Выделение и биохимическая характеристика рекомбинантных анти-HER2 антител из растительного источника тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат наук Щербаков, Александр Игоревич

• Щербаков, Александр Игоревич
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Щербаков, Александр Игоревич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. НЕК2/пеи как мишень в противоопухолевой терапии

1.1.1. Роль НЕК2/пеи в развитии опухолей

1.1.2. Механизм действия трастузумаба

1.1.3. Терапия трастузумабом

1.1.4. Терапия комбинаций трастузумаба и химиопрепаратов

1.2. Получение рекомбинантных антител

1.2.1. Гибридомные технологии

1.2.2. Химерные АТ

1.2.3. Гуманизированные АТ

1.2.4. Системы экспрессии мАт

1.3. Получение рекомбинантных белков из растительного источника

1.4. Растительные системы экспрессии мАт

1.4.1.Технологии стабильной экспрессии рекомбинантных белков

1.4.2. Транзиентная экспрессия рекомбинантных белков

1.4.3. Количество и качество получаемого белка

1.4.4. Проблемы гликозилирования

1.4.5. Получение терапевтических рекомбинантных белков из трансгенных растений

1.5. Преимущества и недостатки растений как платформы для получения фармацевтических рекомбинантных белков

1.6. Заключение

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Векторные конструкции

2.2. Nicotiana benthamiana L. - Табак Австралийский

2.3. Среды для культивирования бактерий

2.4. Агроинфекция

2.5. Экстракция целевого белка из листьев Nicotiana benthamiana

2.6. Скрининг белка

2.6.1. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле (ПААГ)

2.6.2. Иммуноферментный анализ (ИФА)

2.6.3. Исследование аффинности к экстрациллюлярному домену HER2/neu методом ELISA

2.6.4. Исследование анти-НЕК2 фитоантител методом двумерного белкового электрофореза

2.6.5. Вестерн-блоттинг

2.6.6. Мечение антител FITC

2.6.7. Проточная цитофлуориметрия

2.7. Очистка целевого белка, полученного из растительного источника

2.8. Гель-фильтрационная хроматография белка

2.9. Контроль на наличие эндотоксинов методом ЛАЛ-теста

2.10. Определение пирогенности анти-HER2 фитоантител на кроликах

2.11. Иммуноцитохимический анализ гиперэкспрессии антигена HER2 с помощью анти-НЕК2 фитоантител

2.12. Концентрирование проб, содержащих белок

2.13. Статистическая обработка результатов

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Получение и очистка анти-HER2-фитоантител

3.1.1. Наработка растительного материала

3.1.2. Экстракция и первичная очистка анти-НЕК2 фитоантител

3.1.3. Разработка протоколов хроматографической очистки анти-HER2 фитоантител

3.2. Анализ биохимических свойств анти-НЕК2 фитоантител

3.2.1 Анализ электрофоретической подвижности в ПААГ

3.2.2 Анализ электрофоретической подвижности анти-НЕК2 фитоантител

методом двумерного белкового электрофореза

3.2.3 Анализ специфической активности анти-НЕК2 фитоантител in vitro

3.2.4 Сравнение эффективности специфического связывания анти-HER2

фитоантител и трастузумаба с антигеном HER2

3.2.5. Анализ эффективности связывания анти-НЕК2 фитоантител с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора HER2

3.3. Анализ пирогенности полученных анти-НЕК2 фитоантител

3.4. Заключение

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

128

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Выделение и биохимическая характеристика рекомбинантных анти-HER2 антител из растительного источника»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы и степень ее разработанности

Заболеваемость раком молочной железы высока практически во всех развитых странах мира. Рак молочной железы занимает первое место среди всех злокачественных новообразований у женщин (около 23% среди всех онкологических заболеваний) и имеет выраженную тенденцию к росту [2].

В мире ежегодно регистрируется более 1 млн. новых случаев рака молочной железы, а в РФ - свыше 50 тыс., вследствие чего это заболевание по-прежнему является актуальной и серьезной проблемой здравоохранения.

Основным методом лечения РМЖ остается хирургическое удаление опухоли. Однако только хирургического вмешательства бывает недостаточно, а порой оно неэффективно, особенно если у опухоли высокая степень злокачественности или если появились метастазы. Поэтому чаще всего хирургическое лечение сочетают с другими видами терапии (лучевая терапия, химиотерапия и т.д.).

Около 25-30% случаев рака молочной железы - это НЕЕ2-положительный рак молочной железы [2, 3]. HER2 - это трансмембранная тирозиновая протеинкиназа ErbB2, молекулярная масса которой составляет 185 кДа. В человеческом организме HER2 (от Human Epidermal growth factor Receptor 2) экспрессируется и в здоровых тканях. Для опухолевых клеток рака молочной железы характерна гиперэкспрессия HER2. Повышение уровня HER2 означает прогрессирование развития опухоли, так как он отвечает за рост опухоли. Также гиперэкспрессия HER2 вызывает ускоренное метастазирование и устойчивость к химиопрепаратам. Таким образом, рецепторы HER2 являются важной мишенью противоопухолевой терапии.

В конце 90-х годов в клиническую практику был введен таргетный препарат на основе моноклональных антител - трастузумаб (Герцептин; Genetech, Сан-Франциско, Калифорния). Механизм действия трастузумаба основан на том, что

он обладает высоким сродством к рецептору НЕК2/пеи и, связываясь с этим рецептором, предотвращает пролиферацию в клетках рака молочной железы. Применение трастузумаба смогло повысить эффективность лечения и продлить жизнь пациентов с НЕК2-положительным раком молочной железы.

При лечении опухоли классической химиотерапией, мишенью для которой являются молодые, быстроделящиеся клетки, в организме человека нарушаются процессы жизнедеятельности некоторых нормальных клеток организма, например, клеток эпителия кишечника, волос, половых клеток и клеток иммунной системы. Трастузумаб же воздействует только на раковые клетки с повышенным содержанием рецепторов НЕЯ2, что, в свою очередь, уменьшает количество побочных эффектов.

Трастузумаб применяют в виде монотерапии или комбинируют с другими противоопухолевыми препаратами (например, паклитакселом, доцетакселом). Также трастузумаб используют в сочетании с ингибиторами ароматазы при наличии сопутствующей гиперэкспрессии гормональных рецепторов в опухолевых клетках (эстрогеновых и/или прогестероновых). Показано, что использование трастузумаба в терапии РМЖ снижает риск развития отдаленных метастазов и тем самым увеличивает выживаемость пациентов [155]. Трастузумаб производится в культуре животных клеток и стоит очень дорого.

Рекомбинантные антитела - один из самых быстроразвивающихся классов терапевтических белков, а рынок рекомбинантных антител является одним из наиболее быстро растущих направлений использования терапевтических белков [40]. По некоторым прогнозам, в следующие 5 лет каждый год на фармацевтический рынок будут выходить от 5 до 10 новых препаратов антител, в результате чего огромная нагрузка ляжет на производственные мощности [38, 94].

В настоящее время разработаны различные стратегии использования растений в качестве системы экспрессии фармацевтических антител. Современные исследования сосредоточены на детальной проработке характеристик получаемых антител, в том числе и гликозилирования. На данный

момент около 200 новых фармацевтических препаратов на основе антител проходят клинические испытания по всему миру. Спрос на эти препараты постоянно растет, что создает трудности для производственных возможностей фармацевтических предприятий. В связи с этим растения являются конкурентоспособными с точки зрения производительности, безопасности, стоимости и сроков производства. Следовательно, они представляют собой жизнеспособную альтернативу системам экспрессии антител млекопитающих и прокариотов.

На базе лаборатории трансгенных препаратов НИИ ЭДиТО совместно с МГУ им. М.В. Ломоносова была создана оригинальная биотехнологическая платформа получения рекомбинантных моноклональных терапевтических антител. Технология получения моноклональных терапевтических антител основана на транзиентной экспрессии, то есть временной модификации растения. Экспрессия антител происходит только в листьях растения, что значительно упрощает процесс очистки при сохранении высокой продукции белка.

Использование растений в качестве платформы для получения терапевтических антител обусловлено рядом преимуществ по сравнению с получением терапевтических антител из культуры клеток млекопитающих и дрожжей. Процесс получения терапевтических антител из растений дешевле, так как не требует дорогостоящих культуральных сред, системы стерилизации воздуха, ферментеров и другой аппаратуры. Растения можно выращивать как в теплицах, так и на открытом грунте. Легкость масштабирования производства является одним из основных преимуществ трансгенных растений. Также наблюдается более высокая продукция биомассы и высокий выход белка при относительно быстрой экспрессии белка, что необходимо для изготовления препаратов для индивидуальной терапии.

В растениях происходят посттрансляционные модификации белка, в результате чего образуются уже активные антитела. При получении терапевтических моноклональных антител из растений существует очень низкий

риск содержания в продукте возбудителей инфекций человека и различных эндотоксинов.

С помощью генноинженерных методов можно экспрессировать в одном растении гены легких и тяжелых цепей антитела, аффинного к НЕК2/пеи, что позволяет исключить дополнительную стадию сборки антител из отдельных цепей.

