Получение и фитохимический анализ каллусных культур аралии сердцевидной (Aralia cordata Thunb.) как перспективного растительного сырья тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Некрасова Дарья Алексеевна

• Некрасова Дарья Алексеевна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Некрасова Дарья Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ботаническое описание аралии сердцевидной (Aralia cordata Thunb.)

1.2. Химические компоненты аралии сердцевидной

1.2.1. Монотерпеноиды, сесквитерпеноиды и их производные

1.2.2. Дитерпеноиды

1.2.3. Тритерпеноиды

1.2.4. Другие группы биологически активных соединений

1.3. Биологическая активность аралии сердцевидной

1.4. Культуры клеток Aralia ssp: получение, культивирование, химический состав

1.4.1. Работы по in vitro культивированию аралии высокой (Aralia elata Rupr. et Maxim.)

1.4.2. Изучение культур in vitro аралии сердцевидной (Aralia cordata Thunb.)

1.4.3. Использование клеточных технологий для введения в культуру других видов рода Aralia

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы получения и условия культивирования каллусной культуры

2.2.1 Получение каллусной культуры и выбор оптимальной среды для культивирования

2.2.2. Модификация питательной среды Линсмайера-Скуга

2.3. Методы определения ростовых характеристик каллусной культуры аралии сердцевидной

2.4. Методы определения морфологических характеристик и жизнеспособности каллусов

2.4.1. Определение макроскопических признаков полученных каллусов

2.4.2. Изучение микроскопических признаков каллусных культур и определение их жизнеспособности

2.5. Методы фитохимического анализа каллусных культур аралии сердцевидной

2.5.1. Предварительный фитохимический анализ состава каллусных культур

2.5.2. Фитохимический анализ каллусных культур с использованием физико-химических методов

2.6. Методы определения экспрессии гена p-амиринсинтазы в каллусных культурах аралии сердцевидной и листьях интактного растения

2.6.1. Выделение РНК

2.6.2. Получение кДНК

2.6.3. Анализ экспрессии гена p-амиринсинтазы методом ПЦР realtime

2.7. Методы оценки влияния экстракта из каллусных культур аралии сердцевидной на работоспобность на моделях in vivo

2.7.1. Получение сухого экстракта аралии сердцевидной

2.7.2. Определение острой токсичности экстракта из каллусной культуры аралии сердцевидной на моделях in vivo

2.7.3. Оценка актопротекторной активности экстракта каллусной культуры аралии сердцевидной

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение структурных характеристик первичного каллуса аралии сердцевидной

3.1.1. Макроскопические признаки первичного каллуса

3.1.2. Микроскопические признаки первичного каллуса

3.2. Изучение структурных особенностей вторичных каллусов аралии сердцевидной

3.2.1. Макроскопические признаки каллусов

3.2.2. Микроскопические признаки вторичных каллусных культур на питательной среде Линсмайера-Скуга без использования добавок

3.2.3. Определение жизнеспособности каллусных культур

3.2.4. Анализ ростовых характеристик каллусных культур

3.3. Результаты фитохимического анализа каллусных культур аралии сердцевидной

3.3.1. Результаты предварительного фитохимического анализа

3.3.2. Результаты фитохимического изучения каллусных культур с использованием физико-химических методов анализа

3.3.3. Результаты анализа экспрессии гена p-амиринсинтазы в каллусных культурах и листьях аралии сердцевидной

3.3.4. Обоснование выбора культуры для изучения актопротекторной активности на моделях in vivo

3.3.5. Результаты определения актопротекторной активности

экстракта из каллусных культур на моделях in vivo

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение 1. Паспорт каллусной культуры аралии сердцевидной

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и фитохимический анализ каллусных культур аралии сердцевидной (Aralia cordata Thunb.) как перспективного растительного сырья»

ВВЕДЕНИЕ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Растительные организмы обладают уникальной способностью к биосинтезу вторичных метаболитов - различных по природе органических соединений, обеспечивающих взаимодействие растений с окружающей средой и обладающих разнообразной биологической активностью [32].

Среди всех вторичных метаболитов лекарственных растений, наиболее высокое разнообразие фармакологических эффектов проявляют терпеноиды. Данная группа также не имеет аналогов по разнообразию структурных типов молекул. Она насчитывает более 23 тысяч веществ с установленным химическим строением, превосходит по числу представителей все другие классы природных соединений. Терпеноиды образуются во всех частях растений [71].

Одной из причин интереса к терпеноидам, как к биологически активным веществам, являются адаптогенные [94, 105], цитотоксические [75], противодиабетические [31], противовоспалительные [82, 95-96] и др. [3, 117, 121] свойства препаратов на основе растений семейства Araliaceae - женьшеня обыкновенного (Panax ginseng C. A. Mey), элеутерококка колючего (Eleutherococcus senticosus (Maxim. & Rupr.) Maxim.), заманихи высокой (Oplopanax elatus Nakai), аралии маньчжурской (Aralia mandshurica Rupr. & Maxim.) и плюща обыкновенного (Hedera helix L.), действующим началом которых являются тритерпеноиды [42, 75, 97].

На территории России произрастает 10 дикорастущих видов аралиевых (6 родов), одним из наиболее известных видов является аралия сердцевидная (Aralia cordata Thunb.). Aralia cordata - многолетнее травянистое растение, имеющее восточно-азиатский островной тип ареала. В настоящее время растение внесено в Красную книгу России [116].

Особый охранный статус аралии сердцевидной объясняется сложностью возобновления естественных популяций, связанных с наличием периода морфофизиологического покоя и природной недоразвитостью зародыша.

Трудоемкость культивирования, ограниченность природного ареала и большое практическое значение вторичных метаболитов аралии сердцевидной ставит вопрос о целесообразности введения данного вида в культуру in vitro

[9].

Грамотный подход к культурам растительных клеток и тканей может позволить вести работы по получению биологически активных веществ (БАВ) в течение всего года и вне зависимости от условий среды, а контроль над условиями культивирования позволит увеличить их выход [10].

Перечисленные преимущества клеточных технологий открывают большие перспективы для фармацевтической промышленности. Использование культур клеток и тканей растений может решить проблемы ограниченности запасов лекарственного сырья, невозможности выращивания многих видов растений традиционными методами [33].

Степень разработанности темы исследования

Клеточные технологии делают возможным выращивание изолированных органов, тканей и клеток растений в условиях in vitro. В настоящее время указанные технологии широко используются в декоративном растениеводстве и овощеводстве, что позволяет облегчить селекционный процесс и получить растения с заданными характеристиками в короткие сроки [12, 20]. Применимость описанных технологий в области лекарственного растениеводства остается открытым вопросом и требует отдельного изучения, связанного с особенностями накопления целевых групп вторичных метаболитов в культуре [19].

Ранее предполагалось, что накопление фармацевтически ценных вторичных метаболитов в культурах изолированных клеток и тканей растений носит исключительный характер, что было связано со сосредоточенностью

исследователей на поисках конкретных фармакологически активных соединений, синтез которых в данных биологических системах может быть затруднен [11, 89].

Расширение спектра детальных фитохимических исследований позволило определить, что синтез вторичных метаболитов культурами клеток осуществляется, однако имеет свои характерные особенности, связанные с непрерывной пролиферативной активностью, а также дедиференцированным состоянием клеток [22, 80].

Ранние опыты по введению аралии сердцевидной в культуру in vitro были связаны с изучением ее биосинтетической активности в отношении антоцианов [61]. Были разработаны стратегии получения суспензий-продуцентов, изучены факторы, влияющие на процесс накопления данной группы биологически активных веществ [84], тогда как наличие тритерпеновых гликозидов в культурах описано не было. Цели и задачи работы

Целью работы является изучение каллусной культуры аралии сердцевидной (Aralia cordata Thunb.) как потенциального источника растительного сырья.

