Получение и доклинические испытания дифференцированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при остеоартрозе у животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Саттари Фард Ханиех Хассан

• Саттари Фард Ханиех Хассан
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Саттари Фард Ханиех Хассан

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

1 Обзор литературы

1.1 Ауто-, алло- и ксенотрансплантаты

1.2 Тканевая инженерия и скаффолды

1.3 Клеточная терапия и стволовые клетки

1.4 Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (морфология и общие свойства)

1.4.1 Иммунофенотип ММСК костного мозга

1.4.2 Иммунологические свойства ММСК костного мозга

1.4.3 Дифференцированные потенциалы ММСК костного мозга

1.5 Остеоартроз

1.6 Животные модели и методы индуцирования ОА в них

1.7 Лечение заболевания суставов с помощью клеточной терапии

1.8 Заключение

2 Материалы и методы исследований

2.1 Материалы исследования

2.1.1 Реактивы

2.1.2 Расходные материалы и оборудование

2.2 Методы исследования

2.2.1 Получение ММСК из костного мозга мышей и их характеристика

2.2.2 Получение ММСК из костного мозга овцы и их характеристика

2.2.3 Анализ иммунофенотипа ММСК костного мозга

2.2.4 Анализ дифференцированного потенциала ММСК костного мозга (хондрогенная дифференцировка)

2.2.5 Индуцирование ОА путем внутрисуставного введения трипсина в запястный сустав овец

2.2.6 Индуцирование ОА путем внутрисуставного введения в коленный сустав мышей

2.2.7 Получение гидрогеля из фибрина и его характеристика в лаборатории

2.2.8 Трансплантация гидрогеля с ММСК в сустав животных

2.2.9 Изучение влияния трансплантатов на организм животных

2.2.10 Статистическая обработка данных

3 Результаты исследований

3.1 Характеристика ММСК костного мозга

3.2 Определение времени цитогенерации популяции ММСК костного мозга

3.3 Анализ экспрессии поверхностных маркеров полученной популяции

ММСК костного мозга

3.4 Дифференцировка ММСК костного мозга

3.5 Приготовление гидрогеля (скаффолд) из фибрина в лаборатории

3.6 Индуцирование остеоартроза путем внутрисуставного введения трипсина у мышей

3.7 Индуцирование остеоартроза путем внутрисуставного введения у овец

3.8 Влияние фибринового гидрогеля с ММСК на организм животных

4 Обсуждение

5 Выводы

6 Практическое использование результатов исследований

7 Рекомендации по использованию научных выводов

8 Список использованной литературы

Приложения

Список сокращений

АТ - антитела

ММСК - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки

МСК - мезенхимные стромальные клетки

КМ - костный мозг

ФБС - фосфатно-солевой буфер

ДК - дендритные клетки

ЫК-клетки - клетки-естественные киллеры

СО - кластер дифференцировки

СБ 31 - молекула межклеточной адгезии тромбоцитов и эндотелия-1

СО 44 - трансмембранный рецептор для гиалуроновой кислоты

СБ 45 - общий АГ лейкоцитов

СБ 105 - эндоглин, гомодимерный гликопротеин

ГАФДГ - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

КОЕ-Ф - колониеобразующая единица фибробластов

Кол II - коллаген типа II

Кол X - коллаген типа X

АГГ- аггрекан

БСА - бычий сывороточный альбумин ПНР - полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР - ПЦР с применением стадии обратной транскрипции

АГГ- аггрекан

ФИО - фактор некроза опухали

ОА - остеоартроз

ГИМ - гемопоэз, индуцирующий микроокружение РТПХ - реакция "трансплантат против хозяина" ТСР]3 - трансформирующий фактор роста бета РВБ - сыворотка плодов коров 1Ь - интерлейкин

BDNF - brain-derived neurotrophic factor

МНС - молекулы главного комплекса гистосоместимости

DMEM-HG - среда Игла в модификации Дульбекко с высоким содержанием

глюкозы

DMEM-LG - среда Игла в модификации Дульбекко с низким содержанием глюкозы

DMSO - диметилсульфоксид

ММР - матриксная металлопротеиназа

MAP- киназ _ митоген-активируемая протеинкиназа

CFC-F - colony-forming unit fibroblast

EGFR - рецептор эндотелиального фактора роста

ICAM - молекула межклеточной адгезии

РЕСАМ - молекула адгезии тромбоцитов (эндотелиальной клетки)

IFNy — интерферон гамма

TNF - фактор некроза опухоли

PDGF - фактор роста тромбоцитов

LFA - лимфоцитарный функционал

ALCAM - молекула адгезии активированных лейкоцитов

Sca-1 - антиген стволовых клеток-1

HLA - человеческий лейкоцитарный антиген

HGF - фактор роста гепатоцитов

PGF-2 - простагландин F-2

IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста-1

SSEA - эмбриональный антиген специфичной стадии

ГСК - гемопоэтические стволовые клетки

FGF - фактор роста фибробластов

EGF - фактор рост эндотелия

OLA - система лейкоцитарных антигенов овец

FITC - флуоресцеинизотиоцианат

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и доклинические испытания дифференцированных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при остеоартрозе у животных»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Развитие иммунологии и клеточной биологии за последние годы позволяет разработать новые подходы в лечении различных заболеваний и дефектов тканей и органов организма человека и животных. Особую перспективу в биомедицине приобрели методы лечения и замещения крупных повреждений тканей стволовыми клетками, характеризующиеся способностью к высокой пролиферативной активности.

В настоящее время, в ведущих научно-исследовательских институтах различных стран мира изучается множество аспектов проблемы, связанной с исследованием физиологии и особенностей локализации стволовых клеток человека и животных. В научном понимании, стволовые клетки являются особой популяцией не дифференцированных клеток способных к дифферен-цировке в различные виды тканей.

В 60-х годах хх века удалось выделить клетки-предшественники костной ткани, обладающие способностью самообновления и дифферен-цировки в хондрогенные, остеогенные и адипогенные типы клеток. При этом исходным материалом служили клетки костного мозга мыши (Фриденштейн А.Я. и др., 1968). В настоящее время ведутся успешные попытки использования данного типа клеток для получения всех перечисленных типов тканей с использованием биодеградируемых носителей.

Потенции к регенерации тканей мезенхимного происхождения и доступность ММСК позволили ученым рассматривать этот материал как наиболее перспективным в регенерационной и заместительной терапии, что является актуальной задачей в клеточной терапии.

В течение последних десятилетий активно разрабатываются методы клеточной терапии, в частности трансплантации стволовых клеток, в том числе мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, с целью замещения в организме поврежденных клеток и тканевых структур. Это было вызвано

расширением знаний в относительно молодом разделе клеточной биологии -биологии стволовых клеток.

Остеоартроз является гетерогенной группой заболеваний суставов различной этиологии со сходными биологическими, морфологическими и клиническими признаками. ОА характеризуется дегенерацией суставного хряща и структурными изменениями субхондральной кости, а также явно или скрыто протекающим умеренно выраженным синовитом. ОА одно из распространенных заболеваний у людей старше 45 лет, проживающих в северных регионах, и у человека и животных, подвергающихся физическим нагрузкам опорно-двигательного аппарата на фоне нарушений обмена веществ.

Важной составляющей тканевой инженерии является матрикс, с помощью которого осуществляется доставка клеток в область дефекта и их пролиферация в месте патологического поражения. В качестве матрикса для мягких тканей использутся гидрогели различного происхождения, характеризующиеся инъектабельностыо и высокой эффективностью загрузки ММСК.

Цели и задачи исследований. Целью исследований является создание скаффолда с мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками (ММСК) на основе фибринового гидрогеля, изучение его влияния при внутрисуставном введении животным и оценка терапевтического эффекта при остеоартрозе (ОА).

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получение и оптимизация среды культивирования клеток мезенхи-мального происхождения костного мозга (КМ) овец и мышей.

2. Определение морфологических характеристик, митогенной активности и фенотипа мультипотентных мезенхимальных стромальных

клеток костного мозга клеточных культур и длительности пассирования in vitro.

3. Цитодифференцировки ММСК КМ в клетки хондрогенной линий in

vitro.

4. Усовершенствование метода получения гидрогеля in vitro для создания скаффолдов с ММСК и их внутрисуставной трансплантации при OA.

5. Экспериментальное воспроизведение OA у лабораторных и продуктивных животных.

6. Изучение терапевтической эффективности скаффолдов с дифференцированными ММСК костного мозга при OA запястного и коленного суставов у животных.

Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов выделения ММСК из костного мозга овцы и мыши, охарактеризованы морфологические и иммунобиологические свойства мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК), установлена оптимальная концентрация FBS при направленной пролифераций ММСК костного мозга в хондроциты и разработан способ получения фибринового гидрогеля для создания скаффолдов с ММСК.

Впервые разработан метод индуцирования остеоартроза запястного и коленного суставов овец и мышей путем внутрисуставного введения трипсина и способ лечения OA с использованием скаффолдов с ММСК.

Практическая значимость работы. Разработанный метод получения гидрогеля из фибрина плазмы крови для трансплантации ММСК представляет практический интерес для биомедицины, биотехнологии и ветеринарии, поскольку позволяет получить эффективный натуральный носитель (скаффолд) хрящевой ткани при относительно низкой стоимости его приготовления.

Метод выделения и наращивания ММСК мышей применяется на кафедре иммунологии, а способ трансплантации гидрогеля используется на кафедре хирургии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и в учебном процессе.

Личный вклад аспирантки. Автором непосредственно выполнены исследования по получению и культивированию ММСК костного мозга, создании скаффолдов для проведения экспериментальных испытаний при ОА у животных. Проведен анализ, сделаны выводы и даны рекомендации по дальнейшему применению разработанной технологии в биомедицине. В работе использованы материалы, полученные в соавторстве с заведующим кафедрой иммунологии член-корр. РАСХН Девришовым Д.А.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы обсуждались на заседаниях кафедры иммунологии и ученого совета ФГБОУ ВПО МГАВМиБ [Москва, 2010-2013].

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 6 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практического использования полученных научных результатов, рекомендаций по использованию научных выводов, списка использованной литературы (198 источников, из которых 23 отечественных и 175 иностранных). Материал изложен на 124 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц, 23 рисунка и 2 страницы приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Метод выделения ММСК костного мозга овец и мышей и их культурально-морфологическая характеристика и фенотип.

2. Индуцирование остеоартроза в коленных и запястных суставах лабораторных животных путем внутрисуставного введения трипсина.

3. Метод приготовления фибринового гидрогеля и иммобилизация скаффолдов ММСК КМ.

4. Доклинические испытания скаффолдов ММСК при ОА овец и мышей.

1 Обзор литературы 1.1 Ауто-, алло- и ксенотрансплантаты

На сегодняшний день уровень науки и техники позволяет предложить несколько альтернативных путей восстановления или замены поврежденных патологией тканей и органов, в том числе трансплантацию. Каждый из потенциально возможных вариантов имеет как позитивные, так и негативные моменты.

Трансплантаты, которые можно использовать для помещения в организм (трансплантации), могут быть представлены живыми тканями, клетками, органами. Аутотрансплантация - это пересадка биологического материала внутри одного организма. Аллотрансплантация (или гомотрансплантация) - это пересадка клеток, органа или ткани от одного организма (донора) другому организму (реципиенту). Пересадка биологического материала человеку от животных (другого биологического вида) - это ксенотрансплантация.

Использование аутогенных трансплантатов (аутотрансплантатов) -биологического материала, взятого из организма пациента и предназначенного для имплантирования ему же, принято считать «золотым стандартом». Несмотря на очевидные преимущества, аутотрансплантаты обладают рядом недостатков. Нельзя не отметить, однако, что количество «собственного» материала для пересадки ограничено, и его получение связано с необходимостью хирургического вмешательства.

Количество аллотрансплантатов (или гомотрансплантатов), то есть биологического материала, взятого от другого человека, также лимитировано из-за ограниченной доступности, высокой стоимости и необходимости приема иммуносупрессоров в течение всей жизни пациента.

Ксенотрансплантаты (биологический материал, взятый от других видов) требуют генетических или химических модификаций для исключения иммунного отторжения.Органы и клетки животных (свиней, крупного рогатого скота и других млекопитающих) могут рассматриваться в качестве донорских органов и источников терапевтических клеток. Эта концепция получила название ксенотрансплантации. Главным препятствием на пути проведения ксенотрансплантаций является защитная реакция иммунной системы - гипер острое отторжение. Наиболее перспективным подходом к преодолению такого типа отторжения являются различные варианты генетической модификации.

В настоящее время широкое применение нашли синтетические скаффолды для восстановления ткани. Они сочетают в себе все положительные свойства натуральных скаффолдов, но при этом обладают рядом преимуществ. Так, например, в отличие от аутологичных трансплантатов они могут быть получены в необходимом количестве и изготовлены определенного размера и формы, которые требуются в каждом конкретном случае. При использовании трансплантатов из синтетических материалов отсутствует риск передачи болезней и инфекций, как, например, в случае аллогенных и ксеногенных материалов. Кроме того, изменяя некоторые параметры синтетических скаффолдов, можно контролировать не только их механические характеристики, но и скорость резорбции. Данное свойство является важным условием эффективного заживления дефекта.

1.2 Тканевая инженерия и скаффолды

Тканевая инженерия развилась с целью более эффективного восстановления поврежденных органов и тканей. Суть тканевой инженерии в данном случае заключается в созданий скаффолдов, которые имеют соответствующие физические, химические и механические свойства и были

способными формировать клетки и ткани. Хороший скаффолд тот, при созданий которого учитываются биологические его способности.

Хотя существуют многочисленные методы создания скаффолдов, но большинство из них не учитывают биологические свойства скаффолда и, следовательно, имеют ограниченную эффективность. Одной из главных проблем при созданий таких устройств, независимо от типа ткани, является их способность к образованию трехмерной регенераций тканей (Karp J.M. et al., 2003; Sachlos Е. et al., 2003).

Преимущество тканевой инженерии по сравнению с традиционным лечением, основанным на трансплантации тканей и органов и биоматериальной имплантации, в том, что она действует более эффективно. Тканевая инженерия имеет тот потенциал, чтобы произвести иммунологическую толерантность искусственных органов и тканей, которые могут расти в организме пациента. Одной из задач тканевой инженерии является выращивание соответствующих клеток in vitro в виде 3D внутри органа или ткани. Требования к производству скаффолдов :

1) скаффолд должен обладать достаточным количеством пор соответствую-щего диаметра, через которые осуществляется интеграция и васкуляризация ткани; 2) скаффолд должен быть изготовленным из биологического матер-иала так, чтобы ткань в конечном итоге заменила скаффолд полностью; 3) скаффолд должен иметь на своей поверхности химические вещества, позволяющие адгезию, дифференцировку и пролиферацию клеток; 4) не вызывать нежелательных реакций и 5) можно было его легко изготовить в различных формах и размерах (Chung H.J. et al., 2007).

Биодеградаци полимерные скаффолды для тканевой инженерии являются важными элементами, так как они обеспечивают временную и пространственную среду для роста клеток и растущих тканей. Многие

методы обработки были разработаны для изготовления природных и синтетических полимерных скаффолд. В последнее время 3-D матриксы на основе различных структур или минимально инвазивных хирургических методов привлекли на себя внимание как потенциальные методы тканевой инженерии следующего поколения.

Нановолоконные матриксы, полученные электропрядением или самосборкой, имеют большое сходство с физиологической средой. Инъекционые матриксы, такие как гидрогели и микросферы, которые широко используются в качестве препаратов, освобождающих белок, также применя-ются в тканевой инженерии как в качестве носителя клеток, так и поддерживающего матриксы (Park Н. et al., 2013; Slaughter B.V. et al., 2009).

Гидрогели - это нерастворимые, разбухающие в воде сетчатые структуры, имеющие возможные области применения для реконструкции мягких тканей и органов, а также пригодные для доставки лекарственных систем и матриксов для тканевой инженерии. Ранние исследования на гидрогеле в качестве скаффолдов тканевой инженерий включали естественно-полученные материалы, такие как альгинат, фибрин, и желатин. В последнее время широко используются физические гидрогели на основе синтетических полимеров, имеющ их температурную зависимость от фазы золь-гель. Помимо критических концентраций эти гидрогели обладают состоянием золя при комнатной температуре, но могут превратиться в состояние геля при температуре тела.

Свойства гидрогелей (набухание, механические свойства, разрушаемость) важны для определения области их применения. Гидрогели обладают многочисленными желаемыми качествами, включая высокое содержание тканевой жидкости и способность изменить свою форму, которые являются нужными для клинического использования. Распространенным способом контролирования механических свойств

гидрогелей является изменение плотности сшивания полимера. Механика гидрогеля зависит от условий полимеризации при формировании сети. Так, большое количество растворителя во время полимеризации может привести к большей циклизации в формирующейся сети геля; изменения рН, температуры или интенсивности света в ходе реакции гелеобразования также существенно влияют на свойства гидрогелей (Б^^Ме В.У. ег а!., 2009).