В растениях происходят посттрансляционные модификации и белок образуется уже в активной форме. Это позволяет исключить из процесса получения стадию рефолдинга белка. Использование растительных продуцентов помогает значительно удешевить и, одновременно, повысить качество очистки антител.

Антитела, экспрессированные в растениях, не уступают аналогам, полученным из клеток млекопитающих в противоопухолевой активности в отношении клеточных культур, которые экспрессируют НЕК2/пеи на поверхности мембран.

Для внедрения нового препарата на фармацевтический рынок с целью широкого применения в клинической практике он должен пройти доклинические, клинические испытания, этап регистрации.

Целью данной работы стала разработка технологии получения и очистки рекомбинантных анти-НЕК2 антител из растительного источника и исследование их биохимических характеристик.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику экстракции анти-НЕК2 фитоантител из листьев МевИапа Ъвп1вт1апа Ь., инфицированных векторами, экспрессирующими тяжелые и легкие цепи гуманизированного антитела против НЕК2.

2. Разработать эффективные методы очистки рекомбинантных анти-ИВК^ фитоантител.

3. Исследовать основные биохимические характеристики полученных

анти-НЕК2 фитоантител: молекулярную массу, специфическую активность, эффективность связывания с HER2 антигеном. Сравнить полученные анти-НЕК2 фитоантитела с характеристиками коммерческого аналога трастузумаба.

4. Оценить эффективность очистки полученных анти-НЕК2 фитоантител как фармацевтической субстанции: чистота, специфическое связывание, апирогенность.

Научная новизна исследования

В настоящей работе впервые разработана технология получения анти-НЕК2 антител из растительного источника, дающая возможность дешевого промышленного производства терапевтического белка. Впервые показано, что полученные анти-НЕК2 фитоантитела не отличаются по биохимическим характеристикам, специфичному связыванию с антигеном HER2, биологической активности in vitro и являются биоаналогом препарата трастузумаб.

Теоретическая и практическая значимость

Разработанный технологический процесс получения анти-НЕК2 фитоантител основан на транзиентной экспрессии, то есть временной модификации растения. В результате экспрессия полноразмерных антител происходит только в листьях растения, что значительно упрощает процесс очистки при сохранении высокой продукции белка.

Произведена оптимизация лабораторного метода получения рекомбинантных анти-НЕК2 фитоантител из растительного источника. Разработаны технологические этапы финишной очистки белковой субстанции рекомбинантных антител для получения ЛФ препарата с использованием фильтров и хроматограических методов. В результате этого удалось в 1,5-2 раза повысить выход целевого белка.

Разработанная технологическая схема обладает хорошей масштабируемостью, что позволяет перейти от лабораторного производства к промышленному.

Методология и методы исследования

Методологическую основу исследования составили труды российских ученых в области биотехнологии, генной инженерии Ю. Л. Дорохова, Ю. Ю. Глебы и др.

При проведении исследования использованы:

• методы работы с клеточными культурами;

• методы работы с растительным материалом;

• хроматографические методы;

• методы скрининга и характеризации целевого белка;

• иммуноферментный анализ;

• методы определения пирогенности;

• иммуноцитохимические метод;

• проточная цитофлуориметрия;

• математические методы анализа и обработки результатов, полученных в ходе экспериментальной работы.

Степень достоверности результатов

При проведении экспериментальной работы использовано сертифицированное современное оборудование, методами статистической обработки установлена воспроизводимость результатов исследований, что позволяет считать их достоверными.

Положения, выносимые на защиту

1. Растение Nicotiana benthamiana после агроицфекции суспензией Agrobacterium tumifaciens экспрессирует в своих листьях анти-НЕЕ2 антитела.

2. Разработаная методика экстракции и первичной очистки позволяет эффективно очистить анти-НЕК2 фитоантитела от разрушенных частей растительного материала и балластных веществ.

3. Подобранные методы хроматографической очистки позволяют получить субстанцию анти-НЕК2 фитоантител с количеством димеризованных форм

антител не превышающим 1,5-2%.

4. Полученные анти-НЕК2 фитоантитела не отличаются по биохимическим характеристикам и специфическому связыванию с антигеном НЕК2 от препарата сравнения трастузумаба, являясь его биоаналогом.

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 2 научные работы, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 3 тезиса докладов.

Личный вклад автора

Автором лично проведен анализ научной литературы по теме диссертации. Автор принимал непосредственное участие в постановке целей и задач настоящего исследования, их экспериментальной реализации, анализе и обобщении данных, изложении полученных результатов в виде научных публикаций. В работах, выполненных в соавторстве, автором проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, общих выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 11 таблиц. Список литературы состоит из 171 источника, из них 3 - отечественных и 168 — зарубежных.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. HER2/neu как мишень в противоопухолевой терапии 1.1.1. Роль HER2/neu в развитии опухолей

Около 25-30% злокачественных образований молочной железы характеризуются гиперэкспрессией HER2/neu. Гиперэкспрессия HER2/neu коррелирует с неблагоприятным клиническим исходом у пациентов с раком молочной железы [2], также она ассоциирована с более коротким рецидивным интервалом и общей выживаемостью, ускоренной прогрессией заболевания (более высокой частотой возникновения метастазов) и резистентностью к химиотерапии [2, 3, 44].

Эти данные дают основания рассматривать рецепторы HER2 как важное звено патогенеза развития РМЖ, следовательно, и как важную мишень терапии.

Первым препаратом мАт, одобренным FDA для лечения HER2-положительного РМЖ, был трастузумаб (Герцептин) - гуманизированные рекомбинантные антитела к антигену HER2 [15, 56].

1.1.2. Механизм действия трастузумаба

Трастузумаб избирательно связывается с IV субдоменом внеклеточного домена рецептора HER2 и ингибирует пролиферацию клеток РМЖ с гиперэкспрессией HER2 [45, 54, 135], а также активирует механизм антителозависимой клеточной цитотоксичности SK-BR-3 клеток [15, 18].

Иммунологический механизм антипролиферативного действия трастузумаба заключается в обеспечении связывания Fc региона с FcgRIII клеток CD16+ (НК-клетки, CD8+ Т-клетки, моноциты, макрофаги). При этом запускается опосредованная этими клетками реакция, называемая «антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность» (ADCC), в результате которой происходит лизис меченной антителами клетки-мишени. Таким образом, анти-HER2 антитела могут мобилизовать иммунные клетки в районе опухоли [46].

1.1.3. Терапия трастузумабом

Монотерапия трастузумабом у пациентов с метастазирующим HER2-положительным РМЖ показала общую эффективность ответа со стороны опухоли, равную 15-26%, и медианную выживаемость, равную 13 месяцам [19, 149, 155].

Исследования показали, что адъювантная терапия трастузумабом уменьшает трехлетний риск рецидивов у 50% пациентов с раком молочной железы, выявленным на ранней стадии [6].

1.1.4. Терапия комбинаций трастузумаба и химиопрепаратов

Ряд исследований показал синергизм и аддитивный эффект тратсузумаба в комбинации с различными классами цитотоксических химиопрепаратов [111, 114], а также с ингибиторами ароматазы при гормонозависимом РМЖ [56].

К химиопрепаратам, исследуемым в комбинации с трастузумабом, относятся алкилирующие агенты, препараты платины, ингибиторы топоизомераз, антрациклины и таксаны [111, 114]. Интересные результаты получены при сравнении эффектов комбинаций доксирубицина и циклофосфамида или паклитаксела с комбинациями трастузумаба с этими препаратами при метастатическом НЕК2-положительном РМЖ [135]. Отмечалось значительное увеличение иммунного ответа (50% против 32%), времени до прогрессирования (7,4 месяцев против 4,6) и общей выживаемости (25 месяцев против 20). Следует отметить, что эти же исследования подтвердили высокий кардиотоксический эффект трастузумаба в комбинации с доксорубицином.

1.2. Получение рекомбинантных антител

1.2.1. Гибридомные технологии

Получение моноклональных антител с использованием технологии мышиных B-клеточных гибридом

В конце 70-х годов G. Kohler и C. Milstein впервые получили моноклональные антитела гибридомным методом, что открыло широкие

возможности для получения терапевтических антител [134].

Для экспрессии антител ДНК, кодирующие тяжелые и легкие цепи, должны быть трансфицированы в непродуцирующие антитела линии клеток. В настоящее время самыми популярными являются линии клеток мышиной миеломы. Полученные гибридомы клонируют, а мАт получают из идентичных потомков одной клонированной антител-продуцирующей клетки (рис. 1).

До сих пор существует проблема получения стабильных линий гибридом. Кроме того, эти антитела вызывают развитие человеческих антимышиных иммунных реакций (НАМА) у пациентов, что ограничивает использование их в качестве терапевтических средств.

