Oncogene. - 2002. - T. 21, - C. 7700 - 7709.

47) Murata M., Nabeshima S., Kikuchi K., Yamaji K., Furusyo N., Hayashi J. A comparison of the antitumor effects of interferon-a and b on human hepatocellular carcinoma cell lines // Cytokine. - 2006. - T. 33, - C. 121-128.

48) Matsuoka M., Tani K., Asano S. Interferon-a-induced G1 phase arrest through up-regulated expression of CDK inhibitors, p19Ink4D and p21Cip1 in mouse macrophages // Oncogene. - 1998. - T. 16, - C. 2075-2086.

49) Garrison J. I., Berens M. E., Shapiro J. R., Treasurywala S., Floyd-Smith G. Interferon-J3 inhibits proliferation and progression through S phase of the cell cycle in five glioma cell lines // Journal of Neuro-Oncology. - 1996. - T. 30, - C. 213-223.

50) Dubik D., Dembinski T. C., Shiu R. P. C. Stimulation of c-myc Oncogene Expression Associated with Estrogen-induced Proliferation of Human Breast Cancer Cells // Cancer research. - 1987. - T. 47, - C. 6517-6521.

51) Rodriguez-Villanueva J., Mcdonnell T. J. Induction of apoptotic cell death in non-melanoma skin cancer by interferon-a // Int. J. Cancer. - 1995. -T. 61, - C. 110114.

52) Bekisz J., Baron S., Balinsky C., Morrow A., Zoon K. C. Antiproliferative Properties of Type I and Type II Interferon // Pharmaceuticals. - 2010. - T. 3, - C. 9941015.

53) Natsume A., Tsujimura K., Mizuno M., Takahashi T., Yoshida J. IFN-gene therapy induces systemic antitumor immunity against malignant glioma // Journal of Neuro-Oncology. - 2000. - Т. 47, - С. 117-124.

54) Hervas-Stubbs S., Perez-Gracia J. L., Rouzaut A., Sanmamed M. F., Bon A. L., Melero I. Direct Effects of Type I Interferons on Cells of the Immune System // Clin Cancer Res. - 2011. -Т. 17, № 9. - С. 2619-2627.

55) Targan S., Dorey F. Interferon activation of "pre-spontaneous killer" (pre-sk) cells and alteration in kinetics of lysis of both "pre-sk" and active sk cells // The Journal of immunology. - 1980. - Т. 124, № 5. - С. 2157-2161.

56) Bogdan C., Mattner J., Schleicher U. The role of type I interferons in non-viral infections // Immunological Reviews. - 2004. - Т. 202, - С. 33-48.

57) Dall'Acqua W., Simon A. L., Mulkerrin M. G., Carter P. Contribution of Domain Interface Residues to the Stability of Antibody CH3 Domain Homodimers // Biochemistry. - 1998. - Т. 37, - С. 9266-9273.

58) Folkman J. Role of Angiogenesis in Tumor Growth and Metastasis // Seminars in Oncology. - 2002. - Т. 29, № 6. - С.15-18.

59) Baker D. P., Lin E. Y., Lin K., Pellegrini M., Petter R. C., Chen L. L., Arduini R. M., Brickelmaier M., Wen D., Hess D. M., Chen L., Grant D., Whitty A., Gill A., Lindner D. J., Pepinsky R. B. N-Terminally PEGylated Human Interferon-a-1a with Improved Pharmacokinetic Properties and in Vivo Efficacy in a Melanoma Angiogenesis Model // Bioconjugate Chem. - 2006. - Т. 17, - С. 179-188.

60) Кособокова Е., Косоруков В. ИНТЕРФЕРОНЫ В ОНКОЛОГИИ // Врач. - 2010. - Т. 11. - С. 18-20.

61) Chawla-Sarkar M., Leaman D. W., Borden E. C. Preferential Induction of Apoptosis by Interferon (IFN)-b Compared with IFN-a2: Correlation with TRAIL/Apo2L Induction in Melanoma Cell Lines // Clinical Cancer Research. - 2001. - Т. 7, - С. 1821-1831.

62) Murata M., Nabeshima S., Kikuchi K., Yamaji K., Furusyo N., Hayashi J. A comparison of the antitumor effects of interferon-a and b on human hepatocellular carcinoma cell lines // Cytokine. - 2006. - Т. 33, - С. 121-128.

63) Salmon P., Cotonnec Y. L., Galazka A., Abdul-Ahad A., Darragh A. Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Recombinant Human Interferon-P in Healthy Male Volunteers // Journal Of Interferon And Cytokine Research. - 1996. -T.16, - C. 759-764.

64) Suzuki K., Aoki K., Ohnami S., Yoshida K., Kazui T., Kato N., Inoue K., Kohara M., Yoshida T. Adenovirus-mediated gene transfer of interferon a improves dimethylnitrosamine-induced liver cirrhosis in rat model // Gene Therapy. - 2003. - T. 10, - C. 765-773.

65) Vial T., Descotes J. Clinical Toxicity of the Interferons // Drug Safety. -1994. - T. 10, № 2. - C. 115-150.

66) Lee C. G., Kim T., Hong S., Chu J., Kang J. E., Park H. G., Choi J. Y., Song K., Rha S. Y., Lee S., Choi J-S., Kim S. M., Jeong H. M., Shin Y. K. Antibody-Based Targeting of Interferon-Beta-1a Mutein in HER2-Positive Cancer Enhances Antitumor Effects Through Immune Responses and Direct Cell Killing // Frontiers in Pharmacology. - 2021. - T. 11. - C. 608774.