(А)

3-D Porous Matrix

(В)

* v. Г -

1 iV'Y РЙйШШШ

I > С _ ■ ^ г- , . 4 > У **

^ вши "1

Nanofibcr mesh

Рисунок 1. Различные формы полимерных строительных скаффолдов для тканевой инженерии (Chung H. J. et al., 2007)

Разрушение (распад) гидрогелей происходит в результате различных процессов: в присутствии фермента, разрезающего главную цепь гидрогеля; в результате гидролитического распада (в присутствии воды). Способность контролировать распад гидрогеля является важной для применения, поскольку распад контролирует такие свойства, как размер ячейки гидрогеля, что важно для транспорта захваченных молекул и диффузии внеклеточных компонентов матрицы. Также инъектабельность и гидрофилыюсть гидрогелей делают его весьма подходящей для тканевой инженерии хряща. Гидрогели, а в частности локальные инъекционные системы, представляют большой интерес для ускорения регенеративных процессов в хрящевой ткани (Sharma Ch. et al., 2011; Zhu J., 2012; Hong Y. et al., 2007).

Hydrogel

(D)

Microsphere

Таблица 1. Варианты использования гидрогеля в тканевой инженерии

Орган Тип клеток Тип гидрогеля Функция гидрогеля

Хрящ Хондроциты Фибрин, Альгинат, Доставка клетки, инкапсуляция, скаффолд

Хрящ Хондроциты и ММСК PEG Инкапсуляция, Доставка лекарственных средств

Кость Остеобласты PEG-PL А Доставка лекарственных средств, инкапсуляция, имплантат

Сердечнососудистая Клетки костного мозга Фибрин Доставка клетки, скаффолд

Кожа - Фибрин, коллаген, гиалуроновая кислота Клей, доставка лекарственных средств, барьер

Кожа Фибробласты Гиалуроновая кислота Скаффолд

Васкулярная - Альгинат, гиалуроновая кислота, PEG, желатин Доставка лекарственных средств, барьер, скаффолд

Соед ин ител ь ная Фибробласты Гиалуроновая кислота Инкапсуляция, скаффолд

Нервная Астроглиапьные клетки Коллаген Инкапсуляция

Известно множество типов гидрогелей, полученных как из природных, так и синтетических материалов. Наибольшее распространение для формирования гелей получили фибрин, коллаген, гиалуроновая кислота (таб. 1). Коллаген обычно сшивается с помощью глутарового альдегида, карбодиимида, фотоокисления. Так же как коллаген, гиалуроновая кислота модифицируется химически этерификацией, в результате которой

уменьшается растворимость в воде и замедляется распад геля. Гидрогели гиалуроновой кислоты пригодны для получения микросфер, губок и волокон.

Гидрогели, которые на сегодняшний день чаше всего используются для лечения суставной патологии и регенерации хрящевой ткани, это фибрин, PEG, альгинат, коллаген, гиалуроновая кислота, SAP и пр. Фибрин используют в качестве клеящих составов и герметикой в виде пены, листов, частиц и клея. Альгинат (природный полисахарид, состоящий из а-Д маннуроновой кислоты и B-L-гулуроновой кислоты) образует гели в присутствии двухвалентных катионов (типа Са2+, Mg2+) в результате сшивания карбоксилатных групп гулуронатных групп на главной цепи полимера. Альгинатные гели широко используются в качестве перевязочного материала (Slaughter B.V. et al., 2009; Zhao H. et al., 2008).

Фибрин является естественным материалом, который в последние годы стал широко использоваться в качестве транспортного средства клеток и инъекционных скаффолдов. Основным преимуществом фибриновых гелей является то, что фибриноген может быть получен аутогенным путем из плазмы и тем самым уменьшать риск реакции на инородное тело. Кроме того, фибрин используется в сочетании с другими гелями, такими как НА гели. При этом целью является доставка хондроцитов в травмируемый коленный сустав как модель.

1.3 Клеточная терапия и стволовые клетки

Стволовые клетки и клеточная терапия - одна из самых популярных тем последних лет. В течение последних десятилетий активно разрабатываются методы клеточной терапии, в частности трансплантации стволовых клеток, в том числе мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, с целью замещения в организме поврежденных клеток и тканевых структур и восстановления функций различных органов. Это было вызвано

расширением знаний в относительно молодом разделе клеточной биологии -биологии стволовых клеток (Кругляков П.В. и др., 2008; Яргин C.B., 2010; Мао J.J., 2005).

Одним из наиболее перспективных подходов в лечении является применение методов относительно новой отрасли медицины - регенера-ционной, с использованием клеточных технологий. Во взрослом организме, где процессы восстановительной регенерации органов уже не могут быть активизированы естественным путем за счет спонтанной миграции регионарных стволовых и прогениторных клеток, возникает потребность в осуществлении искусственной доставки таких клеток в поврежденный орган. Реализация программы связана с решением ряда проблем, среди которых важнейшей является выбор источника получения стволовых клеток.

Стволовые клетки были выделены как из эмбриональных, так и различных постнатальных тканей (Кирик М.В., 2010). Однако наличие этических проблем, связанных с использованием эмбрионального донорского материала, потребовало расширенного изучения свойств постнатальных стволовых и прогениторных клеток, лишенных этого недостатка. Среди последних наиболее перспективными, с позиций применения для клеточной терапии, считаются мезенхимальные стволовые клетки (ММСК) костного мозга.

Идентификация и исследование свойств линий стволовых клеток человека и животных (Blaber S. et al., 2011) являются важнейшими задачами современной клеточной и молекулярной биологии, фармакологии и биоинженерии. Стволовые клетки, способные безгранично делиться, сохраняя нормальный генный и хромосомный набор, интересуют не только теоретическую науку, но и рассматриваются как реальный инструмент клеточной терапии (Ким И.И., 2006).

1.4 Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (морфология

и общие свойства)

Работы выдающихся отечественных ученых A.A. Максимова и А.Я. Фриденштейна стали основополагающими в развитии истории изучения стволовых клеток. В 1909 году A.A. Максимов предположил, что все клетки крови развиваются из одного общего предшественника, малого лимфоцита, который обладает широким потенциалом к дифференцировке. Одним из главных выводов, сделанных ученым, является то, что стволовые клетки, в частности стволовые клетки крови, имеются не только в эмбриональных тканях, но и во взрослом организме.

Открытие в 60-х годах хх века мультипотентной стромальной клетки костного мозга взрослого организма принадлежит А.Я. Фриденштейну. Костный мозг - единственный орган, в котором сосуществуют и функционально взаимодействуют два различных типа стволовых клеток. Главными функциями стромальых клеток костного мозга являются:

1. формирование гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ); 2. формирование стромального микроокружения; 3. Участие в морфогенезе; 4. Самоподдержание и восстановление пула МСК; 5. участие в гомеостатичес-ких реакциях организма и в процессах регенерации, репарации и адаптации системы мезенхимальных клеток в норме и патологии.

Костный мозг преимущественно получают путем вымывания его из бедренных костей у мышей и других мелких лабораторных животных или путем аспирации его из подвздошной кости у людей (Буравкова Л.Б. и др., 2009; Михайлов В.М. и др., 2006; Попов Б.В. и др., 2009; Baghaban М. et al., 2007; Caplan A.I., 1991; Fadel L. et al., 2011).

Фриденштейн и сотрудники его лаборатории показали, что костный мозг содержит особую популяцию клеток, независимых от стволовых клеток крови. Они не только выделили эти клетки, но и охарактеризовали их. Было

показано, что ММСК способны к длительному самоподдержанию, образуют колонии фибробластоподобных клеток, а также обладают потенцией к дифференцировке в клетки жировой, фиброзной, хрящевой и костной тканей. Костный мозг доступен для многократного получения донорских клеток, при его использовании отпадает необходимость в иммуносупрессивной терапии, поскольку возможно проведение трансплантации аутологичных клеток.

Число ММСК в костном мозге невелико и составляет 0,001-0,01% (Pittenger M.F. et al., 1999; Jones E. et al., 2008; Pountos I. et al., 2005). Эти клетки обладают высокой адгезией к культуральному пластику, что позволяет выделить их из смеси мононуклеарных клеток костного мозга. В процессе культивирования неприкрепившиеся клетки кроветворного ряда постепенно удаляются из популяции. Через 5-7 дней культивирования выделенные ММСК развиваются в отдельные видимые колонии.

К общим свойствам мезенхимальных стволовых клеток относят: способность к симметричному и асимметричному делению, высокий пролиферационный потенциал, высокую способность к адгезии, фибробластоподобную морфологию, образование колоний в культуре, легко индуцируемую дифференцировку.