Чи1 ш он

МНС. Н1М1.1

Рисунок 1 - Упрощенная схема получения мышиных гибридом

Получение моноклональных антител с использованием технологии человеческих В-клеточных гибридом Использование стабильной человеческой В-клеточной гибридомы редко обеспечивает получение высокоаффинных IgG из-за отсутствия подходящей клеточной линии миеломы человека. Наилучшие результаты получаются при использовании в качестве платформы для получения гетеромиелом (гибрид человеческой и мышиной миеломы), но такие гетеромиеломы часто получаются нестабильными. В качестве альтернативы клетки, секретирующие человеческие антитела, могут быть иммортализированы инфицированием вирусом Эпштейна-

Барра (EBV). Однако EBV-инфицированные клетки это уже несколько другой клон, который, как правило, дает очень низкий выход иммуноглобулина [74].

1.2.2. Химерные АТ

Первое поколение мышиных мАт имело ряд недостатков: короткое время полужизни в сыворотке крови, недостаточная активация эффекторных функций и появление у большинства пациентов HAMA, особенно при повторном введении [74]. Были разработаны различные генноинженерные стратегии для снижения иммунного ответа, такие как "химеризация" и «гуманизирование» моноклональных антител [74].

Химерные антитела представляют собой новое семейство молекул для иммунотерапии опухолей, в которых с помощью технологии рекомбинантной ДНК мышиные константные домены заменены эквивалентными доменами человеческих антител.

Антигенсвязывающий участок антитела локализован в вариабильных доменах, поэтому молекулы химерных антител сохраняют аффинность к антигену и приобретают функции замещенных константных доменов эффективно активировать реакции комплиментзависимой цитотоксичности (CDC) и ADCC [117].

Кроме того, это позволяет обеспечить взаимодействие с эффекторными клетками человека и системой комплемента. Химерные антитела воспринимаются организмом человека как менее чужеродные и, следовательно, менее иммуногенные, в отличие от мышиных моноклональных антител. Если на введение мышиных антител 84% пациентов давали иммунный ответ, то на введение химерных антител иммунный ответ давали уже 40%. Однако все-таки у нескольких пациентов наблюдалась определенная иммунная реакция в виде появления в организме человеческих антихимерных антител (HACA) (например, инфликсимаб / Remicade [74]). Повторное введение химерного антитела не вызывает каких-либо иммунологических побочных эффектов. Таким образом,

химерные антитела менее иммуногенные, чем мышиные нативные. Тем не менее, реакция HAMA не может быть полностью устранена, поскольку мышиные вариабельные домены (CDR и FRS) могут вызывать иммунный ответ.

Ритуксимаб был первым мАт, одобренным для терапевтического применения в противоопухолевой терапии [62].

Из-за иммуногенных свойств химерных мАт необходимо проводить гуманизацию, которая позволяет уменьшить реакцию HAMA при сохранении активации реакции ADCC [117].

1.2.3. Гуманизированные АТ

Широкое применение метода гуманизации основывается на двух концепциях: антигенная структура сайта связывания в основном зависит от CDR участка и структура антитела может быть использована в качестве акцептора для мышиных CDR. Полученные видоизмененные антитела содержат лишь небольшую часть аминокислотной последовательности мышиного происхождения и при этом сохранены аффинные свойства [117].

CDR поверхностная модификация

Гуманизированные антитела обычно создаются путем размещения ксеногенных CDR близко к N-концу на каркасе человеческих антител для образования цельной структуры, так как связывание с антигеном, в основном, происходит с CDR участком [62].

CDR-прививка была успешно использована для гуманизирования MAb 4D5-мАт против продукта протоонкогена HER2 [62]. MAb 4D5 является полностью гуманизированным антителом и называется трастузумаб.

Несмотря на снижение доли мышиных последовательностей, уровень иммуногенности гуманизированных мАт значительно снизился до 9%, однако не исчез полностью. Трастузумаб вызывает HAHA у пациентов с раком молочной железы примерно в 0,1% от всех случаев [74].

SDR поверхностная модификация SDR (specificity-determining residues) поверхностная модификация была предложена для сведения к минимуму содержания нечеловеческих остатков в структуре антител. Основанием для разработки этого метода был анализ комплексов антиген-антитело, который показал, что только одна треть последовательностей CDR связывается с антигеном. Сравнение остатков, контактирующих с антигеном, и последующий сиквенс этих последовательностей точно определил наиболее вариабельные остатки. Таким образом, мышиные антитела можно гуманизировать, ограничиваясь только присоединением SDR участка на каркас человеческого антитела [74].

На сегодняшний день проблематично определить, являются ли "полностью человеческие" моноклональные антитела менее иммуногенными, чем гуманизированные мАт [22].

Метод гуманизации - «облицовка» Для уменьшения иммуногенности нечеловеческого Fv - фрагмента гуманизированных антител и сохранения антигенсвязывающих свойств заменяют открытые участки в его каркасных областях, отличающиеся от тех, которые обычно встречаются в человеческих антителах. Это позволяет гуманизировать поверхность ксеногенного антитела, сохраняя при этом внутренние и контактирующие остатки, которые влияют на его антигенсвязывающие свойства и междоменные контакты. Замена поверхностных остатков может быть достаточной для превращения мышиного вариабельного домена в "невидимую" для иммунной системы человека. Этот метод гуманизации называют "облицовкой", так как подвергается изменению только внешняя поверхность антитела, а каркасные остатки остаются в неизмененном виде [62].

Прямое сравнение гуманизированных антител, полученных методами прививки CDR или «облицовкой», не выявило между ними различий в аффинности к антигену [62].

1.2.4. Системы экспрессии мАт

В настоящее время доступно несколько систем экспрессии для получения рекомбинантных антител и фрагментов антител, таких как бактерии, дрожжи, растения, клетки насекомых и клетки млекопитающих [62].

Таблица 1 - Свойства различных платформ экспрессии рекомбининтных

белков [90]

Характеристики Экспрессионная система

Бактерии Дрожжи Насекомые Клетки млекопитающих Растения

Наращиание продуцента Быстрое Быстрое Медленное Медленное Медленное

Стоимость культивирования Низкая Низкая Высокая Высокая Очень низкая

Уровень экспрессии высокий От низкого до высокого От низкого до высокого От низкого до среднего От низкого до среднего

Внеклеточная экспрессия в периплазму, частично в среду в периплазму и среду в среду в среду -

Белковый фолдинг Необходим Может быть необходим Специфический Специфический Специфический

М-концевое гликозилирование: Высокоманнозное Комплексное Нет Нет Да Нет Да Нет Да Да Да Да

О-концевое гликозилирование Нет Да (отлично от млекопитаю щих) (?) Да Да

1.2.4.1. Бактериальные системы экспрессии

Первая успешная экспрессия функционального Fab-фрагмента антитела в E. coli, описана в 1988 году [130]. Экспрессия рекомбинантных фрагментов антител

часто приводит к образованию нерастворимых телец включения, которые содержат несобранный белок [139]. Это вызывает необходимость введения стадии рефолдинга для восстановления активности белка. Однако стадия рефолдинга в настоящее время крайне неэффективна и в некоторых случаях потери белка составляют около 90% [108].

Недавно удалось успешно экспрессировать агликозилированые полноразмерные IgG в E.coli [130]. Связывающие свойства восстановленных антител, были полностью сохранены, однако набор эффекторных функций, связанных с Fc-доменом, был потерян [43].

На сегодняшний день бактериальная система не позволяет экспрессировать полноразмерные функциональные антитела, также эта система неспособна выполнять посттрансляционные модификации белков, что имеет важное значение для функций белка. Кроме того, рекомбинантные белки, продуцируемые в E. coli, всегда загрязнены эндотоксинами, которые вызывают ответные иммунные реакции при введении в организм человека [43].

1.2.4.2. Дрожжевые системы экспрессии

Дрожжевые системы используют для производства рекомбинантных белков, которые не могут быть экспрессированы в E.coli из-за проблем, связанных с фолдингом или гликозилированием [130]. Дрожжи обеспечивают правильное сворачивания гетерологичных белков, а также могут секретировать правильно сложенные и активные белки в среду. Это позволяет легко очистить белок от исходного материала. В отличие от систем экспрессии на основе клеток млекопитающих, дрожжи быстро растут на простых питательных средах. Белки, которые накапливаются в виде нерастворимых телец включения в E.coli, часто экспрессируются в растворимом виде в дрожжах.

Однако дрожжи оказались не в состоянии правильно складывать и секретировать моноклональные антитела. Кроме того, некоторые дрожжи не могут гликозилировать белки или добавляют сахара, которые не встречаются в

человеческих белках.

1.2.4.3. Культуры клеток млекопитающих

Несмотря на высокие издержки производства из-за дорогостоящих сред и культивирования, а также сложных технологий сегодня на фармацевтическом рынке 60-70% рекомбинантных белков получены из клеточных линий млекопитающих. Популярность этой системы экспрессии обусловлена их преимуществами фолдинга, секрецией рекомбинантного белка и наличием посттрансляционного аппарата. Это упрощает последующее медицинское применение, так как снижает риск иммунного ответа у пациентов [130]. Однако остается возможность вирусного заражения конечного продукта и высвобождения факторов с онкогенными или патогенным потенциалом [130].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Щербаков, Александр Игоревич, 2017 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гланц, С.А. Медико-биологическая статистика / С.А. Гланц // М.: Практика, 1998. - 459 c.

