Разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля для восполнения костного дефекта тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат наук Бухарова, Татьяна Борисовна

• Бухарова, Татьяна Борисовна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Бухарова, Татьяна Борисовна

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ...........................................................................................6

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................13

2.1 Строение и регенерация костной ткани.................................................15

2.2 Развитие клеточных технологий для регенерации костной ткани......20

2.3 Характеристика и остеогенный потенциал культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани...............................27

2.4 Матрицы-носители для тканеинженерных конструкций.....................35

2.5 Использование обогащенной тромбоцитами плазмы крови в тканевой инженерии........................................................................................................42

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................47

3.1 Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека.............................................47

3.2 Иммунофенотипический анализ мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани.............................................................48

3.3 Дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека....................................................................49

3.4. Получение и дифференцировка культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани крыс.....................54

3.5 Получение полилактидных матриц-носителей......................................54

3.6 Заселение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на носителях.....................56

3.7 Оценка цитотоксичности материала носителей и пролиферативной активности клеток на носителях с помощью МТТ-теста...........................56

3.8 Визуализация клеток с использованием мембранной метки РКН26 .. 57

3.9 Изучение морфологии клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии....................................................................................................58

3.10 Получение обогащенной тромбоцитами плазмы крови.....................59

3.11 Изготовление тканеинженерных конструкций....................................59

3.12 Оценка жизнеспособности клеток внутри тканеинженерной конструкции in vitro........................................................................................60

3.13 Трансплантация тканеинженерных конструкций крысам..................60

3.14 Подготовка и обработка гистологических срезов...............................63

3.15 Статистический анализ данных.............................................................63

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ.....................................................................................65

4.1. Характеристика культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани.............................................................65

4.2 Выбор оптимальных условий остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека............................................................................................................78

4.3 Оценка цитосовместимости матриц-носителей.....................................87

4.4 Характеристика тканеинженерной конструкции..................................95

4.5 Морфологическое исследование области введения тканеинженерной конструкции в толщу мышечной ткани бедра крыс...................................98

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................110

5.1 Выбор культуры остеогенных клеток...................................................110

5.2 Обоснование выбора матриц-носителей..............................................116

5.3 Получение тканеинженерных конструкций.........................................120

5.4 Трансплантация тканеинженерных конструкций в бедренную мышцу крыс................................................................................................................124

Заключение..........................................................................................................132

Выводы.................................................................................................................136

Список литературы.............................................................................................138

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки ЖТ - жировая ткань

СВФ - стромально-васкулярная фракция ТИК - тканеинженерная конструкция ДМСО - диметилсульфоксид

МТТ - тетразолиум (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка ИЛ - IL/интерлейкин

КОЕ-Ф - колониеобразующие единицы фибробластов (3-ТКФ - (3-трикальций фосфат ФСБ - фосфатно-солевой буфер БСА - бычий сывороточный альбумин ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота СЭМ - сканирующая электронная микроскопия ПСЛС - поверхностно-селективное лазерное спекание ГКИТ - гигантские клетки инородных тел

DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham/ Среда Игла, модифицированная Дульбекко/питательная смесь Хэма F12

BMP - bone morphogenetic protein/костный морфогенетический белок

PRP - platelet-rich plasma/плазма, обогащенная тромбоцитами

CD - cluster of differentiation, кластер дифференцировки (мембранные маркеры)

FGF - fibroblast growth factor/фактор роста фибробластов

PDGF - platelet-derived growth factor/ тромбоцитарный фактор роста

PKH - Red Fluorescent Cell Linker Kit/мембранный красный флюоресцентный маркер

VEGF - vascular endothelial growth factor/фактор роста эндотелия сосудов

ALP - alkaline phosphatase/щелочная фосфатаза

OPN - osteopontin/ocTeonoHTHH

BSP - bone sialopmtein/костный сиалопротеин

Col - collagen/коллаген

BGLAP - bone gamma-carboxyglutamic acid-containing protein/костный гамма-карбоксиглутамат содержащий протеин (остеокальцин)

GAPDH - glyceraldehyde 3-phosphate de hydrogenase/глицеральдегид фосфат дегидрогеназа

FITC - fluorescein 18оШуосуапа1е/флуоресцин-5'-изотиоционат

TRITC - tetramethyl-rhodamine isothiocyanate/ тетраметилродамин изотиоцианат

АРС - allophycocyanin/алофикоцианин

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля для восполнения костного дефекта»

1.1 Актуальность темы

Лечение травматических повреждений и дегенеративных заболеваний кости, таких как неконсолидирующиеся переломы, обширные костные дефекты, возникающие в результате травмы или резекции ткани в случае онкологических заболеваний, пороки развития, является актуальной медико-биологической проблемой. Потребность в костных графтах (graft (англ.) -трансплантат) в мире составляет более 800 ООО в год, наращиванию костной ткани у дентальных хирургов подвергаются 27 млн европейцев в год. Более 44 млн американцев и столько же жителей Европы подвержены остеопорозу [Иванов, 2009]. Традиционно для восполнения дефицита костной ткани при данных заболеваниях используют следующие методы - пересадку собственных тканей пациента (аутопластику), трансплантацию аллогенной костной ткани и введение различных остеопластических материалов на основе ксеногенного костного матрикса, синтетических кальцийфосфатных соединений, полимерных композиций и различных гибридных материалов [Chatterjea, 2010].

Аутотрансплантация на сегодняшний день является «золотым стандартом» в лечении костных дефектов, обеспечивая высокий уровень остеоинтеграции, отсутствие иммунологических реакций, немедленное закрытие дефекта. Однако при аутопластике возникают проблемы, связанные с ограниченностью собственной костной ткани для пересадки и выраженными процессами резорбции трансплантатов. Забор материала из донорской зоны - это дополнительное хирургическое вмешательство, сопровождающееся болевыми ощущениями, потерей крови, развитием гематом, риском инфицирования и развития других осложнений [Laurie, 1984; Arrington, 1996; Fröhlich, 2008]. Также аутографтинг исключен в случаях остеопороза, несовершенного остеогенеза и остеомиелита [Laurencin, 2003]. Использование аллогенных трансплантатов связано с риском

отторжения графта и инфицирования пациента. Для снижения иммуногенности проводят децеллюляризацию аллогенных графтов, что существенно уменьшает их остеоиндуктивность, а, следовательно, и эффективность применения в сравнении с аутографтами [Finkemeier, 2002]. Остеопластические материалы в большинстве случаев выполняют остеокондуктивную функцию, обеспечивая клеточную адгезию и поддержание прорастающих сосудов, но не обладают достаточными остеогенными свойствами [Finkemeier, 2002; Fellah, 2008; Bueno, 2009].