При культивировании ММСК костного мозга представляют собой популяцию гетерогенных по морфологии клеток. Обычно можно выделить три морфологически различных типа клеток: мелкие агранулярные веретеновидные клетки, фибробластоподобные гранулярные клетки большего размера и крупные распластанные клетки (Colter D.C. et al., 2001; Sekiya I. et al., 2002; Shur I. et al., 2002; Zohar R. et al., 1997; Анохина Е.Б. и др., 2007). Эти клетки отличаются по пролиферативному потенциалу и способности к мультилинейной дифференцировке. Такое различие, вероятно, можно объяснить тем, что данные виды клеток являются переходными стадиями друг в друга. Скорее всего, мелкие веретеновидные клетки

являются более ранними предшественниками ММСК, а широкие распластанные клетки представляют собой их более зрелые формы. Отличительной особенностью ММСК в культуре является высокая пролиферативная активность. Тем не менее, существуют данные, что при культивировании до 12-го пассажа клетки сохраняют нормальный кариотип и теломеразную активность (Zhang Z.X. et al., 2007; Pittenger M.F. et al., 1999).

Помимо костного мозга ММСК были выделены из различных органов и тканей взрослого организма. Так, популяции ММСК выделяют из жировой ткани (Zuk Р.A. et al., 2001), мышечной ткани, надкостницы, синовиальной оболочки (Sakaguchi Y. et al., 2005), пуповины (Kastendjieva S. et al., 2008; Kern S. et al., 2006) и других тканей. ММСК были обнаружены у многих животных и человека: мыши, крысы, свиньи, лошади, овцы, козлы, собаки и др. (Rho G.J. et al., 2009; Volk S.W. et al., 2005; Fortier L.A. et al., 2011).

1.4.1 Иммунофенотип ММСК костного мозга

ММСК не экспрессируют характерных маркеров. Тем не менее, для данной популяции клеток характерна экспрессия ряда поверхностных антигенов. Так, согласно предложению Комитета мезенхимальных и тканевых стволовых клеток международного общества клеточной терапии, популяция клеток, охарактеризованных как ММСК костного мозга, должна экспрессировать (> 95%) CD 105 (эндоглин, определяется SH2 антителами), CD73 (экто 5' нуклеотидаза, определяется SH3 и SH4 антителами), CD90 (Thy-1) и не должна окрашиваться антителами (< 2%) к следующим антигенам: CD45 (общий лейкоцитарный маркер), CD34 (маркер ранних предшественников гемопоэтических клеток), CD 14 или CD1 lb (экспрессиру-ются на макрофагах), CD 19 (маркеры В-клеток) и HLA-DR (молекула II класса комплекса гистосовместимости) (Dominici М. et al., 2006).

В целом фенотип ММСК является совокупностью положительной и отрицательной экспрессии различных молекул.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Саттари Фард Ханиех Хассан, 2013 год

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аурих М., Глуз А. Современные направления в лечении повреждений хряща голеностопного сустава // Украшський Журнал Екстремально1 Медицини iMeHi Г.О.Можаева,- 2008.- Vol.9.- №4.- С. 01-08.

2. Анахина Е. Б., Буравкова Л. Б. Гетерогенность стромальных клеток-предшественников, выделенных из костного мозга крыс // Цитология.-2007.- Voll.- №49.-С.40-47.

3. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р. и др. Характеристика мезенхимных стромальных клеток из липоаспирата человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода // Цитология.- 2009.- Vol. 1.- №51.- С.6-11.

4. Григорьева Е.А., Волошин H.A. Лектингистохимические особенности суставного хряща крыс с моделированным остеоартрозом // Укра'шський Морфолопчний Альманах.- 2010.- Vol.8.- №2.- С.40-43.

5. Григорян A.C., Деев Р.В., Кругляков П.В. и др. Применение трасплантатов, содержащих мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, для восстановления поврежденных суставных поверхностей в эксперименте // Клеточная Трансплантология и Таневая Инженерия.- 2010.- №2.- С. 1-12.

6. Гринчук Т.М., Иванцов K.M., Алексеенко Л.Л. и др. Характеристика культуры мезенхимных стволовых клеток мыши, экспрессирующих GFP // Цитология.- 2008.- №12.- С. 1030-1035.

7. Дризе Н.И., Чертков И.Л. «Пластичность» костномозговых стволовых клеток // Терапевтический Архив.- 2004.- №7.- С. 5-11.

8. Зубарева К.Э., Хрипко О.П., Нечаева Е.А. Дифференцировочный потенциал мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток из взрослых и фетальных тканей мышей // ИНВХ.- 2012.- Vol.13.- №1.- С. 58-60.

9. Ким И.И. Выделение и культивирование хондроцитов, полученных из различных источников // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия.- 2006.- Vol.6.- №4.- С.48-51.

10. Кирик М.В., Бутенко Г.М.Стволовые клетки из жировой ткани: основные характеристикии перспективы клинического применения в регенеративной медицине // АМН Украши.- 2010.- Vol.16.- №4.- С.576-604.

11. Ковалев Г. А., Введенский Б. П., Сандомирский Б. П. Технология моделирования остеоартроза крупных суставов // Биотехнология,-2010.- Vol.3.- №4.- С.37-43.

12.Кругляков П.В., Соколова Д.Г., Полынцев Д.Г. Стволовые клетки дифференцированных тканей взрослого организма // Цитология.-2008.- Vol.50.- №7.- С.557-567.

13.Фриденштайн А.Я., Петракова А.И., Куралесова А.И. и др. Клетки-предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротопных трансплантатов костного мозга // Цитология.- 1968.-№5.- С.557-567.

14. Михайлов В.М., Евтифеева Е.В., Сериков В.Б. Участие стволовых клеток костного мозга в дифференцировке поперечнополосатых мышц мышей mdx // Цитология.- 2006.- Vol 5.- №48.- С.410-416.

15. Петренко Ю.А., Мазур С.П., Грищук В.П. и др. Выбор условий индукции дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в инсулинпродуцирующие клетки in vitro // Клеточная Трансплантология и Тканевая Инженерия.- 2011.- №1.- С. 1-7.

16. Попов Б.В., Петров Н.С., Михайлов В.М. и др. Спонтанная трансформация и иммортализация мезенхимных стволовых клеток в культуре in vitro // Цитология.- 2009.- Vol.51.- №2.- С.91-102.

17. Синяченко О.В., Добровинская Е.В., Наумеико Н.В. Тендерные особенности остеодефицита у больных остеоартрозом // У. Р.Журнал.-2010.- Vol.39.- №1.- С.31-37.

18. Советников Н.Н., Кальсин В.А., Коноплянников М.А. и др. Клеточные технологии и тканевая инженерия в лечении дефектов суставной поверхности // Клиническая Практика.- 2013.- №1.- С.52-66.

19. Тепляшии А.С., Коржикова С.В., Шарифуллина С.З. и др. Дифференцировка мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека в клетках хрящевой ткани при культивировании их в трехмерных матриксах OPLA // Цитология.-2007.-№7.-С. 544-551.

20.Торгомян АЛ., Худавердян Д.Н. Молекулярный анализ патологических изменений гиалинового хряща при остеоартрите и современные подходы к его диагностике // Медицинская Наука Армении.- 2012.- №4.- С.1-12.

21. Шевцов В.И., Макушин В.Д., Степанов Т.А. и др. К вопросу моделирования остеоартроза коленного сустава у собак для изучения патогенеза (Экспериментально-морфологическое исследование) // Гений Ортопедии.- 2012.- №1.- С.38-42.

22. Яргин С.В. Схволовые клетки и клеточная терапия: на пути к доказательной медицине // Науков1 Дискуcii'.- 2010.- №6.- С. 1-3.

23. Яргин С.В. Стволовые клетки и клеточная терапия: на подступах к научному подходу // Цитология.- 2010.- Vol.11.- №52.- С.918- 920.

24. Aggarwal S., Pittenger M.F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses // Blood.- 2005.- Vol.4.- №105.- P.1815-1822.

25. Aiam M.R., Lee H.B., Kim M.S. et al. Surgical model of osteoarthritis secondary to medial patellar luxation in dogs // Veterinary Medicine.- 2011,-Vol.3.- №56.- P.123-130.

26. Allen K.D., Adams S.B., Setton L.A. Evaluating intra-articular drug deliver)' for the treatment of osteoarthritis in a rat model // Tissue Engineering.- 2010.- Vol.16.- №1.- P.81-92.

27. Altman R., Tenenbaum J., Latta L. et al. Biomechanical and biochemical properties of dog cartilage in experimentally induced osteoarthritis // Annals of Rheumatic Diseases.- 1984.- №43.- P.83-90.

