Новые генно-инженерные белки на основе рекомбинантных антител против TNF тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Ефимов Григорий Александрович

• Ефимов Григорий Александрович
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Ефимов Григорий Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. История открытия TNF

2. Суперсемейство TNF

3. Структура системы TNF-TNFR

4. Функции TNF

5. Роль TNF в патогенезе ревматоидного артрита и других аутоиммунных заболеваний

6. Терапевтическая блокировка TNF

7. Побочные эффекты и ограничения анти-TNF терапии

8. Новые подходы и перспективы TNF блокировки

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Получение и характеристика нового верблюжьего однодоменного антитела к TNF

человека

Экспрессия и очистка однодоменного антитела Vhh41

Оценка связывания антитела Vhh41 с TNF человека методом ИФА

Изучение взаимодействия Vhh41 и TNF человека методом поверхностного плазмонного

резонанса

Исследования способности Vhh41 блокировать TNF человека

2. Конструирование, получение и характеристика гибридных белков

флуоресцентных сенсоров TNF

Конструирование генов, кодирующих сенсоры TNF

Экспрессия и очистка флуоресцентных сенсоров TNF

Анализ взаимодействия Vhh41-K с рекомбинантным TNF

Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора Vhh41-K TNF in vitro и in vivo

Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo

Прижизненное изучение экспрессии TNF с помощью полученного флуоресцентного сенсора

3. Получение и характеристика одноцепочечного анти-TNF антитела

Изучение мышиного моноклонального антитела F10

Конструирование и экспрессия одноцепочечного антитела ahT-4

Измерение биологической активности одноцепочечного антитела ahT-4

4. Получение и характеристика химерного анти-TNF антитела

5. Конструирование, получение и характеристика биспецифических антител A9 и

mA9

Конструирование, экспрессия и очистка антител A9 и mA9

Взаимодействие антител A9 и mA9 с рекомбинантным TNF человека методом

поверхностного плазмонного резонанса

Цитотоксический тест

Цитофлуориметрия

Оценка способности биспецифического антитела А9 удерживать TNF человека на

поверхности макрофагов

6. Сравнительная оценка эффективности системной и селективной блокировки

макрофагального TNF

Модель острой гепатотоксичности, индуцированной введением ЛПС/D-галактозамина

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение и характеристика нового рекомбинантного однодоменного антитела,

специфически связывающегося с TNF человека, но не блокирующего его

биологическую активность

Создание генетической конструкции, кодирующей рекомбинантное однодоменное антитело

Vhh41

Экспрессия и очистка рекомбинантного однодоменного антитела Vhh41

Анализ взаимодействия однодоменного антитела Vhh41 c TNF человека

Анализ способности антитела Vhh41 блокировать биологическую активность TNF человека

2. Конструирование, получение и характеристика молекулярных сенсоров TNF для прижизненного изучения экспрессии TNF на основе однодоменных рекомбинантных

антител и красного флуоресцентного белка

Получение генетических конструкций, кодирующих флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K и

контрольные гибридные белки

Экспрессия и очистка флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K

Анализ взаимодействия флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K с рекомбинантным TNF мыши

и человека

Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K in vitro и in vivo

Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo

Прижизненное изучение экспрессии TNF с помощью полученного флуоресцентного сенсора

3. Получение и характеристика рекомбинантного одноцепочечного антитела,

блокирующего биологическую активность TNF

Измерение активности мышиного моноклонального антитела F10

Конструирование одноцепочечного антитела на базе вариабельных фрагментов легкой и

тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела F10

Измерение активности одноцепочечного антитела ahT-4

4. Разработка и анализ химерного антитела против TNF человека

Сравнение кинетики взаимодействий химерного антитела 13239 и инфликсимаба с

рекомбинантным TNF человека

3

Сравнение нейтрализующей активности химерного антитела 13239 с активностью

инфликсимаба in vitro

Анализ активности химерного антитела 13239 in vivo

5. Конструирование, получение и характеристика селективного блокатора TNF,

производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда

Молекулярное клонирование, экспрессия и очистка биспецифических антител

Взаимодействие антител A9 и mA9 с рекомбинантным TNF человека

Блокировка антителами A9 и mA9 TNF-зависимой цитотоксичности in vitro

Анализ связывания антител A9 и mA9 с поверхностью макрофагов через взаимодействие с

поверхностной молекулой F4/80

Удержание эндогенно продуцируемого TNF человека на поверхности макрофагов биспецифическим антителом A9

6. Физиологически значимая селективная блокировка TNF, производимого клетками

моноцитарно-макрофагального ряда IN VIVO

Сравнительная оценка эффективности направленной блокировки TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда, и системной блокировки TNF в модели острой

гепатотоксичности

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЦЖ - бацилла Кальмета-Геррена

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор

ИПТГ - изопропил-бета-D-тиогалактозид

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПС - липополисахарид

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - ревматоидный артрит

Трис - трис(гидроксиметил)аминометана

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

A9 - рекомбинантное биспецифическое антитело, распознающее F4/80 и TNF человека

CDR - участок антитела, определяющий комплиементарность связывания

D-гал - D-галактозамин

ICAM - молекула клеточной адгезии

IL - интерлейкин

mA9 - рекомбинантное антитело, аналогичное A9, но с мутированными участками распознавания F4/80

NK - естественные киллеры: лимфоциты, обладающие цитотоксичностью против опухолевых клеток и клеток, зараженных вирусами

scFv - рекомбинантное одноцепочечное антитело, состоящее из вариабельных фрагментов тяжелой и легкой цепей, соединенных гибким линкером в одну пептидную цепь

TGFß - Трансформирующий ростовой фактор бета TNF - фактор некроза опухолей (tumor necrosis factor)

«TNF гуманизованные мыши» - генетически модифицированная линия мышей, несущих ген TNF человека вместо гена Tnf мыши TNFR - рецептор фактора некроза опухолей VH - вариабельный домен тяжелой цепи антитела

VHH - рекомбинантное антитело, представляющее собой вариабельный домен антитела сем. Camelidae, состоящего только из тяжелых цепей VL - вариабельный домен легкой цепи антитела

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые генно-инженерные белки на основе рекомбинантных антител против TNF»

ВВЕДЕНИЕ

TNF (Tumor Necrosis Factor, фактор некроза опухолей) - белок, относящийся к классу цитокинов: сигнальных молекул, выполняющих в иммунной системе функции передачи информации. TNF был впервые описан в 1975 г., когда было обнаружено, что сыворотка мышей, которым вводились бацилла Кальмета-Геррена (БЦЖ) и липополисахарид1 (ЛПС), обладает способностью вызывать геморрагический некроз трансплантированной саркомы [1]. Вскоре после этого, ген TNF был клонирован, а белок охарактеризован [2, 3].

Первоначально TNF изучался как потенциальный противоопухолевый агент. Однако надежды, что TNF сможет найти терапевтическое применение против широкого спектра злокачественных заболеваний, не оправдались. Оказалось, что только незначительная часть новообразований восприимчива к воздействию TNF, и что при системном применении он вызывает серьезные токсические эффекты. В связи с этим, рекомбинантный TNF нашел лишь ограниченное применение в клинике.

Дальнейшие исследования установили, что TNF является одним из ключевых цитокинов иммунной системы и принадлежит к большому семейству гомологичных белков, чьи функции включают в себя тонкую регуляцию межклеточных взаимодействий в процессе органогенеза вторичных лимфоидных органов и развития иммунного ответа. TNF участвует в формировании и поддержании микроструктуры терминальных центров и B-клеточных фолликулов селезенки, пейеровых бляшек, а также гранулем, обеспечивает развитие нормального защитного ответа на бактериальную инфекцию, в особенности, на внутриклеточную.

В то же время было показано, что гиперпродукция TNF является важнейшим элементом патогенеза целого ряда аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, рассеянный склероз, болезнь Крона , псориаз и др. Информация о патогенной роли TNF послужила основой для создания целого ряда генно-инженерных блокаторов этого цитокина. В начале были сконструированы химерные

1 Компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, состоящий из липидной и полисахаридной частей. Также используется термин «эндотоксин», поскольку лизис бактерий и выброс ЛПС в кровь вызывает активацию рецепторов системы врожденного иммунитета у животных.

2 Хроническое гранулематозное воспаление желудочно-кишечного тракта аутоиммунной природы.

антитела, затем рекомбинантный растворимый рецептор и, наконец, полностью гуманизированные антитела [4]. Анти-TNF терапия показала свою высокую эффективность в терапии значительного числа аутоиммунных болезней.

Несмотря на успехи в фармакологической блокировке TNF и продолжающиеся исследования, все еще остаются неизвестными многие важные детали биологии этого цитокина. Не до конца изучены детали экспрессии TNF в ткани, пораженной аутоиммунным процессом, неизвестно насколько его гиперпродукция предшествует развитию клинических симптомов, и как она изменяется со временем. Также остается неизученным вопрос о том, как меняется характер экспрессии TNF в ответ на терапию рекомбинантными TNF-блокаторами. В частности, не установлено, где именно формируется комплекс TNF с блокатором (в системном кровотоке или в воспалительном очаге) и как быстро он выводится из организма. В этой связи одним из перспективных экспериментальных подходов является создание молекулярного биосенсора TNF на базе рекомбинантных антител и флуоресцентного белка [5], описанное в данной работе. Использование такой молекулы в сочетании с современными методами прижизненной визуализации позволит дать ответы на многие вопросы о роли TNF в функционировании иммунной системы.

На сегодняшний день уже пять блокаторов TNF успешно прошли клинические испытания и широко используются в клинике (анти-TNF терапию получали и продолжают получать миллионы пациентов). Применение ингибиторов TNF является одним из ключевых компонентов терапии для нескольких аутоиммунных заболеваний [6]. В то же время продолжаются их клинические испытания во многих других заболевания, включая злокачественные. Однако, пока что все одобренные к клиническому применению ингибиторы TNF производятся за рубежом, а высокая стоимость лечения приводит к тому, что терапия ингибиторами TNF остается недоступной для большинства пациентов в России [7]. Существует необходимость создания отечественных препаратов подобного класса. Получение нового химерного антитела - блокатора TNF - также описано в данной работе.

Несмотря на клиническую эффективность блокаторов TNF системная блокировка TNF связана с риском нежелательных побочных эффектов, которые обусловлены важными природными невырожденным функциями TNF в развитии иммунного ответа. В частности, терапия ингибиторами TNF может приводить к реактивации латентного туберкулеза [8], развитию фармакогенной волчанки [9], повышению вероятности возникновения лимфом [10], ухудшению симптоматики ишемической болезни сердца

[11]. В некоторых аутоиммунных заболеваниях оказалось, что анти-TNF терапия парадоксальным образом может приводить к усилению симптоматики [12], также она способна сама по себе вызывать аутоиммунные реакции [13]. Эти наблюдения согласуются с появляющимися в последнее время экспериментальными данными о том, что TNF, производимый различными типами иммунных клеток, выполняет различные, вплоть до противоположных, функции в развитии воспаления [14]. Это означает, что биология TNF имеет неизученные стороны; модель иммунной системы, в которой TNF играет исключительно провоспалительную роль, далека от реальности, а системная блокировка TNF, предположительно, не является оптимальной терапевтической стратегией. Селективное ингибирование TNF, производимого отдельными типами клеток может оказаться значительно более эффективным и иметь терапевтический эффект в тех заболеваниях, которые ранее считались невосприимчивы к анти-TNF терапии [15].

В связи с этим существует необходимость создания новых блокаторов TNF, которые могли бы блокировать системную секрецию патогенных количеств TNF, не нарушая при этом межклеточные взаимодействия иммуноцитов. Одним из подходов к созданию таких блокаторов является инженерия биспецифических антител, которые могли бы удерживать TNF на поверхности клеток, его продуцирующих, препятствуя проникновению цитокина в системное кровообращение.

В рамках этой работы была предпринята попытка создания ингибитора TNF нового типа, который селективно блокирует TNF, производимый клетками моноцитарно-макрофагального ряда.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

TNF является одним из ключевых цитокинов - белков медиаторов иммунной системы, которые отвечают за регуляцию широкого спектра процессов: развитие иммунного ответа на патогены, формирование и поддержание микроструктуры лимфоидных органов и передачу информации от клетки к клетке. Поскольку TNF является крайне мощным стимулом для иммунной системы, его экспрессия и секреция находятся под сложным многоступенчатым механизмом регуляции на последовательных уровнях транскрипции, трансляции, секреции и биодоступности растворимой формы. Однако при определенных условиях может возникнуть локальная или системная сверхпродукция TNF, стимулирующая, в свою очередь, выброс других провоспалительных цитокинов, что приводит к гиперактивации иммунной системы и лежит в основе патогенеза аутоиммунных заболеваний. В связи с этим фармакологическое ингибирование биологических эффектов TNF и других цитокинов нашло широкое применение в терапии иммунопатологий.

1. История открытия TNF

Изучение биологических эффектов TNF фактически началось задолго до того, как сам белок был выделен и охарактеризован. В конце XIX в. клиницисты заметили, что злокачественные опухоли в некоторых случаях подвергались спонтанной регрессии на фоне острой бактериальной инфекции, вызванной Streptococcus pyogenes. Подобные наблюдения послужили основой для экспериментальных заражений больных саркомами и карциномами живой бактериальной культурой, а позднее - для терапии смешанными бактериальными экстрактами S. pyogenes и грамотрицательной Serratia marcescens, получившими название «токсины Коли» [16]. Противоопухолевый эффект этих экстрактов, согласно современным представлениям, обусловлен активацией клеток иммунной системы за счет связывания рецепторов, распознающих инвариантные бактериальные продукты (преимущественно ЛПС), что приводит к гиперпродукции иммуноцитами TNF и других провоспалительных цитокинов [17].

В 1940-х годах было идентифицировано действующее вещество в экстрактах S. marcescens, ответственное за развитие геморрагического некроза опухолей. Наиболее активная фракция содержала ЛПС [18]. Поскольку сам по себе ЛПС в опытах на культурах опухолевых клеток токсичности не показал, было сделано предположение, что его действие опосредовано неким фактором, вырабатывающимся в организме в ответ на стимуляцию липополисахаридом, который вызывает локальное понижение

давления и ишемию опухоли [19].

В 1975 году было показано, что у BALB/с мышей, которым после предварительной стимуляции БЦЖ вводился ЛПС, в крови вырабатывается белковый фактор, способный при введении мышам с пересаженной подкожно метилхолантрен-индуцированной (Meth A) саркомой вызвать ее геморрагический некроз. Этот фактор из-за своей активности получил названия фактор некроза опухоли [1]. Вскоре было установлено, что кроме макрофагов продуцентами TNF могут быть и В-клетки [20].