Одним из альтернативных подходов для регенерации костной ткани является трансплантация в область костного дефекта собственных остеопрогениторных клеток пациента после предварительного процессинга, позволяющего масштабировать количество первоначально полученных клеток и индуцировать их остеогенные потенции. Для адресной доставки, стабильной локализации в реципиентном ложе, обеспечения высокой выживаемости при трансплантации клетки иммобилизуют на матрицах-носителях из биосовместимых материалов. Важным фактором успешной регенерации является создание оптимального микроокружения для клеток при трансплантации, что достигается введением в состав конструкции ростовых и дифференцировочных факторов, направленных в первую очередь на стимуляцию неоангиогенеза, а также привлечение и дифференцировку резидентных мезенхимальных предшественников. Таким образом, тканеинженерные эквиваленты костной ткани, с одной стороны, оказывают остеоиндуктивное действие за счет остеопрогениторных клеток и биологически активных факторов, что приводит к органотипической регенерации, а с другой стороны, они могут быть получены практически любого требуемого объема при минимально травматичном заборе первичного материала, т.е. их применение лишено недостатков аутопластики. Это позволяет считать тканевую инженерию наиболее перспективным направлением при лечении травматических и дегенеративных заболеваний костной ткани в настоящее время [Деев 2007; Howard 2008; Murphy, 2013].

1.2. Цель и задачи Цель исследования:

Целью исследования является разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, трехмерных пористых полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля для восполнения дефицита костной ткани.

Задачи исследования:

1. Получить культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека в соответствии с требованиями, предъявляемыми к медицинским технологиям;

2. Провести иммунофенотипический анализ и оценку дифференцировочного потенциала культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека;

3. Оптимизировать время и условия остеогенной дифференцировки культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на основании динамики экспресии остеогенных маркеров и минерализации внеклеточного матрикса;

4. Изучить цитотоксический эффект трехмерных пористых полилактидных матриц-носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, в отношении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека;

5. Оценить адгезионные свойства и пролиферативную активность мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на поверхности полилактидных носителей;

6. Разработать методику сборки тканеинжеиериой конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля;

7. Изучить формирование костной ткани на модели гетеротопического остеогенеза при внутримышечной трансплантации крысам тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля.

1.3. Научная новизна исследования

Впервые получена тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, дифференцированных в остеогенном направлении, полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля для регенерации костной ткани.

Матрицы-носители на основе полиэфиров молочной кислоты, полученные методом поверхностно-селективного лазерного спекания, не оказывают цитотоксического действия на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, поддерживают адгезию и пролиферацию клеток.

Установлено, что на 14 сутки культивирования 1а,25-дигидроксивитамин БЗ оказывает выраженное остеогенное действие на мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки жировой ткани человека в отличие от дексаметазона, повышая минерализацию внеклеточного матрикса и уровень экспрессии генов белков остеокальцина и остеопонтина.

С помощью ПЦР в режиме реального времени показано, что при действии 1а,25-дигидроксивитамина ЭЗ на культуры мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека,

9

максимальная экспрессия белков коллагена I типа, остеопонтина и остеокальцина, формирующих органический костный матрикс, выявляется на 7-14 сутки, а на 14-21 сутки наблюдается увеличение уровня экспрессии генов щелочной фосфатазы и костного морфогенетического белка ВМР-2.

Разработан протокол сборки тканеинженерной конструкции на основе дифференцированных в остеогенном направлении мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека и полилактидных носителей путем полимеризации в тромбоцитарном геле. Установлено, что концентрация клеток 4 млн на 1см3 конструкции обеспечивает высокую выживаемость клеток при in vitro культивировании и формирование костной ткани в условиях in vivo.

Впервые показано, что внутримышечная трансплантация крысам тканеинженерной конструкции, содержащей дифференцированные в остеогенном направлении аутологичные ММСК жировой ткани, трехмерные пористые полилактидные носители и тромбоцитарный гель, приводит к гетеротопическому формированию грубоволокнистой костной ткани на 30 сутки.

1.4. Практическое значение

Значение проведенных исследований для медицинской практики заключается в разработке и обосновании применения тканеинженерных конструкций на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля для регенерации костной ткани. Тканеинженерные конструкции, протокол изготовления которых разработан в соответствии с требованиями, предъявляемыми к медицинским технологиям, могут быть рекомендованы для проведения клинических исследований в травматологии и челюстно-лицевой хирургии.

Практическое значение исследований также заключается в разработке протокола доклинической апробации имплантационных материалов с целью

создания на их основе тканевых эквивалентов для регенерации костной ткани. Протокол включает в себя три основных этапа: (1) исследование цитосовместимости матриц носителей на основании оценки их цитотоксичности, способности к поддержанию клеточной адгезии и пролиферации, (2) иммунофенотипическую и функциональную характеристику клеточной культуры с оценкой ее остеогенного потенциала и (3) экспериментальное изучение неоостеогенеза в гетеротопической локализации с участием клеточной культуры и матриц-носителей у животных.

По результатам работы разработана и зарегистрирована новая медицинская технология «Способ получения и хранения культуры мультипотентных стромальных клеток жировой ткани человека», авторы Гольдштейн Д.В., Ржанинова A.A., Бухарова Т.Б., Макаров A.B. (Разрешение на применение ФС № 2010/287 от 05.08.2010).

1.5. Положения, выносимые на защиту

Разработана тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека, преддифференцированных в остеогенном направлении, полилактидных носителей, полученных методом поверхностно-селективного лазерного спекания, и тромбоцитарного геля для регенерации костной ткани.

Трехмерные пористые носители на основе полимолочной кислоты, полученные методом селективного лазерного спекания, характеризуются высокой биосовместимостью.