67) Yamada R., Steward K., Ngarmchamnanrith G., Trinh R., Khare S., Sachdev R., Grewal i., Morrison S., Timmerman J. Antibody-CD20-interferon-alpha fusion protein has superior in vivo activity against human B cell lymphomas compared to Rituximab, and enhanced complement-dependent cytotoxicity in vitro // Journal for ImmunoTherapy of Cancer. - 2013. - (Suppl 1). - C. 263.

68) Young P. A., Morrison S. L., Timmerman J. M. Antibody-cytokine fusion proteins for Treatment of cancer: engineering cytokines For improved efficacy and Safety // Semin Oncol. - 2014. - T. 41, № 5. - C. 623-36.

69) Mimura K., Kono K., Hanawa M., Kanzaki M., Nakao A., Ooi A., Fujii H. Trastuzumab-Mediated Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity against Esophageal Squamous Cell Carcinoma // Clin Cancer Res. - 2005. - T. 11, № 13. - C. 4898-4904.

70) Scheuer W., Friess T., Burtscher H., Bossenmaier B., Endl J., Hasmann M. Strongly Enhanced Antitumor Activity of Trastuzumab and Pertuzumab Combination Treatment on HER2-Positive Human Xenograft Tumor Models // Cancer Res. - 2009. -T. 69, № 24. - C. 9330-9336.

71) Burris H. A., Giaccone G., Im S-A., Bauer T. M., Trepel J. B., Nordstrom J. L. Phase I study of margetuximab (MGAH22), an FC-modified chimeric monoclonal antibody (MAb), in patients (pts) with advanced solid tumors expressing the HER2 oncoprotein // Journal of Clinical Oncology. - 2013. - T. 31, № 15. - C. 3004-3004.

72) Wu X., Chen S., Lin L., Liu J., Wang Y., Li Y., Li Q., Wang Z. A Single Domain Based Anti-Her2 Antibody Has Potent Antitumor Activities // Translational Oncology. - 2018. - T. 11, № 2. - C. 366-372.

73) Berns K., Horlings H. M., Hennessy B. T., Madiredjo M., Hijmans E. M., Beelen K., Linn S. C., Gonzalez-Angulo A. M., Stemke-Hale K., Hauptmann M., Beijersbergen R. L., Mills G. B., van de Vijver M. J., Bernards R. A Functional Genetic Approach Identifies the PI3K Pathway as a Major Determinant of Trastuzumab Resistance in Breast Cancer // Cancer Cell. - 2007. - T. 12, - C. 395-402.

74) Gilabert-Oriol R., Thakur M., von Mallinckrodt B., Hug T., Wiesner B., Eichhorst J., Melzig M. F., Fuchs H., Weng A. Modified trastuzumab and cetuximab mediate efficient toxin delivery while retaining antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity in target cells // Mol Pharm. - 2013. - T. 10, № 11. - C. 4347-4357.

75) von Minckwitz G., Huang C.-S., Mano M.S., Loibl S., Mamounas E.P., Untch M., Wolmark N., Rastogi P., Schneeweiss A., Redondo A., Fischer H.H., Jacot W., Conlin A.K., Arce-Salinas C., Wapnir I.L., Jackisch C., DiGiovanna M.P., Fasching P.A., Crown J.P., Wulfing P., Shao Z., Caremoli E. R., Wu H., Lam L.H., Tesarowski D., Smitt M., Douthwaite H., Singel S.M., Geyer C.E. Trastuzumab Emtansine for Residual Invasive HER2-Positive Breast Cancer // The New England Journal of Medicine. - 2019. - T..380, №. 7. - C. 617-628.

76) Cohen R., Vugts D. J., Visser G. W. M., Stigter-van Walsum M., Bolijn M., Spiga M., Lazzari P., Shankar S., Sani M., Zanda M., van Dongen G. A. M. S. Development of Novel ADCs: Conjugation of Tubulysin Analogues to Trastuzumab Monitored by Dual Radiolabeling // Cancer Res. - 2014. - T. 74, № 20. - C. 57005710.

77) Tamura K., Tsurutani J., Takahashi S., Iwata H., Krop I. E., Redfern C.,

Sagara Y., Doi T., Park H., Murthy R. K., Redman R. A., Jikoh T., Lee C., Sugihara M.,

136

Shahidi J., Yver A., Modi S. Trastuzumab deruxtecan (DS-8201a) in patients with advanced HER2-positive breast cancer previously treated with trastuzumab emtansine: a dose-expansion, phase 1 study // The lancet oncology.- 2019. - T. 20, - C. 816-826.

78) Staudacher A. H., Liapis V., Brown M. P. Therapeutic targeting of tumor hypoxia and necrosis with antibody a-radioconjugates // Antibody Therapeutics. -2018. - T. 1, № 2. - C. 55-63

79) Dziawer L., Majkowska-Pilip A., Gawel D., Godlewska M., Pruszynski M., Jastrzebski J., Was B., Bilewicz A. Trastuzumab-Modified Gold Nanoparticles Labeled with 211At as a Prospective Tool for Local Treatment of HER2-Positive Breast Cancer // Nanomaterials. - 2019. - T. 9, № 4. - C. 632-647.