2. Давыдов, М.И. Структура заболеваемости злокачественными заболеваниями населения России в 2008 г. / Давыдов М.И. // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. -2010. -Т.21. -№2.

3. Чиссов, В.И. Злокачественные новообразования в России в 2010 году (заболеваемость и смертность) // В.И.Чиссов, В.В.Старинский, Г. В. Петрова. -М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России. -2012. -260 с.

4. Abiri, R. Critical review of the concept of transgenic plants: Insights into pharmaceutical biotechnology and molecular farming / R. Abiri, A. Valdiani, M. Maziah, N. A. Shaharuddin, M. Sahebi, Z. Y. Yusof, N. Atabaki, D. A. Talei // Curr. Issues Mol. Biol. -2015. -No. 18. -P. 21-42.

5. Aboul-Ata, A.A. Plant-based vaccines: Novel and low-cost possible route for Mediterranean innovative vaccination strategies / A. A. Aboul-Ata, A. Vitti, M. Nuzzaci, A. K. El-Attar, G. Piazzolla, C. Tortorella, A. M. Harandi, O. Olson, S. A. Wright, P. Piazzolla // Adv. Virus Res. -2014. -No. 89. -P. 1-37.

6. Baselga, J. Adjuvant trastuzumab: a milestone in the treatment of HER-2-positive early breast cancer / J. Baselga, E. A. Perez, T. Pienkowski, R. Bell // Oncologist. -2006. -No. 11. -Suppl 1. -P. 4-12.

7. Bawa, A. Genetically modified foods: safety, risks and public concerns - a review / A. Bawa, K. Anilakumar // J Food Sci Technol. -2013. -No. 50. -P. 10351046.

8. Boivin, E.B. Transient Expression of Antibodies in Suspension Plant Cell Suspension Cultures is Enhanced When Co-transformed with the Tomato Bushy Stunt Virus p19 Viral Suppressor of Gene Silencing/ E. B. Boivin, E. Lepage, D. P. Matton, G. De Crescenzo, M. Jolicoeur// Biotechnol. Prog. - 2010. - Vol. 26. - No. 6. -P: 15341543.

9. Boothe, J. Seed-based expression systems for plant molecular farming / J. Boothe, C. Nykiforuk, Y. Shen, S. Zaplachinski, S. Szarka, P. Kuhlman, E. Murray, D. Morck, M. M. Moloney // Plant Biotechnol. J. -2010. -No. 8. -P. 588-606.

10. Brenner, D. Mitochondrial cell death effectors / D. Brenner, T. W. Mak // Current Opinion in Cell Biology. -2009. -Vol.21. -No.6. -P.871-877.

11. Breyer, D. Biosafety considerations associated with molecular farming in genetically modified plants / D. Breyer, M. Goossens, P. Herman, M. Sneyers // J. Med. Plant Res. -2009. -No. 3. -P. 825-838.

12. Brodzik, R. Plant-derived anti-Lewis Y mAb exhibits biological activities for eicient immunotherapy against human cancer cells / R. Brodzik, M. Glogowska, K. Bandurska et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -2006. -Vol. 103. -No. 23. -P. 8804-8809.

13. Buyel, J.F. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers / J. F. Buyel, R. Fischer // Process Biochem. -2014. -No. 50. -P. 859-866.

14. Buyel, J.F. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins / J. F. Buyel, R. M. Twyman, R. Fischer // Biotechnol. Adv. -2015. -No. 33. -P. 902-913.

15. Carter, P. Humanization of an anti-pl85HER2 antibody for human cancer therapy / P. Carter, L. Presta, C. M. Gorman, J. B. Ridgway, D. Henner et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. -1992. -No. 89. -P. 4285-4289.

16. Catrice, E.V. Assembly and purification of polyomavirus-like particles from plants/ E. V. Catrice, F. Sainsbury // Mol. Biotechnol. -2015. -No. 57. -P. 904913.

17. Chen, Q. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins / Q. Chen, H. Lai, J. Hurtado, J. Stahnke, K. Leuzinger, M. Dent // Adv Tech Biol Med. -2013. -No. 1. -P. 103.

18. Clynes, R.A. Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytotoxicity against tumor targets / R. A. Clynes, T. L. Towers, L. G. Presta, J. V. Ravetch // Journal of

Natural Medicines. -2000. -No. 6. -P. 443-46.

19. Cobleigh, M.A. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease / M. A. Cobleigh, C. L. Vogel, D. Tripathy et al. // JournalofClinical Oncology. -1999. -No. 17. -P. 2639-2648.

20. Conley, A. J. Recombinant protein production in a variety of Nicotiana hosts: a comparative analysis / A. J. Conley, H. Zhu, L. C. Le, A. M. Jevnikar, B. H. Lee, J. E. Brandle, R. Menassa // Plant Biotechnology Journal. -2011. -No. 9. -P. 434444.

21. Cox, K.M. Glycan optimization of a human monoclonal antibody in the aquatic plant Lemna minor / K. M. Cox, J. D. Sterling, J.T. Regan, J.R. Gasdaska, K.K. Frantz, C.G. Peele, A. Black, D. Passmore, C. Moldovan-Loomis, M. Srinivasan et al. // Nat. Biotechnol. -2006. -No. 24. -P. 1591-1597.

22. D. Y. Ryu, D. Recent Progress in Biomolecular Engineering / D. D. Y. Ryu, D.-H. Nam // Biotechnol.Prog. -2000. -No. 16. -P. 2-16.

23. D'Aoust, M. A. Transient expression of antibodies in plants using syringe agromfiltration / M. A. D'Aoust, P. O. Lavoie, J. Belles-Isles, N. Bechtold et al. // Methods Mol. Biol. -2009. -No.483. -P. 41-50.

24. De Jaeger, G. Boosting heterologous protein production in transgenic dicotyledonous seeds using Phaseolus vulgaris regulatory sequences / G. De Jaeger, S. Scheffer, A. Jacobs, M. Zambre, O. Zobell, A. Goossens, A. Depicker, G. Angenon // Nat. Biotechnol. -2002. -No. 20. -P. 1265-1268.

25. De Muynck, B. Production of antibodies in plants: status after twenty years / B. De Muynck, C. Navarre, M. Boutry // Plant Biotechnology Journal. -2010. -No. 8. -P. 529-563.

26. Decker, E.L. Current achievements in the production of complex biopharmaceuticals with moss bioreactors / E. L. Decker, R. Reski // Bioprocess Biosyst. Eng. -2008. -No. 31. -P. 3-9.

27. Downing, W.L. Synthesis of enzymatically active human -L-iduronidase in Arabidopsiscgl (complex glycan-deficient) seeds / W. L. Downing, J. D. Galpin, S. Clemens, S. M. Lauzon, A. L. Samuels, M. S. Pidkowich, A. Clarke, A. R. Kermode // Plant Biotechnol. J. -2006. -No. 4. -P. 169-181.

28. During, K. Synthesis and self-assembly of a functional monoclonal antibody in transgenic Nicotiana tabacum / K. During, S. Hippe, F. Kreuzaler, J. Schell // Plant Mol Biol. -1990. -No. 15 (2). -P. 281-93.

29. Durocher, Y. Expression systems for therapeutic glycoprotein production. / Y. Durocher, M. Butler // Curr. Opin. Biotechnol. -2009. -No. 20. -P. 700-707.

30. Ecker, D. M. The therapeutic monoclonal antibody market. / D. M. Ecker, S. D. Jones, H. L. Levine // MAbs. -2015. -No. 7. -P. 9-14.

31. Faye, L. La production de proteines a usage biopharmaceutique dans les plantes / L. Faye, N. Landry, P. Lerouge, V. Gomord, L. Vezina // Medecine / Sciences SYNTHESE. -2012. -Vol. 17. -No.8-9. -P. 867-877.

32. Fernandes, B. Beta 1-6 branched oligosaccharides as a marker of tumor progression in human breast and colon neoplasia / B. Fernandes, U. Sagman, M. Auger, M. Demetrio, J. W. Dennis // Cancer Research. -1991. -Vol. 51. -No. 2. -P.718-723.

33. Fischer, R. Affinity-purification of a TMV-specific recombinant full-size antibody from a transgenic tobacco suspension culture / R. Fischer, Y. C. Liao, J. Drossard // J Immunol Methods. -1999. -No. 226 (1-2). -P. 1-10.

34. Fischer, R. GMP issues for recombinant plant-derived pharmaceutical proteins / R. Fischer, S. Schillberg, S. Hellwig, M. Twyman, J. Drossard // Biotech Adv. -2012. -No. 30. -P. 434-439.

35. Fischer, R. High-value products from plants: The challenges of process optimization / R. Fischer, N. Vasilev, R. M. Twyman, S. Schillberg // Curr. Opin. Biotechnol. -2015. -No. 32. -P. 56-62.

36. Fischer, R. Plant-based production of biopharmaceuticals / R. Fischer, E. Stoger, S. Schillberg, P. Christou, R. M. Twyman // Curr. Opin. Plant Biol. -2004. -No. 7. -P. 152-158.