Инкубация в индуктивной среде, содержащей 1а,25-дигидроксивитамин D3, в течение 14 суток приводит к эффективной остеогенной дифференцировке мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека.

Тканеинженерная конструкция на основе аутологичных мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, дифференцированных

в остеогенном направлении, трехмерных полилактидных носителей и тромбоциторного геля при внутримышечной трансплантации крысам приводит к формированию грубоволокнистой костной ткани.

1.6. Апробация работы

Основные положения работы изложены на Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», (Украина, Ялта-Гурзуф, 2009 г); World Conference on Regenerative Medicine (Germany, Leipzig, 2009), Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Россия, Москва, 2009 г), Всероссийской школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Россия, Москва, 2010 и 2011 гг), Всероссийской научной конференции «Регенеративная биология и медицина» (Россия, Москва, 2011 г), 1-м Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Россия, Москва, 2013 г), Межлабораторном научном семинаре ФГБУ «МГНЦ» РАМН (2013 г).

1.7. Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, из них 4 статьи и 7 тезисов конференций. Четыре статьи опубликованы в рецензируемых научных изданиях, входящих в Перечень ВАК МОН РФ.

1.8. Объем и структура работы

Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, их обсуждения, выводов, заключения и списка литературы. Литературный указатель включает в себя 205 источников, из них 16 - отечественных, 189 - иностранных. Работа иллюстрирована 26 рисунками, 3 таблицами.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Тканевая инженерия - одно из направлений регенеративной медицины, основной задачей которого является создание живых эквивалентов тканей на основе аутологичных или аллогенных клеточных культур, иммобилизованных на матрице носителе, для обеспечения органотипической регенерации в месте повреждения. Исследования по разработке таких эквивалентов вызывают все больший интерес со стороны клиницистов, как новый эффективный метод восстановления утраченных тканей и органов.

Предпосылками к появлению тканевой инженерии послужило развитие представлений об иммуносовместимости и иммуносупрессии, благодаря которым в 50-60 годах прошлого века были проведены первые успешные трансплантации органов - почки, печени и легкого, поджелудочной железы, сердца и костного мозга. В то же время были достигнуты определенные успехи в экспериментах по получению монослойных культур из различных тканей и органов и созданию на их основе «органотипических культур» путем объединения различных клеточных культур с использованием биоматериалов [Skalak, 1988]. Эти исследования стали первыми шагами в направлении тканевой инженерии. В 1993 году в журнале "Science" вышла статья Langer и Vacanti, в которой впервые была описана новая технология создания функциональных эквивалентов ткани на основе синтетических биосовместимых/биодеградируемых полимерных сеток, используемых в роли скаффолдов для заселения живыми клетками. В работе было дано определение тканевой инженерии как междисциплинарной области знаний, использующей принципы биологии и инженерии с целью создания биологических заменителей для восстановления, поддержания и улучшения функций тканей и целых органов [Langer, 1993; Kemp, 2006].

Сообщение о первом опыте применения тканеинженерных конструкций для восполнения костных дефектов было опубликовано в 2001г. Группой ученых из Италии и России под руководством Quarto были

13

проведены трансплантации конструкций на основе аутологичных ММСК костного мозга и 100% гидроксиапатита трем пациентам с протяженными костными дефектами. По данным компьютерной томографии и рентгенографии во всех случаях наблюдалось формирование костной мозоли и интеграция с окружающей костной тканью [Quarto, 2001]. С тех пор ведется большое количество исследований, направленных на поиск оптимальных подходов к созданию тканеинженерных конструкций для эффективной регенерации костной ткани.

В настоящее время сформулированы следующие условия, выполнение которых необходимо при разработке тканеинженерных конструкций для регенерации костной ткани [Alsberg, 2001; Scheller 2009; Murphy, 2013]:

• Использование клеточной культуры, обладающей остеогенным потенциалом, полученной в результате культивирования в оптимизированных контролируемых условиях;

• Иммобилизация клеток на матрицах-носителях для обеспечения их выживаемости, адресной доставки и реализации остеогенных свойств;

• Применение биосовместимых носителей, обладающих трехмерной пористой структурой, для поддержания объема в течение требуемого периода времени и служащей матрицей для прорастания сосудов, адгезии и миграции клеток;

• Включение в состав конструкции ростовых и дифференцировочных факторов для обеспечения адгезии, пролиферации и дифференцировки трансплантируемых клеток и привлечения резидентных клеток путем хемотаксиса;

• Обеспечение максимально быстрой васкуляризации конструкции при трансплантации, необходимой для выживания клеток.

2.1 Строение и регенерация костной ткани

Костная ткань - это специализированная соединительная ткань, отличительной особенностью которой является наличие минерализованного органического матрикса. Неорганические кальций-фосфатные соединения составляют около 65-70% костной ткани и представлены преимущественно низкокристалличным соединением гидроксиапатитом (Саю(Р04)6(0Н)2) [МшсЫег, 1990; Яескег, 1992]. Органическая часть матрикса образована главным образом коллагеном I типа и на 10% - неколлагеновыми белками, гликопротеинами, протеогликанами, пептидами и липидами [Рго1о, 1990, Яескег, 1992]. Минерализация матрикса происходит под действием фермента щелочной фосфатазы (секретируется остеобластами), расщепляющей глицерофосфаты крови с образованием фосфорной кислоты, которая при взаимодействии с соединениями кальция дает кристаллы гидроксиапатита. Они находятся в тесной связи с коллагеновыми фибриллами.

Клеточные компоненты костной ткани представлены остеопрогениторными клетками, остеобластами, остеоцитами, остеокластами и гематопоэтическими клетками костного мозга [Яескег, 1992].

Детерминированные остеопрогениторные клетки -

недифференцированные клетки мезенхимального происхождения, способные к пролиферации, миграции и дифференцировке в остеобласты. Они располагаются во внутреннем высоковаскуляризованном камбиальном слое надкостницы (периоста), остеоидном слое эндоста и в костном мозге. Помимо детерминированных выделяют также индуцибельные остеопрогениторные клетки, которые находятся в различных органах и тканях и могут дифференцироваться в остеобласты при наличии определенных индукторов [Рпеёег^ет, 1973].