80) Meric-Bernstam F., Beeram M., Mayordomo J. I., Hanna D. L., Ajani J. A., Blum Murphy M. A., Murthy R. K., Piha-Paul S. A., Bauer T. M., Bendell J. C., El-Khoueiry A. B., Lenz H-J., Press M. F., Royer N., Hausman D. F., Hamilton E. P. Single agent activity of ZW25, a HER2-targeted bispecific antibody, in heavily pretreated HER2-expressing cancers // Journal of Clinical Oncology. - 2018. - T. 36, № 15. Suppl. [https://ascopubs.org/doi/abs/10.1200/JCO.2018.36.15_suppl.2500]

81) Alsina M., Boni V., Schultink A. de V., Moreno V., Bol K., Westendorp M., Sirulnik L. A., Tabernero J., Calvo E. First-in-human phase 1/2 study of MCLA-128, a full length IgG1 bispecific antibody targeting HER2 and HER3; final phase 1 data and preliminary activity in HER2+ metastatic breast cancer // Poster. American Society of Clinical Oncology, Annual Meeting, June 2-6, 2017; Chicago, Illinois, USA

82) Hamilton E. P., Petit T., Pistilli B., Goncalves A., Ferreira A. A., Dalenc F. Clinical activity of MCLA-128 (zenocutuzumab), trastuzumab, and vinorelbine in HER2 amplified metastatic breast cancer (MBC) patients (pts) who had progressed on anti-HER2 ADCs // Journal of Clinical Oncology. - 2020. - T. 38, № 15. Suppl 30933093.

83) Wermke M., Alt J., Kauh J. S., Back J., Salhi Y., Reddy V., Bayever E., Ochsenreither S. Preliminary biomarker and pharmacodynamic data from a phase I study of single-agent bispecific antibody T-cell engager GBR 1302 in subjects with

HER2-positive cancers // Journal of Clinical Oncology. - 2018. - T. 36, № 5. suppl 6969.

84) Hinner M. J., Bel Aiba R-S., Wiedenmann A., Schlosser C., Allersdorfer A., Matschiner G., Rothe C., Moebius U., Kohrt H. E., Olwill S. E. Costimulatory T cell engagement via a novel bispecific anti-CD137 /anti-HER2 protein // Journal for ImmunoTherapy of Cancer. - 2015. - T. 3, Suppl 2. - C. 187.

85) Clarke J., Cota E., Fowler S. B., Hamill S. J. Folding studies of immunoglobulin-like b-sandwich proteins suggest that they share a common folding pathway // Structure. - 1999. - T. 7, № 9. - C. 1145-1153.

86) Klinger M., Brandl C., Zugmaier G., Hijazi Y., Bargou R. C., Topp M. S., Gokbuget N., Neumann S., Goebeler M., Viardot A., Stelljes M., Bruggemann M., Hoelzer D., Degenhard E., Nagorsen D., Baeuerle P. A., Wolf a., Kufer P. Immunopharmacologic response of patients with B-lineage acute lymphoblastic leukemia to continuous infusion of T cell-engaging CD19/CD3-bispecific BiTE antibody blinatumomab // BLOOD. - 2012. - T. 119, № 26. - C. 6226-6233.

87) Lu D., Jimenez X., Zhang H., Bohlen P., Witte L., Zhu Z. Fab-scFv fusion protein: an efficient approach to production of bispecific antibody fragments // Journal of Immunological Methods. - 2002. - T. 267. - C. 213- 226.

88) Lizuka A., Nonomura C., Ashizawa T., Kondou R., Ohshima K., Sugino T., Mitsuya K., Hayashi N., Nakasu Y., Maruyama K., Yamaguchi K., Akiyama Y. A T-cell-engaging B7-H4/CD3-bispecific Fab-scFv Antibody Targets Human Breast Cancer // Clin Cancer Res. - 2019. - T. 25, № 9. - C. 2925-2934.

89) Asano R., Sone Y., Makabe K., Tsumoto K., Hayashi H., Katayose Y., Unno M., Kudo T., Kumagai I. Humanization of the Bispecific Epidermal Growth Factor Receptor CD3 Diabody and Its Efficacy as a Potential ClinicalReagent // Clin Cancer Res. - 2006. - T.12, № 13. - C. 4036-4042.

90) Brischwein K., Schlereth B., Guller B., Steiger C., Wolf A., Lutterbuese R., Offner S., Locher M., Urbig T., Rauma T., Kleindienst P., Wimberger P., Kimmigc R., Fichtner I., Kufer P., Hofmeister R., da Silva A. J., Baeuerle P. A. MT110: A novel

bispecific single-chain antibody construct with high efficacy in eradicating established tumors // Molecular Immunology. - 2006. - T. 43, - C. 1129-1143.

91) Baeuerle P. A., Reinhardt C. Bispecific T-Cell Engaging Antibodies for Cancer Therapy // Cancer Res. - 2009. - T. 69, № 12. - C. 4941-4944.

92) Johnson S., Burke S., Huang L., Gorlatov S., Li H., Wang W., Zhang W., Tuaillon N.,Rainey J., Barat B., Yang Y., Jin L., Ciccarone V., Moore P. A., Koenig S., Bonvini E. Effector Cell Recruitment with Novel Fv-based Dual-affinity Re-targeting Protein Leads to Potent Tumor Cytolysis and in Vivo B-cell Depletion // J. Mol. Biol. -2010. - T. 399, - C. 436-449.

93) Circosta P., Elia A. R., Landra I., Machiorlatti R., Todaro M., Aliberti S., Brusa D., Deaglio S., Chiaretti S., Bruna R., Gottardi D., Massaia M., Di Giacomo F., Guarini A. R., Foa R., Kyriakides P. W., Bareja R., Elemento O., Chichili G. R., Monteleone E., Moore P. A., Johnson S., Bonvini E., Cignetti A., Inghirami G. Tailoring CD19xCD3-DART exposure enhances Tcells to eradication of B-cell neoplasms // Oncoimmunology. - 2018. - T. 7, № 4. - C. e1341032.