Затем ген TNF был клонирован и экспрессирован в клетках E.coli. Было показано, что рекомбинантный TNF, проэкспрессированный в бактериальной системе, обладает in vivo противоопухолевым эффектом и оказывает прямое цитотоксическое действие на некоторые опухолевые линии клеток [2, 21]. TNF оказался небольшим белком, молекулярной массой 17 кДа [3]. В это же время независимо был открыт мышиный TNF [22, 23].

Несмотря на изначальные успехи применения TNF в качестве противоопухолевого агента [24], его клинические испытания не увенчались успехом

[25]. Оказалось, что при системном введении TNF обладает высокой токсичностью

[26], доза необходимая для противоопухолево эффекта (> 1.0 Ед/мл) значительно превосходит максимальную переносимую дозу (< 0.2 Ед/мл) [27, 28]. Поэтому фактор некроза опухоли нашел лишь ограниченное применение в иммунотерапии злокачественных заболеваний. В настоящее время он используется для изолированных перфузий органов, пораженных опухолями, что позволяет избежать системной токсичности [29, 30].

2. Суперсемейство TNF

Дальнейшие исследования идентифицировали большое количество гомологичных TNF и TNFR (рецептору TNF) белков, которые были объединены в два суперсемейства. На сегодняшний момент они включают 19 лигандов и 29 рецепторов соответственно

[31].

Некоторые лиганды способны вступать в высокоаффинные взаимодействия (Kd=10-9-10-10M) сразу с несколькими различными рецепторами, а некоторые из рецепторов, в свою очередь, активируются более чем одним лигандом. Так близкородственный TNF цитокин - LTa (лимфотоксин альфа), кроме собственного рецептора, способен активировать оба рецептора TNF (TNFR1 и TNFR2) [32]. Подобная вырожденность системы делает регуляцию процессов с участием белков TNF/TNFR суперсемейств более гибкой.

Эволюционная функция суперсемейств TNF и TNFR - это обеспечение межклеточной коммуникации, регуляция выживания клеток и организация сложных структур у животных. Отдельные члены семейства участвуют и в эмбриогенезе. Гомологи TNF впервые возникли еще у членистоногих. В ходе эволюции, в результате множественных как полногеномных, так и специфичных удвоений и транслокаций [33] образовалась сложная сигнальная система, которая смогла принять на себя дополнительную функцию. В возникшей у позвоночных системе адаптивного иммунитета критическую роль играет межклеточное взаимодействие - регуляция пролиферации или программируемой клеточной гибели.

Исследования нокаутных мышей установили, что члены обоих суперсемейств играют роль в формировании анатомических структур иммунной системы [34]. У мышей нокаутных по гену LTa не образуются вторичные лимфоидные органы (лимфатические узлы и пейеровы бляшки) и наблюдаются значительные дефекты в микроструктуре селезенки: отсутствуют В- и Т-клеточные зоны [35]. Также у них нарушено формирование терминальных центров [36]. Мыши с дефектным геном Tnfr1 имеют нормальные лимфатические узлы, но не способны формировать пейеровы бляшки [37]. В то же время, в отсутствии гена Tnf нарушено формирование герминальных центров и В-клеточных фолликулов, пейеровы бляшки либо имеют дефекты [38], либо не развиваются [39].

Лиганды суперсемейства TNF на уровне аминокислотной последовательности имеют 20-30% гомологию между собой и синтезируются как трансмембранные белки II типа 3. Внеклеточный домен лигандов имеет топологию «сэндвича», состоящего из антипараллельных ß-слоев [40]. Помимо мембраносвязанной формы, TNF и некоторые другие лиганды суперсемейства могут существовать и в растворимой форме [41]. Отрезание трансмембранной части цитокина осуществляется специфическими металлопротеазами. И мембраносвязанная, и растворимая формы путем нековалентных (гидрофобных) взаимодействий внутренних поверхностей мономеров [42] формируют функционально-активные тримеры, которые способны передавать сигнал через рецепторы.

Рецепторы TNFR суперсемейства представляют собой тримерные трансмембранные белки I или III типов. Согласно современным представлениям,

Исключением являются лимфотоксин (ЬТ) и ингибитор роста сосудистого эндотелия (УЕСТ), которые секретируются.

рецепторы существуют на мембране уже собранные в тримеры за счет специального домена PLAD (pre-ligand-binding assembly domain), последующее связывание их с лигандом приводит к изменению конформации и передаче сигнала внутрь клетки [43]. Некоторые из рецепторов имеют в цитоплазматической части так называемые домены смерти DD (death domain) - белковые модули, которые через систему адаптерных белков способны активировать систему каспаз и запустить внешний путь апоптоза. Способность лигандов суперсемейства TNF вызывать программированную клеточную смерть имеет значение для процессов органогенеза, эффекта клеточно-зависимой цитотоксичности в инфекционном процессе и для поддержания гомеостаза в иммунной системе за счет удаления клеток, прошедших клональную экспансию, после стихания инфекционного процесса.

Кроме того, большинство лигандов суперсемейства TNF способны активировать транскрипционный фактор NF-кВ, под контролем которого находятся гены многих провоспалительных цитокинов.

Таким образом, передача сигнала через рецепторы суперсемейства TNFR может приводить как к апоптозу, так и к активации или пролиферации клеток. Выбор того или иного сигнального пути обусловлен сочетанием костимуляторных сигналов и состоянием самой клетки, в том числе наличием в ней. Известно, что блокирование синтеза белка приводит к преимущественному переключению на апоптозный путь [44], что объясняется тем фактом, что для активации каспазного каскада не нужен синтез белка, тогда как NF-кВ зависимый путь требует экспрессии de novo [45].

3. Структура системы TNF-TNFR

TNF синтезируется в виде полипептида молекулярной массой 26 кДа, его мономеры спонтанно собираются на поверхности клетки в тримеры за счет гидрофобных взаимодействий. Мембраносвязанный тример TNF функционально активен и может связывать рецептор и передавать сигнал при межклеточном контакте. Мембраносвязанная матриксная металлопротеаза TACE (ADAM17) разрезает полипептид между аланином в 76-ой позиции и валином в 77-ой 4, в результате чего высвобождается зрелая растворимая форма (мономер имеет размер 17 кДа) [46, 47].

Основными продуцентами TNF являются клетки иммунной системы. Миелоциты

4 У мышиного белка разрезание происходит между 79-ым остатком треонина и 80-ым лизина.

продуцируют большие количества растворимого TNF в ответ на активацию Toll-подобных рецепторов 5, а также под действием других цитокинов или липидных медиаторов воспаления. Продукция TNF лимфоцитами (NK, Т- и В-клетки) также играет роль в развитии иммунного ответа [48]. Кроме того, TNF может производиться целым рядом клеток, не относящихся к иммунной системе, такими как гладкомышечные клетки сосудистой стенки [49], клетки эндотелия, астроциты, нейроны, фибробласты, жировые клетки и базофилы.

Описано два рецептора, связывающих TNF: TNFR1 (p55) и TNFR2 (p75) (см. Рис. 1). TNF рецепторы 1 типа находятся на поверхности практически всех клеток в организме, тогда как TNFR2 представлены преимущественно на поверхности клеток иммунной системы и эндотелия [31].

Рис. 1 Система TNF - TNFR. Механизм действия TNF ингибиторов.

Представлено устройство системы TNF - TNFR. Слева изображены рецепторы TNF: TNR1 и TNFR2, которые могут быть активированы как растворимым, так и мембраносвязанным TNF (не показан). Блокирование TNF моноклональными антителами или рекомбинантным растворимым рецептором препятствует его взаимодействию с рецепторами.

Как было сказано выше, TNFR1 и TNFR2 кроме TNF также могут быть активированы лимфотоксином. У TNFR1 и TNFR2 есть общие и уникальные функции. Передача сигнала через оба рецептора может активировать антиапоптотические и

5 Рецепторы системы врожденного иммунитета, которые распознают ЛПС и другие инвариантные продукты патогенов.

провоспалительные пути; активация TNFR1 может также приводить к апоптозу через передачу сигнала молекулами, содержащими домены смерти, и последующую активацию каспаз. Данные опытов с мышами нокаутными по TNFR1 [50] и TNFR2 [51, 52] говорят о том, что для защиты от бактериальной инфекции необходим именно TNFR1, в то время как TNFR2, по всей видимости, через петлю отрицательной обратной связи ограничивает экспрессию TNF и, таким образом, участвует в механизмах предотвращения чрезмерного воспалительного ответа.

Существуют указания на то, что TNFR1 является рецептором преимущественно для растворимой формы TNF, тогда как TNFR2 активируется мембраносвязанной формой TNF [41, 53, 54], хотя эти предпочтения не абсолютны. Кроме того, связывание трансмембранного TNF с TNFR2 является звеном регуляции Т-клеточной миграции, презентации антигена, репарации тканей и ангиогенеза [55, 56]. Сигнал через TNFR2 способен стабилизировать популяцию регуляторных T-клеток и предотвратить аутоиммунные реакции [57].

Однако другие исследования указывают на то, что как минимум в некоторых моделях, TNFR2 может усиливать сигнал, передаваемый через TNFR1 [58, 59].

Внеклеточные домены TNFR1 и TNFR2, как их лиганды, могут «слущиваться» под воздействием протеолитических ферментов. Растворимые формы рецепторов участвуют в отрицательной регуляторной петле за счет снижения количеств доступного лиганда [60, 61]. Так недавно была продемонстрирована иммунорегуляторная функция растворимого TNFR2 в модельной туберкулезной инфекции у мышей [62].

Аминокислотная последовательность TNF очень консервативна среди млекопитающих. В человеческом и мышином TNF - 79% гомологичных аминокислотных остатков. Этим объясняется факт частичного кросс-взаимодействия между мышиными и человеческими лигандами и рецепторами. Человеческий TNF способен активировать мышиный TNFR1, но не TNFR2 [63, 64].

4. Функции TNF

TNF является одним из ключевых белков, обеспечивающих реакции врожденного иммунитета. Он играет важную роль в развитии иммунного ответа на патогены, в том числе в развитии воспаления. Экспрессия TNF активируется в результате сигнального каскада, который запускается после связывания Toll-подобными рецепторами инвариантных продуктов патогенных микроорганизмов: ЛПС, пептидоглакана, зимозана, флагелина и двухцепочечной РНК. Также TNF производится в результате стимуляции клетки другими провоспалительными цитокинами: IL-1, IL-2. гамма-интерфероном, TGFß, ГМ-КСФ. В результате действия TNF повышается проницаемость кровеносных сосудов, происходит миграция лейкоцитов в очаг воспаления, активируются механизмы фагоцитоза и внеклеточного цитолиза микроорганизмов. Кроме того, TNF стимулирует прокоагуляторную активность. Вызванная TNF активация клеток эндотелия приводит к временному раскрытию межэндотелиальных клеточных соединений, в результате чего развивается так называемое "протекание" сосудов [65]. Также TNF усиливает адгезию нейтрофилов и моноцитов к эндотелию, индуцируя экспрессию молекул адгезии 1САМ-1и ELAM-1.

TNF выполняет непрямую провоспалительную функцию, связывание TNF с TNFR1 вызывает активацию двух внутриклеточных каскадов:

1) адаптерный белок TRADD , взаимодействующий с DD участком внутриклеточной части TNFR1, рекрутирует белок-медиатор TRAF2, который, в свою очередь, связывает IkB киназу (IKK). IKK фосфорилирует белок-ингибитор 1кВа, вызывая высвобождение и последующую транслокацию в ядро транскрипционного фактора NF-кВ. Это вызывает экспрессию других провоспалительных цитокинов, чьи гены имеют в своем промоторе сайт узнавания NF-кВ. Среди них, например, такие мощные провоспалительные цитокины как IL-1 и IL-6.

2) активируется сигнальный путь MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа): MEKK1 и ASK1 фосфорилируют киназу MKK7, которая, в свою очередь, активирует JNK. JNK транслоцируется в ядро и активирует транскрипционный фактор AP-1, под контролем которого находятся гены, отвечающие за пролиферацию.

TNF играет важную роль в контроле внутриклеточных бактериальных инфекций,

при заражении Mycobacterium tuberculosis он опосредует активацию макрофагов,

привлечение клеток в очаг инфекции, а также формирование и поддержание

целостности гранулем, в которых инкапсулируются зараженные микобактериями

макрофаги [66]. У трансгенных мышей, лишенных гена Tnf или Tnfr1, инфекция после

15

заражения туберкулезом развивается бесконтрольно [67]. В ряде исследований также было показано, что активация TNF-сигнального пути необходима для защиты от других внутриклеточных патогенов, таких как Listeria monocytogenes и Salmonella typhimurium [68].

Развитие потенциально летального синдрома токсического шока при бактериальных инфекциях обусловлено сверхэкспрессией TNF возникающее в ответ на выброс в кровь бактериального эндотоксина [69]. Современные данные указывают на то, что основными продуцентами TNF в этой патологии являются макрофаги [70].

TNF также участвует в формировании терминальных центров во вторичных лимфоидных органах. У нокаутных по гену Tnf мышей полностью отсутствуют первичные В-клеточные фолликулы в селезенке и не формируются организованные сети фолликулярных дендритных клеток и герминальные центры [38]. Подобные дефекты наблюдаются и в мышах, в которых инактивирована экпрессии TNF B-лимфоцитами [71].

5. Роль TNF в патогенезе ревматоидного артрита и других

аутоиммунных заболеваний

Ревматоидный артрит (РА) является воспалительным аутоиммунным заболеванием и поражает в среднем около одного процента популяции. Основными патологическими признаками заболевания является формирование воспалительного эрозивного синовия, которое приводит к разрушению хряща, кости и мягких тканей. Несмотря на то, что при РА в первую очередь страдают суставы, данное заболевание носит системный характер: часто при РА развивается пульмонарный фиброз, васкулит, формируются подкожные воспалительные узлы.

Патогенез ревматоидного артрита обусловлен активацией лимфоцитов в периферической крови, синовиальной мембране и синовиальной жидкости [72, 73]. Первым цитокином, выделенным из синовиальной жидкости пациентов, страдающих ревматоидным артритом был IL-1. Патогенная роль этого цитокина в развитии РА была подтверждена на модели антиген-индуцируемого артрита с помощью внутрисуставного введения IL-1 в коленные суставы кроликов [74]. Первые свидетельства о том, что TNF также может играть роль в развитии РА, были получены в опытах на клеточных культурах, выделенных из синовиальной мембраны пациентов. Оказалось, что эти клетки в ответ на TNF продуцируют коллагеназу и простагландин E2, участвующие в процессах деструкции костной ткани при РА [75]. Более того, было показано, что TNF

стимулирует резорбцию и ингибирует синтез протеогликана в хрящевых эксплантах [76]. Кроме того, TNF обладает способностью к активации остеокластов и индукции резорбции костной ткани in vitro [77]. TNF является индуктором экспрессии IL-1 [78], а IL-1, в свою очередь, вызывает экспрессию TNF, замыкая петлю положительной обратной связи [79].