Остеобласты — зрелые метаболически-активные клетки, чья основная функция - секреция органического костного матрикса (остеоида) и контроль его минерализации. Эти клетки являются потомками остеопрогениторных

клеток и по мере снижения синтетической активности превращаются в остеоциты [КпеБег, 2006].

Остеоциты - зрелые высокодифференцированные клетки, замурованные внутри костного матрикса. Они сообщаются друг с другом и с кровеносными сосудами через сеть, образованную цитоплазматическими выростами, проходящими внутри костных канальцев. Остеоциты вовлечены в регуляцию обмена кальций-фосфатных соединений, а также участвуют в процессах ремоделирования, координируя межклеточные взаимодействия в ответ на изменения в микроокружении.

Остеокласты - крупные многоядерные клетки гематогенного происхождения, образующиеся из моноцитов. Функции остеокластов заключаются в деминерализации и последующей резорбции костного матрикса за счет гидролитической активности лизосомальных ферментов.

В процессе эмбриогенеза формирование костей скелета человека происходит двумя способами - путем интрамембраной или энхондральной оссификации. Интрамембранный (прямой) остеогенез происходит на месте фиброзной (волокнистой) соединительной ткани, в которой появляются очаги оссификации - так формируются кости свода черепа, диафизы длинных трубчатых костей и альвеолярные отростки верхней и нижней челюсти. При энхондральном (непрямом) остеогенезе наблюдается закладка хрящевых пластинок, которые постепенно замещаются костной тканью - так формируется большинство костей скелета.

Важной особенностью костной ткани является ее способность к регенерации. Выделяют три основные стадии этого процесса - воспаление, восстановление (репарация) и ремоделирование [ВигсИагск, 1978; ОеРа1та, 1972].

Первыми событиями воспалительной реакции в ответ на повреждение тканей являются расширение сосудов, повышение их проницаемости и эксудация плазмы и лейкоцитов [МсЮЬЫп, 1978]. В сайте костного

повреждения развивается гематома - в результате полимеризации фибриногена формируется фибриновый сгусток, который окружает костные отломки и служит матрицей для дальнейшего формирования костной мозоли [Gerstenfeld, 2003]. Помимо фибриновых волокон гематома состоит из клеток крови, компонентов плазмы, а также провоспалительных и антивоспалительных цитокинов, и при этом лишена сосудов, что обуславливает условия гипоксии [Kolar, 2010; 2011]. На начальных стадиях воспаления гематома функционирует как скэффолд для активной инвазии воспалительных клеток. В первую очередь в нее мигрируют богатые лизосомами полиморфоядерные нейтрофилы (polymorphonuclear neutrophils, PMNs), чьи ферменты разрушают внеклеточный матрикс. Продукты секреции этих клеток активируют систему комплимента и осуществляют хемотаксис макрофагов - следующих главных героев процесса. Накопление в очаге воспаления недоокисленных продуктов, в первую очередь молочной кислоты, приводит к понижению рН. PMN являются короткоживущими клетками, их продолжительное нахождение в очаге воспаления оказывает негативное влияние на процесс костного заживления [Bastian, 2011]. А макрофаги, напротив, оказывают положительное влияние на этот процесс. При этом популяция резидентных макрофагов, локализованных в периосте и эндосте, принимают участие главным образом в интрамембранном остеогенезе [Alexander, 2011]. А в энхондральной оссификации ключевую роль играют макрофаги, пришедшие в сайт повреждения с током крови [Xing, 2010].

К числу основных молекулярных регуляторов заживления костной ткани следует отнести провоспалительные цитокины (интерлейкины IL-1, 6, IL-8, фактор некроза опухоли-а (tumor necrosis factor-а, TNF-а), активатор рецептора ядерного фактора кВ, макрофагальный колониестимулирующий фактор и др.), члены суперсемейства трансформирующего фактора роста (transforming growth factor, TGF) (BMP-2, BMP-4, ВМР-5, ВМР-6, TGF(3) и ангиогенные факторы (ангиопоэтин-1, фактора роста эндотелия сосудов

(vascular endothelial growth factor, VEGF)) [Kon, 2001; Gerstenfeld, 2003; Ai-Aql, 2008]. Секретируемый макрофагами IL-1 активирует продукцию коллагена фибробластами, вызывает пролиферацию эндотелиальных и гладкомышечных клеток [Шехтер А.Б., 1995]. IL-6 стимулирует продукцию VEGF и дифференцировку остеобластов [Yang, 2007]. IL-8 также влияет на эндотелий сосудов и вызывает хемотаксис нейтрофилов. TNF-а участвует в регуляции пролиферации и синтетической активности фибробластов и влияет на остеогенную дифференцировку остеопрогениторных клеток [Cho, 2006]. Привлечение ангиогенных факторов в зону повреждения обусловлено условиями гипоксии вследствие разрушения сосудов. Эндотелиальные клетки мигрируют из сосудов, расположенных в периосте, к краям костных отломков и внутрь гематомы для формирования новых сосудов [Lienau 2009]. Также в зоне повреждения появляются фибробласты, которые активно пролиферируют и синтезируют белки внеклеточного матрикса, формируя строму для поддержки прорастающих сосудов. Таким образом, гематома постепенно замещается грануляционной тканью (на 5-10 сутки), богатой коллагеновыми волокнами, фибробластами и капиллярами [McKibbin, 1978]. Формирование сосудистой сетки обеспечивает поступление в зону регенерации мезенхимальных предшественников - мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) из окружающих мягких тканей. В настоящее время активно обсуждается вопрос, какие молекулы могут являться хемоаттрактантами этих клеток. Есть данные, подтверждающие участие в этом процессе белков семейства BMP (ВМР-2 или ВМР-7) [Granero-Molto, 200 9; Bais, 2009], фактора стромальных клеток-1 (stromal cell-derived factor-l(SDF-l)) [Kitaori, 2009] и индуцируемого гипоксией фактора-1 а (hypoxia inducible factor-1 а (HIF-1 а)) [Ceradini, 2004; Wan, 2008]. Известно, что сами ММСК стимулируют регенерацию костной ткани, оказывая противовоспалительное действие [Granero-Molto, 2009].