28. AI Safar F.J., Ganabadi S., Yaakub H. et al. Collagenase and sodium Iodoacetate-Induced experimental Osteoarthritis model in rats // Asian Journal of Scientific Research.- 2009.- Vol.4.- №2.- P. 167-179.

29. Augello A., De Bari C. The regulation of differentiation in mesenchymal stem cells // Human Gene Therapy.-2010.- №21.- P. 1-13.

30. Augello A., Kurth T.B., DeBari C. Mesenchymal stem cells: A perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches // European Cells and Materials.- 2010.- Vol.20.- P. 121-133.

31. Arsever C.L., Bole G.G. Experimental osteoarthritis induced by selective myectomy and tendotomy // Arthritis and Rheumatism.- 1986.- Vol.29.-№2.-P.251-261.

32. Aragon Z., Ohtsuki K., Ohnishi M. et al. Immunohistochemical study of the upper surface layer in rat mandibular condylar cartilage // Histology and Histopathology.- 2004.- №19.- P.29-36.

33. Arinzeh T.L., Peter S. J., Archambault M. P. et al. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sizes canine segmental defect // The Journal of Bone & Joint Surgery.- 2003.- Vol.10.- №85.- P. 1927-1938.

34. Arzi B., Wisner E.R., Huey D.J. et al. A prpoposed model of naturally occurring osteoarthritis in the domestic rabbit // Nature America.- 2012.-Vol.41.-№l.- P. 20-25.

35. Attur M., Samuels J., Krasnakutsky S. et al. Targeting the synovial tissue for treating osteoarthritis (OA): where is the evidence? // Best Practice & Research Clinical Rheumatology.- 2010.- №24.- P. 71-79.

36. Baghaban M., Falahi F., Nazarian H. et al. Differentiation potential and culture requirement of mesenchymal stem cells from ovine bone marrow for tissue regeneration applications // Iranian Journal of Veterinary Surgery.-2007.- Vol.2.- №5.- P. 53-65.

37. Baghban M., Falahi N. Effects of BIO on proliferation and chondrogenic differentiation of mouse marrow-derived mesenchymal stem cells // Veterinary Research Forum.- 2013.- Vol.2.- №4.- P.69-76.

38. Bai K., Huang Y., Jia X. et al. Endothelium oriented differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells under chemical and mechanical stimulations // Journal of Biomechanics.- 2010.- Vol.6.- №43.- P. 11761181.

39. Bartholomew A., Sturgeon C., Siatskas M. et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo // Experimental Hematology.- 2002.- №30.- P. 42-48.

40. Barry F.P., Murphy J.M. Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology.- 2004.- №36.- P. 568-584.

41. Barry F.P., Boynton R.E., Liu B. et al. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components // Experimental Cell Research.- 2001.-№268.- P. 189-200.

42. Black L.L., Gaynor J., Adams Ch. et al. Effect of intraarticular injection of autologous adipose-derived mesenchymal stem and regenerative cells on clinical signs of chronic osteoarthritis of the elbow joint in dogs // Veterinaiy Therapeutics.- 2008.- Vol.9.- №3.- P. 192-200.

43. Buckwalter J.A., Mankin H.J., Grodzinsky A.J. Articular cartilage and osteoarthritis // AAOS Instructional Course Lectures.- 2005.- №54.- P.465-480.

44. Burger C., Mueller M., Wlodarczyk P. et al. The sheep as a knee osteoarthritis model: early cartilage changes after meniscus injury and repair // Laboratory Animals.- 2007.- №41.- P.420-431.

45. Bendele A.M. Animals models of osteoarthritis in an era of molecular biology // Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions.- 2002.-Vol.6.- №6.- P.501-503.

46. Battula V.L., Treml S., Bareiss P.M. et al. Isolation of functionally distinct mesenchymal stem cell subsets using antibodies against CD56, CD271, and mesenchymal stem cell antigen-1 // Haematologica.- 2009.-Vol.2.- №94.- P. 173-184.

47. Blaber S., Webster R., Vesey G. Mesenchymal stem cells in veterinary medicine // The Veterinary Nurse.- 2011.- Vol.2.- №2.- P.l-7.

48. Botter S.M., Zar M., Osch G.J. et al. Analysis of osteoarthritis in a mouse model of the progeroid human DNA repair syndrome trichothiodystrophy // AGE.- 2010.-№10.- P.l-14.

49. Burger C., Mueller M., Wlodarczyk P. et al. The sheep as a knee osteoarthritis model: early cartilage changes after meniscus injury and repair // Laboratory Animals.- 2007.- №71.- P.420-431.

50. Centeno Ch., Faulkner S. The use of mesenchymal stem cells in orthopedics: review of the literature, current research, and regulatory landscape // Journal of American Physicians ans Surgeons.- 2011.- Vol. 16.-№2.- P.38-44.

51. Centeno Ch., Busse D., Kisiday J. et al. Increased knee cartilage volume in degenerative joint disease using percutaneously implanted, autologous mesenchymal stem cells // Pain Physician.- 2008.- Vol.3.- №11.- P.343-353.

52. Centeno Ch., Busse D., Kisiday J. et al. Regeneration of meniscus cartilage in a knee treated with percutaneously implanted autologous // Medical Hypotheses.- 2008.- №71.- P.900-908.

53. Chan B. Y., Fuller E. S., Russell L. K. et al. Increased chondrocyte sclerostin may protect against cartilage degradation in osteoarthritis // Osteoarthritis and cartilage.- 2011.- №19.- P.874-885.

54. Chang J., Rasamny J., Park S. S. Injectable tissue-engineered cartilage using a fibrin sealant // American Medical Association.- 2007.- Vol.9.-P.161-166.

55. Chen F.H., Tuan R.S. Adult stem cells for cartilage tissue engineering and regeneration // Current Rheumatology Reviews.- 2008.- Vol.4.- №3.- P.161-170.

56. Chevrier A., Nelea M., Hurting M. et al. Meniscus structure in human, sheep, and rabbit for animal models of meniscus repair // Journal of Orthopaedic Research.- 2009.- №102.- P.l 197-1203.

57. Chung H.J., Park T.G. Surface engineered and drug releasing prefabricated scaffolds for tissue engineering // Advanced Drug Delivery Reviews.- 2007.- №59.- P.-249-262.

58. Christiansen B.A., Anderson M.J., Lee C.A. et al. Musculoskeletal changes following non-invasive knee injury using a novel mouse model of post-traumatic osteoarthritis // Osteoarthritis and Cartilage.- 2012.- №20.-P.773-782.

59. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells // Journal of Orthopaedic Research.-1991.- Vol.9.- №5.- P.641-650.

60. Colter D.C., Sekiya I., Prockop D.J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.- 2001.- Vol.14.- №98.- P.7841-7845.

61. Corcione A., Benvenuto F., Ferretti E. et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions // Blood.- 2006.- Vol.1.- №107.- P.367-372.

62. Danisovic L., Lensny P., Havlas V., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells // Journal of Applied Biomedicine.- 2007.- №5.- P.139-150.

63. Davatchi F., Sadeghi B., Mohyeddin M. et al. Mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis. Preliminary report of four patients // International Journal of Rheumatic Diseases.- 2011.- №14.- P.211-215.

64. Dealy C.N. Chondrogenic progenitors for cartilage repair and osteoarthritis treatment // Rheumatology.- 2012.- №3.- P. 1-4.

65. De Boer J., Wang H.J., van Blitterswijk C. Effect of Wnt signaling on proliferation and differentiation of human mesenchymal stem cells // Tissue Engineering.- 2004.- Vol.3.- №10.- P.393-401.

66. Dejbakhsh-Jones S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells // The Journal of Immunology.- 1995.- №.155.-P.3338-3344.

67. Delise A.M., Tuan R.S. Analysis of N-cadherin function in limb mesenchymal chondrogenesis in vitro // Developmental Dynamics.- 2002.-Vol.2.- №.225.- P. 195-204.

68. Dhandayuthapani B., Yoshida Y., Maekawa T. et al. Polymeric scaffolds in tissue engineering application: A Review // International Journal of Polymer Science.- 2011.- P. 1-19.

69. Diekman B. O., Guilak F. Stem cell-based therapies for osteoarthritis: challenges and opportunities // Osteoarthritis.- 2013.- Vol.25.- №1.- P.119-126.

70. Di Nicola M., Carlo-Stella C., Magni M. et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli // Blood.- 2002.- Vol.10.- №99.- P.3838-3843.

71. D'Ippolito G., Diabira S., Howard G.A. et al. Marrow-isolated adult multilineage inducible (MIAMI) cells, a unique population of postnatal young and old human cells with extensive expansion and differentiation potential // Journal of Cell Science.- 2004.- Vol.14.- №117.- P.2971-2981.