Задачи исследования:

1. Введение аралии сердцевидной (Aralia cordata Thunb) в культуру, подбор и оптимизация условий для длительного поддержания полученных культур;

2. Анализ ростовых и биосинтетических (накопление терпеноидов) характеристик культур Aralia cordata в динамике культивирования на средах с различными добавками;

3. Оценка качественного и количественного состава биологически активных веществ, накапливаемых культурами клеток Aralia cordata, в сравнении с интактными растениями;

4. Изучение экспрессии гена Р-амиринсинтазы в культурах аралии сердцевидной в сравнении с интактным растением;

5. Установление биологической активности экстрактов из культур клеток на моделях in vivo.

Научная новизна работы

Впервые получена стабильная каллусная культура из листьев интактного растения Aralia cordata на среде Мурасиге-Скуга с добавлением 0,5 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,5 мг/л кинетина, подобраны условия для ее стабильного роста.

Впервые изучено влияние липофильных добавок и кокосовой воды на микроскопические, макроскопические признаки, ростовые характеристики и жизнеспособность культуры.

С использованием современных физико-химических методов анализа установлено, что полученные культуры являются продуцентами тритерпеновых гликозидов. Методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии и ВЭЖХ впервые подтверждено наличие аралозида А во всех полученных культурах.

Определено количественное содержание тритерпеновых гликозидов в культурах в сравнении с листьями интактного растения аралии сердцевидной и корнями аралии маньчжурской. Показано, что культуры накапливают количество тритерпеновых гликозидов, сравнимое с корнями аралии маньчжурской и листьями аралии сердцевидной.

Впервые проведена оценка количественного содержания аралозида А в культурах методом ВЭЖХ-УФ. Показано, что в процессе культивирования количество аралозида А постепенно снижается по отношению к нарастающей биомассе. Наиболее чувствительными к колебаниям количества аралозида А оказались культуры на средах с липофильными добавками, что объясняется постепенным образованием на

поверхности клеток тонкой пленки масла, которая ведет к уменьшению количества субстрата для синтеза тритерпеновых гликозидов и оказывает негативное влияние на жизнедеятельность клеток.

Качественный анализ методом ВЭЖХ-МС показал наличие в культурах тритепеновых гликозидов и подтвердил схожесть химического состава каллусных культур с листом интактного растения аралии сердцевидной.

Анализ экспрессии гена Р-амиринсинтазы в каллусных культурах показал, что уровень экспрессии гена прямо пропорционален накоплению аралозида А, однако низкий уровень экспрессии данного гена в культурах по сравнению с листьями позволяет предположить наличие иных молекулярных механизмов биосинтеза тритерпеновых гликозидов в культурах растительных тканей.

Определение биологической активности экстракта из каллусной культуры аралии сердцевидной показало, что биологически активные вещества, входящие в состав культуры, обладают низким уровнем токсичности и увеличивают работоспособность животных при интенсивных физических нагрузках.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты проделанной работы позволяют рассматривать полученную культуру аралии сердцевидной (Aralia cordata Thunb.) в качестве потенциальной пищевой и фармацевтически ценной субстанции.

В ходе работы установлено, что культуры являются продуцентами тритерпеновых гликозидов, а изменение условий культивирования позволяет влиять на морфологические признаки культуры, а также модифицировать скорость накопления вторичных метаболитов, их качественный и количественный состав, что подкреплено результатами фитохимического анализа с использованием современных физико-химических методов. В частности установлено, что в начале цикла культивирования наибольшую

продуктивность в отношении вторичных метаболитов показывают культуры на средах с липофильными добавками. Все используемые в ходе анализа подходы демонстрируют, что качественный и количественный состав культур приближен к составу листьев интактного растения аралии сердцевидной и накапливают большее количество биологически активных веществ, чем корень аралии маньчжурской.

С использованием методов ВЭТСХ и ВЭЖХ-УФ подтверждено наличие в культурах аралозида А - мажорного соединения фармакопейного сырья -аралии маньчжурской. Таким образом, аралозид А может использоваться для стандартизации и являться маркером доброкачественности культур как лекарственного растительного сырья.

Результаты, полученные в ходе работы, использованы для составления паспорта каллусной культуры Aralia cordata Thunb., в котором отражены все основные морфологические, ростовые и биосинтетические характеристики.

Выявленная актопротекторная активность позволяет рассматривать полученные культуры в качестве сырья для получения фитопрепаратов для повышения физической работоспособности.

Результаты диссертационного исследования использованы в научно-исследовательской деятельности кафедры фармакогнозии и лаборатории культур растительных клеток федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (акт внедрения от 22.05.2024 г.).

Методология и методы исследования

Исследование проводили в период с 2021 по 2024 год с использованием актуальных биотехнологических, фитохимических и молекулярно-генетических методов и современного научного оборудования. Фитохимический анализ проводили с использованием ряда хроматографических методов: ВЭЖХ-МС высокого разрешения, ВЭЖХ-УФ и

ВЭТСХ. Теоретическую основу исследования составили труды отечественных и зарубежных исследователей по получению культур растительных клеток и фитохимическому анализу вторичных метаболитов A. cordata и A. mandshurica. Положения, выносимые на защиту

1. Результаты получения и оптимизации условий культивирования каллусной культуры аралии сердцевидной;

2. Результаты изучения морфологических особенностей и ростовых характеристик полученных каллусных культур в зависимости от состава питательной среды;

3. Результаты фитохимического анализа каллусных культур методами ВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-УФ и ВЭТСХ;

4. Результаты сравнительного исследования активности гена Р-амиринсинтазы в листьях аралии сердцевидной и каллусных культурах;

5. Результаты определения биологической активности экстракта из каллусных культур на моделях in vivo.

Степень достоверности и апробации результатов исследования

Основные результаты, полученные в рамках исследования, были представлены на V (XIII) Международной ботанической конференции молодых учёных в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 2022 год), научно-практической конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье XXV Международная медико-биологическая конференция молодых исследователей» (Санкт-Петербург, 2022), международной конференции PLAMIC 2022 (Санкт-Петербург, 2022), XXVI Международном Конгрессе PHYTOPHARM 2023 (Санкт-Петербург, 2023), Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным участием «Молодая фармация - потенциал будущего» (Санкт-Петербург, 2021, 2022, 2023), Научно-методической конференции с международным участием «Сандеровские чтения» (2022, 2023). Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России для опубликования основных научных результатов диссертаций, среди которых 1 статья в издании, включенном в международную наукометрическую базу данных Scopus.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических

наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Санкт-Петербургский государственный химико-фармацевтический университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, в рамках инициативной тематики НИР «Создание промышленно-значимых штаммов культур клеток лекарственных растений и оценка их биосинтетического потенциала», (регистрационный номер ЕГИСУ НИОКТР- 122120100021-2 от 01.12.2022)

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертационной работы соответствуют паспорту специальности 3.4.2. Фармацевтическая химия, фармакогнозия, а именно пункту 5 - Изучение вопросов рационального использования ресурсов лекарственного растительного сырья с учетом влияния различных факторов на накопление биологически активных веществ в сырье и пункту 6 - Изучение химического состава лекарственного растительного сырья, установление строения, идентификация природных соединений, разработка методов выделения, стандартизации и контроля качества лекарственного растительного сырья и лекарственных форм на его основе.

Личный вклад автора в проведенное исследование и получение научных результатов

Автор лично участвовал в формулировке цели исследования и постановке задач, сборе и анализе литературных данных, планировании

экспериментальной работы, постановке экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов. Автор лично осуществлял написание тезисов и статей по тематике исследования. Личный вклад автора составил не менее 90%.

Объем и структура работы. Работа изложена на 135 страницах компьютерного набора, включает введение, список сокращений, обзор литературных данных, главу «Материалы и методы» и «Результаты и обсуждение», заключение, список литературы, состоящий из 138 источников (из них 113 на иностранных языках). Материалы исследования проиллюстрированы 15 рисунками и 43 таблицами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ботаническое описание аралии сердцевидной (Aralia cordata Thunb.)