Процесс репарации костной ткани, как и в эмбриональном развитии, может происходить двояко: путем прямого остеогенеза через

непосредственное развитие костной мозоли или путем энхондрального остеогенеза через предварительное образование хряща волокнистого или гиалинового типа. Скорость и характер репарации во многом зависят от микроокружения клеток, уровня оксигенации, репозиции отломков, качества фиксации и других причин. В случае прямого остеогенеза вокруг зоны дефекта формируется первичная (мягкая) мозоль из коллагеновых волокон, которая постепенно минерализуется, в результате чего формируется ретикулофиброзная (грубоволокнистая) костная ткань, характеризующаяся хаотичным расположением волокон. В формировании костной мозоли принимают участие остеопрогениторные клетки периоста, эндоста и костного мозга, а также недифференцированные мезенхимные клетки окружающих тканей. Основными молекулярными регуляторами остеогенной дифференцировки являются белки семейства BMP. Энхондральный остеогенез наблюдается при недостаточной механической фиксации и в условиях дефицита кровоснабжения. В этом случае мезенхимальные предшественники дифференцируются в хондробласты, которые делятся, гипертрофируются, затем начинается минерализация матрикса и хрящевые клетки постепенно замещаются костными - формируется костная мозоль [Barnes, 1999]. Важную роль в регуляции энхондрального костного формирования играет TNF-a, который вызывает апоптоз гипертрофированных хондроцитов и стимулирует остеокласты.

На стадии ремоделирования неупорядоченная по структуре грубая волокнистая костная ткань заменяется ламелярной костью, образованной слоями строго параллельно расположенных коллагеновых фибрилл. Ремоделирование происходит в ответ на факторы осевой механической нагрузки, передаваемой остеоцитам, а затем остеокластам и остеобластам [Kneser, 2006; Probst, 1997]. В результате наблюдается полное восстановление структуры костной ткани, ориентация костных балок в соответствии с силовыми линиями осевой нагрузки, формируется

надкостница, восстанавливаются функциональные возможности повреждённого участка.

2.2 Развитие клеточных технологий для регенерации костной ткани

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бухарова, Татьяна Борисовна, 2014 год

Список литературы

1. Антонов E.H., Баграташвили В.Н., Бочкова С.А., Попов В.К., Попова A.B., Марквичева Е.А., Бородина Т.Н., Румш Л.Д., Фельдман Б.М. Влияние селективного лазерного спекания на активность трипсина, инкапсулированного в полилактид. Альманах клинической медицины. 2008, Том XVII, стр. 30-32.

2. Арутюнян И.В., Ржанинова A.A., Волков A.B., Гольдштейн Д.В. Влияние дексаметазона на дифференцировку мультипотентных стромальных клеток жировой ткани человека. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2009; №2: 67-72.

3. Бухарова Т.Б., Фатхудинов Т.Х., Цедик Л.В., Ильющенко А.Ф., Гольдштейн Д.В. Тканеинженерная конструкция на основе пористых керамических 3 D-носителей и мультипотентных стромальных клеток для восстановления дефектов костной ткани. Клеточные технологии в биологии и медицине 2009, №1, с.38-47.

4. Бухарова Т.Б., Антонов E.H., Попов В.К., Фатхудинов Т.Х., Попова A.B., Бочкова С.А., Баграташвили В.Н., Гольдштейн Д.В. Биосовместимость тканеинженерных конструкций на основе пористых полилактидных носителей, полученных методом селективного лазерного спекания, и мультипотентных стромальных клеток костного мозга. Клеточные технологии в биологии и медицине 2010, №1, с.40-46.

5. Бухарова Т.Б., Арутюнян И.В., Шустров С.А., Алексеева И.С., Федюнина И.А., Логовская Л.В., Волков A.B., Ржанинова A.A., Григорьян A.C., Кулаков A.A., Гольдштейн Д.В. Тканеинженерная конструкция на основе мультипотентных стромальных клеток жировой ткани и материала «Остеоматрикс» для регенерации костной ткани. Клеточные технологии в биологии и медицине 2011, № 3, с. 167-173.

6. Бухарова Т.Б., Волков A.B., Антонов E.H., Вихрова Е.Б., Попова A.B., Попов В.К., Гольдштейн Д.В. Тканеинженерная конструкция на основе

138

мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013, №4, с._.

7. Вахрушев И.В., Антонов E.H., Попова A.B., Константинова Е.В., Каралкин П.А., Холоденко И.В., Лупатов А.Ю., Попов В.К., Баграташвили В.Н., Ярыгин К.Н. Разработка тканеинженерных имплантов для регенерации костной ткани на основе полилактогликолидных скаффолдов нового поколения и мультипотентных мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба (SHED-клеток). Клеточные технологии в биологии и медицине. 2010; №1: 55-60.

8. Вахрушев И.В., Суздальцева Ю.Г., Бурунова В.В., Каралкин В.В., Лупатов А.Ю., Ярыгин К.Н. Мезенхимальные клетки пульпы молочного зуба: цитофенотип и первичная оценка возможности применения в тканевой инженерии костной ткани. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012; №1: 29-33.

9. Волков A.B. Синтетические биоматериалы на основе полимеров органических кислот в тканевой инженерии. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2005. №2, с. 43-45.

10. Гусев С.А., Щеплев П.А., Гарин H.H., Борисенко Г.Г. Система отбора перспективных имплантируемых трехмерных полимерных материалов для тканевой инженерии. Перспективные материалы 2005, №6: 49-56.

11. Деев Р.В., Исаев A.A., Кочиш А.Ю. и соавт. Клеточные технологии в травматологии и ортопедии: пути развития. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2007; 11(4): 18-30.

12. Иванов A.A. Перспективы применения стволовых клеток в медицине. В кн. Биология стволовых клеток и клеточные технологии, п/ред. Пальцева М.А., М. Медицина, 2009, т. 1, 31-43.

13. Логовская Л.В., Бухарова Т.Б., Волков А.В., Вихрова Е.Б., Махнач О.В., Гольдштейн Д.В. Индукция остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека. Клеточные технологии в биологии и медицине 2013, №1, с. 28-34.