Было показано, что продукция IL-1 и ГМ-КСФ в культурах синовиальных фибробластов больных РА зависит от присутствия TNF и его способности передать сигнал через TNFR: нейтрализация TNF моноклональными антителами снижает экспрессию этих [80, 81] и других провоспалительных цитокинов: IL-6 и IL-8 [82].

Предположение о том, что TNF гиперэкспрессирован в воспаленных суставах больных РА подтвердилось экспериментами, в которых в выделенных из синовиальной полости пациентов, страдающих РА, мононуклеарных клетках присутствовала мРНК TNF, кроме того, эти клетки продуцировали TNF в культуре [83]. Иммуногистохимическими методами было установлено, что в воспаленном суставе TNF продуцируется клетками моноцитарного ряда, локализованными в местах сочленении хряща и паннуса [84]. В дополнении к этому, растворимая форма TNF была детектирована в синовиальной жидкости больных РА [85, 86].

Также было установлено, что TNF стимулирует ангиогенез путем индукции экспрессии VEGF (фактор роста эндотелия сосудов). В синовиальной жидкости пациентов, страдающих ревматоидным артритом, повышен уровень VEGF, а в ответ на анти-TNF терапию он снижается [87]. Образование новых сосудов вносит вклад в патогенез воспалительного процесса, поскольку обеспечивает приток лимфоцитов в пораженный орган.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ефимов Григорий Александрович, 2015 год

по - -

гистидино гексамер удаляли протеолизом тром ,

конъюгиро (Sigma RECOMT). После этого

проводили вторую металл-хелатную хроматографию для очистки препарата одноцепочечного антитела от отщепленного гистидинового гексамера и от протеазы. Гомогенность полученного препарата была проверена с помощью денатурирующего электрофореза с последующей окраской серебром. Финальный белковый раствор был профильтрован через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм.

Измерение биологической активности одноцепочечного антитела ahT-4.

Измерения биологической активности одноцепочечного антитела и сравнение с биологической активностью материнского моноклонального антитела F10 и Fab-фрагмента

L929 по протоколу, описанному выше.

4. Получение и характеристика химерного анти-TNF

антитела.

Фирмой Modiquest (Нидерланды) на основании предоставленных им последовательностей, кодирующих одноцепочечное антитело ahT-4 было получено химерное антитело 13239.

Измерение кинетики взаимодействия химерного антитела 13239 и TNF человека проводилось методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе Proteon XPR36 (BioRad). В соответствии с опубликованым ранее протоколом [202] на поверхности чипа были иммобилизованы поликлональные козьи антитела против Fc человека (Jackson ImmunoResearch Laboratories, 109-005-008) в концентрации 20 нМ. Затем на чип наносился инфликсимаб или химерное антитело 13239 в концентрации 1 мкг/мл. Рекомбинантный TNF человека был был нанесен в качестве аналита в концентрации 100, 50, 25 или 12,5 нМ. Анализ полученных сенсограмм проводился в программе ProteOn Manager (Bio-Rad) с использованием модели Ленгмюра.

Измерения биологической активности химерного антитела 13239

активностью инфликсимаба in vitro проводились методом цитотоксического теста на культуре мышиных фиб L929 по

протоколу, описанному выше, а in vivo в модели ЛПСЮ-гал. индуцировнной гепатотоксичности, как было описано ранее.

5. Конструирование, получение и характеристика биспецифических антител A9 и mA9

Конструирование, экспрессия и очистка антител A9 и mA9.

Генетическая конструкция, кодирующая биспецифическое антитело А9 была собрана ПЦР реакцией с 4 праймерами аналогичной, описанной выше для гена одноцепочечного антитела ahT-4. Получившаяся в результате последовательность состояла из: гена однодоменного анти-TNF антитела [198], затем последовательности, кодирующей линкер вида (Gly4Ser)3, и гена одноцепочечного анти^4/80 антитела (любезно предоставлен С.Гордоном и М.Стейси). Сайты узнавания рестриктаз NcoI и XhoI были включены в последовательность прямого и обратных праймеров соответственно. После рестрикции ПЦР продукта и клонирования его в экспрессионный вектор pET-28b (Novagen) последовательность, кодирующая

полигексидиновую метку оказалась на 3' конце в той же рамке считывания.

43

Для получения контрольного антитела mA9 мутантный ген анти-Р4/80 scFv, содержащий вместо CDR последовательностей глицин-сериновые вставки был синтезирован de-novo (Geneart, Германия) и клонирован вместо нативного гена анти-F4/80 (см. Рис. 31 В).

Экспрессионные вектора, несущие вставки, кодирующие A9 и mA9 были использованы для трансформации клеток E.coli штамма Rosetta2(DE3)pLysS (Novagen). Лучшие клоны продуценты были отобраны методом иммуноблотинга колоний с использованием никель-конъюгированной пероксидазы (Pierce, 15165). Бактериальные культуры наращивались в среде LB, содержащей 50 цг/мл карбенициллина (Sigma -C1389) и 50 цг/мл хлорамфеникола (Sigma - C1863) до логарифмической фазы, а затем экспрессия индуцировалась 0.2 мМ ИПТГ. Через 4 часа культуры подвергались центрифугированию при 3200 g в течение 30 мин. Осадки замораживались а затем ресуспензировась в лизирующем буфере (50 мМ TrisHCl, 300 мМ NaCl, 5% глицерин, 0.5% детергента Triton X-100, 10000 Ед/мл лизоцим, 10 мМ ß-меркаптоэтанол) а потом разрушались с помощью утразвукового гомогенизатора. Лизаты центрифугировались при 17000 g в течение 40 мин., супернатанты отбирали и фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 цм. БиспецифическМ антитела A9 и mA9 очищались из просветленных супернатантов на хроматографической колонке, содержащей агарозу, конъюгированную с Ni-нитрилоуксусной кислотой (Invitrogen R90115). Аффинную хроматографию проводили по протоколу производителя. Полученный элюат концентрировали, диализовали против фосфатно-солевого буфера, с последующей фильтрацией через фильтр 0.22 мкм. Концентрация белка в растворе измерялась с помощью реакции c

2,2'-бицинхониновой кислотой (набор PIERCE 23225) по протоколу фирмы производителя. Гомогенность полученного препарата была проверена методом электрофореза в 15% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия с последующей окраской кумасси.

Взаимодействие антител A9 и mA9 с рекомбинантным TNF человека методом поверхностного плазмонного резонанса.

Сравнение аффинностей и кинетик взаимодействия антител А9 и mA9 с рекомбинантным TNF человека проводилось на приборе ProteOn XPR36 (Bio-Rad). В ходе измерения всех взаимодействий использовался фосфатно-солевой буфер, имеющий pH=7,4, в который был добавлен детергент Tween 20 до концентрации 0,005%, температура поверхности чипа составляла 25° C. Рекомбинантный TNF

44

человека был экспрессирован в E. coli по описанной ранее методике [203]. Антитела A9 и mA9 в концентрации 50 нМ иммобилизировались через амино-группу на поверхности биочипа с модифицированной альгинатной полимерной поверхностью (Bio-Rad 1765011). Затем аналит (TNF человека) в пяти двукратно убывающих концентрациях (50 -3 нМ) наносились в пять параллельных каналов. В шестой канал вводился буфер, не содержащий антитела, для нормировки. Анализ полученных сенсограмм проводился в программе ProteOn Manager (Bio-Rad) с использованием модели Ленгмюра.

Цитотоксический тест.

Измерения биологической активности антител А9 и mA9

L929 по

протоколу, описанному выше.

Цитофлуориметрия.

В экспериментах с перитонеальными макрофагами клетки перитонеальной полости выделялись из мышей дикого типа (C57BL/6) и сразу же окрашивались с использованием антител, коъюгированных с флуорохромами. Для получения костномозговых макрофагов костный мозг выделялся, после чего клетки культивировались в течение 10 дней в кондиционный среде (полученной на линии L929), затем клетки снимались с пластика ледяным фосфатным буфером.

Перед окрашиванием Fc-гамма рецептор блокировался, затем клетки инкубировались c антителами А9 или mA9 или буфером, после чего клетки отмывались и окрашивались одним из трех способов:

1) поликлональными кроличьими антителами к hTNF-VHH, затем со вторичными антителами к IgG кролика, конъюгированными с флуорохромом.

2) моноклональными мышиными антителами к гексагистидиновой последовательность (Novagen - 70796), затем со вторичными антителами к IgG мыши, конъюгированными с флуорохромом.

3) к клеткам добавлялся рекомбинантный TNF человека, а затем моноклональные анти-TNF антитела (Miltenyi Biotec - clone: cA2), меченные флуорохромом.

Кроме того клетки окрашивались анти^4/80 и анти-CDllb антителами, конъюгированными с флуорохромами. Образцы анализировались либо на приборе FACSAria (BDBiosciences) или Guava EasyCyte 8HT (Millipore) а затем полученные данные обрабатывались с помощью программы FlowJo (Treestar Inc.).

Оценка способности биспецифического антитела А9 удерживать TNF человека на

45

поверхности макрофагов.

Перитонеальные макрофаги из мышей, продуцирующих TNF человека, выделялись и рассаживались в количестве 100 тыс. клеток на лунку в 96-луночные культуральные планшеты. Клетки инкубировались в течение 2 ч при 37°C, 5%CO2, после чего не прикрепившиеся клетки смывались теплым фосфатным буфером. Затем клетки икубировались в течение ночи при 37°C, 5% CO2. После промывки 200 мкл теплой среды DMEM клетки инкубировались с антителами A9 в концентрации 2мкг/мл или со средой DMEM 30 минут при 37°C. После еще одной промывки клетки стимулировались ЛПС (Sigma, L2630) в концентрации 100 нг/мл. Через 4 ч культуральные супернатанты собирались и концентрация TNF человека измерялась с помощью набора для ИФА (eBioscience, 88-7346) по протоколу производителя.

Костный мозг из мышей, продуцирующих TNF человека выделялся, после чего клетки культивировались в течение 10 дней в кондиционный среде (полученной на линии L929), затем клетки снимались с пластика ледяным фосфатным буфером. Количество живых клеток подсчитывалось и они рассаживались на 96 луночные планшеты в концентрации 50000 клеток/лунку. Затем к клеткам добавлялось 250 цМ антитела А9 или однодоменного антитела hTNF-VHH или пустая среда (DMEM). Клетки инкубировались с антителами в течение 30 мин. Затем лунки промывались фосфатно-солевым буфером. После этого продукция TNF стимулировалась ЛПС (Sigma - L2630) в концентрации 100 нг/мл. Через 4 часа супернатанты собирались, концентрация TNF в них измерялась с помощью цитотоксического теста на линии мышиной фибросаркомы L929 по протоколу аналогичному описанному выше.

6. Сравнительная оценка эффективности системной и селективной блокировки макрофагального TNF.

Модель острой гепатотоксичности, индуцированной введением ЛПС/D-галактозамина.

Самки линии мышей, гуманизованных по гену TNF, были случайно разделены на 7 экспериментальных групп. Биспецифические антитела А9 и mA9 вводились интаперитонеально в трех различных дозах: 1500, 750 и 300 ЕД/г веса (активность препаратов антител предварительно определялась в цитотоксическом тесте по протоколу, описанному выше). Седьмая группа получала только буфферный раствор. Спустя 30 минут мышам также интраперитонеально вводился ЛПС (Sigma - L2630) в дозе 400 нг/г веса и D-галактозамин (Sigma - G1639) в дозе 800 мкг/г веса. За мышами

46

вели наблюдение в течение 800 минут. Время смерти животных фиксировалось.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В рамках данной работы были решены следующие задачи: I. Создание нового метода прижизненной визуализации областей патологической гиперэкспрессии TNF в моделях острых и хронических аутоиммунных заболеваний.

1. В сотрудничестве с лабораторией молекулярных биотехнологий (С.В. Тиллиб) ИБГ РАН было получено новое рекомбинантное однодоменное антитело против TNF -Vhh41, специфически связывающее TNF с высокой аффинностью, но не блокирующее его биологическую активность.

2. Антитело Vhh41 было проэкспрессировано в бактериальной системе и очищено биохимическими методами.

3. Были охарактеризованы биологические свойства этого антитела.

4. В сотрудничестве с ИБХ РАН (Д.М. Чудаков и С.А.Лукьянов) на основе антитела Vhh41 был создан флуоресцентный сенсор TNF - Vhh41-K, представляющий собой гибридный белок: однодоменное антитело и красный флуоресцентный белок Katushka [199].

5. Были изучены биологические свойства полученного сенсора: константы взаимодействия с TNF человека и мыши, способность блокировать биологические эффекты TNF, флуоресцентные свойства, стабильность in vivo.

6. Было показано, что флуоресцентный сенсор может быть использован для in vivo и ex vivo визуализации областей гиперпродукции TNF в острых и хронических заболеваниях.

II. Создание на основе мышиного моноклонального антитела против TNF рекомбинантного одноцепочечного антитела (scFv), а затем химерного анти-TNF антитела - прототипа терапевтического агента.

1. На основе описанного ранее высокоаффинного блокирующего мышиного моноклонального антитела против TNF человека [201 ] было сконструировано рекомбинантное одноцепочечное антитело (scFv).

2. Были изучены биологические свойства этого антитела в сравнении с исходным мышином антителом.

3. На основе одноцепочечного антитела в сотрудничестве с фирмой Modiquest (Нидерланды) было создано химерное полноразмерное антитело, имеющее человеческие аминокислотные последовательности в константных участках.

4. Были изучены биологические свойства химерного антитела: кинетика его взаимодействия с TNF человека и анти-TNF активность in vitro сравнивались с

кинетикой и активностью уже использующегося в клинике блокатора TNF -инфликсимаба.

5. Были проведены первичные эксперименты in vivo, показавшие, что полученное антитело может стать прототипом лекарственного средства. III. Проверка гипотезы о том, что направленное ингибирование TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда является более эффективным, чем системная блокировка этого цитокина, в модели острой аутоиммунной патологии.

1. Был создан принципиально новый ингибитор TNF селективного действия, который избирательно блокирует TNF, производимый макрофагами и моноцитами. Этот блокатор представляет собой биспецифическое антитело, одна из специфичностей которого связывается с поверхностью клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а вторая захватывает и блокирует секретируемый ими TNF.

2. Был отработан протокол экспрессии и очистки данного биспецифического антитела.

3. Было проведено детальное изучение биологических свойств данного антитела: измерена кинетика его взаимодействия с TNF, изучена его активность в ингибировании биологических свойств TNF, показана его способность селективно связываться с макрофагами и удерживать производимый ими TNF.