Аралия сердцевидная - многолетнее травянистое растение высотой до 1.5 м с простыми неветвящимся надземными побегами, густо усеянными оттопыренными волосками. Листья черешковые, с прилистниками, дважды непарно-перистосложные, в очертании ромбические, до 60 см в длину и ширину. Листочки с черешочками, яйцевидные, иногда эллиптические, длиной до 20 см, шириной до 13 см. Сверху тёмно-зелёные, голые или с шипиками, снизу более светлые, встречаются короткие волоски по жилкам. Соцветие зонтиковидное, верхушечное, длиной 30-70 см, боковые зонтики достигают величины 15-25 см. Цветки мелкие, зеленовато-белые. Плод - чёрная шаровидная костянка, диаметром до 4,5 см. Косточки от светло-коричневого до серого цвета, продолговатые, с волокнистой поверхностью. Длина косточек 2,5 мм, ширина 1,5 мм, толщина 0,5 мм [23].

Корень толстый, мясистый, с ароматным запахом.

Цветет в первой-второй декаде августа, семена созревают в сентябре-октябре.

Аралия сердцевидная имеет восточноазиатский островной тип ареала, в России распространена только на Дальнем Востоке: на Сахалине, Монероне и Курильских островах. Естественный ареал охватывает Японию, восточные провинции Китая, Тайвань, Корею (рис.1.) [4].

Рисунок 1. Ареал обитания аралии сердцевидной (Aralia cordata Thunb.) на карте России.

В дубовых, хвойных и смешанных лесах образует сплошные заросли, встречается отдельными популяциями в ильмово-березово-кленовых лесах нижнего пояса гор, в бамбучниках, реже встречается на лугах [17].

Семена аралии сердцевидной характеризуются недоразвитостью зародыша, длина которого порядка 0,4 мм, что составляет примерно 1/5 длины семени. Это объясняет наличие у семян периода морфофизиологического покоя, преодоление которого требует длительной стратификации, что ограничивает применение семенного способа воспроизведения растительных популяций.

1.2. Химические компоненты аралии сердцевидной

Химический состав аралии сердцевидной включает большое разнообразие различных по структуре терпеновых соединений: во всех органах отмечено большое содержание монотерпеноидов, сесквитерпеноидов,

дитерпеноидов и их производных, а также тритерпеновых гликозидов. Кроме того, в растении обнаружены углеводы, стероиды, кумарины, антоцианы, и др. химические компоненты [102].

Для аралии сердцевидной описано порядка двадцати соединений, относящихся к монотерпеноидам и сесквитерпеноидам их производным. Исследователями отмечено, что мажорными компонентами эфирных масел, полученных из различных частей растения, служат а-пинен (63.3%), Р-пинен, камфен, сабинен, мирцен, а-лимонен, оцимен, пара-цимен, а-фарнезен, р-кариофиллен, D-карвон, изопинокамфон, транс-пинокамфон, вербенон, терпинен-4-ол, лавандулол, цис-сабинен, транс-пинокарвеол и а-бетуленол [48].

1.2.1. Монотерпеноиды, сесквитерпеноиды и их производные

Таблица 1. Монотерпеноиды, сесквитерпеноиды, входящие в состав сырья аралии сердцевидной.

№ Название Формула Локализация Литературный источник

1 а-пинен сн3 СНз Корни, стебли [48, 79, 131]

2 Р-пинен сн2 Н3С^ ] Корни, стебли [48, 79]

3 Камфен н2с^ НзС-^т1 НзС Корни, стебли [79, 131]

4 Цимол СНз Корни, стебли [48]

5 у-терпинен СНз Корни, стебли [131]

6 Сабинен НзС С |Н2 С ^Нз Корни, стебли [131]

7 Мирцен СНз СН2 Нз^ ^^ ^^ Корни, стебли [131]

8 Лимонен Н2С С -•Н-э с ^Нз Корни, стебли [131]

9

а-копаэн

СН СНо с 3Н ' 3

= Н = Н

Н3С СН3

Корни, стебли

[132]

10

Гумулен

НС

НС

НС

Корни, стебли

[132]

11

Транс-

сабиненгидрат

Н3С___ -СН3

НО СНзН

Корни, стебли

[132]

12

Терпинен-4-ол

НС

,СН

НзС НО

Стебли

[79, 131]

13

Р-оцимен

СН2

НС

Стебли

[48, 79]

14

Р-фарнезен

НС'

Стебли

^СН2

[79]

з

3

15 Карвон СН3 О А^СНз Стебли [48]

16 Изопинокамфон Н СН3 Н Стебли [48]

17 Цис- пинокамфон Н СН3 с Н Стебли [48]

18 Вербенон СН3 0 Стебли [48]

19 а-бетуленол СНз НзС^^^ СН2 ж07 11 Стебли [79]

20 Р-кариофиллен Н3С Н 3 N Н3С*"" Н С Стебли [79]

21 у-мууролен сн2 НзС^Х Н3С СН3 Стебли [79]

22 а-фарнезен СН3 СН3 СН3 Стебли [48]

23 Лавандулол СН3 Н3С—^ ^-V СН3 НО—' СН2 Стебли [48]

1.2.2. Дитерпеноиды

Данный класс соединений широко представлен как в корнях, так и в надземной части растения (табл.2.). Основными представителями дитерпеноидов являются производные энт-пимарана и энт-каурана [41, 51, 126].

Таблица 2. Дитерпеноиды сырья аралии сердцевидной.

Локализ Литературный

№ Название Формула

ация источник

24

Энт-пимара-8(14),15-диен-19-овая кислота

(континенталова я кислота)

НС

О

Корни

[17, 51, 54, 58]

Н

25

17-гидрокси-энт-каур-15-ен-19-овая кислота

Корни

—^ СНз

[51]

26

Пимара-8(14),15-диен-19-аль

Корни

\\ СНз О

[17]

НС

27

Пимаровая кислота

"ЮН

Корни

О

[17]

з

2

33

18-нор-энт-пимара-8(14),15-диен-4р-ол

Н

НС

Н

ОН

Корни

[51]

18-нор-энт-каур-16-ен-4р-34 ол (4-

эпируилопезиол )

Корни

НС ОН

[17, 51]

7р-гидрокси-энт-пимар-35 8(14),15-диен-19-ол (энт-пимарол)

НС

Корни

/Ч Н

НО СН3

[17]

36

7а-гидрокси-энт-пимара-8(14),15-диен-19-ол

Корни

[51]

2

2

3

2

37

7а-гидрокси-энт

пимара-8(14),15-диен-19-овая кислота

Н

НО

СН,

^ СНз О

Корни

[51, 58]

38

Энт-пимар-15-ен-8а,19-диол

Корни

Н

СНз

[51]

39

16а,17-дигидрокси-энт-кауран-19-овая кислота

Корни

НО СНз

О

[51]

40

16а-метокси,17-гидрокси-энт-кауран-19-овая кислота

Корни

н^°"ЧСНз

О

[51]

Н

2

Энт-пимара-45 8(14),15-диен-18-овая кислота

НО

Д СН3 О

Корни

[17, 58]

Энт-пимара-46 8(14),15-диен-19-ол

Корни

[17, 51,58]

47

Акантол

СН

СН

СН

Корни

[58]

НО—' СН3

48

7-оксо-энт-пимара-8(9),15-диен-19-овая кислота

НС

Корни

[51, 58]

НО—& СН3 ^О

3

3

3

49

Кауренол

Г 1

Н

Корни

НО-

Н

СНз

[58]

50

Энт-каур-15-ен-17-аль-19-овая кислота

Г 1

Н

О

Корни

СНз

О

[58]

51

Грандифлоровая кислота

Г 1

Н

Корни

' н НзС

ОН

[58]

Н

52

Энт-каур-15-ен-17,19-диоат

ОН

// О

Корни

НзС Х^О НО

[58]

2

2

53

Цис-коммунол

НзС

СНз!