72. Djouad F., Plence P., Bony C. et al. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals // Blood.- 2003.- №102.- P.3837-3844.

73. Docheva D., Haasters F., Schieker M. Mesenchymal stem cells and their cell surface receptors // Current Rheumatology Reviews.- 2008.- Vol.4.-№3.- P. 1-6.

74. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement // Cytotherapy.- 2006.- Vol.4.- №8.- P.315-317.

75. Fadel L., Viana B., Feitosa M. et al. Protocols for obtainment and isolation of two mesenchymal stem cell sources in sheep // Acta Cirurgica Brasileira.- 2011.- Vol.26.- №4.- P.267-273.

76. Floman Y., Eyre D.R., Glimcher M.J. Induction of osteoarthrosis in the rabbit knee joint: biochemical studies on the articular cartilage // Clinical Orthopaedics and Related Research.- 1980.- №147.- P.278-86.

77. Fortier L.A., Travis A.J. Stem cells in veterinary medicine // Stem Cell Research & Therapy.- 2011.- Vol.9.- №2.- P. 1-6.

78. Frassoni F., Bacigalupo A., Oneto R. et al. Expanded mesenchymal stem cells (MSC), co-infused with HLA identical hematopoietic stem cell transplants, reduce acute and chronic graft-versus-host disease: a matched pair analysis // Bone Marrow Transplant.- 2002.- №29.- P. 140-143.

79. Gang E.J., Bosnakovski D., Figueiredo C.A. et al. SSEA-4 identifies mesenchymal stem cells from bone marrow // Blood.- 2007.- Vol.4.- №109.-P.1743-1751.

80. Gearhart J.D., Addis R.C. The use of animals in human stem cell research: past, present, and future // Institute for Laboratory Animal Research Journal.- 2010.- Vol.51.- №1.- P. 1-2.

81.Gerwin N., Hops C., Lucke A. Intra-articular drug delivery in osteoarthritis // Advanced Drug Delivery Reviews.- 2006.-№.58.-P.226-242.

82. Goldring M. B. The role of cytokines as inflammatory mediators in osteoarthritis: lessons from animal models // Connective Tissue Research.-1999.- Vol.40.-№1.-P.1-11.

83. Goranov N.V. Clinical changes in sodium monoiodoacetate-induced stifle osteoarthritis model in dogs // Veterinary World.- 2012.- Vol.3.- №5,-P.138-144.

84. Goranov N.V. Experimental osteoarthritis models in veterinary medicine-relevance, potential and challenges // Bulgarian Journal of Veterinary Medicine.- 2011.- Vol.14.- №4.- P. 191-200.

85. Guzman R.E., Evans M.G., Bove S. et al. Mono-Iodoacetate-induced histologic changes in subchondral bone and articular cartilage of rat femorotibial joints: an animal model of osteoarthritis // Toxicologic Pathology.- 2003.- №31.- P.619-624.

86. Gregory M.H., Capito N., Kuroki K. et al. A review of translational animal models for knee osteoarthritis // Arthritis.- 2012.- №764621.- P. 1-14.

87. Grin nemo K., Mansson A., Dellgren G. et al. Xenoreactivity and engraftment of human mesenchymal stem cells transplanted into infarcted rat myocardium // The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery.-2004.- №127.- P.1293-1300.

88. Gronthos S., Graves S. E., Ohta S. et al. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors // Blood.- 1994.-Vol.12.- №84.- P.4164-73.

89. Heidari B., Shirazi A., Akhondi M.M. et al. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of Sheep mesenchymal stem cells

derived from bone marrow, liver, and adipose tissue // Journal of Medical Biotechnology.- 2013.- Vol.5.- №2.- P. 104-117.

90. Hidaka Ch., Goldring M.B. Regulatory mechanisms of chondrogenesis and implications for understanding articular cartilage homeostasis // Current Rheumatology Reviews.- 2008.- Vol.4.- №3.- P. 1-12.

91. Hong Y., Gong Y., Gao Ch. et al. Collagen-coated polylactide microcarriers/chitosan hydrogel composite: Injectable scaffold for cartilage regeneration // Journal of Biomedical Materials Research Part A.- 2007.-№10.- P.628-637.

92. Hunziker E.B., Stahli A. Surgical suturing of articular cartilage induces osteoarthritis-like changes // Osteoarthritis and Cartilage.- 2008.- Vol. 10.-№10.- P. 1-7.

93. Inglis J.J., McNamee K.E., Chia Sh.L. et al. Regulation of pain sensitivity in experimental osteoarthritis by the endogenous peripheral opioid system // Arthritis & Rheumatism.- 2008.- Vol.58.- №10.- P.3110-3119.

94. Jamalpour Z., Nourani M., Amirizade N. et al. Comparative study between fibrin scaffold and auto-graft in sciatic nerve repair: a tissue engineering approach // Journal of the Academy of Marketing Science.-2009.- Vol.7.- №2.- P.65-71.

95. Jamous M., Al-Zoubi A., Khabaz M. Purification of mouse bone marrow-derived stem cells promotes ex vivo neuronal differentiation // Cell Transplantation.- 2010.- Vol.16.- P. 193-202.

96. Jean Y.H., Wen Z.H., Chang Y.C. et al. Intra-articular injection of the cyclooxygenase-2 inhibitor parecoxib attenuates osteoarthritis progression in anterior cruciate ligament-transected knee in rats: role of excitatory amino acids // Osteoarthritis Cartilage.- 2007.- Vol.15.- №6.- P.638-645.

97. Jones E., McGonagle D. Human bone marrow mesenchymal stem cells in vivo // Rheumatology (Oxford).- 2008.- Vol.2.- №47.- P.126-131.

98. Jorgensen C., Djouad F., Apparailly F. et al. Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy // Gene Therapy.- 2003.- №10.- P.928-931.

99. Katz A.J., Tholpady A., Tholpady S.S. et al. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells // Stem Cells.- 2005.- Vol.3.- №23.- P.412-423.

100. Karaoz E., Aksoy A., Ayhan S. et al. Characterization of mesenchymal stem cells from rat bone marrow: ultrastuctural properties, differentiation potential and immunophenotypic markers // Histochemistry and Cell Biology.- 2009.- №10.- P. 1-10.

101. Karp J.M., Dalton P.D., Shoichet M.S. Scaffolds for tissue engineering // Mrs Bulletin.- 2003.- P.301-306.

102. Kestendjieva S., Kyurkchiev D., Tsvctkova G. et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord // Cell Biology International.- 2008.- Vol.7.- №32.- P.724-732.

103. Kern S., Eichler H., Stoeve J. et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue // Stem Cells.- 2006.- Vol.5.- №.24.- P. 1294-1301.

104. Koh Y.G., Choi Y.J. Infra-patellar fat pad-derived mesenchymal stem cell therapy for knee osteoarthritis // The Knee.- 2012.- №10.- P. 1-6.

105. Kotlarchyk M.A., Botvinick E.L., Putnam A.J. Characterization of hydrogel microstructure using laser tweezers particle tracking and confocal reflection imaging // Journal of Physics: Condensed Matter.- 2010.- Vol. 19.-№22.- P.2-18.

106. Kuroki K., Cook C.R., Cook J.L. Subchondral bone changes in three different canine models of osteoarthritis // Osteoarthritis and Cartilage.-2011.-№19.- P.l 142-1149.

107. Krampera M., Pizzolo G., Aprili G. et al. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair // Bone.- 2006.- №39.-P.678-683.

108.Leblanc K., Tammik C., Rosendahl K. et al. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells // Experimental Hematology.- 2003.- Vol.10.- №31.- P.890-896.

109. Leor J., Amsalem Y., Cohen S. Cells, scaffolds, and molecules for myocardial tissue engineering // Pharmacology & Therapeutics.- 2005.-№105.- P.151-163.

110. Liechty K., Mac Kenzie T.S., Shaaban A.F. et al. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep // Nature Medicine.- 2000.- №11.- P. 1282-1286.

111. Lippiello L., Kaye C., Neumata T. et al. In vitro metabolic response of articular cartilage segments to low levels of hydrostatic pressure // Connective Tissue Research.- 1985.- №.13.- P.99-107.

112. Little C.B., Smith M.M. Animals models of osteoarthritis // Current Rheumatology Reviews.- 2008.-Vol.4.- №.3.- P. 1-7.

113. Little C.B., Zaki S. What constitutes an "animal model of osteoarthritis"-the need for consensus? // Osteoarthritis and Cartilage.-2012.- №20.- P.261-267.