4. В модели TNF-зависимого септического шока было показано, что направленное ингибирование TNF имеет существенное преимущество по сравнению с системным. Полученные данные должны послужить основой для разработки нового поколения ингибиторов TNF, обладающих меньшим количеством побочных эффектов и большей терапевтической эффективностью.

1. Получение и характеристика нового рекомбинантного однодоменного антитела, специфически связывающегося с TNF человека, но не блокирующего его биологическую

активность

В рамках первого этапа разработки нового прижизненного неинвазивного метода детекции TNF было сконструировано и очищено рекомбинантное антитело, специфически связывающее TNF с высокой аффинностью, но, в то же время, не препятствующее активации TNF рецептора и последующей передачи сигнала. Эта часть работы детально описана в [ 197]. На данное антитело был получен патент Российской Федерации №2530553.

Создание генетической конструкции, кодирующей рекомбинантное однодоменное антитело Vhh41.

В качестве антиген-распознающего модуля для последующей инженерии флуоресцентных сенсоров TNF было решено выбрать однодоменное рекомбинантное антитело (VhH). Подобные антитела из-за своего небольшого размера и высокой стабильности являются удобным модулем для биоинженерии [204]. У представителей семейства Camelidae (верблюжьи), а также у акул, помимо обычных антител , присутствующих у человека и других млекопитающих, есть особые антитела, содержащие только две тяжелые цепи [205]. Соответственно, в таких антителах в связывании антигена участвует только один вариабельный домен (VH) из каждой тяжелой цепи. Отсутствие вариабельной части легкой цепи отчасти компенсируется наличием очень длинной петли CDR3 9, которая может проникать в углубления в антигенах, недоступные для обычных антител, например, в полость активного центра ферментов.

По имеющимся на сегодняшний день данным, VHH являются наименьшими природными белковыми фрагментами (12-15 кДа), обладающими свойствами антител. Благодаря небольшому размеру и достаточно высокой гомологии с вариабельными

8 Состоят из двух тяжелых и двух легких цепей.

9 Участки, определяющие комплементарность (complementarity determining region) - гипервариабельные участки антител, связывающие антиген.

50

доменами иммуноглобулинов человека рекомбинантные однодоменные антитела10, представляющие собой VHH домены (Рис. 4), обладают сравнительно небольшой иммуногенностью.

Однодоменные антитела получают путем клонирования библиотеки вариабельных доменов иммунизованных животных, и последующего отбора клонов из фаговой библиотеки с помощью иммобилизованного антигена.

Рис. 4 Схема строения стандартных иммуноглобулинов IgG1, антител представителей сем. СатеМае, лишенных легких цепей, и рекомбинантных однодоменных антител (УИН).

На рисунке схематически изображен репертуар антител представителей семейства СатеМае, а также рекомбинантные однодоменные антитела, которые получают на основе вариабельных последовательностей антител, лишенных легких цепей (IgG3 и IgG2). Стандартное антитело IgG1 состоит из двух тяжелых и двух легких цепей. Участок связывания антигена формируется вариабельными фрагментами тяжелой и легкой цепей (УН и V), неканонические антитела IgG3 и IgG2, состоящие из двух тяжелых цепей имеют антиген-связывающий участок, состоящий из одного домена (Уи). На их основе возможно получить рекомбинантные однодоменные антитела УиН, полностью сохраняющие специфичность исходного антитела.

В лаборатории молекулярных биотехнологий ИБГ РАН С.В. Тиллибом была проведена иммунизация двугорбого верблюда (Camelus bactrianus), создана фагмидная библиотека всего репертуара последовательностей вариабельных доменов неканонических антител из В-лимфоцитов периферической крови, а затем была проведена селекция антител к TNF человека методом фагового дисплея. В рамках данной работы был отобран клон антител Vhh41, обладающий относительно высокой аффинностью к TNF человека, но, в то же время, не блокирующий его биологическую активность. Последовательность антитела Vhh41 с отмеченными антиген-связывающими участками приведена на Рис. 5.

10 тт

Их также называют «нано-антитела».

20 40

Peiß последовательность i I

MKYL LPTAAAC L L L LAAQPAMAMAQVQLV E SCGC S VQACC S LR LSCAASC ST

60 80 100

CDR1_. I CDR2 I I

NS E LCMAWF REV PCKER EVVALVNSDCRTIYCEAVKGRFTMSKDNAКNTLYL

120 I CDR3

140 I

QMN S L КA E DTAMYYCAAGPC F FСRCNYNSVCQCTQVTVS SСRY PYDVPDYAS

160

i 6xHis CRCS L EHHHHHH

Рис. 5 Аннотированная последовательность однодоменного антитела Vhh41.

Аминокислотная последовательность однодоменного антитела Vhh41. На Оконце содержится сингнальная последовательность Ре1В, обеспечивающая транспорт белка в периплазму, на С-конце гексагистидиновая последовательность. Отмечены гипервариабельные участки (CDR1-3).

Экспрессия и очистка рекомбинантного однодоменного антитела Vhh41.

Для получения препаративных количеств однодоменного антитела против TNF человека ген антитела Vhh41 был проклонирован в экспрессионный вектор pET-22(b). Конструкция также содержала гистидиновый гексамер для хроматографической очистки белка и сигнальную последовательность для периплазматической экспрессии. Эта генетическая конструкция позволила получить в бактериальной системе растворимые однодоменные антитела в достаточном количестве.

Антитела были очищены из периплазматичекого экстракта с помощью металл-аффинной хроматографии. Конечный препарат антител, по данным электрофореза, представлял собой очищенный белок в стандартном солевом растворе с молекулярной массой около 15 кДа (Рис. 6), что совпадает с молекулярной массой, предсказанной по аминокислотной последовательности.

Рис. 6 Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле.

Электрофореграмма однодоменного антитела Vhh41 после частичной очистки методом металл-хелатной хроматографии. Слева - маркеры молекулярного веса белков и соответствующие им значения молекулярного веса, справа препарат однодоменного антитела Vhh41 (обозначен стрелкой). Однодоменное антитело имеет подвижность, соответствующую расчетной молекулярной массе - 14,7 кДа.

Анализ взаимодействия однодоменного антитела Vhh41 c TNF человека.

Иммуноферментный анализ связывания полученных рекомбинантного антитела с рекомбинантным TNF человека показал, что антитела специфически взаимодействуют с человеческим TNF с относительно высокой аффинностью (Рис. 7), сравнимой с аффинностью ранее опубликованного антитела hTNF-VHH, блокирующих биологическую активность TNF человека [206].

Рис. 7 Иммуноферментный анализ связывания однодоменного антитела Vhh41 с рекомбинантным TNF человека.

Приведена кривая зависимости оптической плотности при 450 нм от концентрации антитела Vhh41 при концентрации сорбированного TNF человека 10 мкг/мл. Также для сравнения приведена кривая для блокирующего TNF однодоменного антитела hTNF-VHH. Кроме того, показан отрицательный контроль - неспецифическое связывание в лунках, в которых не был сорбирован TNF.

Анализ кинетики связывания антитела с TNF человека методом поверхностного плазмонного резонанса подтвердил данные иммуноферментного анализа (Рис. 8, А и

Б). Так, однодоменное антитело Vhh41 имеет константу диссоциации с TNF человека =

1 2 9,36 х 10" М. При этом скорость диссоциации (off-rate) составляет 1,62 х 10" 1/с, а

скорость связывания (on-rate) = 1,37 х 104 1/Мс. Данные значения скорости связывания

и диссоциации означают, что антитело быстро вступает во взаимодействие с TNF, но

формируют недостаточно стабильную связь. Значения скорости диссоциации могут

быть уменьшены, а тем самым стабильность связи и аффинность антитела повышены, за счет димеризации однодоменных антител.

Рис. 8 Кинетика взаимодействия однодоменного антитела Vhh41 с рекомбинантным TNF человека.

(А) Приведены кривые взаимодействия (сенсограммы) образцов антитела Vhh41 в концентрациях 1 цМ и 500 нМ с сенсорным чипом, на который был конъюгирован TNF человека в концентрациях 450, 300 и 200 нМ. По оси абсцисс отложено время в секундах, по оси ординат сдвиг угла резонанса в условных единицах (УЕ). (Б) Для каждой пары сенсограмм были расчитаны значения скорости связывания (on-rate), скорости диссоциации (off-rate) и константы диссоциации (Kd). Полученные значения, средние значения, а также стандартное отклонение (SD) отложены на диаграмме рассеяния.

Анализ способности антитела Vhh41 блокировать биологическую активность TNF человека.

Измерение блокирующей активности полученного однодоменного антитела Vhh41 в цитотоксическом тесте показало, что это рекомбинантное антитело, в отличие от контрольного антитела, не блокируют цитотоксическое действие TNF человека на клетки мышиной фибросаркомы линии L929 (Рис. 9). Учитывая весьма высокую аффинность антитела можно предположить, что его эпитоп не пересекается с участком поверхности молекулы TNF человека, который участвует во взаимодействии с TNF-рецептором.

Рис. 9 Анализ блокировки цитотоксической активности TNF человека однодоменным антителом Vhh41 на культуре мышиной фибросаркомы L929.

Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз однодоменных антитела Vhh41. Для сравнения приведена кривая выживаемости при добавлении контрольного блокирующего анти-TNF однодоменного антитела hTNF-VHH [206] в тех же дозах.

Таким образом, антитела Vhh41 представляют собой удобный антиген-связывающий модуль для создания молекулярных сенсоров TNF, а также для биоинженерии ингибиторов системных эффектов TNF, работающих по принципу удержания TNF в месте его биосинтеза для предотвращения распространения этого цитокина с кровотоком.

2. Конструирование, получение и характеристика молекулярных сенсоров TNF для прижизненного изучения экспрессии TNF на основе однодоменных рекомбинантных антител и красного флуоресцентного белка

На основе гена антитела Vhh41 [ 197] и гена, кодирующего флуоресцентный белок Katushka (turbo FP 635) [199], была получена генетическая конструкция, кодирующая гибридный белок - флуоресцентный сенсор TNF, получивший название Vhh41-K. Использование неблокирующего антитела Vhh41 в качестве антиген распознающего модуля имеет своим следствием то, что полученный флуоресцентный сенсор не ингибирует биологической активности TNF и, тем самым, может быть использован для изучения экспрессии этого цитокина в ходе воспалительного процесса, не влияя на уровень его продукции и не внося изменений в изучаемую систему. Данные прижизненной визуализация TNF с использованием флуоресцентного сенсора Vhh41-K были частично опубликованы [207].

Кроме того, были получены еще два контрольных белка с аналогичной структурой: один из которых несет вместо гена Vhh41 ген блокирующего TNF однодоменного антитела hTNF-VHH [198], а в другом ген однодоменного антитела Vhh41 был подвергнут точечному мутагенезу в участках, кодирующих CDR, что привело к его неспособности связывать TNF.

Получение генетических конструкций, кодирующих флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K и контрольные гибридные белки.

Нами был сконструирован ген, кодирующий флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K, для чего последовательность, кодирующая флуоресцентный белок Katushka [199] была ПЦР-амплифицированна с модифицирующими праймерами и проклонирована в экспрессионный вектор, содержащий однодоменное верблюжье антитело Vhh-41 [197], таким образом, что они оказались в одной рамке считывания а между ними образовалась последовательность, кодирующая гибкий глицин-сериновый линкер. На С-конце генетической конструкции содержалась последовательность, кодирующая гистидиновый гексамер, для последующей аффинной очистки (см. Рис. 10).

Аналогичным способом была получена генетическая конструкция, кодирующая блокирующий сенсор TNF. Для этого гибридного белка в качестве антиген-распознающего домена было использовано однодоменное антитело hTNF-VHH,

опубликованное ранее [198].

Для создания контрольного белка - mVhh41 -K, который был бы неспособен связывать TNF, вектор, содержащий последовательность Vhh41-K, был подвергнут точечному мутагенезу в трех гипервариабельных участках антитела Vhh41.

А В

Vhh41 ) [линкер] [ Katustika линкер 6XHis

TNF

Рис. 10 Устройство генетической конструкции, кодирующей флуоресцентный сенсор TNF - Vhh41-K . Схематическое изображение двухвалентного взаимодействия димера флуоресцентного сенсора с тримером TNF.

(A) Строение генетической конструкции: последовательность, кодирующая однодоменное антитело против TNF, сопровождается последовательностью, кодирующей гибкий линкер, а затем геном красного флуоресцентного белка Katushka, вторым линкером и последовательностью, кодирующей полигексидиновую метку. (B) Флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K спонтанно димеризуется. Два VHH домена способны одновременно связываться с тримером TNF.

Экспрессия и очистка флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K.

Клетки E.coli штамма BL21DE3 были трансформированы экспрессионным вектором, несущим ген Vhh41 -K, после чего белок был экспрессирован и очищен с помощью никель-хелатной хроматографии.

Аналитическая хроматограмма сенсора TNF по методу эксклюзионной водной хроматографии (гель-фильтрации) показала, что гибридный белок сенсор-TNF имеет подвижность, рассчитанную по белкам-маркерам, соответствующую массе в 99,7 кДа (Рис. 11), тогда как масса мономера флуоресцентного сенсора, предсказанная по аминокислотной последовательности составляла 43,1 кДа.

Рис. 11 Эксклюзионная водная хроматография (гель-фильтрация) сенсора-TNF Vhh41-K.

(A) Хроматограмма флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K (отмечена красным цветом), наложенная на хроматограмму маркеров молекулярной массы. (B) Функция зависимости времени прохождения молекулы в зависимости от молекулярной массы. Расчетная молекулярная масса флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K составила 99,7 кДа.

Это указывает на то, что флуоресцентный сенсор TNF существует в растворе в виде димера, что согласуется с описанной ранее способностью флуоресцентного белка Katushka образовывать димеры. Димеризация флуоресцентного сенсора TNF дает ряд преимуществ: бивалентное связывание увеличивает авидность и снижает скорость диссоциации, усиливается флуоресцентный сигнал и увеличивается время полувыведения.

Анализ взаимодействия флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K с

рекомбинантным TNF мыши и человека.

Способность флуоресцентного сенсора Vhh41-K связывать TNF человека и TNF мыши была проанализирована методом иммуноферментного анализа (ИФА). Было показано, что Vhh41 -K специфически связывается и с TNF человека и с TNF мыши (Рис. 12), тогда как блокирующий сенсор TNF взаимодействует только с TNF человека.

Рис. 12 Анализ взаимодействия флуоресцентного сенсора Vhh41-K с TNF человека и мыши методом ИФА.

Взаимодействие сенсора Vhh41-K с человеческим и мышиным TNF было измерено методом прямого иммуноферментного анализа. Для этого рекомбинантный TNF сорбировался в лунках, а образцы сенсора Vhh41-K и контрольного блокирующего сенсора TNF наносились в убывающих коцентрациях. Затем концентрация сенсора детектировалась с помощью никель-конъюгированной пероксидазы. На графике отложены значения оптической плотности при 450 нм и стандартное отклонение (SD).