37. Fox, J. L. First plant-made biologic approved./ J. L. Fox// Nat Biotech. -2012. -No. 30. -P. 472.

38. Franklin, S.E. Recent developments in the production of human therapeutic proteins in eukaryotic algae / S. E. Franklin, S. P. Mayfield // Expert Opin. Biol. Ther. -2005. -No. 5. -P. 225-235.

39. Giddings, G. Transgenic plants as factories for biopharmaceuticals / G. Giddings, G. Allison, D. Brooks, A. Carter // Nat Biotechnol. -2000. -No. 18(11). -P. 1151-5.

40. Ginsberg, P.L. The road ahead for biologics manufacturing / P. L. Ginsberg, S. Bhatia, R.L. McMinn // US Bancorp Piper Jaffray. - 2002. - P. 1-23.

41. Gleba, Y. Magnifection—a new platform for expressing recombinant vaccines in plants / Y. Gleba, V. Klimyuk, S. Marillonnet // Vaccine. -2005. -No. 23. -P. 2042-2048.

42. Gomord, V. Biopharmaceutical production in plants: problems, solutions and opportunities / V. Gomord, P. Chamberlain, R. Jefferis // TRENDS in Biotechnology. -2005. - Vol.23. No.11. -P. 559-565.

43. Gomord, V. Plant-specific glycosylation patterns in the context of therapeutic protein production / V. Gomord, A. C. Fitchette, L. Menu-Bouaouiche, C. Saint-Jore-Dupas, C. Plasson, D. Michaud, L. Faye // Plant Biotechnol. J. -2010. -No. 8. -P. 564-587.

44. Gomord, V. Production and glycosylation of plant-made pharmaceuticals: the antibodies as a challenge / V. Gomord, C. Sourrouille, A.-C. Fitchette et al. // Plant Biotechnology Journal. -2004. -Vol.2. -No.2. -P. 83-100.

45. Guan, C. Expression of biologically active anti-thrombosis protein lumbrokinase in edible sunflower seed kernel / C. Guan, X. Du, G. Wang, J. Ji, C. Jin, X. Li // J. Plant Biochem. Biotechnol. -2014. -No. 23. -P. 257-265.

46. Guan, C. Expression of cholera toxin B subunit-lumbrokinase in edible sunflower seeds-the use of transmucosal carrier to enhance its fusion protein's effect on protection of rats and mice against thrombosis / C. Guan, J. Ji, C. Jin, G. Wang, X. Li,

W. Guan // Biotechnol. Prog. -2014. -No. 30. -P. 1029-1039.

47. Gupta, S.K. Microbial platform technology for recombinant antibody fragment production: A review / S. K. Gupta, P. Shukla // Critical Reviews In Microbiology. -2016. -No. 7. -P. 1-12.

48. Gutierrez, C. HER2: biology, detection, and clinical implications / C. Gutierrez, R. Schiff // Archives of Pathology & Laboratory Medicine. -2011. -No. 135(1). -P. 55-62.

49. Harari, D. Molecular mechanisms underlying ErbB2/HER2 action in breast cancer / D. Harari, Y. Yarden // Oncogene. -2000. -No. 19. -P. 6102-6114.

50. Harries, M. The development and clinical use of trastuzumab (Herceptin) / M. Harries, I. Smith // Endocrine-Related Cancer. -2002. -V. 9. -P. 75-85.

51. Hefferon, K. Plant virus expression vector development: new perspectives / K. Hefferon // BioMed Res Int. -2014. -P: 1-6.

52. Hiatt, A. Production of antibodies in transgenic plants / A. Hiatt, R. Caffertey, K. Bowdish // Nature. -1989. -No. 342. -P. 76-78.

53. Highsmith, J. Biologic Therapeutic Drugs: Technologies and Global Markets. / J. Highsmith // Wellesley. -MA.: BCC Research. -2013. -142 p.

54. Holtz, B.R. Commercial-scale biotherapeutics manufacturing facility for plant-made pharmaceuticals / B. R. Holtz, B. R. Berquist, L. D. Bennett, V. J. M. Kommineni, R. K. Munigunti, E. L. White, D. C. Wilkerson, K. I. Wong, L. H. Ly, S. Marcel // Plant Biotechnol. -2015. -No. 13. -P. 1180-1190.

55. Hood, E. E. Monoclonal antibody manufacturing in transgenic plants — myths and realities / E. E. Hood, S. L. Woodard, M. E. Horn // CurrentOpinioninBiotechnology. -2002. -No. 13(6). -P. 630-635.

56. Houdebine, L.-M. Antibody manufacture in transgenic animals and comparisons with other systems / L. -M. Houdebine // Current Opinion in Biotechnology. -2002. -No. 13. -P. 625-629.

57. Huang, Z. High-level rapid production of full-size monoclonal antibodies in plants by a single-vector DNA replicon system / Z. Huang, W. Phoolcharoen, H. Lai,

K. Piensook, G. Cardineau, L. Zeitlin, K. J. Whaley, C. J. Arntzen, H. S. Mason, Q. Chen // Biotechnol. Bioeng. -2010. -No. 106. -P. 9-17.

58. Hudziak, R. M. pl85HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor / R. M. Hudziak, G. D. Lewis, M. Winget, B. M. Fendly, H. M. Shepard et al. // Molecular and Cellular Biology. -1989. -No. 9. -P. 1165-1172.

59. Jamal, A. Chimerism of multiple monoclonal antibodies expressed in a single plant / A. Jamal, J.-H. Lee, K. Ko et al. // Horticulture Environment and Biotechnology. -2012. -Vol.53. -No.6. -P.544-551.

60. Jeyakumar, A. Trastuzumab for HER2-Positive Metastatic Breast Cancer: Clinical and Economic Considerations / A. Jeyakumar, T. Younis // Clinical Medicine Insights: Oncology. -2012. -No. 6. -P. 179-187.

61. Joensuu, J.J. Transgenic plants for animal health: plant-made vaccine antigens for animal infectious disease control / J. J. Joensuu, V. Niklander-Teeri, J. E. Brandle // Phytochem. Rev. -2008. -No. 7. -P. 553-577.

62. Jones, P.T. Replacing the complementarity-determining regions in a human-antibody with those from a mouse / P.T. Jones, P.H. Dear, J. Foote, M.S. Neuberger, G. Winter //Nature. -1986. -No. 321. -P. 522-525.

63. Kamarck, M. E. Building biomanufacturing capacity - The chapter and verse / M. E. Kamarck // Nat. Biotechnol. -2006. -No. 24. -P. 503-505.

64. Kim, D.-S. Optimization of colorectal cancer vaccine candidate protein GA733-Fc expression in a baculovirus-insect cell system / D.-S. Kim, L. Qiao, K.-J. Lee, K. Ko // Entomological Research. -2015. -Vol. 45. -No.1. -P. 39-48.

65. Kim, H.-S. N-glycosylation modiication of plant-derived virus-like particles: an application in vaccines / H.-S. Kim, J. -H. Jeon, K. J. Lee, K. Ko // BioMed Research International. -2014. -Vol. 2014, -Article I D 249519.

66. Kipriyanov, S.M. Generation and Production of Engineered Antibodies / S. M. Kipriyanov, F. Le Gall // Molecular Biotechnology. -2004. -No. 26. -P. 39-60.

67. Kisung, K. Expression of recombinant vaccines and antibodies in plants /

K. Kisung // Monoclonal Antibodies in Immunodiagnosis and Immunotherapy. -2014. -Vol. 33. -No.3. -P.192-198.

68. Ko, K. Function and glycosylation of plant-derived antiviral monoclonal antibody / K. Ko, Y. Tekoah, P. M. Rudd, D. J. Harvey, R. A. Dwek, S. Spitsin, C. A. Hanlon, C. Rupprecht, B. Dietzschold, M. Golovkin, H. Koprowski // Proc Natl Acad Sci U S A. -2003. -No. 100 (13). -P. 8013-8.

69. Ko, K. Inhibition of tumor growth by plant-derived mAb / K. Ko, Z. Steplewski, M. Glogowska, H. Koprowski // Proc Natl Acad Sci U S A. -2005. -No. 102(19). -P. 7026-7030.

70. Ko, K. Plant biopharming of monoclonal antibodies / K. Ko, H. Koprowski // Virus Research. -2005. -Vol. 111. -No. 1. -P. 93-100.

71. Ko, K. Production of antibodies in plants: approaches and perspectives / K. Ko, R. Brodzik, Z. Steplewski // Current Topics in Microbiology and Immunology. -2010. -No. 332. -P.55-78.

72. Kohler, G. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity / G. Kohler, C. Milstein // Nature. -1975. -No. 256. -P. 495-497.

73. Komarova, T.V. New viral vector for efficient production of target proteins in plants / T.V. Komarova, M.V. Skulachev, A.S. Zvereva, A.M. Schwartz, Y.L. Dorokhov, J.G. Atabekov // Biochemistry-Moscow. -2006. -V. 71 (8). -P. 846-850.