О"

СН2

Корни

[58]

54

16-формил-каур-15-ен-19-овая кислота

О

Корни

НО—& СНз О

[98]

55

15,16-дигидроксипима р-8(14)-ен-19-овая кислота

ОН СНз

Корни

но—<\ СНз О

[58]

НС

56

Меланокан Е

Корни

О

[58]

2

з

57

Жиадифеноевая кислота М

НС

Корни

[58]

\ Н НО—Л СН3

^О

3

1.2.3. Тритерпеноиды

Тритерпеновые гликозиды традиционно считаются основной группой действующих веществ сырья аралии. Состав тритерпеновых гликозидов аралии сердцевидной изучен не так подробно, как состав аралии высокой, что может быть связано с ее ограниченным распространением [39, 123] (табл.3.). Таблица 3. Тритерпеноиды и их гликозиды.

№ Название Формула Локализация Литературн ый источник

58 Аралозид А =-"ОН .ОН о Т^ О\ О пт ""ОН ОН СНэТ Т Г^НТ%й'СН3СН3 ОН Н3С^ Н | Н "''ОН \_/ ОН НО ОН Корни [25]

59

Олеаноловая кислота

Н зС СНз

ОН

Н

Н зС СНз

Ветви

[38]

60

28-О-р-О-глюкопирано зиловый эфир олеаноловой кислоты

Ветви

[64]

61

Тараксерол

СНо Н СН

Н

НзС СНз

Ветви

[64]

62

Мирикардио л

НзС СНз

ОН

Н

НзС СНз

Ветви

[64]

63

Удосапонин А

НзС СНз

НО ОН

НО' X "О*"

: н

ОН НзС СНз

Ветви

[55]

НС СН

О

64

Удосапонин

в

НзС СНз

НО

ОН НО' X О' _

О^ „О НзС сН

Ветви

[55]

65

Удосапонин

с

НО' X О ,.

£ / ■-- Н

.а ,.0 НзС СНз

Ветви

[55]

66

Удосапонин D

1НО' X 'О' ,

_ Н

ОН НзС

НО

Ветви

[55]

67

Удосапонин Е

НО' у ОН ОН

Ветви

[55]

Н С СН

68 Удосапонин F Н3С СНз НО X Ч СН^ Т^Г^ 0Н ^,0. .0 Н3С ? I НО ^^ Н0 II Н0 -ОН НО^^^^ '''0Н 0Н Ветви [55]

69 Салсолозид D 0 Уч о Ветви [55]

70 Салсолозид С 5 Д 0 Ветви [55]

1.2.4. Другие группы биологически активных соединений

Помимо терпеноидов, сырье аралии сердцевидной богато стероидами -стигмастерином, даукостерином, ситостерином, 3р,5а-дигидрокси-6р-метоксиэргоста-7,22-диеном, эндопероксидом эргостерина [41, 64, 91, 98].

Среди ароматических соединений для аралии сердцевидной описаны следующие: пеонол, 1-метил-4-(1-метилэтил)бензол, 3-тридецен-1-ин-2,3,4,5,6,7-гексагидро-1Н-инден-2-ол [79, 92], октадегидро-4-метил-6-(1-метилэтил)-3,5-диоксо-4а-(2Н)нафталинкарбальдегид [79].

Корни, ветви и плоды растения содержат антоцианы - 3-О-Р-О-ксилопиранозил-(1^2)-Р-0-галактопиранозид цианидина [56].

Наряду с тем, исследователями определено наличие в ветвях растения аралия-цереброзида [64], докозановой, гексадекановой кислот, а-монопальмитина [98].

В корнях были найдены фалькаринол, 8-ацетат фалькаринола, дегидрофалькаринол, (-)-8-ацетат дегидрофалькаринола,

дегидрофалькариндиол, 8-ацетат дегидрофалькариндиола, относящиеся к полиацетиленовым соединениям [41] и алифатический альдегид н-гексаналь [92].

1.3. Биологическая активность аралии сердцевидной

Корни аралии сердцевидной нашли применение в традиционной китайской медицине для лечения ревматизма, пояснично-крестцовых болей, растяжения связок и прочих травм. Кроме того, препараты на основе сырья использовали для купирования зубной, головной боли и мигрени [50].

Современные исследования показывают, что этанольный экстракт из корней препятствует деградации хрящевой ткани и хондроцитов при остеоартрите, оказывая влияние на активность каспазы-3 [30, 95], (-)-каур-16-ен-19-овая, (-)-пимара-8(14),15-диен-19-овая кислоты демонстрируют обезболивающее и противовоспалительное действие через ингибирование активности №-карраВ и активации луциферазы, либо путем активации №12 [54, 60, 77, 93, 119, 129].

Этанольный экстракт из надземной части растения и олеаноловая кислота оказывают нейропротекторное и обезболивающее действие [37, 38, 129], 7-оксосандаракопимаровая кислота проявляет антиастматическую активность [36]. 16а-гидрокси-17-изовалерилокси-еП-кауран-19-овая кислота ингибирует активность ДНК-топоизомераз I и II [111].

Энт-пимара-8(14),15-диен-19-овая кислота, (-)-каур-16-ен-19-овая кислота, эндопероксид эргостерина, 3р,5а-дигидрокси-6р-метоксиэргоста-7,22-диен, олеаноловая кислота, 16а-гидрокси-еП-кауран-19-овая кислота,

15,16-дигидроксипимар-8(14)-ен-19-овая кислота, 28-O-P-D-

глюкопиранозиловый эфир олеаноловой кислоты, тараксерол, мирикадиол, фалькариндиол, дегидрофалькариндиол, фалькариндиол, 8-ацетат дегидрофалькариндиола, 8-ацетат фалькариндиола и 7а-гидрокси-(-)-пимара-8(14),15-диен-19-овая кислота ингибируют активность циклооксигеназ 1 и 2 [41, 64], (-)-пимар-15-ен-8а,19-диол — активность бутирилхолинэстеразы [51]. 3р,5а-дигидрокси-6р-метоксиэргоста-7,22-диен проявляет цитотоксическую активность в отношении клеток линий L1210, K562 и LLC [64].

Помимо описанной активности, для континенталовой кислоты показано гиполипидемическое, антиатеросклеротическое и вазопротекторное действие [59, 119].

Аралозид А, описанный для аралии сердцевидной, обладает гастропротекторным [45, 63], противовоспалительным, цитотоксическим [73], антигипертензивным [128] и тонизирующим [62] действием.

Изучение адаптогенного потенциала настойки аралии сердцевидной в сравнении с настойкой аралии маньчжурской на моделях in vivo показало сходные результаты, что позволило предположить, что сырье аралии сердцевидной может являться заменой сырья аралии маньчжурской [24]. Наличие адаптогенной активности может также предполагать наличие актопротекторного действия, описанного для сырья аралии маньчжурской

[115].

Проведенные исследования демонстрируют, что вторичные метаболиты аралии сердцевидной обладают широким спектром биологической активности, действуя на различные мишени и сигнальные пути, что подтверждает фармакологическую ценность сырья.

1.4. Культуры клеток Aralia ssp: получение, культивирование,

химический состав

Богатый опыт использования видов рода Aralia в восточной традиционной медицине сделало их потенциальными объектами для введения в культуру in vitro [35, 49, 78, 108, 113-114, 126].