14. Попов В.К., Евсеев А.В., Антонов Е.Н., Баграташвили В.Н., Коновалов А.Н., Панченко В.Я., Барри Д.Д., Уитакер М.Д., Хоудл С.М. Лазерные технологии изготовления индивидуальных имплантатов и матриц для тканевой инженерии. Оптический журнал. 2007. Т. 74. № 9. С. 73-79.

15. Фриденштейн А.Я., Петракова К.В., Куролесова А.И., Фролова Г.П. Клетки предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротопных трансплантантов костного мозга. Цитология 1968; 5: 557 67

16. Шехтер А.Б., Серов В.В. Воспаление и регенерация. В кн. Воспаление. М. Медицина, 1995, 200-219.

17. Agacayak S, Gulsun В, Ucan МС, Karaoz Е, Nergiz Y. Effects of mesenchymal stem cells in critical size bone defect. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2012 May; 16(5): 679-86.

18. Ai-Aql, Z. S., Alagl, A. S., Graves, D. Т., Gerstenfeld, L. C. & Einhorn, T. A. Molecular mechanisms controlling bone formation during fracture healing and distraction osteogenesis. J. Dent. Res. 2008; 87: 107-118.

19. Alexander, K. et al. Osteal macrophages promote in vivo intramembranous bone healing in a mouse tibial injury model. J. Bone Miner. Res. 2011; 26: 1517— 1532.

20. Alsberg E, Hill EE, Mooney DJ. Craniofacial tissue engineering. Crit Rev Oral Biol Med, 2001; 12(1): 64-75.

21. Alsousou J, Thompson M, Hulley P, Noble A, Willett K. The biology of platelet-rich plasma and its application in trauma and orthopaedic surgery. J Bone Joint Surg Br. 2009; 91(8): 987-96.

22. Anitua E, Andia I, Ardanza B, Nurden P, Nurden AT. Autologous platelets as a source of proteins for healing and tissue regeneration. Thromb Haemost 2004; 91:4-15.

23. Antonov E. N., V. N. Bagratashvili, S.M. Howdle, A.N. Konovalov, V.K. Popov, V.Ya. Panchenko, Fabrication of polymer scaffolds for tissue engineering using surface selective laser sintering, Laser Physics, 2006, v. 16: 774 - 787.

24. Arrington E. D., W. J. Smith, H. G. Chambers, A. L. Bucknell, N. A. Davino, "Complications of iliac crest bone graft harvesting," Clinical Orthopaedics and Related Research, 1996; 329: 300-309.

25. Bais MV, Wigner N, Young M, et al. BMP2 is essential for post natal osteogenesis but not for recruitment of osteogenic stem cells. Bone. 2009; 45(2): 254-66

26. Barnes GL, Kostenuik LC, Gerstenfeld LC, et al. Growth factor regulation of fracture repair. J Bone Miner Res. 1999; 14: 1805-1815.

27. Bastian, O. et al. Systemic inflammation and fracture healing. J. Leukoc. Biol. 2011;89:669-673.

28. Blanton MW, Hadad I, Johnstone BH, Mund JA, Rogers PI, Eppley BL, March KL. Adipose stromal cells and platelet-rich plasma therapies synergistically increase revascularization during wound healing. Reconstr. Surg. 2009 Feb; 123(2 Suppl): 56S-64S.

29. Bucholz RW. Nonallograft osteoconductive bone graft substitutes. Clin Orhop Relat Res. 2002; 44.

30. Bueno E. M. and J. Glowacki, "Cell-free and cell-based approaches for bone regeneration," Nature Reviews Rheumatology, vol. 5, no. 12, pp. 685-697, 2009.

31. Burchardt H, Enneking WF: Transplantation of bone. Surg Clin North Am 58:403-427, 1978

32. Cai L, Johnstone BH, Cook TG, Liang Z, Traktuev D, Cornetta K, Ingram DA, Rosen ED, March KL Suppression of hepatocyte growth factor production impairs the ability of adipose-derived stem cells to promote ischemic tissue revascularization. Stem Cells. 2007 Dec; 25(12): 3234-43.

33. Campagnoli C, Roberts IA, Kumar S, Bennett PR, Bellantuono I, Fisk NM. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. Blood 2001; 98: 2396 - 402.

34. Cao Y, Sun Z, Liao L, Menq Y, Han Q, Zhao RC: Human adipose tissue-derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo. Biochem Biophys Res Commun 2005; 332: 370—379.

35. Carvallo L, Henriquez B, Paredes R, Olate J, Onate S, van Wijnen AJ, Lian JB, Stein GS, Stein JL, Montecino M. 1 alpha,25-dihydroxy vitamin D3-enhanced expression of the osteocalcin gene involves increased promoter occupancy of basal transcription regulators and gradual recruitment of the 1 alpha,25-dihydroxy vitamin D3 receptor-SRC-1 coactivator complex. J Cell Physiol. 2008 Mar; 214(3):740-9.

36. Ceradini DJ, Kulkarni AR, Callaghan MJ, et al. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. Nature Medicine. 2004; 10(8):858-64.

37. Chatterjea, A., Meijer, G., van Blitterswijk C, de Boer J. Clinical Application of Human Mesenchymal Stromal Cells for Bone Tissue Engineering. Stem Cells Int. 2010; Vol. 2010, 12 pages.

38. Chen CW, Montelatici E, Crisan M, Corselli M, Huard J, Lazzari L, Peault B Perivascular multi-lineage progenitor cells in human organs: regenerative units, cytokine sources or both? Cytokine Growth Factor Rev. 2009 Oct-Dec; 20(5-6): 429-34.

39. Chen D, Ji X, Harris MA, Feng JQ, Karsenty G, Celeste AJ, Rosen V, Mundy GR, Harris SE. Differential roles for bone marrow morphogenic protein

(BMP) receptor type IB and IA in differentiation and specification of mesenchymal precursor cells to osteoblast and adipocyte lineages. J Cell Biol 1998; 142: 295305.