74. Komarova, T.V. Plant-Made Trastuzumab (Herceptin) Inhibits HER2/Neu+ Cell Proliferation and Retards Tumor Growth. / T.V. Komarova, V.S. Kosorukov, O.Y. Frolova, I.V. Petrunia, K.A. Skrypnik, Y.Y. Gleba, Y.L. Dorokhov // Plos One. - 2011. - V.6 (3). - e17541. doi:10.1371 / journal.pone. 0017541.

75. Koprowski, H. Colorectal carcinoma antigens detected by hybridoma antibodies / H. Koprowski, Z. Steplewski, K. Mitchell, M. Herlyn, D. Herlyn, P. Fuhrer // Somatic Cell Genetics. -1979. -Vol. 5. -No. 6. -P. 957-971.

76. Kristina, K.L. Characterization of protein N-glycosylation by tandem mass spectrometry using complementary fragmentation techniques / K. L. Kristina, W. Zeng, J. L. Heazlewood, A. Bacic // Front. Plant Sci. -2015. -Vol. 6. -Article 674.

77. Kumagai, M. H. Rapid, high-level expression of biologically active alpha-trichosanthin in transfected plants by an RNA viral vector. / M. H. Kumagai, T. H. Turpen, N. Weinzettl, G. della-Cioppa, A. M. Turpen, J. Donson, M. E. Hilf, G. L. Grantham, W. O. Dawson, T. P. Chow // Proceedings of the National Academy of Sciences. -1993. -No. 90. -P. 427-30.

78. Laffly, E. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after... / E. Laffly, R. Sodoyer // Human Antibodies. -2005. -No. 14. -P. 33-55.

79. Lallemand, J. Extracellular peptidase hunting for improvement of protein production in plant cells and roots / J. Lallemand, F. Bouché, C. Desiron, J. Stautemas, F. de Lemos Esteves, C. Périlleux, P. Tocquin // Front. Plant Sci. -2015. -Vol. 6. -Article. 37. -10 pages.

80. Larrick, J.W. Production of secretory IgA antibodies in plants / J. W. Larrick, L. Yu, C. Nafttzger, S. Jaiswal, K. Wycoff // Biomol Eng. -2001. -No. 18(3). -P. 87-94.

81. Lee, J.-H. Expression of recombinant anti-breast cancer immunotherapeutic monoclonal antibody in baculovirus-insect cell system / J.-H. Lee, K.-A. Hwang, S. S. Park, Y.-K. Choo, K. Ko // Entomological Research. -2014. -Vol.44. -No.5. -P.207-214.

82. Lee, J.-H. Intracellular reprogramming of expression, glycosylation, and function of a plantderived antiviral therapeuticmonoclonal antibody / J.-H. Lee, D.-Y. Park, K.-J. Lee et al. // PLoS ONE. -2013. -Vol. 8. -No. 8. -Article ID e68772.

83. Leuzinger, K. Efficient agroinfiltration of plants for high-level transient expression of recombinant proteins / K. Leuzinger, M. Dent, J. Hurtado, J. Stahnke, H. Lai, X. Zhou et al. // J Vis Exp. -2013. -No. 77. -ex. 50521.

84. Lim, C.-Y. Effect of the developmental stage and tissue position on the expression and glycosylation of recombinant glycoprotein GA733-FcK in transgenic plants / C.-Y. Lim, K. J. Lee, D.-B. Oh, K. Ko // Frontiers in Plant Science. -2015. -Vol. 5. -Article 778.

85. Lim, C.-Y. Optimization of storage temperature for the pollen viability of

transgenic plants that express the anti-breast cancer monoclonal antibody mAb BR55 / C.-Y. Lim, D.-S. Kim, K. J. Lee, K.-A. Hwang, Y.-K. Choo, K. Ko // Plant Omics. -2015. -Vol.7. -No.5. -P. 403-409.

86. Lombardi, R. Optimisation of the purification process of a tumourtargeting antibody produced in N. benthamiana using vacuum-agroinfiltration/ R. Lombardi, M. E. Villani, M. D. Carli, P. Brunetti, E. Benvenuto, M. Donini// Transgenic Res. -2010. - No. 19. -P:1083-1097.

87. Longstaff, M. Expression and characterisation of single-chain antibody fragments produced in transgenic plants against the organic herbicides atrazine and paraquat / M. Longstaff, C. A. Newell, B. Boonstra, G. Strachan, D. Learmonth, W. J. Harris, A. J. Porter, W. D. Hamilton // Biochem Biophys Acta. -1998. -No. 1381 (2). -P. 147-60.

88. Loos, A. Expression and glycoengineering of functionally active heteromultimeric IgM in plants / A. Loos, C. Gruber, F. Altmann et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -2014. -Vol. 111. -No. 17. -P. 6263-6268.

89. Loos, A. Plant glyco-biotechnology on the way to synthetic biology / A. Loos, H. Steinkellner // Front. Plant Sci. -2014. -No. 5. -Art. 523.

90. Lu, Z. Expression of GA733-Fc fusion protein as a vaccine candidate for colorectal cancer in transgenic plants / Z. Lu, K.J. Lee, Y. Shao, J.H. Lee, Y. So, Y.K. Choo, D.B. Oh, K.A. Hwang, S.H. Oh, Y.S. Han, K. Ko // J. Biomed. Biotechnol. -2012. -Art. ID. 364240.

91. Ma, J. K. Generation and assembly of secretory antibodies in plants / J. K. Ma, A. Hiatt, M. Hein, N. D. Vine, F. Wang, P. Stabila, C. van Dolleweerd, K. Mostov, T. Lehner // Science. -1995. -No. 268 (5211). -P. 716-9.

92. Ma, J. K.-C. The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants / J. K.-C. Ma, P. M. W. Drake, P. Christou // Nature Reviews Genetics. -2003. -Vol.4. -No.10. -P.794-805.

93. Ma, J. K-C. Plant-derived pharmaceuticals - the road forward/ J. K-C.

Ma, R. Chikwamba, P. Sparrow, R. Fischer, R. Mahoney, R. M. Twyman // TRENDS in Plant Science. -2005. -Vol.10. -No. 12.

94. MacDonald, J. Bringing plant-based veterinary vaccines to market: Managing regulatory and commercial hurdles / J. MacDonald, K. Doshi, M. Dussault, J.C. Hall, L. Holbrook, G. Jones, A. Kaldis, C. L. Klima, P. Macdonald, T. McAllister et al. // Biotechnol. Adv. -2015. -No. 33 (8). -P. 1572-81.

95. Magy, B. Accumulation of secreted antibodies in plant cell cultures varies according to the isotype, host species and culture conditions / B. Magy, J. Tollet, R. Laterre, M. Boutry, C. Navarre // Plant Biotechnol. J. -2014. -No. 12. -P. 457-467.

96. Marillonnet, S. In planta engineering of viral RNA replicons: Efficient assembly by recombination of DNA modules delivered by Agrobacterium. / S. Marillonnet, A. Giritch, M. Gils, R. Kandzia, V. Klimyuk, Y. Gleba // Proceedings of the National Academy of Sciences. -2004. -No. 101. -P. 6852-7.

97. Marino, M. H. Expression systems for heterologous protein production / M. H. Marino // BioPharm. - 1989. - Vol. 2. -P. 18-33.

98. Markou, G. Microalgae for high-value compounds and biofuels production: A review with focus on cultivation under stress conditions / G. Markou, E. Nerantzis // Biotechnol. Adv. -2013. -No. 31. -P. 1532-1542.

99. Mathieu-Rivet, E. Protein N-glycosylation in eukaryotic microalgae and its impact on the production of nuclear expressed biopharmaceuticals / E. Mathieu-Rivet, M.-C. Kiefer-Meyer, G. Vanier, C. Ovide, C. Burel, P. Lerouge, M. Bardor // Front. Plant Sci. -2014. -No. 5. -57 pages.

100. McCormick, A. A. Individualized human scFv vaccines produced in plants: humoral anti-idiotype responses in vaccinated mice confirm relevance to the tumor Ig / A. A. McCormick, S. J. Reinl, T. I. Cameron, F. Vojdani, M. Fronefield, R. Levy, D. Tuse // J Immunol Methods. -2003. -No. 278 (1-2). -P. 95-104.

101. McCormick, A. A. Rapid production of specific vaccines for lymphoma by expression of the tumor-derived single-chain Fv epitopes in tobacco plants / A. A. McCormick, M. H. Kumagai, K. Hanley, T. H. Turpen, I. Hakim, L. K. Grill, D. Tuse,

S. Levy, R. Levy // Proc Natl Acad Sci U S A. -1999. -No. 96 (2). -P. 703-8.

102. Mett, V. Plants as biofactories / V. Mett, C. E. Farrance , B. J. Green, V. Yusibov // Biologicals. -2008. -No. 36 (6). -P. 354-8.

103. Molowa, D. The state of biologics manufacturing: part 2 / D. Molowa, M. Shenouda, A. Meyers, P. Tublin, A. Fein // JP Morgan. -2002. - P. 1-16.

104. Molowa, D. The state of biopharmaceutical manufacturing / D. Molowa, R. Mazanet // Biotechnol. Annu. Rev. -2003. -No. 9. -P. 295-301.