1.4.1. Работы по in vitro культивированию аралии высокой (Aralia elata

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Некрасова Дарья Алексеевна, 2024 год

ация источник

24

Энт-пимара-8(14),15-диен-19-овая кислота

(континенталова я кислота)

НС

О

Корни

[17, 51, 54, 58]

Н

25

17-гидрокси-энт-каур-15-ен-19-овая кислота

Корни

—^ СНз

[51]

26

Пимара-8(14),15-диен-19-аль

Корни

\\ СНз О

[17]

НС

27

Пимаровая кислота

"ЮН

Корни

О

[17]

з

2

33

18-нор-энт-пимара-8(14),15-диен-4р-ол

Н

НС

Н

ОН

Корни

[51]

18-нор-энт-каур-16-ен-4р-34 ол (4-

эпируилопезиол )

Корни

НС ОН

[17, 51]

7р-гидрокси-энт-пимар-35 8(14),15-диен-19-ол (энт-пимарол)

НС

Корни

/Ч Н

НО СН3

[17]

36

7а-гидрокси-энт-пимара-8(14),15-диен-19-ол

Корни

[51]

2

2

3

2

37

7а-гидрокси-энт

пимара-8(14),15-диен-19-овая кислота

Н

НО

СН,

^ СНз О

Корни

[51, 58]

38

Энт-пимар-15-ен-8а,19-диол

Корни

Н

СНз

[51]

39

16а,17-дигидрокси-энт-кауран-19-овая кислота

Корни

НО СНз

О

[51]

40

16а-метокси,17-гидрокси-энт-кауран-19-овая кислота

Корни

н^°"ЧСНз

О

[51]

Н

2

Энт-пимара-45 8(14),15-диен-18-овая кислота

НО

Д СН3 О

Корни

[17, 58]

Энт-пимара-46 8(14),15-диен-19-ол

Корни

[17, 51,58]

47

Акантол

СН

СН

СН

Корни

[58]

НО—' СН3

48

7-оксо-энт-пимара-8(9),15-диен-19-овая кислота

НС

Корни

[51, 58]

НО—& СН3 ^О

3

3

3

49

Кауренол

Г 1

Н

Корни

НО-

Н

СНз

[58]

50

Энт-каур-15-ен-17-аль-19-овая кислота

Г 1

Н

О

Корни

СНз

О

[58]

51

Грандифлоровая кислота

Г 1

Н

Корни

' н НзС

ОН

[58]

Н

52

Энт-каур-15-ен-17,19-диоат

ОН

// О

Корни

НзС Х^О НО

[58]

2

2

53

Цис-коммунол

НзС

СНз!

О"

СН2

Корни

[58]

54

16-формил-каур-15-ен-19-овая кислота

О

Корни

НО—& СНз О

[98]

55

15,16-дигидроксипима р-8(14)-ен-19-овая кислота

ОН СНз

Корни

но—<\ СНз О

[58]

НС

56

Меланокан Е

Корни

О

[58]

2

з

57

Жиадифеноевая кислота М

НС

Корни

[58]

\ Н НО—Л СН3

^О

3

1.2.3. Тритерпеноиды

Тритерпеновые гликозиды традиционно считаются основной группой действующих веществ сырья аралии. Состав тритерпеновых гликозидов аралии сердцевидной изучен не так подробно, как состав аралии высокой, что может быть связано с ее ограниченным распространением [39, 123] (табл.3.). Таблица 3. Тритерпеноиды и их гликозиды.

№ Название Формула Локализация Литературн ый источник

58 Аралозид А =-"ОН .ОН о Т^ О\ О пт ""ОН ОН СНэТ Т Г^НТ%й'СН3СН3 ОН Н3С^ Н | Н "''ОН \_/ ОН НО ОН Корни [25]

59

Олеаноловая кислота

Н зС СНз

ОН

Н

Н зС СНз

Ветви

[38]

60

28-О-р-О-глюкопирано зиловый эфир олеаноловой кислоты

Ветви

[64]

61

Тараксерол

СНо Н СН

Н

НзС СНз

Ветви

[64]

62

Мирикардио л

НзС СНз

ОН

Н

НзС СНз

Ветви

[64]

63

Удосапонин А

НзС СНз

НО ОН

НО' X "О*"

: н

ОН НзС СНз

Ветви

[55]

НС СН

О

64

Удосапонин

в

НзС СНз

НО

ОН НО' X О' _

О^ „О НзС сН

Ветви

[55]

65

Удосапонин

с

НО' X О ,.

£ / ■-- Н

.а ,.0 НзС СНз

Ветви

[55]

66

Удосапонин D

1НО' X 'О' ,

_ Н

ОН НзС

НО

Ветви

[55]

67

Удосапонин Е

НО' у ОН ОН

Ветви

[55]

Н С СН

68 Удосапонин F Н3С СНз НО X Ч СН^ Т^Г^ 0Н ^,0. .0 Н3С ? I НО ^^ Н0 II Н0 -ОН НО^^^^ '''0Н 0Н Ветви [55]

69 Салсолозид D 0 Уч о Ветви [55]

70 Салсолозид С 5 Д 0 Ветви [55]

1.2.4. Другие группы биологически активных соединений

Помимо терпеноидов, сырье аралии сердцевидной богато стероидами -стигмастерином, даукостерином, ситостерином, 3р,5а-дигидрокси-6р-метоксиэргоста-7,22-диеном, эндопероксидом эргостерина [41, 64, 91, 98].

Среди ароматических соединений для аралии сердцевидной описаны следующие: пеонол, 1-метил-4-(1-метилэтил)бензол, 3-тридецен-1-ин-2,3,4,5,6,7-гексагидро-1Н-инден-2-ол [79, 92], октадегидро-4-метил-6-(1-метилэтил)-3,5-диоксо-4а-(2Н)нафталинкарбальдегид [79].

Корни, ветви и плоды растения содержат антоцианы - 3-О-Р-О-ксилопиранозил-(1^2)-Р-0-галактопиранозид цианидина [56].

Наряду с тем, исследователями определено наличие в ветвях растения аралия-цереброзида [64], докозановой, гексадекановой кислот, а-монопальмитина [98].

В корнях были найдены фалькаринол, 8-ацетат фалькаринола, дегидрофалькаринол, (-)-8-ацетат дегидрофалькаринола,

дегидрофалькариндиол, 8-ацетат дегидрофалькариндиола, относящиеся к полиацетиленовым соединениям [41] и алифатический альдегид н-гексаналь [92].

1.3. Биологическая активность аралии сердцевидной

Корни аралии сердцевидной нашли применение в традиционной китайской медицине для лечения ревматизма, пояснично-крестцовых болей, растяжения связок и прочих травм. Кроме того, препараты на основе сырья использовали для купирования зубной, головной боли и мигрени [50].

Современные исследования показывают, что этанольный экстракт из корней препятствует деградации хрящевой ткани и хондроцитов при остеоартрите, оказывая влияние на активность каспазы-3 [30, 95], (-)-каур-16-ен-19-овая, (-)-пимара-8(14),15-диен-19-овая кислоты демонстрируют обезболивающее и противовоспалительное действие через ингибирование активности №-карраВ и активации луциферазы, либо путем активации №12 [54, 60, 77, 93, 119, 129].

Этанольный экстракт из надземной части растения и олеаноловая кислота оказывают нейропротекторное и обезболивающее действие [37, 38, 129], 7-оксосандаракопимаровая кислота проявляет антиастматическую активность [36]. 16а-гидрокси-17-изовалерилокси-еП-кауран-19-овая кислота ингибирует активность ДНК-топоизомераз I и II [111].