94) Root A. R., Cao W., Li B., LaPan P., Meade C., Sanford J., Jin M., O'Sullivan C., Cummins E., Lambert M., Sheehan A. D., Ma W., Gatto S., Kerns K., Lam K., D'Antona A. M., Zhu L., Brady W. A., Benard S., King A., He T., Racie L., Arai M., Barrett D., Stochaj W., LaVallie E. R., Apgar J. R., et al. Development of PF-06671008, a Highly Potent Anti-P-cadherin/Anti-CD3 Bispecific DART Molecule with Extended Half-Life for the Treatment of Cancer // Antibodies. - 2016. - T. 5, № 6.

95) Brien J. D., Sukupolvi-Petty S., Williams K. L., Lam C-Y. K., Schmid M. A., Johnson S., Harris E., Diamond M. S. Protection by Immunoglobulin Dual-Affinity Retargeting Antibodies against Dengue Virus // Journal of Virology. - 2013. - T. 87, № 13. - C. 7747-7753.

96) Poljak R. J. Production and structure of diabodies // Structure. - 1994. - T. 2, - C. 1121-1123.

97) Lu D., Jimenez X., Witte L., Zhu Z. The effect of variable domain orientation and arrangement on the antigen-binding activity of a recombinant human

bispecific diabody // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2004. - T. 318. - C. 507-513.

98) Bühler P., Wolf P., Gierschner D., Schaber I., Katzenwadel A., Schultze-Seemann W., Wetterauer U., Tacke M., Swamy M., Schamel W. W. A., Elsässer-Beile U. A bispecific diabody directed against prostate-specific membrane antigen and CD3 induces T-cell mediated lysis of prostate cancer cells // Cancer Immunol Immunother. -2008. - T. 57. - C. 43-52.

99) Hayashi H., Asano R., Tsumoto K., Katayose Y., Suzuki M., Unno M., Kodama H., Takemura S-i., Yoshida H., Makabe K., Imai K., Matsuno S., Kumagai I., Kudo T. A highly effective and stable bispecific diabody for cancer immunotherapy: cure of xenografted tumors by bispecific diabody and T-LAK cells // Cancer Immunol Immunother. - 2004. - T. 53, - C. 497-509.

100) Sonn G. A., Behesnilian A. S., Jiang Z. K., Zettlitz K. A., Lepin E. J., Bentolila L. A., Knowles S. M., Lawrence D., Wu A. M., Reiter R. E. Fluorescent Image-Guided Surgery with an Anti-Prostate Stem Cell Antigen (PSCA) Diabody Enables Targeted Resection of Mouse Prostate Cancer Xenografts in Real-Time // Clin Cancer Res. - 2016. - T. 22, № 6. - C. 1403-1412.

101) Reusch U., Duell J., Ellwanger K., Herbrecht C., Knackmuss S. HJ., Fucek I., Eser M., McAleese F., Molkenthin V., Gall F. L., Topp M., Little M., Zhukovsky E. A. A tetravalent bispecific TandAb (CD19/CD3), AFM11, efficiently recruits T cells for the potent lysis of CD19+ tumor cells // mAbs. - 2015. - T. 7, № 3. - C. 584—604.

102) Zhang X., Yang Y., Zhang L., Lu Y., Zhang Q., Fan D., Zhang Y., Zhang Y., Ye Z., Xiong D. Mesenchymal stromal cells as vehicles of tetravalent bispecific Tandab (CD3/CD19) for the treatment of B cell lymphoma combined with IDO pathway inhibitor D-1-methyl-tryptophan // Journal of Hematology & Oncology. -2017. - T. 10. - C. 56.

103) Ellwanger K., Reusch U., Fucek I., Knackmuss S., Weichel M., Gantke T., Molkenthin V., Zhukovsky E. A., Tesar M., Treder M. highly specific and effective Targeting of EGFRvIII -Positive Tumors with Tandab antibodies // Frontiers in Oncology. - 2017. - T. 7. - C. 100.

104) Reusch U., Burkhardt C., Fucek I., Le Gall F., Le Gall M., Hoffmann K., Knackmuss S. HJ, Kiprijanov S., Little M., Zhukovsky E. A. A novel tetravalent bispecific TandAb (CD30/CD16A) efficiently recruits NK cells for the lysis of CD30+ tumor cells // mAbs. - 2014. - Т. 6, № 3. - С. 727-738.

105) Haraldsson B., Nystrom J., Deen W. M. Properties of the Glomerular Barrier and Mechanisms of Proteinuria // Physiol Rev. - 2008. - Т. 88. - С. 451-487.

106) Pavlinkova G, Beresford G. W., Booth B. J. M., Batra S. K., Colcher D. Pharmacokinetics and Biodistribution of Engineered Single-Chain Antibody Constructs of MAb CC49 in Colon Carcinoma Xenografts // The Journalof Nuclearmedicine. -1999. - Т. 40, № 9, - С. 1536-1546.

107) Mertens N. Tribodies: Fab-scFv Fusion Proteins as a Platform to Create Multifunctional Pharmaceuticals // Bispecific Antibodies. - С. 135-149. https://link. springer.com/chapter/10.1007%2F978-3-642-20910-9_8

108) Nicholson R. I., Gee J. M. W., Harper M. E. EGFR and cancer prognosis // European Journal of Cancer. - 2001. - Т. 37. - С. S9-S15.

109) Fury M. G., Lipton A., Smith K. M., Winston C. B., Pfister D. G. A phase-I trial of the epidermal growth factor receptor directed bispeciWc antibody MDX-447 without and with recombinant human granulocyte-colony stimulating factor in patients with advanced solid tumors // Cancer Immunol Immunother. - 2008. - Т. 57, - С. 155163.