Способность флуоресцентного сенсора связывать TNF человека и кинетика этого взаимодействия были также проанализированы методом поверхностного плазмонного резонанса (Рис. 13 А, В и Таб. 1). Расчетная скорость диссоциации (off-rate) для флуоресцентного сенсора более чем в 20 раз ниже, чем для однодоменного антитела

4 2

(7,29 х 10- 1/с и 1,62 х 10- 1/с соответственно), что обеспечивает уменьшение константы диссоциации более, чем на порядок. Разница в авидности между

флуоресцентным сенсором (9,04 х 10- М) и исходным однодоменным антителом (9,36

1

х 10- М) подтверждает, что при димеризации обе TNF-связывающие субъединицы

остаются функционально активными, и что сенсор способен формировать бивалентную связь.

Тем же методом поверхностного плазмонного резонанса была проанализирована способность флуоресцентного сенсора связывать TNF мыши (Рис. 13 Б и Таб. 1). Константа диссоциации для мышиного TNF примерно в два раза превышает константу диссоциации для TNF человека. Несмотря на то, что для иммунизации верблюда использовался рекомбинантный TNF человека, высокая степень гомологии между TNF человека и мыши (79%) обеспечила возможность перекрестного распознавания. Это обстоятельство позволяет использовать флуоресцентный сенсор TNF не только в генетически модифицированных мышах, несущих ген TNF человека вместо гена Tnf мыши («TNF гуманизованные мыши»), но и в мышах дикого типа.

Эксперименты по связыванию TNF человека контрольным флуоресцентным белком mVhh41-K, имеющих мутации в гипервариабельных участках показали, что его константа диссоциации составляет 7,01 х 10-5 М, т.е. на три порядка выше, чем для сенсора с интактными CDR участками (Рис. 13 А, В и Таб. 1). Это свидетельствует, что данный белок пригоден для использования в качестве отрицательного контроля при изучении распределения TNF в организме.

Рис. 13 Кинетика взаимодействия флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K c рекомбинантным TNF человека и мыши. Кинетика взаимодействия контрольного

флуоресцентного гибридного белка mVhh41-K с TNF человека.

Кинетика взаимодействия была проанализированна методом поверхностного плазмонного резонанса. (А) Приведены кривые взаимодействия (сенсограммы) образцов флуоресцентного сенсора Vhh41-K и контрольного флуоресцентного гибридного белка в концентрациях 1 цМ и 500 нМ с сенсорным чипом, на который был конъюгирован TNF человека в концентрациях 450, 300 и 200 нМ. (Б) Приведены кривые взаимодействия (сенсограммы) образцов флуоресцентного сенсора Vhh41 -K в концентрациях 1.5 цМ, 1 цМ, 750 и 500 нМ с сенсорным чипом, на который был конъюгирован TNF мыши в концентрации 100 нМ. По оси абсцисс отложено время в секундах, по оси ординат сдвиг угла резонанса в условных единицах (УЕ). (В) Для каждой сенсограммы были расчитаны значения скорости связывания (on-rate), скорости диссоциации (off-rate) и константы диссоциации (Kd). Полученные значения, средние значения, а также стандартное отклонение (SD) отложены на диаграммах рассеяния.

Взаимодействие Kd, M On-rate, 1/Мс Off-rate, 1/с

(SD) (SD) (SD)

Vhh41-K c TNF 9,04x10-8 9,75x103 7,29x10-4

человека (3,01 x10-7) (3,41 x103) (1,49x10-3)

Vhh41-K c TNF 4,66x10-7 1,54x104 6,04x10-3

мыши (2,7 x10-7) (6,01 x103) (2,89 x10-3)

mVhh41-K c TNF 7,01 x10-5 3,78x102 2,15x10-2

человека (5,53 x10-5) (1,27x104) (7,74x10-3)

Таб. 1 Значения констант диссоциации, скорости связывания и скорости диссоциации для взаимодействий флуоресцентных сенсоров TNF и рекомбинантного TNF человека и мыши, измеренные методом поверхностного плазмонного резонанса.

Исследование биологических свойств флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K in vitro и in vivo.

Для флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K был определен профиль поглощения и эмиссии. Пик поглощения Vhh41-K находится на 588 нм, пик эмиссии на 635 нм (Рис. 14). Это соответствует спектральным характеристикам флуоресцентного белка Katushka, для которого данные значения были определены как 589 и 635 нм соответственно. Эмиссия в дальне-красной области, в которой живые ткани обладают максимальной прозрачностью, делает данный белок пригодным для in vivo визуализации [199].

ЮОп

Длина волны, нм

Рис. 14 Профиль поглощения и эмиссии для флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K.

Для того, чтобы исключить, что димеризация антитела Vhh41 могла привести к тому, что стерически блокируется взаимодействие связанного тримера TNF с его рецептором, было проанализирована TNF-ингибирующая активность флуоресцентного сенсора Vhh41-K. Для сравнения нами был использован блокирующий флуоресцентный сенсор TNF. Результаты цитотоксического теста на культуре мышиной фибросаркомы L929, чувствительной к цитотоксическим эффектам TNF человека, показали, что флуоресцентный сенсор Vhh41-K не влияет на активацию TNF-рецепторов на мембране фибробластов, тогда как для контрольного слитного белка наблюдалось дозозависимое ингибирование цитотоксичности (Рис. 15). Отсутствие влияния флуоресцентного сенсора на биологическую функцию TNF делает его удобным инструментом для изучения динамики экспрессии TNF in vivo без внесения изменений в изучаемую систему.

Рис. 15 Анализ блокировки цитотоксической активности TNF человека флуоресцентным сенсором TNF Vhh41-K и контрольным блокирующим сенсором TNF.

Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз флуоресцентного сенсора Vhh41-K. Для сравнения приведена кривая выживаемости при добавлении контрольного блокирующего сенсора TNF в тех же дозах.

Также была проведена оценка стабильности флуоресцентного сенсора in vivo. Для этого он вводился мышам в системный кровоток, после чего через определенные промежутки времени проводились взятия крови либо животные забивались, проводился забор отдельных органов и приготовление гомогенатов. Полученные образцы анализировались методом иммуноблоттинга на содержание сенсора TNF (Рис. 16).

Рис. 16 Иммуноблотинг образцов крови и лизатов тканей, взятых через различные интервалы после введения флуоресцентного сенсора TNF мышам.

Флуоресцентный сенсор TNF вводился в системный кровоток мышам, после чего через различные интервалы проводился забор крови из ретроорбитального синуса, либо животные забивались и у них забирались образцы тканей из различных органов. Сыворотка крови и лизаты тканей подвергались денатурирующему электрофорезу и иммуноблоту с антителами, специфичными к флуоресцентному белку Katushka. Кр. р./с. - кровь из ретроорбитального синуса. Кр. с. - кровь из сердца, Л. - лизат легочной ткани, С. - лизат суставной ткани (коленный сустав), Поч. - лизат почечной ткани, Печ. - лизат ткани печени.

В эксперименте по TNF-зависимой острой гепатотоксичности in vivo было подтверждено, что флуоресцентный сенсор не оказывает влияния на развитие патологии. «TNF гуманизованным мышам» вводился фосфатно-солевой буфер, или препарат флуоресцентного сенсора в дозах 75 или 100 пмоль/г веса, или блокирующий сенсор TNF или блокирующее однодоменное антитело в тех же дозах. Спустя 30 мин мыши получали инъекцию смеси D-галактозамина (D-гал) и липополисахарида (ЛПС) в дозе, вызывающей 100% летальность в течение 12 часов. Все мыши, получившие блокирующий сенсор TNF в концентрациях 75 или 150 пмоль на грамм веса, выжили. В группе, получившей наименьшую дозировку - 37,5 пмоль/г наблюдалась частичная летальность. В то же время в группе мышей, получавший флуоресцентный сенсор в любой дозировке или фосфатно-солевой буфер наблюдалась 100% летальность (Рис. 17 А). Кроме того необходимо отметить, что исходное однодоменное антитело, блокирующее TNF (hTNF-VHH) имело меньшую активность in vivo, чем блокирующий

сенсор TNF, полученный на его основе. Это косвенно подтверждает обсуждавшееся выше положение о том, что гибридные белки, имеющие флуоресцентный белок Katushka в своей основе, могут образовывать функционально активные димеры.

В аналогичном эксперименте на мышах дикого типа флуоресцентный сенсор TNF также не проявил TNF-ингибирующей активности. Все мыши, получавшие инъекцию сенсора в различных концентрацией перед введением летальной дозы ЛПС/й-гал, умерли (Рис. 17 Б). Использование этанерцепта - блокатора TNF, который взаимодейстует также и с мышиным TNF, в качестве положительного контроля в этом эксперименте привело к дозозависимой защите от TNF-токсичности. Две верхние дозы (200 и 100 пмоль/г) способны полностью защитить мышей от летальности, в то время как в других дозировках наблюдается замедление кинетики смертности.

Рис. 17 Влияние флуоресцентного сенсора Vhh41-K и контрольного блокирующего сенсора на развитие TNF-зависимой летальности в модели ЛПС/О-гал индуцированной гепатотоксичности.

(А) Мыши, имеющие ген TNF человека вместо мышиного гена Tnf, получали

65

летальную дозу ЛПСЮ-гал в сочетании с различными дозировками флуоресцентного сенсора Vhh41-K или блокирующего сенсора TNF или блокирующего TNF однодоменного антитела. На столбчатой диаграмме отложена выживаемость мышей. (Б) Мыши дикого типа (C57B1) получали летальную дозу ЛПСЮ-гал в сочетании с различными дозировками флуоресцентного сенсора Vhh41 -K или этанерцепта. Приведена кривая выживаемости (метод Каплан-Мейера).

Полученные данные указывают на то, что системное введение флуоресцентного сенсора не должно мешать развитию TNF-зависимых модельных аутоиммунных патологий, и что данный сенсор может быть использован in vivo для изучения динамики экспрессии TNF как в «TNF гуманизованных» мышах, несущих ген TNF человека вместо мышиного гена Tnf, так и в мышах дикого типа.

Изучение способности флуоресцентного сенсора связывать TNF in vivo.

Способность флуоресцентного сенсора Vhh41-K связывать TNF in vivo была проанализирована в модели аутоиммунного гепатита, индуцированного введением конканавалина А. Мышам, несущим ген TNF человека вместо мышиного гена Tnf вводился конканавалин А и/или флуоресцентный сенсор Vhh41-K. Через 90 минут животные забивались, а печень подвергалась гистологическому исследованию для оценки уровня патологии а также конфокальной микроскопии для визуализации флуоресцентного сенсора Vhh41-K.

Конфокальная микроскопия показала, что введенный внутривенно сенсор TNF аккумулируется в печени, пораженной аутоиммунным гепатитом, вблизи стенок центральных вен. В контрольных животных, не получавших инъекции конканавалина А наблюдалось лишь незначительное диффузное окрашивание по ходу синусоидных капилляров (Рис. 18).

Рис. 18 Ex vivo визуализация аккумуляции флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K в печени, пораженной аутоиммунным гепатитом.

Срезы печени, после индукции гепатита были проанализированы методом конфокальной микроскопии. (А) Печень генетически модифицированных мышей, несущих ген TNF человека, у которых был индуцирован аутоиммунный гепатит и которые получали флуоресцентный сенсор. Наблюдается аккумуляция флуоресцентного сенсора TNF вблизи стенок центральных вен печени и на

поверхности клеток, расположенных в просвете центральных вен (отмечено стрелками). (Б) Срезы печени мышей с аутоиммунным гепатитом, не получавших флуоресцентный сенсор. Флуоресцентный сигнал отсутствует. (В) Срезы печени здоровых мышей, получивших инъекцию флуоресцентного сенсора. Наблюдается диффузное распределение по ходу синусоидных капилляров (отмечено стрелками).

Кроме того, способность флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K специфически накапливаться в областях гиперэкспрессии TNF была показана на модели аутоиммунного артрита, индуцированного инъекциями куриного коллагена II типа. У генетически модифицированных мышей сначала индуцировали аутоиммунный артрит, после развития симптомов мышам внутривенно вводили сенсор. Мыши забивались, а гистологические срезы суставов подвергались конфокальной микроскопии. Было показано, что введенный флуоресцентный сенсор способен специфически накапливаться в пораженном суставе в области лейкоцитарной инфильтрации и в зонах эрозии хрящевой ткани. (Рис. 19).

Рис. 19 Конфокальная микроскопия тканей сустава после системного введения флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K

Мышам, развившим аутоиммунное воспаление суставов после иммунизации коллагеном II типа (А), и здоровым мышам (Б) внутривенно вводился флуоресцентный сенсор Vhh41-K. Через час после введения мыши умерщвлялись, а ткани сустава декальцинировались, заключались в парафиновые блоки, а затем нарезались, окрашивались и подвергались конфокальной микроскопии. Сенсор TNF Vhh41-K специфически накапливается в зонах эрозии хрящевой ткани и зонах лейкоцитарных инфильтратов (отмечены стрелками).

Специфичность накопления сенсора была независимо подтверждена иммуноблотом лизатов пораженных суставов и контрольных суставов здоровых мышей, также получавших внутривенно сенсор (Рис. 20).

А

Б

N1 N2 N3 N4 N1

N2

Рис. 20 Иммуноблот лизатов тканей суставов мышей, получавших инъекцию флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K.

Мышам, с коллаген-индуцированным аутоиммунным артритом различной степени тяжести (А), или контрольным здоровым животным (Б) внутривенно вводился флуоресцентный сенсор TNF. Через час после введения мыши умерщвлялись, проводился забор тканей предплюсно-плюсневых суставов, которые впоследствии лизировались и подвергались иммуноблоту с антителами против флуоресцентного белка Katushka.

Таким образом ex vivo методами было подтверждено, что сенсор специфически накапливается в областях повышенной экспрессии TNF.

Прижизненное изучение экспрессии TNF с помощью полученного флуоресцентного сенсора.

Далее были изучена возможность прижизненной визуализации TNF с использованием флуоресцентного сенсора в моделях острой и хронической аутоиммунной патологии на лабораторных животных.