Энт-пимара-8(14),15-диен-19-овая кислота, (-)-каур-16-ен-19-овая кислота, эндопероксид эргостерина, 3р,5а-дигидрокси-6р-метоксиэргоста-7,22-диен, олеаноловая кислота, 16а-гидрокси-еП-кауран-19-овая кислота,

15,16-дигидроксипимар-8(14)-ен-19-овая кислота, 28-O-P-D-

глюкопиранозиловый эфир олеаноловой кислоты, тараксерол, мирикадиол, фалькариндиол, дегидрофалькариндиол, фалькариндиол, 8-ацетат дегидрофалькариндиола, 8-ацетат фалькариндиола и 7а-гидрокси-(-)-пимара-8(14),15-диен-19-овая кислота ингибируют активность циклооксигеназ 1 и 2 [41, 64], (-)-пимар-15-ен-8а,19-диол — активность бутирилхолинэстеразы [51]. 3р,5а-дигидрокси-6р-метоксиэргоста-7,22-диен проявляет цитотоксическую активность в отношении клеток линий L1210, K562 и LLC [64].

Помимо описанной активности, для континенталовой кислоты показано гиполипидемическое, антиатеросклеротическое и вазопротекторное действие [59, 119].

Аралозид А, описанный для аралии сердцевидной, обладает гастропротекторным [45, 63], противовоспалительным, цитотоксическим [73], антигипертензивным [128] и тонизирующим [62] действием.

Изучение адаптогенного потенциала настойки аралии сердцевидной в сравнении с настойкой аралии маньчжурской на моделях in vivo показало сходные результаты, что позволило предположить, что сырье аралии сердцевидной может являться заменой сырья аралии маньчжурской [24]. Наличие адаптогенной активности может также предполагать наличие актопротекторного действия, описанного для сырья аралии маньчжурской

[115].

Проведенные исследования демонстрируют, что вторичные метаболиты аралии сердцевидной обладают широким спектром биологической активности, действуя на различные мишени и сигнальные пути, что подтверждает фармакологическую ценность сырья.

1.4. Культуры клеток Aralia ssp: получение, культивирование,

химический состав

Богатый опыт использования видов рода Aralia в восточной традиционной медицине сделало их потенциальными объектами для введения в культуру in vitro [35, 49, 78, 108, 113-114, 126].

1.4.1. Работы по in vitro культивированию аралии высокой (Aralia elata

Rupr. et Maxim.)

Большая часть исследований по получению культур in vitro посвящена Aralia elata Rupr. - виду, который применяется в традиционной медицине Азии для лечения кашля, опухолей, сахарного диабета, ревматоидного артрита, язвы желудка и других заболеваний [39, 43, 49, 78, 88, 133].

В исследовании, посвященном получению каллусов аралии высокой и последующей регенерации растений, Karim M.Z. с соавт. (2007) использовали черенки и листья интактного растения в качестве первичного экспланта. Экспланты стерилизовали спиртом этиловым 70% и гипохлоритом натрия 3% с добавлением твина-80. Части растения помещали на среду Мурасиге-Скуга (МС) и среду Broad-leaved tree medium (BT) с добавлением и без добавления фитогормонов. Результаты показали, что наибольшее количество каллусов образовалось из черенков на среде МС с добавлением 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) в количестве 5 мг/л. Наиболее интенсивное образование побегов наблюдали из каллусной культуры листа на среде BT без добавления фитогормонов, а наибольшее число корней регенерировалось из каллусов листа на среде BT с добавлением 2 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК) [134].

J.M. Li с соавт. (2001) изучали индукцию соматического эмбриогенеза в каллусных культурах Aralia elata Rupr. et Maxim. Каллус получали из молодых

побегов аралии на среде МС с добавлением 0,5 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП) и 0,5 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (НУК). Затем культуры пересаживали на среду МС, содержащую 2 мг/л 2,4-Д, 0,5 мг/л 6-БАП, 0,5 мг/л НУК и 0,2% активированного угля для индукции соматического эмбриогенеза. В результате эксперимента, ученым удалось получить растения-регенеранты [72].

Dai J.-L. и соавт. (2011) исследовали быстрый способ регенерации аралии маньчжурской с использованием соматического эмбриогенеза. В качестве первичных эксплантов ученые использовали листья, черешки и корневые сегменты. Они культивировали экспланты на протяжении пяти недель на среде Шенка-Хилдебранта с различными концентрациями индолил-3-масляной кислоты (ИМК) для получения эмбриогенного каллуса. Исследователи отметили, что в 100% случаев индукция процесса происходила на среде, содержащей ИМК 2 мг/л, 3 мг/л и 0,3 мг/л. Кроме того, было выявлено наличие вторичного соматического эмбриогенеза и изучены условия, при которых этот процесс наиболее эффективен. В ходе исследования первичные эмбриоиды выращивали на средах с различной концентрацией ИМК, абсцизовой кислоты (АБК) и сахарозы. Установлено, что ИМК активнее влияет на процесс вторичного соматического эмбриогенеза по сравнению с АБК. Пониженная концентрация сахарозы в среде (10-20 г/л) также способствует лучшему росту и развитию эмбриогенных структур [40].

Авторами показано, что использование ауксина 2,4-Д в качестве индуцирующего агента является менее эффективным подходом по сравнению с рассматриваемым, поскольку в первом случае процесс эмбриогенеза занимает больше времени [28, 40].

Yue Sui с соавт. (2022) изучали динамику накопления флавоноидов и олеаноловой кислоты в культуре гормон автотрофных клеток аралии высокой. Исследование демонстрирует, что наилучший рост культуры наблюдается на жидкой среде МС с добавлением 70 г/л сахарозы, а наибольший выход

олеаноловой кислоты отмечали при обработке культур метилжасмонатом в количестве 250 мкмоль/л в течение 6 дней или при добавлении салициловой кислоты в концентрации 25 мг/л в течение 3 дней, что позволило увеличить эффективность выхода олеаноловой кислоты в 1,597 и 3,59 раза по сравнению с контролем. Рекордное количество флавоноидов накапливалось в культурах при их обработке ацетатом натрия в количестве 50 мг/л в течение 14 дней, что в 2,37 раз превышало эффективность накопления целевой группы биологически активных веществ по сравнению с контролем. Оптимальная концентрация обоих прекурсоров в среде была определена в количестве 5 мг/л для ацетата натрия и 25 мг/л для салициловой кислоты, что повышало уровень выхода как флавоноидов, так и олеаноловой кислоты [120].

1.4.2. Изучение культур in vitro аралии сердцевидной (Aralia cordata

Thunb.)

Другим объектом культуральных исследований является Aralia cordata Thunb. [52, 86-87], что связано с широким спектром биологической активности и богатым опытом применения аралии в восточной медицине [39, 44, 127]. В Японии корни аралии сердцевидной (Araliae Cordatae Radix) являются фармакопейным сырьем [136].

Nagashima S. c соавт. (2004) использовали суспензионную культуру аралии сердцевидной в качестве источника фермента антоцианин-3-О-галактозилтрансферазы для последующего изучения его активности. Каллус аралии получали из побегов и листьев на среде Мурасиге-Скуга с добавлением 1 мг/л 2,4-Д, 0,1 мг/л кинетина и 70 мл кокосовой воды. Культуру каллуса на последующем этапе использовали для получения суспензионной культуры, из ДНК которой секвенировали аминокислотную последовательность антоцианин-3-О-галактозилтрансферазы. Ген, ответственный за кодирование исследуемого фермента, переносили с помощью вектора в E.coli, что

позволило подтвердить, что фермент способствует именно 3-О-галактозилированию флавоноидов [85].

Sakamoto K. и соавт. (1993) и Asada Y. и соавт. (1994) исследовали состав антоцианов, накапливаемых каллусными культурами A. cordata. В ходе работы были определены структуры цианидин-3-ксилозилгалактозида и пионидин-3-ксилозилгалактозида. Помимо этого, ученые обнаружили, что воздействие света, высокое содержание сахарозы или низкий уровень нитратов в питательной среде стимулируют процессы метилирования цианидин-3-ксилозилгалактозида, что приводит к увеличению количества пионидин-3-ксилозилгалактозида [29, 107].