114. Longo U.G., Petrillo S., Franceschetti E. et al. Stem cells and gene therapy for cartilage repair // Stem Cells International.- 2012,- P. 1-9.

115.Lubis A.M., Lubis V.K. Adult bone marrow stem cells in cartilage therapy // Acta Medica Indonesiana.- 2012.- Vol.44.- №1.- P.62-68.

116. Overstreet D.J., Dutta D., Stabenfeldt S.E. et al. Injectable hydrogels // Journal of Polymer Science.- 2012.- №50.- P.881-903.

117. Ozkan F. U., Ozkan K., Ramadan S., Guven Z. Chondroprotective effect of N-acetylglucosamine and hyaluronate in early stages of osteoarthritis- an experimental study in rabbits // Bulletin of the NYU hospital for joint diseases.- 2009.- Vol.67.- №4.- P.352-357.

118. Ma H.L., Blanchet T.J., Peluso D. et al. Osteoarthritis severity in sex dependent in a surgical mouse model // Osteoarthritis and Cartilage.- 2007.-№15.- P.695-700.

119. Majumdar M.K., Keane-Moore M., Buyaner D. et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells // Journal of Biomedical Science.- 2003.- Vol.2.- №10.- P.228-41.

120. Mao J.J. Stem-cell-driven regeneration of synovial joints // Biology of the Cell.- 2005.- №97.- P.289-301.

121. Maumus M., Guerit D., Toupet K. et al. Mesenchymal stem cell-based therapies in regenerative medicine: applications in rheumatology // Stem Cell Research & Therapy.- 2011.- Vol.14.- №2.- P. 1-6.

122. Map P.I., Avery P.S., McWilliams D.F. et al. Angiogenesis in two animal models of osteoarthritis // Osteoarthritis and Cartilage.- 2008.- №16.-P.61-69.

123. Mastbergen S.C., Lafeber F.P. Animals models of osteoarthritis-why choose a larger model? // Osteoarthritis.- 2009.- P. 11-14.

124. Massague J., Blain S.W., Lo R.S. TGFbeta signaling in growth control, cancer and heritable disorders // Cell.- 2000.- Vol.2.- №92.- P.295-309.

125.Marijnissen A.C., Van Roermund P.M., TeKoppele J.M. et al. The canine «groove» model, compared with the ACLT model of osteoarthritis // Osteoarthritis and Cartilage.- 2002.- Vol.10.- №2.-P. 145-155.

126. Meisel R. Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase-mediated tryptophan degradation // Blood.- 2004,- №103.- P.4619-4621.

127. Meie E. Epidemiology of osteoarthritis // Veterinary Focus.- 2007.-Vol.l7.-№3.- P.4-10.

128. McCarty R., Leavesley D., Simmons P. Application of mesenchymal stem cells for repair and regeneration of cartilage and bone // Australian Biochemist.- 2005.- Vol.36.- №1.- P.7-10.

129. Meirelles L.S., Nardi N.B. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization // British Journal of Haematology.- 2003.- №123.- P.702-711.

130. Murpliy K.C., Leach J.K. A reproducible, high throughput method for fabricating fibrin gels // Bio Med Central.- 2012.- №5.- P.l-4.

131. Murphy J.M., Fink D.J., Hunziker E.B. et al. Stem cell therapy in a caprine model of osteoarthritis // Arthritis & Rheumatism.- 2003.- Vol.48.-№12.- P.3464-3474.

132.Musina R.A., Bekchanova E.S., Belyavskii A.V. et al. Differentiation potential of mesenchymal stem cells of different origin // Cell Technologies in Biology and Medicine.- 2006.- Vol.2.- №1.- P. 147-151.

133. Nadri S., Soleimani M. Isolation of CD34+ mesenchymal stem cells from mouse bone marrow // Blood.- 2007.- Vol.2.- №4.- P. 143-151.

134. Neustadt D.H. Intra-articular injections for osteoarthritis of the knee // Cleveland Clinic Journal of Medicine.- 2006.- Vol.73.- №10.- P.897-911.

135.Niemeyer P., Seckinger A., Simank H.G. et al. Allogeneic transplantation of human mesenchymal stem cells for tissue engineering purposes: an in vitro study // Orthopäde Journal.- 2004.- Vol.12.- №33.-P.1346-1353.

136. Niu C.C., Yuan L.J., Lin S.S. et al. Mesenchymal stem cell and nucleus pulposus cell coculture modulates cell profile // Clinical Orthopaedics and Related Research.- 2009.- Vol.467.- №12.- P.3263-3272.

137. Niu H.J, Li L.F., Sun F. et al. Ultrasound speed and attenuation in progressive trypsin digested articular cartilage // Science China Life Sciences.- 2011.- Vol.54.- №11.- P. 1029-1035.

138.Nöth U., Steinert A.F., Tuan R.S. Technology insight: adult mesenchymal stem cells for osteoarthritis therapy // Rheumatology.- 2008.-Vol.4.- №7.- P.371-380.

139. Park H., Choi B., Hu J. et al. Injectable chitosan hyaluronic acid hydrogels for cartilage tissue engineering // Acta Biomaterialia.- 2013.-№9.- P.4779-4786.

140.Phinney D. G., Kopen G., Righter W. et al.Donor variation in the growth properties and osteogenic potential of human marrow stromal cells // Journal of Cellular Biochemistry.- 1999.- Vol.3.- №75.- P.424-36.

141. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science.- 1999.- Vol.11.- №284,-P.143-147.

142. Poole R., Blake S., Buschman M. et al. Recommendations for the use of preclinical models in the study and treatment of osteoarthritis // Osteoarthritis and Cartilage.- 2010.- №18.- P. 10-16.

143.Pountos I., Giannoudis P. Biology of mesenchymal stem cells // International Journal of The Care of The Injured.- 2005.- №365.- P.8-11.

144. Plumas J., Chaperot L., Richard M. J. et al. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells // Leukemia.- 2005.- Vol.9.- №19.-P. 1597-1604.

145.Pritzker P.H. Animal models for osteoarthritis: processes, problems and prospects // Annals of the Rheumatic Diseases.- 1994.- №53.- P.406-420.

146. Qi Y., Feng G., Yan W. Mesenchymal Stem cell-based treatment for cartilage defects in osteoarthritis // Cellular & Molecular Biology Research.-2012.-№39.- P.5683-5689.

147. Rasmusson I. Mesenchymal stem cells inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not activated cytotoxic T lymphocytes or natural killer cells // Transplantation.- 2003,- №76.- P. 1208-1213.

148. Redman S.N., Oldfield S.F, Archer C.W. Current strategies for articular cartilage repair // Furopean Cells and Materials.- 2005.- Vol.9.- P.23-32.

149. Reyes M., Verfaillie C.M. Characterization of multipotent adult progenitor cells, a subpopulation of mesenchymal stem cells // Annals of the New York Academy of Sciences.- 2001.- №938.- P.231-233.

150. Rho G.J., Kumar B.M., Balasubramanian S.S. Porcine mesenchymal stem cells-current technological status and future perspective // Frontiers in Bioscience.- 2009.- №14.- P.3942-3961.

151. Roberts S., Genever P., McCaskie A. et al. Prospect of stem cell therapy in osteoarthritis // Regenerative Medicine.- 2012.- Vol 3.- №6.- P. 351-366.

152. Sachlos E and Czernuszka J. T. Making tissue engineering scaffolds work. Review on the application of solid freeform fabrication technology to the production of tissue engineering scaffolds // European Cells and Materials.- 2003.- Vol.5.- P.29-40.

153. Sakaguchi Y., Sekiya I., Yagishita K. et al. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source // Arthritis & Rheumatism.- 2005.- Vol.8.- №52.- P.2521-2529.

154. Saito T., kuang J. Q., Bittira B. et al. Xenotransplant cardiac chimera: immune tolerance of adult stem cells // The Annals of Thoracic Surgery.-2002.- №74.- P. 19-24.

155. Sanchez-Ramos J., Song S., Cardozo-Pelaez F. et al. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vivo // Experimental Neurology.- 2000.- Vol.2.- №164.- P.247-256.

156. Sanghi D., Avasthi S., Srivastava R. N. et al. Nutritional factors and osteoarthritis: a review article // Internet Journal of Medical Update.- 2009.-Vol.4.- №1.- P.42-53.

157. Schek R.M., Michalek A.J., Iatridis J.C. Genipin-crosslinked fibrin hydrogels as a potential adhesive to augment intervertebral disc annulus repair // European Cells and Materials.- 2011.- Vol.21.- P.373-383.