Было показано, что введение флуоресцентного сенсора мышам, у которых гиперпродукция TNF была предварительно стимулирована введением ЛПС, вызывает диффузное усиление сигнала по сравнению с мышами, не стимулированными ЛПС но также получавшими сенсор (Рис. 21). Это, по всей вероятности, объясняется связыванием сенсора с TNF, который в больших количествах выбрасывается в системный кровоток в ответ на стимуляцию рецепторов системы врожденного иммунитета. Формирование комплексов TNF-сенсор в кровотоке должно увеличивать период полувыведения сенсора и, следовательно, приводить к усилению флуоресцентного сигнала при визуализации всего организма. Незначительная диффузная флуоресценция в мышах, не получавших ЛПС, объясняется неспецифическим сигналом от несвязавшего TNF сенсора, циркулирующего в системном кровотоке. Таким образом, хотя этот сенсор и связывает TNF при острой аутоиммунной патологии, он имеет ограниченную применимость в этом типе заболеваний в связи с неспособностью четко обозначить области гиперэкспрессии TNF.

О мин 20 мин 40 мин 60 мин

■ ¡ ч «л «ь Г.,- 7 Гр. | Л fjk I .4 К г' i V t-A ¡ rAJ 1

V / I

4 л i /'

Ow •1 »

■ § - ^ / 'Ч, w #

Рис. 21 Прижизненная визуализация областей гиперэкспресии TNF при помощи флуоресцентного сенсора Vhh41-K в модели септического шока.

Мыши дикого типа получали внутрибрюшинную инъекцию 1 мг ЛПС (А) или буфера (Б). Через час после этого внутривенно вводилось 200 мкг флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K. Непосредственно перед введением сенсора и далее через равные промежутки времени проводилась прижизненная визуализация флуоресценции на уровне всего организма с помощью прибора Kodak Carestream In Vivo FX PRO. Псевдоцвета отражают интенсивность сигнала. У животных, получаших ЛПС, наблюдалась значительно более интенсивная флуоресценция, чем у контрольных животных.

Модель коллаген-индуцированного артрита, как заболевания, сопровождающегося локализованной гиперпродукцией TNF, оказалась более пригодна для прижизненной визуализации этого цитокина. У мышей, получавших внутривенную инъекцию флуоресцентного сенсора, наблюдалось его специфическое накопление в пораженном суставе (Рис. 22).

»4 *

Рис. 22 Прижизненная визуализация областей гиперэкспрессии TNF в модельном аутоиммунном артрите с помощью флуоресцентного сенсора Vhh41-K.

Мыши, развившие аутоиммунный артрит после иммунизаци куриным коллагеном II типа, получали внутривенно 50 пмоль флуоресцентного сенсора TNF Vhh41-K. Прижизненная визуализация проводилась до введения флуоресцентного сенсора и через различные интервалы времени после введения. (А) флуоресценция до введения сенсора TNF, наложенная на рентгенограмму. (Б) флуоресценция через 50 минут после введения флуоресцентного сенсора Vhh41-K, наложенная на рентгенограмму. Псевдоцвета отражают интенсивность сигнала. Наблюдается специфическое накопление сигнала в пораженном суставе (отмечен стрелкой).

Полученные данные свидетельствуют о том, что флуоресцентный сенсор TNF Vhh41 -K пригоден для in vivo визуализации TNF в моделях локализованного воспаления. В дальнейшем с использованием флуоресцентного сенсора Vhh41-K планируется изучить динамику экспрессии TNF при развитии аутоиммунного и инфекционного воспалительного процесса, а также отслеживать динамику снижения экспрессии TNF на фоне анти-TNF терапии.

3. Получение и характеристика рекомбинантного одноцепочечного антитела, блокирующего биологическую

активность TNF

В качестве первого этапа разработки отечественного терапевтического блокатора TNF было получено и изучено рекомбинантное одноцепочечное антитело (scFv) против TNF человека. Антитело, получившее название ahT-4, было получено на основе клонированных ДНК последовательностей высокоаффинного блокирующего мышиного моноклонального антитела против TNF человека. Эта работа детально описана в [208]. Полученное одноцепочечное антитело ahT-4 сохраняет способность блокировать цитотоксическую активность TNF, что в сочетании с его малыми размерами и простотой экспрессии сделало его пригодным для дальнейшей биоинженерии на его основе терапевтического блокатора TNF.

Измерение активности мышиного моноклонального антитела F10.

До начала биоинженерии рекомбинантных антител на базе вариабельных доменов антитела F10 было проведено сравнение активностей мышиного моноклонального антитела F10 против TNF человека в блокировании биологических эффектов TNF с активностями двух широко применяемыми в клинике ингибиторов TNF. Хотя антитело F10 было получено и охарактеризовано давно [201], ранее такого сравнения в биологических системах не проводилось. Оказалось, что F10 обладает высокой активностью в блокировке TNF: так в цитотоксическом тесте на линии мышиной фибросаркомы L929 антитело F10 показало активность выше, чем у инфликсимаба и примерно соответствующую активности этанерцепта (Рис. 23).

Рис. 23 Сравнение анти-TNF активности in vitro мышиного моноклонального антитела F10 и терапевтических блокаторов TNF.

Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз антитела F10 и терапевтических блокаторов TNF - инфликсимаба и этанерцепта.

Сравнение ингибирующих свойств блокаторов TNF человека в мышиной системе затруднено, так как большинство блокаторов, за исключением этанерцепта, не нейтрализуют TNF мыши. В этой связи в последующем эксперименте были использованы нокаутные по Tnf мыши, в которых биологические эффекты (в т.ч. токсичность) вызывались инъекцией рекомбинантного TNF человека. В таком относительно грубом эксперименте in vivo антитело F10 и блокатор TNF инфликсимаб показали примерно одинаковую эффективность (Рис. 24). Выжили все животные, получившие максимальную дозу одного из двух этих блокаторов (молярное соотношение блокатор - TNF составило приблизительно 75:1). В минимальной дозировке (молярное соотношение 3:2) погибли все животные. Во всех других группах наблюдалась дозозависимая летальность, значительно растянутая во времени.

Рис. 24 Сравнительная активность антитела F10 и инфликсимаба in vivo.

Мышам генотипа Tnf - -

каждого из блокаторов.

от концентрации

Конструирование одноцепочечного антитела на базе вариабельных фрагментов легкой и тяжелой цепей мышиного моноклонального антитела F10.

Для получения прототипа блокатора TNF человека гены вариабельных участков тяжелой и легкой цепей, проклонированные ранее [201], были соединены в генетическую конструкцию, кодирующую одноцепочечное антитело таким образом, что между ними образовалась последовательность, кодирующая гибкий глицин-сериновый линкер. Конструкция также содержала участок, кодирующий гистидиновый гексамер для хроматографической очистки белка (Рис. 25).

Рис. 25 Устройство генетической конструкции, кодирующей одноцепочечное антитело ahT-4.

(Л) Строение генетической конструкции: последовательность, кодирующая вариабельный участок тяжелой цепи, сопровождается последовательностью, кодирующей гибкий линкер, а затем последовательностью, кодирующей вариабельный участок легкой цепи и последовательностью, кодирующей полигексидиновую метку.

Данная генетическая конструкция, проклонированная в плазмиду pET-22(b),

экспрессировалась в клетка E. coli в виде растворимых одноцепочечных антител, за

счет содержащейся в плазмиде нуклеотидной последовательности, кодирующей

74

сигнальный пептид, обеспечивающий транслокацию белка в периплазму. Растворимые одноцепочечные антитела были очищены из периплазматичекого экстракта последовательно с помощью металл-аффинной хроматографии и хроматографии на сорбенте с конъюгированным протеином L11 [209]. Конечный препарат антител, по данным электрофореза, представлял собой очищенный белок, практически без видимых примесей, с молекулярной массой около 28 кД (Рис. 26), что совпадает с молекулярной массой, предсказанной по аминокислотной последовательности.

А Б В

;

Рис. 26 Электрофоретическая подвижность препарата одноцепочечного анти-TNF антитела ahT-4.

(A) Электрофореграмма одноцепочечного антитела ahT-4

- хроматографии. Слева - маркеры молекуляного веса белков и

соответствующие им значения молекулярного веса, справа - препарат одноцепочечного анти- тела (ahT-4 ). (Б) Электрофореграмма одноцепочечного

антитела ahT-4 после второй ступени очистки на сорбенте, конъюгрованном с протеином-L. Слева - маркеры молекулярного веса белков, справа - препарат одноцепочечного антитела. (В) Иммуноблот препарата одноцепочечного антитела ahT-4 с антителами к полигексидиновой последовательности.

Измерение активности одноцепочечного антитела ahT-4.

Антитело ahT-4 эффективно блокирует биологические функции TNF в цитотоксическом тесте (Рис. 27). Следует отметить, что сравнительная активность одноцепочечного антитела ahT-4 ниже, чем активность материнского моноклонального антитела F10 приблизительно на два порядка, что объясняется снижением авидности из-за наличия только одного участка связывания с молекулой TNF (полноразмерные антитела имеют два таких участка и способны к бивалентному связыванию). При

11 Белок, выделенный из Peptostreptococcus magnus, специфически связывающий легкие цепи иммуноглобулинов изотипа каппа.

сравнении одноцепочечного антитела аЬТ-4 с БаЬ-фрагментом материнского антитела в одинаковых молярных концентрациях, их активность не различалась.

104 102 10° ю2 ю4

Концентрация, нМ

Рис. 27 Сравнение анти-TNF активности in vitro одноцепочечного атитела ahT-4, исходного мышиного моноклонального антитела F10 и Fab-фрагмента данного антитела.

Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз одноцепочечного антитела ahT-4, Fab-фрагмента антитела F10 и полноразмерного антитела F10. Сравнение проводилось в молярных концентрациях для того, чтобы исключить влияния различий в молярной массе на активность.

Таким образом было показано, что вариабельные домены мышиного моноклонального антитела F10, проэкспрессированные в бактериальной системе в виде одноцепочечных антител, сохраняют способность связывать TNF человека и блокировать его биологические действия, что делает их пригодными для создания прототипа терапевтического агента на основе рекомбинантных антител.

4. Разработка и анализ химерного антитела против TNF

человека.

Изучение свойств одноцепочечного антитела ahT-4 и материнсткого антитела F10 сделало возможным в сотрудничестве с компанией ModiQuest (Нидерланды) создать химерное антитело 13239, блокирующее TNF человека. В рамках настоящей работы было проведено изучение кинетики взаимодействия этого химерного антитела с рекомбинантным TNF человека методом поверхностного плазмонного резонанса и сравнение его свойств с таковыми для широко применяющегося в клинической практике химерного антитела против TNF человека - инфликсимаба. Кроме того было проведено сравнение биологической активности данных антител в in vitro системе на клеточной культуре, чувствительной к TNF, и проведены пилотные эксперименты по сравнительной активности обоих химерных антител in vivo.

Сравнение кинетики взаимодействий химерного антитела 13239 и инфликсимаба с рекомбинантным TNF человека.

Методом поверхностного плазмонного резонанса на приборе ProteOn XPR36 было проведено сравнение аффинности и кинетики взаимодействия двух химерных антител (13239 и инфликсимаба) против TNF человека. Для это в соответствии с описанной ранее методикой [202] на сенсорном чипе были вначале ковалентно иммобилизованы поликлональные антитела козы против Fc человека. Затем на чип наносились химерные антитела, которые удерживались за счет взаимодействия вариабельных фрагментов поликлональных антител с эпитопами в константных участках. Альтернативный метод прямой пришивки исследуемых антител к сенсорной поверхности приводил к тому, что часть паратопов12 оказывалась инактивированной за счет взаимодействия аминогрупп в лизинах, содержащихся в CDR участках, с карбоксильными группами на поверхности чипа. Присоединение же через вторичные антитела обеспечивало то, что исследуемые антитела располагаются в правильной ориентации и полностью функционально активны. Рекомбинантный TNF человека наносился в качестве аналита, а полученные сенсограммы взаимодействий анализировались.

Кинетика диссоциации комплекса антиген-антитело была определена как 12,6 пМ для химерного антитела 13239 и 33,4 пМ для инфликсимаба (Рис. 28 и Таб. 2).

12

Участок антитела, обеспечивающий специфичное распознавание эпитопа на поверхности антигена.

Определенное значение константы диссоциации для инфликсимаба 33,4 пМ оказалось очень близко к значению, описанному в литературе - 27,3 пМ [202]. Таким образом мы заключили, что химерное антитело 13239 имеет несколько большее сродство к TNF человека, чем инфликсимаб. Играет ли эта разница функциональное значение in vivo могут показать только дополнительные исследования.

Рис. 28 Кинетика взаимодействия химерного антитела 13239 и инфликсимаба с рекомбинантным TNF человека.

(А) Приведены кривые взаимодействия (сенсограммы) рекомбинантного TNF человека в концентрациях 100 нМ - 12,5 нМ с сенсорным чипом, на котором были иммобилизованы химерные антитела. По оси абсцисс отложено время в секундах, по оси ординат сдвиг угла резонанса в условных единицах (УЕ). (Б) Для каждой группы сенсограмм были расчитаны значения скорости связывания (on-rate), скорости диссоциации (off-rate) и константы диссоциации (Kd). Полученные средние значения, а также стандартное отклонение (SD) отложены на диаграмме изоаффиности. Диагональные линии соответсвуют указанным значениям Kd.

Взаимодействие Kd, M On-rate, 1/Мсек Off-rate, 1/сек

(SD) (SD) (SD)

Химерное антитело 1,29х10-11 2,17х106 2,79х10-5

13239 (3,83 х10-12) (8,49х104) (7,21х10-6)

Инфликсимаб 3,34х10-11 7,74х105 2,58х10-5

(8,84х10-13) (7,07х102) (7,07 х10-7)

Таб. 2 Значения констант диссоциации, скорости связывания и скорости диссоциации для взаимодействий химерных антител - блокаторов TNF и рекомбинантного TNF человека, измеренные методом поверхностного плазмонного резонанса.

Сравнение нейтрализующей активности химерного антитела 13239 с активностью инфликсимаба in vitro.

Анти-TNF активность полученного химерного антитела была изучена in vitro на культуре мышиной фибросаркомы L929, чувствительной к TNF человека. Причем нейтрализующая активность была сравнена с таковой для материнского моноклонального антитела F10 и терапевтического антитела инфликсимаб (Рис. 29). Оказалось, что эффективные дозы моноклонального антитела F10 и химерного антитела 13239, защищающие 50% клеток от TNF-зависимой токсичности (ED50), практически не отличаются и составляют 51 и 60 пМ соответственно, что в молярном пересчете составляет приблизительно одну молекулу антитела на три молекулы TNF13. Для терапевтического антитела инфликсимаб ED50 составила 161 пМ, что соответствует 1 молекуле антитела на 1 молекулу TNF.

Таким образом было продемонстрированно, что полученное новое химерное анти-TNF антитело 13239 имеет значительно большую активность in vitro, чем широко использующееся в клинике терапевтическое химерное антитело инфликсимаб.

13

Расчет проводился относительно тримера TNF, который содержит три эпитопа. Одна молекула антитела одновременно может связаться с двумя различными тримерами TNF [210].