Lee K.-S. с соавт. исследовали процесс регенерации аралии сердцевидной из культур клеток. Эмбриогенный каллус получали из молодых соцветий, культивируя первичные экспланты на среде МС с добавлением 6,8 мкмоль/л 2,4-Д. Конгломераты эмбриогенных клеток пересаживали каждые две недели, а затем поддерживали в жидкой среде МС с добавлением 4,5 мкмоль/л 2,4-Д и 3 % сахарозы. Следующим этапом являлась синхронизация соматического эмбриогенеза, которая заключалась во фракционировании эмбрионов на разных стадиях развития с последующим культивированием глобулярных или сердцевидных зародышей на среде с разной концентрацией абсцизовой кислоты для формирования семядольных зародышей. Семядольные зародыши пересаживали в чашки Петри с агаризованной средой МС без фитогормонов. Было показано, что наибольший выход (60,7 %) растений-регенерантов наблюдался при «созревании» сердцевидных зародышей на среде с концентрацией абсцизовой кислоты 3,8 мкмоль/л [6570].

1.4.3. Использование клеточных технологий для введения в культуру

других видов рода Aralia

Xiao-Xia Y.A.N.G с соавт. (2005) изучали условия индукции каллусогенеза, увеличения биомассы и ризогенеза в каллусных культурах Aralia thomsnii. Образование каллуса наблюдали на среде МС с добавлением 0,18 мг/л 6-БАП и 0,4 мг/л ИМК, активное увеличение массы клеток отмечали на среде МС с концентрацией 6-БАП 1,2 мг/л и ИМК 0,5 мг/л, образование многочисленных корней фиксировали на среде 1/2МС + 3 мг/л ИМК [125].

Yang L.X с соавт. (2011) исследовали условия получения каллуса аралии материковой (Aralia continentalis Kitag.) и возможность регенерации полноценного растения с использованием клеточных технологий. В качестве первичного экспланта использовали пазушные почки интактного растения. Было установлено, что оптимальной для индукции каллуса является среда Мурасиге-Скуга, содержащей 1,5 мг/л 6-БАП и 1,0 мг/л 2,4-Д, выход каллусных культур при данных условиях составил 100%. Образование адвентивных побегов наблюдалось на среде МС с концентрацией 2,0 мг/л 6-БАП и 0,2 мг/л НУК, эффективность дифференциации при описываемых условиях достигала 90%. Наилучшие показатели по корнеобразованию показали образцы, культивируемые на среде 1/2 МС с добавлением 0,02 мг/л НУК или 0,5 мг/л ИМК, укореняемость аралии составила 100% [7, 130].

Растения рода Aralia представляют большой интерес в качестве объектов для получения культур клеток и тканей, что связано со сравнительно небольшим опытом введения представителей рода в культуру in vitro [35]. Кроме того, на сегодняшний день не имеется достаточного количества информации о накоплении в культурах аралий основного класса биологически активных веществ - тритерпеновых гликозидов, что также открывает большие возможности для дальнейших исследований.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы исследования

В качестве объектов исследования использовали:

1. Части листа интактного растения аралии сердцевидной (Aralia cordata Thunb.), культивируемого на территории Ботанического института имени В.Л. Комарова Российской академии наук (БИН РАН) для изучения процесса каллусообразования и подбора условий для увеличения биомассы каллуса. Сбор листьев осуществляли в июне 2022 года;

2. Каллусную культуру аралии сердцевидной, полученную из листьев интактного растения, для последующего изучения ростовых характеристик и особенностей накопления вторичных метаболитов. Культура была получена в июле 2022 года в Лаборатории культур растительных клеток Санкт-Петербургского государственного химико-фармацевтического университета;

2.2. Методы получения и условия культивирования каллусной культуры 2.2.1 Получение каллусной культуры и выбор оптимальной среды для

культивирования

Первичными эксплантами для получения каллусной культуры являлись части листа аралии сердцевидной, произрастающей на территории Ботанического института имени В.Л. Комарова Российской академии наук (БИН РАН). Подтверждение видовой принадлежности образца осуществлялось к.б.н., старшим научным сотрудником БИН РАН, научным куратором коллекций полезных растений и растений Северо-запада России И. А. Паутовой.

Части листа аралии сердцевидной предварительно обрабатывали спиртом этиловым 70% (ООО «РОСБИО», Россия) в течение 30 секунд и стерилизовали с использованием двух режимов (табл. 4): выдерживали в течение 15 минут в 3,5% растворе «Белизны» (ООО «Еврохим трейдинг Рус»,

Россия) или 5 минут в 2 % растворе бензалкония хлорида (ООО «Витареактив», Россия) с добавлением Твин-80 (АО «Ленреактив»), затем трехкратно отмывали в стерильной воде очищенной с интервалами в 15 минут, и помещали на питательную среду Мурасиге-Скуга [83] с добавлением 0,5 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л кинетина (табл. 5). Образование первичного каллуса наблюдали спустя 14 дней культивирования [8, 9].

Таблица 4. Характеристика режимов стерилизации.

Стерилизат ор Время стерилизаци и, мин Количество контаминированн ых образцов, % Выживаемо сть, % Индукция каллусогенеза *, %

3,5 % «Белизна» 15 90 10 100

2% Бензалкони я хлорид + 0,1 % Твин-80 5 0 50 100

*Процент индукции каллусообразования рассчитывали от количества выживших эксплантов.

С целью подбора питательной среды для длительного пассивирования культур, через 60 дней культивирования (2 пассажа) первичные каллусы пересаживали на питательные среды различного состава (табл. 5), которые были выбраны на основе анализа литературных источников [29, 80, 103].

Для изготовления сред использовали следующие реактивы: калий азотнокислый (АО «ВЕКТОН», Россия), аммоний азотнокислый (АО «ВЕКТОН», Россия), аммоний сернокислый (АО «ЛенРеактив», Россия), калий фосфорнокислый 1-замещенный (АО «ВЕКТОН», Россия), магний

сернокислый, 7-водный (АО «ВЕКТОН», Россия), кальций хлористый, 2-водный (АО «ВЕКТОН», Россия), кальций азотнокислый, 4-водный (АО «ВЕКТОН»), натрий молибденовокислый, 2-водный (АО «ВЕКТОН», Россия), медь сернокислая(П), 5-водная (АО «ВЕКТОН», Россия), борная кислота (АО «ВЕКТОН», Россия), марганец сернокислый(П), 5-водный (АО «ВЕКТОН», Россия), цинк сернокислый, 7-водный (АО «ВЕКТОН», Россия), калий сернокислый (АО «ВЕКТОН», Россия), калий йодистый (АО «ВЕКТОН», Россия), кобальт хлористый без никеля(П), 6-водный (АО «ВЕКТОН», Россия), железо сернокислое(П), безводное (АО «ВЕКТОН», Россия), трилон Б (АО «ВЕКТОН», Россия), тиамин гидрохлорид (Merck KGaA, Германия), пиридоксин (Merck KGaA, Германия), никотиновая кислота (АО «ВЕКТОН», Россия), аминоуксусная кислота (АО «ВЕКТОН», Россия), мезо-Инозит (Merck KGaA, Германия), сахароза (АО «ВЕКТОН», Россия), агар-агар (ГОСТ 17206-96, ООО «Научно-исследовательский центр фармакотерапии», Россия), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) (Merck KGaA, Германия), кинетин (Merck KGaA, Германия), а-нафтилуксусная кислота (НУК) (Shijiazhuang Lemandou Chemicals Co., Ltd., Китай), 6-бензиламинопурин (6-БАП) (Duchefa Biochemie, Нидерланды), калия сульфат (АО «ЛенРеактив», Россия), калия нитрат (АО «ЛенРеактив», Россия).

Таблица 5. Составы питательных сред, используемых для культивирования каллусных культур аралии сердцевидной.