105. Morrison, S. L. Chimeric human-antibody molecules - mouse antigenbinding domains with human constant region domains / S. L. Morrison, M. J. Johnson, L. A. Herzenberg, V. T. Oi // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America-Biological Sciences. -1984. -No. 81. -P. 6851-6855.

106. Moussavou, G. Production of Monoclonal Antibodies in Plants for Cancer Immunotherapy / G. Moussavou, K. Ko, J.-H. Lee, Y.-K. Choo // BioMed Research International. -2015. -2015:306164.

107. Nagels, B. Production of complex multiantennary N-glycans in Nicotiana benthamiana plants / B. Nagels, E. J. M. Van Damme, M. Pabst, N. Callewaert, K. Weterings // Plant Physiology. -2011. -Vol.155. -No. 3. -P. 1103-1112.

108. Nandi, S. Techno-Economic Analysis of a Transient Plant-BasedPlatform for Monoclonal Antibody Production. / S. Nandi, A. T. Kwong, B. Holtz, R. Erwin, S. Marcel, K. A. McDonald // MAbs. -2016. -No. 8. -P. 1456-1466.

109. Nemoto-Sasaki, Y. Correlation between the sialylation of cell surface homsen-Friedenreich antigen and the metastatic potential of colon carcinoma cells in amousemodel / Y. Nemoto-Sasaki, M. Mitsuki, M. Morimoto-Tomita, A. Maeda, M. Tsuiji, T. Irimura // Glycoconjugate Journal. -2001. -Vol. 18. -No. 11-12. -P. 895906.

110. Nichols, E. J. Carbohydrate determinants associated with carcinoembryonic antigen (CEA) / E. J. Nichols, R. Kannagi, S. I. Hakomori, M. J. Krantz, A. Fuks // The Journal of Immunology. -1985. -Vol. 135. -No. 3. -P. 1911-

1913.

111. Nikolov, Z. Production of recombinant proteins from transgenic crops / Z. Nikolov, D. Hammes // In Plants as Factories for Protein Production. - 2002. -P. 159— 174.

112. Nissim, A. Historical development of monoclonal antibody therapeutics / A. Nissim, Y. Chernajovsky // Handb Exp Pharmacol. —2008. —No. 181. —P. 3—18.

113. Oey, M. Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic / M. Oey, M. Lohse, B. Kreikemeyer, R. Bock // Plant. —2009. —J. 7. —P. 436—445.

114. Omasa, T. Cell engineering and cultivation of chinese hamster ovary (CHO) cells. / T. Omasa, M. Onitsuka, W.—D. Kim // Curr. Pharm. Biotechnol. —2010. — No. 11. —P. 233—240.

115. Orzáez, D. Manufacturing antibodies in the plant cell / D. Orzáez, A. Granell, M. A. Blázquez // Biotechnology Journal. —2009. —No. 4. —P. 1712—1724.

116. Ou, J. Transgenic rice endosperm as a bioreactor for molecular pharming / J. Ou, Z. Guo, J. Shi, X. Wang, J. Liu, B. Shi, F. Guo, C. Zhang, D. Yang // Plant Cell Rep. —2014. —No. 33. —P. 585—594.

117. Palacpac, N. Q. Stable expression of human beta1,4—galactosyltransferase in plant cells modifies N—linked glycosylation patterns / N. Q. Palacpac, S. Yoshida, H. Sakai, Y. Kimura et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —1999. —No. 96. —P. 4692—4697.

118. Palomares, L.A. Production of recombinant proteins: challenges and solutions / L. A. Palomares, S. Estrada—Mondaca, O.T. Ramírez // Methods Mol Biol. — 2004. —No. 267. —P.15—52.

119. Park, S.—R. Expression, glycosylation and function of recombinant anti— colorectal cancermAb CO17—1A in SfSWT4 insect cells / S.—R. Park, Y. K. Shin, K. J. Lee et al. // Entomological Research. —2014. —Vol. 44. —No. 1. —P. 39—46.

120. Paul, M. Plant—made pharmaceuticals: Leading products and production platforms / M. Paul, J. K. Ma // Biotechnol. Appl. Biochem. —2011. —No. 58. —P. 58—67.

121. Pegram, M. Inhibitory effects of combinations of HER—2/neu antibody and

chemotherapeutic agents used for treatment of human breast cancers / M. Pegram, S. Hsu, G. Lewis et al. // Oncogene. -1999. -No. 18. -P. 2241-2251.

122. Peyret, H. The pEAQ vector series: the easy and quick way to produce recombinant proteins in plants / H. Peyret, G. Lomonossoff // Plant Mol Biol. -2013. -No. 83. -P. 51-58.

123. Peyret, H. When plant virology met Agrobacterium: The rise of the deconstructed clones / H. Peyret, G. P. Lomonossoff // Plant Biotechnol. J. -2015. -No. 13. -P. 1121-1135.

124. Pietras, R.J. Remission of human breast cancer xenografts on therapy with humanized monoclonal antibody to HER-2 receptor and DNA-reactive drugs / R. J. Pietras, M. D. Pegram, R. S. Finn et al. // Oncogene. -1998. -No. 17. -P. 2235-2249.

125. Pujol, M. Fighting cancer with plant-expressed Pharmaceuticals/ M. Pujol, J. Gavilondo, M. Ayala, M. Rodriguez, E. M. Gonzalez, L. Perez// TRENDS in Biotechnology.- 2007.- Vol. 25. -No.10. -P: 455-459.

126. Qin, S. Advances in genetic engineering of marine algae / S. Qin, H. Lin, P. Jiang // Biotechnol. Adv. -2012. -No. 30. -P. 1602-1613.

127. Ramirez, N. Expression and long-term stability of a recombinant single-chain Fv antibody fragment in transgenic Nicotiana tabacum seeds / N. Ramirez, P. Oramas, M. Ayala, M. Rodriguez, M. Perez, J. Gavilondo // Biotechnol Lett. -2001. -Vol. 23. -No. 1. -P. 47-49.

128. Rapley, R. The Biotechnology and Applications of Antibody Engineering / R. Rapley // Molecular Biotechnology. -1995. -Vol. 3. -P. 139-154.

129. Raskin, I. Plants and human health in the twenty-first century / I. Raskin et al. // Trends Biotechnol. -2002. -No. 20. -P. 522-530.

130. Raven, N. Scaled-up manufacturing of recombinant antibodies produced by plant cells in a 200-L orbitally-shaken disposable bioreactor / N. Raven, S. Rasche, C. Kuehn, T. Anderlei, W. Klöckner, F. Schuster, M. Henquet, D. Bosch, J. Büchs, R. Fischer et al. // Biotechnol. Bioeng. -2015. -No. 112. -P. 308-321.

131. Riethmuller, G. Monoclonal antibody therapy for resected Dukes' C

colorectal cancer: seven year outcome of amulticenter randomized trial / G. Riethmuller, E. Holz, G. Schlimok et al. // Journal of Clinical Oncology. —1998. —Vol. 16. —No. 5. —P. 1788—1794.

132. Riethmuller, G. Randomised trial of monoclonal antibody for adjuvant therapy of resected Dukes' C colorectal carcinoma / G. Riethmuller, R. Gruber, E. Schneider—Gadicke // The Lancet. —1994. —Vol. 343. —No.8907. —P.1177—1183.

133. Robert, S. Protection of Recombinant Mammalian Antibodies from Development-Dependent Proteolysis in Leaves of Nicotiana benthamiana/ S. Robert, M. Khalf, M.-C. Goulet, M.-A. D'Aoust, F. Sainsbury, D. Michaud// PLoS One. — 2013. — No. 8(7): e70203. Published online 2013 Jul 3. doi: 10.1371/journal.pone.0070203

134. Roy, G. A novel two—component Tobacco mosaic virus—based vector system for high—level expression of multiple therapeutic proteins including a human monoclonal antibody in plants. / G. Roy, S. Weisburg, S. Rabindran, V. Yusibov // Virology. —2010. —No. 405. —P. 93—9.

135. Sabalza, M. Recombinant plant—derived pharmaceutical proteins: Current technical and economic bottlenecks / M. Sabalza, P. Christou, T. Capell // Biotechnol. Lett. —2014. —No. 36. —P. 2367—2379.

136. Sack, M. From gene to harvest: Insights into upstream process development for the GMP production of a monoclonal antibody in transgenic tobacco plants / M. Sack, T. Rademacher, H. Spiegel, A. Boes, S. Hellwig, J. Drossard, E. Stoger, R. Fischer // Plant Biotechnol. J. —2015. —No. 13 (8). —P. 1094—1105.

137. Sack, M. The increasing value of plant—made proteins. / M. Sack, A. Hofbauer, R. Fischer, E. Stoger // Current Opinion in Biotechnology. — 2015. —No. 32. — P. 163—170.

138. Sainsbury, F. Transient expressions of synthetic biology in plants / F. Sainsbury, G. P. Lomonossoff // Curr. Opin. Plant Biol. —2014. —No. 19. —P. 1—7.