40. Cheng H, Jiang W, Phillips FM, Haydon RC, Peng Y, Zhou L, Luu HH, An N, Breyer B, Vanichakarn P, Szatkowski JP, Park JY, He TC (2003) Osteogenic activity of the fourteen types of human bone morphogenic proteins (BMPs). J Bone Surg Am 85: 1544-1552

41. Chieregato K, Castegnaro S, Madeo D, Astori G, Pegoraro M, Rodeghiero F. Epidermal growth factor, basic fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor-bb can substitute for fetal bovine serum and compete with human platelet-rich plasma in the ex vivo expansion of mesenchymal stromal cells derived from adipose tissue. Cytotherapy. 2011 Sep; 13(8):933-43. Epub 2011 May 30.

42. Cho HH, Kyoung KM, Seo MJ, et al. Overexpression of CXCR4 increases migration and proliferation of human adipose tissue stromal cells. Stem Cells & Development. 2006; 15(6): 853-64.

43. Cognet PA, Minguell JJ Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells. J Cell Physiol 1999; 181: 67-73.

44. Conejero JA, Lee JA, Parrett BM, Terry M, Wear-Maggitti K, Grant RT, Breitbart AS. Repair of palatal bone defects using osteogenically differentiated fat-derived stem cells. Plast Reconstr Surg. 2006 Mar; 117(3): 857-63.

45. Cooper, A. I. Polymer synthesis and processing using supercritical carbon dioxide. J. Mater. Chem. 2000; 10: 207-234.

46. Cowan CM, Shi YY, Aalami OO, Chou YF, Mari C, Thomas R, Quarto N, Contag CH, Wu B, Longaker MT. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nat Biotechnol. 2004 May; 22(5): 560-7.

47. Dallari D, Fini M, Stagni C et al. In vivo study on the healing of bone defects treated with bone marrow stromal cells, platelet-rich plasma, and freeze-dried bone allografts, alone and in combination. J Orthop Res 2006; 24: 877-888.

48. Dallari D, Savarino L, Greco M, Rani N, Piccolo N. D, Baldini N. Relevance of deep decortication and vascularization in a case of post-traumatic femoral non-union treated with grafts, platelet gel and bone marrow stromal cells Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc 2012; 20: 1834-1838.

49. Dazzi F, Ramasamy R, Glennie S, Jones SP, Roberts I The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis. Blood Rev 2006; 20: 161-171.

50. De Bari C, Dell'Accio F, Tylzanowski P, Luyten FP. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane. Arthritis Rheum 2001; 44: 1928-42.

51. Dennis JE, Charbord P. Origin and differentiation of human and murine stroma. Stem Cells 2002; 20: 205-214.

52. DePalma AF, Rothman RH, Lewinnek GE, et al: Anterior interbody fusion for severe cervical disc degeneration. Surg Gynecol Obstet 1972; 134: 755-758.

53. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8(4): 315-7.

54. Efimenko A., Starostina E., Kalinina N., Stolzing A. Angiogenic properties of aged adipose derived mesenchymal stem cells after hypoxic conditioning. Journal of Translational Medicine 2011, 9:10.

55. Egusa H, Schweizer FE, Wang CC, Matsuka Y, Nishimura I. Ne uronal differentiation of bone marrow-derived stromal stem cells involves suppression of discordant phenotypes through gene silencing. J Biol Chem 2005; 280(25): 236917.

56. El-Ghannam A. Bone reconstruction: from bioceramics to tissue engineering. Expert Rev Med Devices. 2005 Jan; 2(1): 87-101.

57. Estes BT, Diekman BO, Guilak FMonolayer cell expansion conditions affect the chondrogenic potential of adipose-derived stem cells. Biotechnol Bioeng. 2008 Mar 1; 99(4): 986-95.

58. Fellah B. H., O. Gauthier, P. Weiss, D. Chappard, and P. Layrolle, Osteogenicity of biphasic calcium phosphate ceramics and bone autograft in a goat model, Biomaterials, 2008; vol. 29, no. 9, pp. 1177-1188.

59. Fibbe WE, Noort WA Mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells transplantation. Ann NY Acad Sci 2003; 996: 235-244.

60. Finkemeier C. G., Bone-grafting and bone-graft substitutes, Journal of Bone and Joint Surgery. Series A, 2002 vol. 84, no. 3, pp. 454-464.

61. Fraser JK, Schreiber R, Strem B, et al.: Plasticity of human adipose stem cells toward endothelial cells and cardiomyocytes. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2006 (2); 3: Suppl 1: S33—37.

62. Friedenstein A, et al. Precursors for fibroblasts in different populations of hemopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method. Exper Hematol. 1974; 2: 83-92.

63. Friedenstein A. Stromal mechanocytes of bone marrow: cloning in vitro and retransplantation in vivo. In: Thierfelder S, Rodt H, Kolb H (eds). Immunology of bone marrow transplantation. Springer-Verlag. 1980; 19-29.

64. Friedenstein A.J, Chailakhjan R.V, Lalykina K.S. The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet. 1970; 3: 393-403.

65. Friedenstein A.J, Chajlachyan R.K, Gerasimov Y.F. Bone marrow osteogenic stem cells in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 1987; 20: 263-272.

66. Friedenstein A.J. Stromal-hematopoietic interrelationships: Maximov,s ideas and modern models. Haematol. Blood Transfus. 1989; 32: 159-67.

67. Friedenstein, A.J. Determined and inducible osteogenic precursor cells. In: Hand Tissue Growth Repair and Remineralisation. Ciba Foundation Symposium. New series 1973; 11: 169-181.

68. Fröhlich M., W. L. Grayson, L. Q.Wan, D.Marolt, M. Drobnic, G. Vunjak-Novakovic. Tissue engineered bone grafts: biological requirements, tissue culture and clinical relevance. Current Stem Cell Research & Therapy, 2008; vol. 3, no. 4, pp. 254-264.

69. Gerstenfeld LC, Cullinane DM, Barnes GL, et al. Fracture healing as a postnatal developmental process: molecular, spatial, and temporal aspects of its regulation. Journal of Cellular Biochemistry. 2003; 88(5): 873-84.

70. Göpferich A. Mechanisms of polymer degradation and erosion. Biomaterials. 1996 Jan; 17(2):103-14.

71. Granero-Molto F, Weis JA, Miga MI, et al. Regenerative effects of transplanted mesenchymal stem cells in fracture healing. Stem Cells. 2009; 27(8): 1887-98.