110) James N. D., Atherton P. J., Jones J., Howie A. J.,Tchekmedyian S., Curnow R. T. A phase II study of the bispecific antibody MDX-H210 (anti-HER2 x CD64) with GM-CSF in HER2+ advanced prostate cancer // British Journal of Cancer. - 2001. - Т. 85, № 2. - С. 152-156.

111) Muyldermans S. Nanobodies: Natural Single-Domain Antibodies // Annu. Rev. Biochem. - 2013. - Т. 82. - С. 775-797.

112) Kijanka, Dorresteijn, Oliveira, van Bergen. Nanobody-based cancer therapy of solid tumors // Nanomedicine (Lond.). - 2015. - Т. 10, № 1, - С. 161-174.

113) Bannas P., Lenz A., Kunick V., Fumey W., Rissiek B., Schmid J., Haag F., Leingärtner A., Trepel M., Adam G., Koch-Nolte F. Validation of Nanobody and

Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy // Journal of Visualized Experiments. - 2015. - T. 98, - C. 52462.

114) Merlot A. M., Kalinowski D. S., Kovacevic Z., Jansson P. J., Lane D. JR., Huang M. L-H., Sahni S. Making a case for albumin - a highly promising drug-delivery system // Future Med. Chem. - 2015. - T. 7, № 5. - C. 553-556.

115) https://www.ablynx.com/uploads/home/0f2be188-88e3-4659-b582-d50f1fe39da5-corporatepresentation_july2017_website.pdf

116) https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02156466?term=MSB0010841 &cond =Psoriasis&draw=2&rank= 1

117) Coppieters K., Dreier T., Silence K., de Haard H., Lauwereys M., Casteels P., Beirnaert E., Jonckheere H., Van de Wiele C., Staelens L., Hostens J., Revets H., Remaut E., Elewaut D., Rottiers P. Formatted Anti-Tumor Necrosis Factor _ VHH Proteins Derived From Camelids Show Superior Potency and Targeting to Inflamed Joints in a Murine Model of Collagen-Induced Arthritis // Arthritis & Rheumatism. -2006. -T. 54, № 6. - C.1856-1866.

118) Muyldermans S. Single domain camel antibodies: current status // Reviews in Molecular Biotechnology. - 2001. - T. 74, - C. 277-302.

119) Cortez-Retamozo V., Lauwereys M., Hassanzadeh GH. G., Gobert M., Conrath K., Muyldermans S., De Baetselier P., Revets H. Efficient Tumor Targeting By Single-Domain Antibody Fragments Of Camels // Int. J. Cancer. - 2002. - T. 98, - C. 456-462.

120) Strop P., Ho W-H., Boustany L. M., Abdiche Y. N., Lindquist K. C., Farias S. E., Rickert M., Appah C. T., Pascua E., Radcliffe T., Sutton J., Chaparro-Riggers J., Chen W., Casas M. G., Chin S. M., Wong O. K, Liu S-L., Vergara G., Shelton D., Rajpal A., Pons J. Generating Bispecific Human IgG1 and IgG2 Antibodies from Any Antibody Pair // J. Mol. Biol. - 2012. - T. 420, - C. 204-219.

121) Gelderman K. A., Blok V. T., Fleuren G. J., Gorter A. The Inhibitory Effect of CD46, CD55, and CD59 on Complement Activation After Immunotherapeutic Treatment of Cervical Carcinoma Cells with Monoclonal Antibodies or Bispecific

Monoclonal Antibodies // Laboratory Investigation. - 2002. - T. 82, № 4. - C. 483493.

122) Jefferis R. Glycosylation of Recombinant Antibody Therapeutics // Biotechnol. Prog. -2005. - T. 21, - C. 11-16.

123) Shiraiwa H., Narita A., Kamata-Sakurai M., Ishiguro T., Sano Y., Hironiwa N., Tsushima T., Segawa H., Tsunenari T., Ikeda Y., Kayukawa Y., Noguchi M., Wakabayashi T., Sakamoto A., Konishi H., Kuramochi T., Endo M., Hattori K., Nezu J., Igawa T. Engineering a bispecific antibody with a common light chain: Identification and optimization of an anti-CD3 epsilon and anti-GPC3 bispecific antibody, ERY974 // Methods. - 2019. - T. 154, - C. 10-20.

124) Blarcom T. V., Lindquist K., Melton Z., Cheung W. L., Wagstrom C., McDonough D., Oseguera C. V., Ding S., Rossi A., Potluri S., Sundar P., Pitts S., Sirota M., Galindo M. C., Yan Y., Jones J., Roe-Zurz Z., Srinivasan S. S., Zhai W., Pons J., Rajpal A., Chaparro-Riggers J. Productive common light chain libraries yield diverse panels of high affinity bispecific antibodies // mAbs. - 2018. - T. 10, № 2, - C. 256268.

125) Brennan M., Davison P. F., Paulus H. Preparation of Bispecific Antibodies by Chemical Recombination of Monoclonal Immunoglobulin G1 Fragments // SCIENCE, - 1985. - T. 229, - C. 81-83.

126) Labrijn A. F., Meesters J. I., de Goeij B. E. C. G., van den Bremer E. T. G., Neijssen J., van Kampen M. D., Strumane K., Verploegen S., Kundu A., Gramer M . J., van Berkel P. H. C., van de Winke J. G. J., Schuurman J., Parren P. W. H. I. Efficient generation of stable bispecific IgG1 by controlled Fab-arm exchange // PNAS. - 2013. - T. 110, № 13. - C 5145-5150.

127) Massino Y. S., Kizim E. A., Dergunova N. N., Vostrikov V. M., Dmitriev A. D. Construction of a quadroma to a-endorphin/horseradish peroxidase using an actinomycin D-resistant mouse myeloma cell line // Immunology Letters, - 1992. - T. 33, - C. 217-222.