139. Salazar—González, J. Current status of viral expression systems in plants and perspectives for oral vaccines development / J. Salazar—González, B. Bañuelos— Hernández, S. Rosales—Mendoza // Plant Mol Biol. —2015. —No. 87. —P. 203—217.

140. Schähs, M. Production of a monoclonal antibody in plants with a humanized N-glycosylation pattern / M. Schähs, R. Strasser, J. Stadlmann, R. Kunert, T. Rademacher, H. Steinkellner // Plant Biotechnology Journal. -2007. -No. 5. -P. 65763.

141. Schillberg, S. Molecular farming of pharmaceutical proteins using plant suspension cell and tissue cultures / S. Schillberg, N. Raven, R. Fischer, R. M. Twyman, A. Schiermeyer // Curr. Pharm. -2013. -No. 19. -P. 5531-5542.

142. Schillberg, S. Molecular farming of recombinant antibodies in plants / S. Schillberg, R. Fischer, N. Emans // Cell. Mol. Life Sci. -2003. -No. 60. -P. 433-445.

143. Schirrmann, T. Production systems for recombinant antibodies / T. Schirrmann, L. Al-Halabi, S. Dübel, M. Hust // Frontiers in Bioscience. -2008. -No. 1. -P. 4576-4594.

144. Schouten, A. Improving scFv antibody expression levels in the plant cytosol / A. Schouten, J. Roosien, J. M. de Boer, A. Wilmink, M. N. Rosso, D. Bosch, W. J. Stiekema, F. J. Gommers, J. Bakker, A. Schots // FEBS. -1997. -Lett 415 (2). -P. 235-41.

145. Schouten, A. The C-terminal KDEL sequence increases the expression level of a single-chain antibody designed to be targeted to both the cytosol and the secretory pathway in transgenic tobacco / A. Schouten, J. Roosien, F. A. van Engelen, G. A. de Jong, A. W. Borst-Vrenssen, J. F. Zilverentant, D. Bosch, W. J. Stiekema, F. J. Gommers, A. Schots, J. Bakker // Plant Mol Biol. -1996. -No. 30 (4). -P. 781-93.

146. Sharp, J.M. Strategies for enhancing monoclonal antibody accumulation in plant cell and organ cultures / J. M. Sharp, P.M. Doran // Biotechnol Prog. -2001. -No. 17 (6). -P. 972-92.

147. Shukra, A. M. Production of recombinant antibodies using bacteriophages / A. M. Shukra, N. V. Sridevi, D. Chandran, K. Maithal // Journal of Microbiology and Immunology. -2014. -No. 4. -P. 91-98.

148. Slamon, D.J. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2 / D. J. Slamon, B.

Leyland-Jones, S. Shak et al. // The New England Journal of Medicine. -2001. -No. 344. -P. 783-792.

149. So, Y. Glycomodification and characterization of anti-colorectal cancer immunotherapeutic monoclonal antibodies in transgenic tobacco / Y. So, K.-J. Lee, D.S. Kim et al. // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -2013. -Vol. 113. -No. 1. -P. 4149.

150. Song, I. C. Comparison of total soluble protein in various horticultural crops and evaluation of its quantiication methods / I. C. Song, D. S. Kim, M. K. Kim, A. Jamal, K.-A. Hwang, K. Ko // Horticulture, Environment, and Biotechnology. -2015. -Vol. 56. -No.1. -P.123-129.

151. Sourrouille, C. Down-regulated expression of plant-specific glycoepitopes in alfalfa / C. Sourrouille, E. Marquet-Blouin, M. A. D'Aoust, M. C. Kiefer-Meyer, M. Severn, S. Pagny-Salehabadi, M. Bardor, G. Durambur, P. Lerouge, L. Vezina et al. // Plant Biotechnol. J. -2008. -No. 6. -P. 702-721.

152. Spadiut, O. Microbials for the production of monoclonal antibodies and antibody fragments / O. Spadiut, S. Capone, F. Krainer, A. Glieder, C. Herwig // Human Antibodies. - 2005.- No. 14. -P. 33-55.

153. Sparrow, P. Risk assessment and regulation of molecular farming—A comparison between Europe and US / P. Sparrow, I. Broer, E. E. Hood, K. Eversole, F. Hartung, J. Schiemann // Curr. Pharm. Des. -2013. -No. 19. -P. 5513-5530.

154. Spök, A. Plant Molecular Farming, Opportunities and Challenges / A. Spök, S. Karner // JRC Technical Report EUR 23383 EN. Kopstal. Luxembourg. -2008. -148p.

155. Steplewski, Z. Biological activity of human-mouse IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 chimeric monoclonal antibodies with antitumor specificity / Z. Steplewski, L. K. Sun, C. W. Shearman, J. Ghrayeb, P. Daddona, H. Koprowski // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -1988. -Vol. 85. -No. 13. -P.4852-4856.

156. Steplewski, Z. Human macrophages armed with murine immunoglobulin

G2a antibodies to tumors destroy human cancer cells / Z. Steplewski, M. D. Lubeck, H. Koprowski // Science. -1983. -Vol. 221. -No.4613. -P. 865-867.

157. Stoger, E. Plant molecular pharming for the treatment of chronic and infectious diseases. / E. Stoger, R. Fischer, M. Moloney, J. K. -C. Ma // Annu. Rev. Plant Biol. -2014a. -No. 65. -P. 743-768.

158. Stoger, E. Plantibodies: applications, advantages and bottlenecks / E. Stoger, M. Sack, R. Fischer, P. Christou // Current Opinion in Biotechnology. -2002. -No. 13. -P. 161-166.

159. Stoger, E. Recent progress in plantibody technology / E. Stoger, M. Sack, L. Nicholson, R. Fischer, P. Christou // Curr Pharm Des. -2005. -No. 11(19). -P. 24392457.

160. Stoger, E. Sowing the seeds of success: pharmaceutical proteins from plants / E. Stoger, J. K. C. Ma, R. Fischer, P. Christou // Curr. Opin. Biotechnol. -2005. -No. 16. -P. 167-173.

161. Strasser, R. Generation of glyco-engineered Nicotiana benthamiana for the production of monoclonal antibodies with a homogeneous human-like N-glycan structure / R. Strasser, J. Stadlmann, M. Schähs, G. Stiegler, H. Quendler, L. Mach, J. Glössl, K. Weterings, M. Pabst, H. Steinkellner // Plant Biotechnol. J. -2008. -No. 6. -P. 392-402.

162. Tao Qin. HER2-positive breast cancer patients receiving trastuzumab treatment obtain prognosis comparable with that of HER2-negative breast cancer patients / Tao Qin et al. // OncoTargets and Therapy. -2013. -V.6. -P. 341-347.

163. Ullrich, K.K. Means to optimize protein expression in transgenic plants / K. K. Ullrich, M. Hiss, S. A. Rensing // Curr. Opin. Biotechnol. -2015. -No. 32. -P. 61-67.

164. Vaquero, C. Transient expression of a tumor-specific single-chain fragment and a chimeric antibody in tobacco leaves / C. Vaquero, M. Sack, J. Chandler, J. Drossard, F. Schuster, M. Monecke, S. Schillberg, R. Fischer // Proc Natl Acad Sci U S A. -1999. -No. 96 (20). -P. 11128-33.

165. Veluthambi, K. The current status of plant transformation technologies / K. Veluthambi, K. Aditya et al. // Curr. Sci. — 2003. — Vol. 84 (3). — P. 368—380.

166. Verch, T. Expression and assembly of a full—length monoclonal antibody in plants using a plant virus vector / T. Verch, V. Yusibov, H. Koprowski // J Immunol Methods. —1998. —No. 220 (1—2). —P. 69—75.

167. Villani, M. E. Plant pharming of a full—sized, tumour—targeting antibody using different expression strategies / M. E. Villani, B. Morgun, P. Brunetti, C. Marusic, R. Lombardi, I. Pisoni, C. Bacci, A. Desiderio, E. Benvenuto, M. Donini // Plant Biotechnology Journal. —2009. —No. 7. —P. 59—72.

168. Vogel, C.L. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first— line treatment of HER2—overexpressing metastatic breast cancer / C. L. Vogel, M. A. Cobleigh, D. Tripathy et al. // . —2002. —No. 20. —P. 719—726.

169. Wilken, L.R. Recovery and purification of plant—made recombinant proteins / L. R. Wilken, Z. L. Nikolov // Biotechnol. Adv. —2012. —No. 30. —P. 419—433.

170. Yao, J. Plants as Factories for Human Pharmaceuticals: Applications and Challenges / J. Yao, Y. Weng, A. Dickey, K. Y. Wang // International Journal of Molecular Sciences. —2015. —No. 16. —P. 28549—28565.

171. Zhong, Q. Extraction of recombinant dog gastric lipase from transgenic corn seed/ Q. Zhong, Z. Gu, C. E. Glatz // J. Agric. Food Chem. —2006. —No. 54. —P. 8086—8092.

ПРИЛОЖЕНИЕ ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА

< н

н

и «

н и

рр

о ч

и ^

Й

I—I ^

н и к К

рн ^

о