Рис. 29 Сравнение анти-TNF активности in vitro химерного антитела 13239, мышиного моноклонального антитела F10 и инфликсимаба.

Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз химерного антитела 13239, моноклонального антитела F10 и инфликсимаба.

Анализ активности химерного антитела 13239 in vivo.

Чтобы подтвердить эффективность полученного препарата в живой системе были проведены пилотные эксперименты по ингибированию токсического действия TNF в модели септического шока, индуцированного ЛПС и D-галактозамином. «TNF гуманизованные мыши» получали инъекцию летальной дозы ЛПСЮ-гал, а 30 минут спустя инъекцию блокаторов TNF или буфера. Все мыши, получившие моноклональные антитела F10, либо химерные антитела 13239, либо инфликсимаб выжили, в то время как в группе мышей, получавший фосфатно-солевой буфер, наблюдалась 100% летальность (Рис. 30).

Рис. 30 Активность химерного антитела 13239 in vivo.

Мышам, несущим ген TNF человека вводилась летальная доза ЛПС/О-гал, а спустя 30 минут различные блокаторы TNF человека в дозе 15 мкг/г веса. Приведен график суммарной через 12 часов.

Эти данные подтверждают ожидаемое: химерное антитело 13239 имеет значительную анти-TNF активность in vivo. Следует отметить, что имевшиеся в нашем распоряжении дозы антител позволили дать только качественный ответ. Дальнейшие исследования на больших группах мышей должны показать, приводит ли большая анти-TNF активность химерного антитела 13239 in vitro к снижению терапевтической дозы in vivo.

5. Конструирование, получение и характеристика селективного блокатора TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда.

На основании экспериментальных данных, полученных на линиях мышей, в которых ген Tnf удален в отдельных клеточных популяциях [70], была сформулирована гипотеза о возможных различных функциях TNF, производимого разными типами иммуноцитов. Так недавно было показано, что в модели экспериментальной туберкулезной инфекции TNF, продуцируемый Т-лимфоцитами, но не миелоидными клетками, имеет уникальную защитную функцию [188]. Кроме того в нашей лаборатории получены данные, указывающие на патогенные свойства TNF из миелоидных клеток при аутоиммунных заболеваниях [14]. Терапевтически применяемая полная блокировка Т№не учитывает этих особенностей. В рамках развития данной гипотезы было выбрано специфическое ингибирование TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда, которое могло бы иметь существенное преимущество перед системной блокировкой этого цитокина. В частности, интактный сигнал от TNF, производимого B- и T- лимфоцитами, мог бы снизить частоту побочных эффектов, а, кроме того, сделать анти-TNF терапию эффективной в тех болезнях, для которых ранее блокаторы TNF не показали клинической эффективности, или даже вызывали усиление симптоматики. Кроме того, такой подход может потенциально снизить необходимую дозу за счет адресной доставки к клеткам-продуцентам.

Для проверки этого предположения мы сконструировали и испытали биспецифическое антитело, которое одной своей частью связывается с поверхностью макрофагов за счет взаимодейсвия с трансмембранной молекулой F4/80, а второй специфичностью захватывает и блокирует производимый ими TNF.

Молекулярное клонирование, экспрессия и очистка биспецифических антител.

Биспецифическое антитело - селективный блокатор макрофагального TNF -получило название А9. Для создания кодирующей его генетической конструкции были использованы однодоменное блокирующего анти-TNF антитело hTNF-VHH [198] и одноцепочечное антитело (scFv) против макрофагального поверхностного маркера F4/80 (любезно предоставленное С. Гордоном (Оксфордский университет, Великобритания) и М. Стейси (университет Лидса, Великобритания).

Последовательности, кодирующие оба антитела были амплифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и клонированы в экспрессионный вектор таким образом, что они оказались в одной рамке считывания, а между ними образовалась нуклеотидная последовательность, кодирующая гибкий глицин-сериновый линкер (ОБООООБО). На С-конце последовательности располагается последовательность, кодирующая гистидиновый гексамер, для последующей очистки белка (Рис. 31).

Рис. 31 Дизайн биспецифического антитела А9, схематическое изображение его механизма действия, строение генетических конструкций, кодирующих биспецифическое антитело А9 и контрольный системный блокатор TNF -антитело mA9.

(А) Биспецифическое антитело А9 состоит из однодоменного антитела (VhH) против TNF человека и одноцепочечного антитела (scFv) против поверхностной молекулы F4/80, экспрессирующейся на моноцитах и макрофагах. (Б) Принцип селективной блокировки TNF, производимого макрофагами: А9 связывется с поверхностью макрофагагов и захватывает высвобождаемый с их поверхности TNF, предотвращая его попадание в системную циркуляцию. (В) Схема генетической конструкции биспецифического антитела А9 и контрольного системного блокатора TNF - mA9. Ген

однодоменного анти-TNF антитела сопровождается последовательностью, кодирующей гибкий глицин-сериновый линкер, а затем геном одноцепочечного антитела против F4/80. Затем следует последовательность, кодирующая гистидиновый гексамер для аффинной очистки. Контрольное антитело mA9 имеет аналогичную последовательность за исключением того, что 6 гипевариабельных участков анти-Р4/80 антитела заменены на последовательности вида (Gly3Ser)n, что препятствует связыванию антитела с поверхностью макрофагов и превращает его в системный ингибитор TNF.

Для изучения эффектов специфической блокировки TNF, производимого макрофагами, был необходим контрольный системный блокатор. Чтобы избежать эффектов связанных с различиями в аффинности14 антител, было решено использовать блокатор имеющий аналогичный A9 TNF-связывающий участок. А для того, чтобы исключить влияние других факторов, в частности изоэлектрической точки и молекулярной массы, которая может влиять на время полувыведения, контрольное антитело должно быть максимально приближено по первичной аминокислотной последовательности к изучаемому. Поэтому нами было сконструировано контрольное антитело - тА9, имеющее ту же структуру и аминокислотную последовательность, что и А9 за исключением того, что 6 его гипервариабельных участков в анти-Р4/80 scFv заменены на последовательности вида (Gly3Ser)n, той же длины, что исходные CDR участки (см. Рис. 31 В).

Оба антитела были экспрессированы в бактериальной системе и очищены методом аффинной хроматографии.

Размер антитела А9, определенный по электрофоретической подвижности и по данным ВЖЕХ, соответствовал расчетной молекулярной массе - 45 кДА15 (Рис. 32).

14 А также параметра суммарной авидности для бивалентных полноразмерных антител.

15 Антитело mA9 имеет молекулярную массу в 42 кДа.

84

Рис. 32 Анализ препаратов антител А9 и шЛ9 методом денатурирующего электрофореза и эксклюзионной водной хроматографии.

хроматографии. Слева - значения молекуляного веса белков. (Б) Хроматограмма биспецифического антитела A9 (отмечена красным цветом), наложенная на хроматограмму маркеров молекулярной массы. (В) Функция

зависимости времени прохождения молекулы в зависимости от молекулярной массы. Расчетная молекулярная масса биспецифического антитела А9 составила 43,4 кДа.

Взаимодействие антител A9 и mA9 с рекомбинантным TNF человека.

Кинетика взаимодействия антител A9 и mA9 с рекомбинантным TNF человека измерялась методом поверхностного-плазмонного резонанса. Для этого оба антитела в концентрации 50 нМ были иммобилизованы на поверхности сенсорного чипа, после чего рекомбинантный TNF человека в серийных разведениях 50 - 3 нМ был нанесен в качестве аналита, а кинетика взаимодействия измерялась на приборе ProteOn XPR36. Оба антитела показали высокую аффинность: Kd А9 и mA9 составила 85 и 95 пМ соответственно. Это подтверждает, что внесенные мутации не повлияли на связывание с TNF. Кроме того оба антитела обладали сходными параметрами скорости связывания (Kforward, on-rate) и скорости диссоциации (Kreverse, off-rate) - приведены на Рис. 33 и в Таб. 3. Малая скорость диссоциации должна позволить антителу А9 удерживать связанный TNF.

Рис. 33 Кинетика взаимодействия биспецифического антитела А9 и контрольного антитела mA9 с рекомбинантным TNF человека.

(А) Приведены кривые взаимодействия (сенсограммы) рекомбинантного TNF человека в концентрациях 50 нМ - 3 нМ с сенсорным чипом, на котором были иммобилизованы биспецифическое антитело А9 и контрольное антитело mA9. По оси абсцисс отложено время в секундах, по оси ординат сдвиг угла резонанса в условных единицах (УЕ). (Б) Для каждой группы сенсограмм были расчитаны значения скорости связывания (on-rate), скорости диссоциации (off-rate) и константы диссоциации (Kd). Полученные средние значения, а также стандартное отклонение (SD) отложены на диаграмме изоаффиности. Диагональные линии соответсвуют указанным значениям константы диссоциации.

Взаимодействие Kd, M On-rate, 1/Мсек Off-rate, 1/сек

(SD) (SD) (SD)

A9 8,48x10-11 7,97x105 6,54x10-5

(4,21x10-11) (8,95x104) (2,71x10-5)

mA9 9,47x10-11 7,45x105 6,88x10-5

(3,02x10-u) (7,13x104) (1,4x10-5)

Таб. 3 Значения константы диссоциации, скорости связывания и скорости диссоциации для взаимодействий биспецифического антитела А9 контрольного антитела mA9 с рекомбинантным TNF человека, измеренные методом поверхностного плазмонного резонанса.

Блокировка антителами A9 и mA9 TNF-зависимой цитотоксичности in vitro.

Для оценки сравнительной активности антитела A9 в ингибировании биологических эффектов TNF проводился цитотоксический текст на линии мышиной фибросаркомы L929. К постоянным концентрациям рекомбинантного TNF человека и актиномицина-D добавлялись серийные разведения антител A9 и mA9. Согласно полученным данным антитела A9 и mA9 имеют близкую анти-TNF активность (Рис. 34 А). Кроме того было подтверждено, что активность биспецифического антитела А9 соответствует активности однодоменного анти-TNF антитела hTNF-VHH, которое входит в состав А9 и mA9 (Рис. 34 Б).

Рис. 34 Анти-TNF активность биспецифического антитела А9, контрольного антитела mA9 и однодоменного антитела hTNF—УнН.

(А) Сравнение активности биспецифического антитела А9 и контрольного антитела mA9. Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз антител А9 и mA9. (Б) Сравнение активности биспецифического антитела А9 и однодоменного антитела hTNF-VHH. Приведена кривая выживаемости клеток мышиной фибросаркомы L929 при одновременном воздействии константной дозы TNF человека и убывающих доз антител А9 и hTNF-VHH.Сравнение проводилось в

молярных концентрациях для того, чтобы исключить влияния различий в молярной массе на определяемую активность антитела.

Анализ связывания антител А9 и шЛ9 с поверхностью макрофагов через взаимодействие с поверхностной молекулой F4/80.

Способность биспецифического антитела А9 специфически связываться с поверхностью макрофагов была оценена методом проточной цитофлуориметрии. Для этого клетки, выделенные из перитонеальной полости, инкубировались с антителами А9, после чего проводилось окращивание на макрофагальные маркеры CD1 1Ь16 и F4/80, одновременно осуществлялось специфическое окрашивание на биспецифическое антитело А9 через антитела к VHH или антитела к полигистидиновой метке. Затем образцы подвергались проточной цитофлуориметрии и анализу.

Эти эксперименты показали, что биспецифическое антитело А9 способно связываться с поверхностью перитонеальных клеток, экспрессирующих F4/80 и CD11b на своей поверхности (моноциты и макрофаги) (Рис. 35 А - Г). В то же время, А9 не связывается с клетками перитонеальной полости, не имеющими этих маркеров (преимущественно лимфоциты) (Рис. 35 Д и Е). Снижения уровня параллельного анти-F4/80 окрашивания при добавлении антитела А9 за счет конкуренции двух антител за связывание с мишенью подтверждает, что А9 специфически взаимодействует именно с этой молекулой на поверхности клеток (Рис. 35 Ж и З).

16 Также используется название Mac-1. Составной элемент рецептора С3 компонента системы комплемента. У мышей экспрессируется на моноцитах, макрофагах и клетках микроглии.

Рис. 35 Анализ специфичности связывания биспецифического антитела A9 с поверхностью перитонеальных макрофагов.

Клетки перитонеальной полости инкубировались с биспецифическим антителом Л9 (изображено красным цветом) или без него (изображено синим цветом), а затем подвергались окрашиванию флуоресцентно меченными антителами к поверхностным маркерам, специфичным для клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а также антителами, специфичными к А9. Затем полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. (А, В, Д, Ж) окрашивание через антитела к УнН домену. (Б, Г, Е, З) окрашивание через антитела к полигексидиновой последовательности. (А, Б) биспецифическое антитело А9 связывается с клетками,

отобранными по высокому уровню экспрессии F4/80 и CD11b (макрофаги). На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (В, Г) то же самое в форме гистограммы рассеяния. По горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси значение флуоресценции в канале окрашивания на F4/80. (Д, Е) -биспецифическое антитело А9 не связывается с клетками перитонеальной полости, не экспрессирующими F4/80 и CD11b (лимфоциты). На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (Ж, З) -инкубация с биспецифическим антителом А9 снижает интенсивность окрашивания на F4/80. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на F4/80, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события.

Специфичность взаимодействия биспецифического антитела А9 была подтверждена в экспериментах с костномозговыми макрофагами (Рис. 36 А). В то же время было показано, что мутации в CDR контрольного антитела mA9 препятствуют его взаимодействию с макрофагами (Рис. 36 Б).

А Б

биспецифическое антитело

Рис. 36 Анализ специфичности связывания биспецифического антитела A9 и контрольного антитела mA9 с поверхностью костномозговых макрофагов.

Костномозговые макрофаги инкубировались с биспецифическим антителом A9 (изображено красным цветом), без него (изображено синим цветом), или с контрольным антителом mA9 (изображено черным цветом) а затем подвергались окрашиванию антителами, специфичными к A9/mA9. Полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. (А) биспецифическое антитело А9 специфически связывается с костномозговыми макрофагами. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на А9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (Б) контрольное антитело mA9 неспособно связываться с костномозговыми макрофагами. На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на mA9, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события.

Кроме того, в дополнительных цитофлуориметрических экспериментах было показано, что антитело A9, будучи прикрепленным к поверхности макрофагов, способно одновременно связывать экзогенно добавленный TNF человека (Рис. 37). Что

подтверждает, что обе субъединицы биспецифического антитела функционально активны одновременно, и что связывание двух антигенов одновременно стерически возможно.

Рис. 37 Удержание экзогенного TNF человека биспецифическим антителом A9, прикрепленным к поверхности макрофагов.