128) Milstein C., Cuello A. C. Hybrid Hybridomas and their use in immunohistochemistry // Nature. - 1983. - T. 305, № 6. - C. 537-540.

129) Fanger M. W., Guyre P. M. Bispecific antibodies for targeted cellular cytotoxicity // TIBTECH. - 1991. - T. 9, - C. 375-380.

130) Ridgway J. B. B., Presta L. G., Carter P. 'Knobs-into-holes' engineering of antibody CH3 domains for heavy chain heterodimerization // Protein Engineering. -1996. - T. 9, №.7. - C. 617-621.

131) Merchant A. M., Zhu Z., Yuan J. Q., Goddard A., Adams C. W., Presta L. G., Carter P. An efficient route to human bispecific antibodies // Nature Biotechnology. - 1998. - T. 16, - C. 677-681.

132) Atwell S., Ridgway J. B. B., Wells J. A., Carter P. Stable Heterodimers from Remodeling the Domain Interface of a Homodimer using a Phage Display Library // J. Mol. Biol. - 1997. - T. 270, - C. 26-35.

133) Davis J. H., Aperlo C., Li Y., Kurosawa E., Lan Y., Lo K-M., Huston J. S. SEEDbodies: fusion proteins based on strand-exchange engineered domain (SEED) CH3 heterodimers in an Fc analogue platform for symmetric binders or immunofusions and bispecific antibodies // Protein Engineering, Design & Selection. - 2010. - T. 23, № 4. - C. 195-202.

134) Von Kreudenstein T. S., Escobar-Carbrera E., Lario P. I., D'Angelo I., Brault K., Kelly J. F., Durocher Y., Baardsnes J., Woods J. R., Xie M. H., Girod P-A., Suits M. D. L., Boulanger M. J., Poon D. K. Y., Ng G. Y., Dixit S. B. Improving biophysical properties of a bispecific antibody scaffold to aid developability // mAbs. -2013. - T. 5, № 5. - C. 646-654.

135) Moore G. L., Bautista C., Pong E., Nguyen D-H. T., Jacinto J., Eivazi A., Muchhal U. S., Karki S., Chu S. Y., Lazar G. A. A novel bispecific antibody format enables simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of distinct target antigens // mAbs. - 2011. - T. 3, № 6, - C. 546-557.

136) Gunasekaran K., Pentony M., Shen M., Garrett L., Forte C., Woodward A., Ng S. B., Born T., Retter M., Manchulenko K., Sweet H., Foltz I. N., Wittekind M., Yan W. Enhancing Antibody Fc Heterodimer Formation through Electrostatic Steering Effects // The Journal Of Biological Chemistry. - 2010. - T. 285, № 25. - C. 1963719646.

137) Wei H., Cai H., Jin Y., Wang P., Zhang Q., Lin Y., Wang W., Cheng J., Zeng N., Xu T., Zhou A. Structural basis of a novel heterodimeric Fc for bispecific antibody production // Oncotarget. - 2017, - T. 8, № 31, - C. 51037-51049.

138) Choi H-J., Seok S-H., Kim Y-J., Seo M-D., Kim Y-S. Crystal structures of immunoglobulin Fc heterodimers reveal the molecular basis for heterodimer formation // Molecular Immunology. - 2015. - T. 65, - C. 377-383.

139) Bostrom J., Yu S-F.,, Kan D.,, Appleton B. A., Lee C. V., Billeci K., Man W., Peale F., Ross S., Wiesmann C., Fuh G. Variants of the Antibody Herceptin That Interact with HER2 and VEGF at the Antigen Binding Site // SCIENCE. - 2009. - T. 323. - C. 1610-1614.

140) Liu Z., Leng E. C., Gunasekaran K., Pentony M., Shen M., Howard M., Stoops J., Manchulenko K., Razinkov V., Liu H., Fanslow W., Hu Z., Sun N., Hasegawa H., Clark R., Foltz I. N., Yan W. A Novel Antibody Engineering Strategy for Making Monovalent Bispecific Heterodimeric IgG Antibodies by Electrostatic Steering Mechanism // The Journal Of Biological Chemistry. - 2015. - T. 290, № 12, - C. 75357562.

141) Lewis S. M., Wu X., Pustilnik A., Sereno A., Huang F., Rick H. L., Guntas G., Leaver-Fay A., Smith E. M., Ho C., Hansen-Estruch C., Chamberlain A. K., Truhlar S. M., Conner E. M., Atwell S., Kuhlman B., Demarest S. J. Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface // nature biotechnology. - 2014. - T. 32, № 2. - C. 191-198.

142) Bönisch M., Sellmann C., Maresch D., Halbig C., Becker S., Toleikis L., Hock B., Rüker F. Novel CH1:CL interfaces that enhance correct light chain pairing in heterodimeric bispecific antibodies // Protein Engineering, Design & Selection. - 2017.

- T. 30, № 9. - C. 685-696.

143) Schaefer W., Regula J. T., Bähner M., Schanzer J., Croasdale R., Dürr H., Gassner C., Georges G., Kettenberger H., Imhof-Jung S., Schwaiger M., Stubenrauch K. G., Sustmann C., Thomas M., Scheuer W., Klein C. Immunoglobulin domain crossover as a generic approach for the production of bispecific IgG antibodies // PNAS.

- 2011. - T. 108, № 27. - C. 11187-11192.