Broad WPM

leaf tree LS

MS (Lloyd,

basal (Linsmaier,

Компоненты (Murashige, Skoog, 1962) (Chalupa, McCown, Skoog,

среды [83] 1980)

1981) 1965) [74]

[76]

[34]

Концентрация вещества, мг/л

Аммония нитрат 1650 1650 1650 1650 82,5 400 1650

Аммония сульфат - - - - 120 - -

Борная кислота 6,2 6,2 6,2 6,2 1,55 6,2 6,2

Кальция хлорид 332,2 332,2 332,2 332,2 16,6 72,5 332,2

Кальция нитрат - - - - 222 386 -

Кобальта хлорид 0,025 0,025 0,025 0,025 0,005 - 0,025

Меди сульфат 0,025 0,025 0,025 0,025 0,063 0,025 0,025

ЭДТА 37,3 37,3 37,3 37,3 9,325 37,3 37,3

Железа сульфат 27,8 27,8 27,8 27,8 6,95 27,8 27,8

Магния сульфат 180,7 180,7 180,7 180,7 90 180,7 180,7

Марганца сульфат 16,9 16,9 16,9 16,9 4,225 22,3 16,9

Натрия молибдат 0,25 0,25 0,25 0,25 0,063 0,213 0,213

Калия иодид 0,83 0,83 0,83 0,83 0,038 - 0,83

Калия дигидрофосфат 170 170 170 170 85 170 170

Калия нитрат 1900 1900 1900 1900 95 - 1900

Калия сульфат - - - - 430 990 -

Цинка сульфат 8,6 8,6 8,6 8,6 2,15 8,6 -

Мио-инозитол 0,5 0,5 0,5 0,5 50 100 100

Тиамин (В1) 0,1 0,1 0,1 0,1 50 1 0,4

Пиридоксин (Be) 0,1 0,1 0,1 0,1 - 0,5

Никотиновая кислота (PP) 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5 0,5

Гидролизат казеина 0,5 0,5 0,5 0,5 - - 0,5

Сахароза 30000 30000 30000 30000 30000 20000 20000

2,4-Д 0,5 1 - 2 - 2 1

Кинетин 0,5 - 1 1 0,5 1 0,25

НУК - 0,5 6 - - - -

6-БАП - - - - 0,5 - -

Глицин - - - - - 2 -

Культивирование каллусов осуществляли в темноте при 25 ±1 оС в прозрачных колбах объемом 200 мл на питательной среде объемом 50 мл. Цикл выращивания каллусных культур составлял 21 день.

Визуализация процесса получения каллусной культуры аралии сердцевидной представлена на рис. 2.

А Б В Г

Рисунок 2. Визуализация введения аралии сердцевидной в культуру in vitro А - интактное растение аралии сердцевидной; Б - индукция каллусогенеза; В - каллусы аралии сердцевидной на разных питательных средах, 3-й пассаж; Г - Каллусы аралии сердцевидной на среде Линсмайера-Скуга, 6-й пассаж.

Стерилизацию посуды и расходных материалов осуществляли в сухожаровом шкафу при температуре 180 оС в течение двух часов. Питательные среды стерилизовали автоклавированием при температуре 121 оС, 1 атм., в течение часа.

Дальнейшие исследования проводили с каллусными культурами, поддерживаемыми на питательной среде Линсмайера-Скуга, поскольку она обеспечивала непрерывный прирост биомассы без участков некротизации и гипергидрации [8, 9].

2.2.2. Модификация питательной среды Линсмайера-Скуга

Часть каллусов, культивируемых на среде Линсмайера-Скуга в течение 5 пассажей, переносили на модифицированные питательные среды, содержащие оливковое масло, сквалан, амарантовое масло и кокосовую воду (табл. 6).

Таблица 6. Модификация питательных сред.

Питательная среда Используемая добавка Концентрация

ЛС + 0,25 мг/л кин + 1 мг/л 2,4-Д Сквалан 1 г/л

Амарантовое масло 1 г/л

Оливковое масло 1 г/л

Кокосовая вода 60 мл/л

Подбор липофильных компонентов осуществляли в зависимости от содержания сквалена - структурного предшественника аралозидов [3, 13, 90, 109]. Амарантовое, оливковое масло - рекордсмены по содержанию данного соединения, сквалан - его гидрированная форма. Кокосовая вода является распространенным регулятором роста для культур растительных клеток,

однако ее влияние на количественное содержание целевой группы БАВ ранее не изучалось [27, 53, 101].

2.3. Методы определения ростовых характеристик каллусной культуры

аралии сердцевидной

Ростовые характеристики каллусной культуры аралии сердцевидной оценивали на 7, 14 и 21 день культивирования путём отбора и взвешивания сырой биомассы в течение трех пассажей.

Кривые роста для каллусной культуры, выращиваемой на средах Линсмайера-Скуга с добавками и без них, строили с использованием языка программирования R v4.1.2 [104] и пакета Growthcurver [118]. Аналитические характеристики культур - удельная скорость роста и время удвоения биомассы - высчитывались автоматически на основании линейной регрессионной модели.

Индекс роста культуры I высчитывали по формуле (1):

т Хтах I = —— , где Хо

Хтах и Х0 - это максимальное и начальное значение сухой или сырой биомассы.

Экономический коэффициент Y высчитывали по формуле (2):

У = -, где

X - количество образовавшейся сухой биомассы, а S - количество потребленного субстрата (сахарозы), количество которого составляло 20 г на 1 литр среды.

2.4. Методы определения морфологических характеристик и жизнеспособности каллусов 2.4.1. Определение макроскопических признаков полученных каллусов

Макроскопические признаки каллусных культур определяли визуально в течение нескольких пассажей, фиксируя цвет, особенности структуры, наличие морфогенности.

2.4.2. Изучение микроскопических признаков каллусных культур и определение их жизнеспособности

Для определения микроскопических признаков - количества паренхимных, прозенхимных клеток, наличия хлоропластов и др. морфологических особенностей, использовали цифровой микроскоп Bresser LCD 50x-2000x (Германия). Микроскопию клеток проводили с применением техники «давленый» препарат при увеличении 200 и 400 [100].

Жизнеспособность каллусной культуры определяли путем окрашивания препаратов витальными красителями - нейтральным красным для определения живых клеток и Эвансом синим для определения нежизнеспособных клеток с дальнейшим подсчетом числа окрашенных клеток на каждые 400 клеток препарата [2].

2.5. Методы фитохимического анализа каллусных культур аралии

сердцевидной

2.5.1. Предварительный фитохимический анализ состава каллусных

культур

Для определения химической группы тритерпеновых гликозидов 1,0 г высушенной и измельченной каллусной культуры помещали в колбу на 50 мл, заливали 10 мл воды и нагревали на кипящей водяной бане в течение 15 минут. Полученную водную вытяжку фильтровали с использованием фильтра «Красная лента» и разливали в две пробирки. В одну добавляли 5 мл кислоты

хлористоводородной (0,1 моль/л), в другую - 5 мл раствора натрия гидроксида (0,1 моль/л), энергично встряхивали и определяли высоту столбов пены.

Для дальнейшего качественного анализа использовали спиртовую вытяжку, которую получали следующим образом:

1,0 г высушенного каллуса помещали в колбу 50 мл, заливали 10 мл 70% спирта, настаивали при медленном кипении в течение 10 минут, охлаждали, фильтровали через складчатый фильтр «Красная лента» и проводили качественные реакции:

1. Реакцию Либермана-Бурхарда для обнаружения тритерпеновых гликозидов. В выпарительную чашку добавляли 10 капель спиртовой вытяжки и упаривали до сухого остатка. К сухому остатку прибавляли 5 капель уксусного ангидрида и 1 каплю серной кислоты концентрированной;

2. Реакцию для обнаружения флавоноидов. К 1 мл фильтрата добавляли 5 капель 5 % спиртового раствора А1С13.

3. Реакцию на флавоноиды и дубильные вещества. К 1 мл спиртовой вытяжки добавляли 3 капли 1% раствора хлорида железа (III);