Клетки перитонеальной полости инкубировались с биспецифическим антителом A9 (изображено красным цветом) или без него (изображено синим цветом), затем c рекомбинантным TNF человека, после чего подвергались окрашиванию флуоресцентно-меченными антителами к поверхностным маркерам, специфичным для клеток моноцитарно-макрофагального ряда, а также антителами, специфичными к TNF человека. Полученные образцы анализировались методом проточной цитофлуориметрии. (А) биспецифическое антитело А9, способно удерживать TNF человека на поверхности макрофагов (клеток, отобранных по высокому уровню экспрессии F4/80 и CD11b). На изображеной гистограмме по горизонтальной оси отложено значение флуоресценции в канале окрашивания на TNF, по вертикальной оси нормализованная частота встречаемости события. (Б) те же данные в форме гистограммы рассеяния. По горизонтальной оси отложены значения флуоресценции в канале окрашивания на TNF, по вертикальной оси значения флуоресценции в канале окрашивания на F4/80.

Для определения периода полужизни биспецифического антитела А9 на поверхности макрофагов мы также использовали метод проточной цитофлуориметрии. Костномозговые макрофаги, инкубировавшиеся с антителом А9 фиксировались параформальдегидом через определенные промежутки времени, а затем окрашивали и анализировались на цитофлуориметре. Согласно этим данным время полужизни антитела А9 на поверхности макрофагов составило 1,5 часа (Рис. 38).

время, ч

Рис. 38 Время жизни биспецифического антитела А9 на поверхности макрофагов.

Костномозовые макрофаги инкубировались с биспецифическими антителами А9 при 37°С, 5% CO2. Через различные промежутки времени клетки фиксировали и подвергали окрашиванию на антитела А9, а затем анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Нормализованные средние значения флуоресценции были использованы для построения кривой зависимости интенсивности окрашивания от времени икубации.

Эти результаты показали, что антитело A9 находится на поверхности клеток моноцитарно-макрофагального ряда достаточно долго и может быть использовано для адресной блокировки TNF, производимого макрофагами.

Удержание эндогенно продуцируемого TNF человека на поверхности макрофагов биспецифическим антителом A9.

Для того, чтобы подтвердить, что биспецифическое антитело А9 может эффективно удерживать эндогенно продуцируемый TNF человека были использованы перитонеальные и костномозговые макрофаги из «TNF гуманизованных мышей». Макрофаги, инкубированные с антителом А9 или без него, стимулировали ЛПС, после чего уровень TNF человека в культуральном супернатанте измеряли методом ИФА. Предынкубация с антителом А9 как перитонеальных так и костномозговых макрофагов существенно снижала уровень TNF в супернатанте (Рис. 39 А и Б) в то время как предынкубация с однодоменным антителом hTNF-УнИ не влияла на уровень TNF (Рис. 39 Б).

Рис. 39 Способность биспецифического антитела А9 и однодоменного антитела удерживать TNF человека, производимый макрофагами из «TNF гуманизованных мышей».

(А) Перитонеальные макрофаги из «TNF гуманизованных мышей» инкубировались с биспецифическим антителом А9 или без него, затем отмывались, после чего экспрессия TNF индуцировалась добавлением ЛПС (к контрольным образцам ЛПС не добавлялся). Через 4 часа инкубации при 37°С, 5% CO2 уровень TNF в супернатанте измерялся методом ИФА. На графике отложено определенное среднее значение концентрации TNF и стандартное отклонение (SD). (Б) Перитонеальные макрофаги из «TNF гуманизованных мышей» инкубировали с биспецифическим антителом А9 или с однодоменным антителом hTNF-УнИ, или без антител, затем отмывали, после чего экспрессия TNF индуцировалась добавлением ЛПС (к контрольным образцам ЛПС не добавлялся). Через 4 часа инкубации при 37°С, 5% CO2 уровень TNF в супернатанте измеряли методом цитотоксического теста на клеточной линии L929. На графике отложено среднее значение концентрации TNF и стандартное отклонение (SD).

Дополнительно было установлено, что инкубация рекомбинантного TNF с биспецифическим антителом А9 в физиологически достижимых молярных

J у

соотношениях не влияет на детекцию TNF методом ИФА (Рис. 40) .

Таким образом нами была продемонстрирована способность антитела А9 предотвращать высвобождение макрофагами TNF в среду, что в системе in vivo могло быть эквивалентом удержания этого цитокина от попадания в системную циркуляцию.

17 I

По-видимому, это объясняется тем, что антитела А9 и антитела в наборе для ИФА распознают различные эпитопы на поверхности TNF.

О —.........—.........

10 100 1000

Концентрация 4TNF, пг/мл

Рис. 40 Влияние предынкубации TNF человека с антителом А9 на его детекцию методом ИФА.

Рекомбинантный TNF человека инкубировали 30 минут с различными концентрациями биспецифического антитела А9 или без него, после чего концентрация TNF измерялась методом ИФА. На графике отложены кривые зависимости оптической плотности от концентрации TNF для каждой группы образцов. Приведены средние значения и стандартное отклонение (SD).

6. Физиологически значимая селективная блокировка TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагального

ряда in vivo.

Эксперименты in vitro продемонстрировали, что биспецифическое антитело А9 способно селективно связываться с мембраной макрофагов через взаимодействие с молекулой F4/80 и удерживаться на ней достаточно продолжительное время. В то же время антитело A9 способно захватывать TNF, секретируемый макрофагами, и предотвращать его распространение. Однако принципиальное доказательство того, что направленное ингибирование TNF, производимого миелоидными клетками, обладает преимуществом перед системной блокировкой этого цитокина могло быть получено только в экспериментах in vivo.

Сравнительная оценка эффективности направленной блокировки TNF, производимого клетками моноцитарно-макрофагального ряда, и системной блокировки TNF в модели острой гепатотоксичности.

Ранее было продемонстрировано, что введение системных ингибиторов TNF человека в определенной дозе полностью защищает «TNF гуманизованных мышей» от гепатотоксичности, вызванной введением ЛПС/О-гал (см. Рис. 17, Рис. 24 и Рис. 30). В то же время, введение субтерапевтических доз тех же блокаторов вызывает частичную выживаемость или полную смертность (Рис. 17, Рис. 24). Это объясняется тем, что присутствие функционально активного (не заблокированного антителами) TNF в системном кровотоке в концентрации выше определенного порогового уровня вызывает запуск необратимых процессов гепатотоксичности. При снижении концентрации ниже пороговой гепатотоксичность не развивается и животное выживает.

Биспецифическое антитело А9, как и другие блокаторы TNF, способно защитить мышей от гепатотоксичности (Рис. 41 А). Стимуляция системы Toll-подобных рецепторов липополисахаридом вызывает выброс больших количеств TNF в кровоток, что, в свою очередь, приводит к гибели гепатоцитов, сенсибилизированных D-галактозамином. У мышей, не получивших TNF-блокатор, развивался массивный некроз печени, что отразилось в повышении уровня аланинаминотрансферазы (АЛТ), в то время как у животных, получивших блокатор TNF уровень АЛТ заметно снижался (Рис. 41 Б).

Рис. 41 Эффект введения биспецифического антитела А9 in vivo на смертность мышей и уровень АЛТ в модели острой гепатотоксичности.

(А) «TNF гуманизированным мышам» вводилось биспецифическое антитело А9, либо инфликсимаб, либо буфер. Спустя 30 минут животные получали летальную дозу ЛПС/О-гал. Приведен график суммарной выживаемости мы через 12 часов. (Б) Мышам, несущим ген TNF человека, вводилось биспецифическое антитело А9, либо инфликсимаб, либо буфер. Спустя 30 минут животные получали летальную дозу ЛПС/О-гал. Через 90 минут после индукции гепатотоксичности проводился забор крови, выделялась плазма и измерялся уровень АЛТ. На графике отложены средние значения активности АЛТ и стандартное отклонение (SD).

Предположительно адресная доставка блокатора TNF на поверхность макрофагов, которые являются главными продуцентами TNF в данной модели [70], должна снизить необходимую терапевтическую дозу. Для того, чтобы проверить эту гипотезу мышам

вводилась полная (1500 Ед./грамм веса) и сниженные (750 и 300 Ед./г) дозы

18

биспецифического антитела А9 и контрольного антитела mA9 . Антитела А9 и mA9 in vitro обладают одинаковой TNF-нейтрализующей активностью (Рис. 34 А), но при этом mA9, в отличии от А9, не связывается с поверхностью макрофагов (Рис. 36), и, тем самым, выполняет функцию системного ингибитора TNF. Через 30 минут после введения различных доз антител А9 и mA9 или буфера мыши получали дозу ЛПС/D-гал, ранее охарактеризованную как вызывающую 100% летальность. Затем животные наблюдались в течение 12 часов, и время их смерти фиксировалось.

В контрольной группе, получившей инъекцию буфера, через 7 часов наблюдалась 100% летальность. Мыши, получившие 750 или 1500 Ед./г антитела А9 полностью выжили. У мышей, получивших наименьшую дозу биспецифического антитела А9 -

18 Активность рассчитывалась в цитотоксическом тесте на линии мышиной фибросаркомы L929, как описано выше.

300 Ед./г, наблюдалась 100% летальность, но с несколько замедленной по сравнению с введением буфера или тА9 кинетикой. Однако, в отличие от А9, введение контрольного антитела тА9 в дозе 750 Ед./г оказалось неспособным защитить мышей от летального токсического шока, в этой группе также как и в группе 300 Ед./г наблюдалась полная летальность. Только группа, получившая макс дозу - 1500 Ед./г, продемонстрировала практически полную выживаемость (Рис. 42).

300 Ед/г 750 Ед/г 1500 Ед/г

Время, мин

Рис. 42 Сравнительная эффективность селективной блокировки макрофагального TNF и системной блокировки TNF в модели острой гепатотоксичности.

«TNF гуманизированным мышам» вводились различные дозы биспецифического антитела А9 или контрольного системного блокатора TNF - mA9 или буфера. Спустя 30 минут животные получали летальную дозу ЛПС/О-гал. Приведена кривая выживаемости (метод Каплан-Мейера). ** - p < 0.01.

Таким образом нами было показано, что адресная доставка ингибитора TNF к клеткам-продуцентам способна существенно снизить необходимую терапевтическую дозу. Это принципиально обосновывает возможность создания нового типа блокаторов TNF, обладающих большей эффективностью, сниженной частотой побочных эффектов и, возможно, эффективных в заболеваниях, ранее считавшихся резистентными к анти-TNF терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе данной работы была создана и изучена панель рекомбинантных молекул на базе генно-инженерных антител против TNF человека. Предполагается, что дальнейшие исследования с использованием этих молекул внесут существенный вклад в развитие областей иммунологии молекулярной биологии, изучающих цитокины и их роль в развитии аутоиммунных состояний.

На основе полученного нового однодоменного анти-TNF антитела Vhh41 [ 197] был разработан флуоресцентный сенсор TNF Vhh41-K. Кинетика его взаимодействия с TNF, способность блокировать биологические эффекты TNF, флуоресцентные свойства, стабильность in vivo были изучены. Было показано, что он специфично связывается с TNF c высокой аффинностью. Также было продемонстрировано, что флуоресцентный сенсор специфически накапливается в локусах гиперпродукции TNF в моделях острых и хронических заболеваний на лабораторных животных и может быть детектирован in vivo и ex vivo. Таки образом он может быть использован для прижизненной визуализации областей повышенной экспрессии TNF в ходе инфекционных и аутоиммунных заболеваний. С помощью прижизненной визуализации цитокинов возможно глубже изучить механизмы развития аутоиммунного воспаления и воздействие на него блокаторов цитокинов и других терапевтических агентов.

Новое химерное антитело 13239 полученное на основе одноцепочечного антитела ahT-4 и охарактеризованное в настоящей работе превосходит по аффинности и in vitro активности использующееся в клиники химерное антитело инфликсимаб. Дальнейшие исследования должны показать, вызывают ли эти свойства снижение эффективной терапевтической дозы in vivo. Возможно это антитело послужит прототипом отечественного терапевтического антитела - блокатора TNF.

Методом селективной блокировки TNF, производимого миелоидными клетками, были независимо подкреплены полученные на панели нокаутных мышей данные о том, что TNF, производимый этими клетками играет преимущественную патологическую роль в модельных аутоиммунных заболеваниях. Это говорит о том, что существующая на сегодняшний день стратегия системной блокировки TNF при лечении аутоиммунных болезней может быть далека от оптимальной. Полученный направленный блокатор макрофагального TNF (биспецифическое антитело А9), таким образом, может стать прототипом для создания нового класса адресных блокаторов TNF.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Carswell, E. A., Old, L. J., Kassel, R. L., Green, S., Fiore, N. and Williamson, B.,

An endotoxin-induced serum factor that causes necrosis of tumors. Proc Natl Acad Sci USA 1975. 72: 3666-3670.

2 Pennica, D., Nedwin, G. E., Hayflick, J. S., Seeburg, P. H., Derynck, R., Palladino,

M. A., Kohr, W. J., Aggarwal, B. B. and Goeddel, D. V., Human tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin. Nature 1984. 312: 724-729.

3 Aggarwal, B. B., Kohr, W. J., Hass, P. E., Moffat, B., Spencer, S. A., Henzel, W. J.,

Bringman, T. S., Nedwin, G. E., Goeddel, D. V. and Harkins, R. N., Human tumor necrosis factor. Production, purification, and characterization. J Biol Chem 1985. 260: 2345-2354.

4 Efimov, G. A., Kruglov, A. A., Tillib, S. V., Kuprash, D. V. and Nedospasov, S. A.,

Tumor Necrosis Factor and the consequences of its ablation in vivo. Mol Immunol 2009. 47: 19-27.

5 , А. А., Ефимов, Г. А. и Недоспасов, С. А., визуализации in vivo. Биохимия 2012. 77: 1603-1620.

6 Астраханцева, И. В., Ефимов, Г. А., Друцкая, М. С., Круглов, А. А. и

Недоспасов, С. А.,

. Биохимия 2014. 79: 1607-1618.

7 Балабанова, Р. М., Амирджанова, В. Н. и Насонов, Е. Л., Применение генно-

инженерных биологических препаратов при ревматоидном артрите в Российской Федерации. Научно-практическая ревматология 2012. 50: 10-14.

8 Keystone, E. C., Safety of biologic therapies - an update. J Rheumatol Suppl 2005. 74:

8-12.

9 Markham, A. and Lamb, H. M., Infliximab: a review of its use in the management of

rheumatoid arthritis. Drugs 2000. 59: 1341-1359.

10 Wolfe, F. and Michaud, K., Lymphoma in rheumatoid arthritis: the effect of

methotrexate and anti-tumor necrosis factor therapy in 18,572 patients. Arthritis Rheum 2004. 50: 1740-1751.

11 Chung, E. S., Packer, M., Lo, K. H., Fasanmade, A. A. and Willerson, J. T.,