144) Regula J. T., von Leithner P. L., Foxton R., Barathi V. A., Cheung C. M. G., Tun S. B. B., Wey Y. S., Iwata D., Dostalek M., Moelleken J., Stubenrauch K. G., Nogoceke E., Widmer G., Strassburger P., Koss M. J., Klein C., Shima D. T., Hartmann G. Targeting key angiogenic pathways with a bispecific CrossMAb optimized for neovascular eye diseases // EMBO Molecular Medicine. - 2016. - Т. 8, № 11. - С. 1265-1288.

145) Bacac M., Klein C., Umana P. CEA TCB: A novel head-to-tail 2:1 T cell bispecific antibody for treatment of CEA-positive solid Tumors // Oncoimmunology. -2016. - Т. 5, № 8. - С. e1203498.

146) Krah S., Schröter C., Eller C., Rhiel L., Rasche N., Beck J., Sellmann C., Günther R., Toleikis R., Hock B., Kolmar H., Becker S. Generation of human bispecific common light chain antibodies by combining animal immunization and yeast display // Protein Engineering, Design & Selection. - 2017. - Т. 30, №. 4. - С. 291-301.

147) Солопова О. Н., Мисюрин В. А. Биспецифические антитела в клинике и клинических исследованиях // Клиническая онкогематология. - 2019. - Т.12, № 2. - С.125-144.

148) Li Y., Hickson J. A., Ambrosi D. J., Haasch D. L., Foster-Duke K .D., Eaton L . J., DiGiammarino E. L., Panchal S. C., Jiang F., Mudd S. R., Zhang C., Akella S. S., Gao W., Ralston S. L., Naumovski L., Gu J., Morgan-Lappe S. E. ABT-165, a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-Ig) Targeting DLL4 and VEGF, demonstrates Superior Efficacy and Favorable Safety Profiles in Preclinical Models // Mol Cancer Ther. - 2018. - Т. 17, № 5. - С. 1039-1050.

149) Moretti P., Skegro D., Ollier R., Wassmann P., Aebischer C., Laurent T., Schmid-Printz M., Giovannini R., Blein S., Bertschinger M. BEAT® the bispecific challenge: a novel and efficient platform for the expression of bispecific IgGs // BMC Proceedings. - 2013. 7(Suppl 6):O9.

150) https://i.moscow/patents/RU2555533C2_20150710

151) Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - T. 227, - C. 680-685.

152) Friguet B., Chaffotte A. F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M. E. Measurements of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay // J Immunol Methods. - 1985. - T. 77, № 2. - C. 305-19.

153) Klotz I. M.; Ayers J. Protein interactions with organic molecules // Discussions on Faraday Society. - 1953. - T. 13, - C. 189-196.

154) Mamedova T. G., Pienaar E. Whitneya S. E., TerMaat J. R., Carvill G., Goliath R., Subramaniana A., Viljoena J. R. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA template // Computational Biology and Chemistry. -2008. - T. 32, - C. 452-457.

155) Blanco N., Williams A. J., Tang D., Zhan D., Misaghi S., Kelley R. F., Simmons L. C. Tailoring translational strength using Kozak sequence variants improves bispecific antibody assembly and reduces product-related impurities in CHO cells // Biotechnology and Bioengineering. - 2020. - T. 117, - C. 1946-1960.

156) Kretschmer A., Schwanbeck R., Rösner T. V. T. Antibody Isotypes for Tumor Immunotherapy // Transfus Med Hemother. - 2017. - T. 44. - C. 320-326.

157) Salfeld J. G. Isotype selection in antibody engineering // Nature Biotechnology. - 2007. - T. 25, № 12. - C. 1369-1372.

158) Raju T. S. Glycosylation Variations with Expression Systems and Their Impact on Biological Activity of Therapeutic Immunoglobulins // BioProcess International. - 2003. - T. - C. 44-53.

159) Böhm E., Seyfried B. K., Dockal M., Graninger M., Hasslacher M., Neurath M., Konetschny C., Matthiessen P., Mitterer A., Scheiflinger F. S. Differences in N-glycosylation of recombinant human coagulation factor VII derived from BHK, CHO, and HEK293 cells // BMC Biotechnology. - 2015. - T. 15, -C. 87.

160) Jozalaa A. F., Geraldes D.C., Tundisi L. L., Feitosac V. A., Breyer C. A., Cardosoe S. L., Mazzola P. G., Nascimento L., Rangel-Yagui C. de O., Magalhaes P. de O., Pessoa A. Biopharmaceuticals from microorganisms: from production to purification // brazilian journal of microbiology. - 2015. - T. 47, - C. 51-63.

161) Schlatter S., Stansfield S. H., Dinnis D. M., Racher A. J., Birch J. R., James D. C. On the Optimal Ratio of Heavy to Light Chain Genes for Efficient Recombinant Antibody Production by CHO Cells // Biotechnol. Prog. - 2005. - Т. 21, - С. 122-13.

162) Goldenberg M. M. Trastuzumab, a Recombinant DNA-Derived Humanized Monoclonal Antibody, a Novel Agent for the Treatment of Metastatic Breast Cancer // Clinical Thempeutics. - 1999. - Т.. 21, №. 2. - С. 309-318.

163) Gupta K., Parasnis M., Jain R., Dandekar P. Vector-related stratagems for enhanced monoclonal antibody production in mammalian cells // Biotechnology Advances. - 2019. - Т. 37. - С. 107415.

164) Li J., Menzel C., Meier D., Zhang C., Dübel S., Jostock T. A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies // Journal of Immunological Methods. - 2007. - Т. 318. - С. 113-124.

165) Tustian A. D., Endicott C., Adams B., Mattila J., Bak J. Development of purification processes for fully human bispecific antibodies based upon modification of protein A binding avidity // mABs journal. - 2016. - Т. 8, - С. 828-838.