158.Seung'Ah Y., Bo'Hyoung P., Hyung'Ju Y. et al. Calcineurin modulates the catabolic and anabolic activity of chondrocytes and participates in the

progression of experimental osteoarthritis // Arthritis & Rheumatism.-2007.-Vol.56.- №7.-P.2299-2311.

159. Scliuelert N., McDougall J.J. Grading of monosodium iodoacetate-induced osteoarthritis reveals a concentration-dependent sensitization of nociceptors in the knee joint of the rat // Neuroscience Letters.- 2 009.-№465.- P. 184-188.

160. Sekiya I., Colter D.C., Prockop D.J. BMP-6 enhances chondrogenesis in a subpopulation of human marrow stromal cells // Biochemical and Biophysical Research Communications.- 2001.- №284.- P411-418.

161. Sekiya I., Larson B.L., Smith J.R. et al. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality // Stem Cells.- 2002.- Vol.6.- №20.-P.530-541.

162. Shakhbazau A.V., Goncharova N.V., Kosmacheva S.M. Plasticity of human mesenchymal stem cell phenotype and expression profile under neurogenic conditions // Bulletin of Experimental Biology and Medicine.-2009.- Vol.4.- №147.- P.513-516.

163.Sharma Ch., Gautam S., Dinda A. et al. Cartilage tissue engineering: current scenario and challenges // Advanced Materials letters.- 2011.-Vol.2.- №2.- P.90-95.

164. Shimizu S., Asou Y., Itoh S. et al. Prevention of cartilage destruction with intra-articular osteoclastogenesis inhibitory factor/ osteoprotegerin in murine model of osteoarthritis // Arthritis & Rheumatism.- 2007.- Vol.56.-№10.- P.3358-3365.

165. Shur I., Marom R., Lokiec F. et al. Identification of cultured progenitor cells from human marrow stroma // Journal Cell Biochemistry.- 2002.-Vol.l.- №87.- P.51-57.

166. Singaravelu K., Padanilam B.J. In vitro differentiation of MSC into cells with a renal tubular epithelial-like phenotype // Renal Failure.- 2009.-Vol.6.- №31.- P.492-502.

167. Sotiropoulou P.A., Petez S.A., Gritzapis A.D. et al. Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells // Stem Cells.- 2006,-Vol.l.- №24.- P.74-85.

168.Snibbe J.C., Gambardella R.A. Use of injections for Osteoarthritis in joints and sports activity // Clinical Sports Medicine.- 2005.- №24.- P.83-91.

169. Singh J.A. Stem cells and other innovative intra-articular therapies for osteoarthritis: what does the future hold? // BioMed Central Medicine.-2012.- Vol.44.-№10.- P.l-5.

170. Slaughter B.V., Khurshid S.S., Fisher O.Z. et al. Hydrogels in regenerative medicine // Advanced Materials.- 2009.- №21.- P.3307-3329.

171. Sung K.K., Shin I.S., Myung S.K. et al. Journey of mesenchymal stem cells for homing: strategies to enhance efficacy and safety of stem cell therapy // Stem Cells International.- 2010.- №342968.- P.l-11.

172. Smith G.Jr., Myers S.L., Brandt K.D. et al. Effect of intra-articular hyaluronan injection on vertical ground reaction force and progression of osteoarthritis after anterior cruciate ligament transaction // The Journal of Rheumatology.- 2005.- Vol.32.- №2.- P.325-334.

173.Tabera S., Perez-Simon J. A., Diez-Campelo M. et al. The effect of mesenchymal stem cells on the viability, proliferation and differentiation of B-lymphocytes // Haematologica.- 2008.- Vol.9.- №93.- P.1301-1309.

174. Tahmasebi A., Tedman R., Goss A.N. et al. The influence of experimentally induced osteoarthritis on articular nerve fibers of the sheep temporo-mandibular Joint // Journal of Orofacial Pain.- 2001.- Vol. 15.-№3.- P.206-217.

175.Takagi M., Umetsu Y., Fujiwara M. et al. High inoculation cell density could accelerate the differentiation of human bone marrow mesenchymal

stem cells to chondrocyte cells // Journal Bioscience Bioengineering.- 2007.-№103.- P.98-100.

176. Teplyashin A.S., Kojikova S.V., Sharifuliina S.Z. et al. The comparative analysis of influence of TGF-betal and TGF-beta3 on differentiation of MSCs isolated from human adipose tissue into cells of cartilage tissue in 2D and 3D systems // Tissue Engineering.- 2007.- Vol.7. №13.- P.57-62.

177. Tharasanit T., Phutikanit N., Wangdee Ch. et al. Differentiation potentials of canine bone marrow mesenchymal stem cells // The Thai veterinary medicine.- 2011.- Vol.1.- №41.- P.79-86.

178.Torneto M.P., Fernandez B. Activation of bone marrow mesenchymal stem cells from patients with osteoarthritis in response to chemotactic signals // Osteoarthritis.- 2009.- P. 16-18.

179. Tuli R., Tuli S., Nandi S. et al. Transforming growth factor-beta-mediated chondrogenesis of human mesenchymal progenitor cells involves N-cadherin and mitogen-activated protein kinase a Wnt signaling cross-talk // Journal of Biological Chemistry.- 2003.- Vol.42.- №278.- P.41227-36.

180. Tse W.T., Pendleton J.D., Beyer W.M. Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation // Transplantation.- 2003.- Vol.3.- №75.- P.389-97.

181.Uchii M., Tamura T., Suda T. et al. Role of fibroblast growth factor 8 (FGF8) in animal models of osteoarthritis // Arthritis Research & Therapy.-2008.- Vol.10.-№4.-P.l-10.

182. Uccelli A., Moretta L., Pistoia V. Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells // European Journal of Immunology.- 2006.- №36.-P.2566-2573.

183.Vives J., Caminal M., Pia A. Osteoarthritis: from physiotherapy to advanced-therapy medicinal products and back again // Novel Physiotherapies.- 2013.- Vol.3.- №1.- P.l-6.

184. Volk S.W., Diefenderfer D.L., Christopher S.A. et al. Effects of osteogenic induced on cultures of canine mesenchymal stem cells // American Journal of Veterinary Research.- 2005.- Vol.10.- №66.- P.1729-1737.

185. Wakitani S., Saito T., Caplan A.I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine // Muscle Nerve.-1995.- P.1417-1426.

186. Wang Q.G., Hughes N., Cartmell S.H. et al. The composition of hydrogels for cartilage tissue engineering can influence glycosaminoglycan profiles // European Cells and Materials.- 2010.- Vol.19.- P.86-95.

187. Weinand Ch., Pomerantseva I., Neville C.M. et al. Hydrogel-ß-TCP scaffolds and stem cells for tissue engineering bone // Bone.- 2006.- №38.-P.555-563.

188. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J. et al. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons // Journal of Neuroscience Research.- 2000.- Vol.4.- №61.- P.364-370.

189. Xu L., Peng H., Wu D. et al. Activation of the discoidin domain receptor 2 induces expression of matrix metalloproteinase 13 associated with osteoarthritis in mice // The Journal of Biological Chemistry.- 2005.-№280.- P.548-55.

190. Xu W., Zhang X., Qian H. et al. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro // Experimental Biology and Medicine (Maywood).- 2004.- Vol.7.- №229.-P.623-31.

191. Young A.A., McLennan S., Smith M.M. et al. Proteoglycan 4 down regulation in a sheep meniscectomy model of early osteoarthritis // Arthritis Research & Therapy.- 2006.- Vol.8.- №2.- P. 1-6.

192. Zhao H., Ma L., Zhou J. et al. Fabrication and physical and biological properties of fibrin gel derived from human plasma // Biomedical Materials.-2008.- №3.- P. 1-9.

193. Zhang Z.X., Guan L.X., Zhang K. et al. Cytogenetic analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro // Cell Biology International.- 2007.- Vol.6.- №31.- P.645-648.

194. Zhu J. Biomimetic hydrogels as scaffolds for tissue engineering // Journal of Biochips and Tissue Chips.- 2012.- Vol.2.- №4.- P. 1-3.

195.Ziagang G.E., Yang H.U., Heng B.C. et al. Osteoarthritis and therapy // Arthritis & Rheumatism.- 2006,- Vol.55.- №3.- P.493-500.

196. Zohar R., Sodek J., McCulloch C. A. Characterization of stromal progenitor cells enriched by flow cytometry // Blood.- 1997.- Vol.9.- №90.-P.3471-3481.

197. Zuk P.A., Zhu M., Maziuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies // Journal of Tissue Engineering.- 2001.- Vol.2.- №7.- P.211-228.

198. Zuk P. A., Zhu M., Ashjian P. et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Molecular Biology of the Cell.- 2002.- Vol. 12.-№13.- P.4279-4295.