166) Klein R., Ruttkowski B., Knapp E., Salmons B., Günzburg W. H., Hohenadl C. WPRE-mediated enhancement of gene expression is promoter and cell line specific // / Gene. - 2006. - Т. 372, - C. 153-161.

167) Christian S. L., Zu D., Licursi M., Komatsu Y., Pongnopparat T., Codner D. A., Hirasawa K. Suppression of IFN-Induced Transcription Underlies IFN Defects Generated by Activated Ras/MEK in Human Cancer Cells // PLOS ONE. - 2012. - Т. 7, № 9. - C. e44267.

168) Рыбченко В.С., Балабашин Д.С., Панина А.А., Солопова О.Н., Якимов С.А., Алиев Т.К., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. Получение Внеклеточной Части Рецептора Erbb2 Для Исследования Иммунобиологических Препаратов // Биоорганическая химия. - 2020. -Т. 46, № 3, - С. 1-8.

169) Duarte H.O., Balmana M., Mereiter S., Osorio H., Gomes J., Reis C.A. // Int. J. Mol. Sci. 2017. V. 18. P. 2262-2281, doi: 10.3390/ijms18112262

170) Peiris D., Spector A.F., Lomax-Browne H., Azimi T., Ramesh B., Loizidou M., Welch H., Dwek M.V. // Scientific Reports. 2017. V. 7. 43006-43017, doi:

10.1038/srep43006

171) Миронов А. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств под ред. А.Н. Миронова // ЗАО «Гриф и К». - 2012. - М.: Часть вторая. - 536 с.

172) Dreier T., Baeuerle P. A., Fichtner I., Grün M., Schlereth B., Lorenczewski G., Kufer P., Lutterbüse R., Riethmüller G., Gjorstrup P., Bargou R. C. T cell costimulus-independent and very efficacious inhibition of tumor growth in mice bearing subcutaneous or leukemic human B cell lymphoma xenografts by a CD19-/CD3-bispecific single-chain antibody construct// J Immunol. - 2003 Т. - 170. - .С 43974402.

173) Hwang W.Y., Foote J.// Methods. - 2005. - Т. 36, - С. 3-10.

174) Almagro J.C., Franson J. // Bioscience. - 2008. - Т. 13, - С. 1619-1633

175) Wedemayer G. J., Patten P. A., Wang L. H., Schultz P. G., Stevens R. C. //Science. - 1997. - Т. 276, - С.1665-1669.

176) Zimmermann J., Oakman E. L., Thorpe I. F., Shi X., Abbyad P., Brooks C. L., Boxer S.G., Romesberg F. E. //PNAS. - 2006. - Т. 103, - С. 13722-13727.

177) Kabat E.A. // Sequences of Immunological Interest, 5 ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, Md, USA,1991.

178) Ильина E.H., Солопова O.H., Балабашин Д.С., Ларина М.В., Алиев Т.К., Гребенникова Т.В., Лосич М.А., Зайкова О.Н., Свешников П.Г., Долгих Д.А., Кирпичников М.П. // Биоорганическая химия. - 2019. - Т. 45, - С. 58-68.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю благодарность Паниной А.А. (отдел биоинженерии ИБХ РАН), за помощь в подготовке манускриптов статей, выступлений на конференциях, за ознакомление с обзором литературы и консультацию по его редактированию, советы по планированию экспериментальной работы и совместному анализу, а также обсуждению результатов.

Искренне благодарю к.б.н. Солопову О.Н. и д.б.н. Свешникова П.Г., сотрудников всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения, за помощь в получении моноклональных антител к интерферону-бета и постановке экспериментов на животных.

Новоселецкого В.Н., к.ф.-м.н. (каф. биоинженерии биологического факультета МГУ) за проведение моделирований структур химерного и гуманизированного антител B16.

Балабашина Д.С. (отдел биоинженерии ИБХ РАН) за помощь в работе с эукариотической культурой клеток яичника китайского хомячка.

Всему коллективу лаборатории инженерии белка ИБХ РАН, а также кафедры биоинженерии биологического факультета МГУ выражаю признательность за консультативную помощь и создание продуктивной рабочей атмосферы.

ПРИЛОЖЕНИЕ

1 I

Рисунок 33. Анализ перекрытия пептидов, полученных методом протелиза биспецифического антитела В16/Т7 и зарегистрированных методом времяпролетной масс-спектрометрии. В качестве последовательности сравнения приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела против рецептора БгЬВ2.

И И_■_и äd _

1 DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS ITCKASQDVG TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW ASTRHTGVPD RFTGSGSGTD FTLTISNVQS ■ Carbamidomethylation(+57.02)

_ i д i ■ ~ i i d Deamidation (NQ) (+0.93)

1 ' " ill —. о Oxidation (M) (+15.99)

Рисунок 34. Анализ перекрытия пептидов, полученных методом протелиза биспецифического антитела В16/Т7 и зарегистрированных методом времяпролетной масс-спектрометрии. В качестве последовательности сравнения приведена аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела В16 с осуществленной рекомбинацией вариабельных доменов

Рисунок 35. Анализ перекрытия пептидов, полученных методом протелиза биспецифического антитела В16/Т7 и зарегистрированных методом времяпролетной масс-спектрометрии. В качестве последовательности сравнения приведена аминокислотная последовательность легкой цепи антитела В16 с осуществленной рекомбинацией вариабельных доменов.

Рисунок 36. Анализ перекрытия пептидов, полученных методом протелиза биспецифического антитела В16/Т7 и зарегистрированных методом времяпролетной масс-спектрометрии. В качестве последовательности сравнения приведена аминокислотная последовательность легкой цепи антитела против рецептора БгЬВ2 (Т7).

38888