72. Gronthos S, Franklin DM, Leddy HA, Robey PG, Storms RW, Gimble JM. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells. J Cell Physiol 2001; 189: 54-63.

73. Gunatillake P.A., Adhikari R. Biodegradable synthetic polymer for tissue engineering. European Cells and Materials 2003; 5: 1-16.

74. Gupta A, Leong DT, Bai HF, Singh SB, Lim TC, Hutmacher DW. Osteo-maturation of adipose-derived stem cells required the combined action of vitamin D3, beta-glycerophosphate, and ascorbic acid. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Oct 12; 362(1): 17-24.

75. Habibovic P, Kruyt MC, Juhl MV, Clyens S, Martinetti R, Dolcini L, Theilgaard N, van Blitterswijk CA. Comparative in vivo study of six hydroxyapatite-based bone graft substitutes. J Orthop Res. 2008 Oct; 26(10): 136370.

76. Hauschka P.V. Osteocalcin: the vitamin K-dependent Ca2+-binding protein of bone matrix. Haemostasis. 1986; 16(3-4): 258-72.

77. Hanna R, Trejo PM,Weltman RL. Treatment of intrabony defects with bovine derived xenograft alone and in combination with platelet-rich plasma: a randomized clinical trial. J Periodontol 2004; 75(12): 1668-77.

78. Harris, L. D., B. S. Kim, and D. J. Mooney. Open pore biodegradable matrices formed with gas foaming. J. Biomed. Mater. Res. 1998; 42: 396^102.

79. Hibi H, Yamada Y, Ueda M, Endo Y. Alveolar cleft osteoplasty using tissue-engineered osteogenic material. Int J Oral Maxillofac Surg 2006; 35: 551-5.

80. Horwitz E, Le Blanc K, Dominici M, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Deans R, Krause D, Keating A. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2005; 7; 5:393-395

81. Howard D., Buttery L.D., Shakesheff K.M. et al. Tissue engineering: strategies, stem cells and scaffolds. J Anat. 2008; 213(1): 66-72.

82. Hutmacher D. W., M. Sittinger, M. V. Risbud, Scaffold-based tissue engineering: rationale for computer-aided design and solid free-form fabrication systems, Trends in Biotechnology, 2004; 22: 354-362.

83. Ilgenli T, Dundar N, Kal BI. Demineralized freeze-dried bone allograft and platelet-rich plasma vs. platelet-rich plasma alone in infrabony defects: a clinical and radiographic evaluation. Clin Oral Investig 2007; 11:51-59.

84. in't Anker PS , Noort WA , Scherjon SA , et al. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunopheno type but a heterogeneous multilineage differentiation potential. Haematologica 2003; 88: 845 - 52.

85. Ito K, Yamada Y, Naiki T, Ueda M. Simultaneous implant placement and bone regeneration around dental implants using tissue-engineered bone with fibrin

glue, mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma. Clin. Oral Impl. Res. 2006; 17: 579-586.

86. Izadpanah R, Trygg C, Patel B, Kriedt C, Dufour J, Gimble JM, Bunnell BA. Biologic properties of mesenchymal stem cells derived from bone marrow and adipose tissue. J Cell Biochem. 2006 Dec 1; 99(5): 1285-97.

87. Jeon O, Rhie JW, Kwon IK, Kim JH, Kim BS, Lee SH. In vivo bone formation following transplantation of human adipose-derived stromal cells that are not differentiated osteogenically. Tissue Eng Part A. 2008 Aug; 14(8): 128594.

88. Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Shwartz RE, Keene CD, Oritz-Gonzalez XR, Reyes M, Lenvik T, Lund T, Blackstad M, Du J, Aldrich S, Lisberg A, Low W, Largaespada DA, Verfaillie CM. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature 2002; 418: 41-49.

89. Jorgensen NR, Henriksen Z, Sorensen OH, Civitelli R. Dexamethasone, BMP2, and 1,25-dihydroxyvitamin D enhance a more differentiated osteoblast phenotype: validation of an in vitro model for human bone marrow-derived primary osteoblasts. Steroids. 2004 Apr; 69(4):219-26.

90. Jürgens WJ, Oedayrajsingh-Varma MJ, Helder MN, Zandiehdoulabi B, Schouten TE, Kuik DJ, Ritt MJ, van Miliigen FJ. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell Tissue Res. 2008 Jun; 332(3): 415-26.

91. Kakudo N, Shimotsuma A, Kusumoto K Fibroblast growth factor-2 stimulates adipogenic differentiation of human adipose-derived stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Jul 27; 359(2): 239-44.

92. Kanczler JM, Mirmalek-Sani SH, Hanley NA, Ivanov AL, Barry JJ, Upton C, Shakesheff KM, Howdle SM, Antonov EN, Bagratashvili VN, Popov VK, Oreffo RO. Biocompatibility and osteogenic potential of human fetal femur-

derived cells on surface selective laser sintered scaffolds. Acta Biomater. 2009 Jul; 5(6): 2063-71.

93. Kemp P. History of regenerative medicine: looking backwards to move forwards. Regenerative Med. 2006; 1(5): 653-669.

94. Kilroy GE, Foster SJ, Wu X, Ruiz J, Sherwood S, Heifetz A, Ludlow JW, Strieker DM, Potiny S, Green P, Halvorsen YD, Cheatham B, Storms RW, Gimble JM. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 2007 Sep; 212(3): 702-9.

95. Kitagawa Y, Korobi M, Toriyama K, Kamei Y, Torii S: History of discovery of human adipose-derived stem cells and their clinical application. Jpn J Plast Reconstr Surg 2006; 49: 1097—1104.

96. Kitaori T, Ito H, Schwarz EM, et al. Stromal cell-derived factor 1/CXCR4 signaling is critical for the recruitment of mesenchymal stem cells to the fracture site during skeletal repair in a mouse model. Arthritis & Rheumatism. 2009; 60(3): 813-23.

97. Kitoh H, Kitakoji T, Tsuchiya H, Katoh M, Ishiguro N. Transplantation of culture expanded bone marrow cells and platelet rich plasma in distraction osteogenesis of the long bones. Bone 2007; 40: 522-528.

98. Kitoh H, Kitakoji T, Tsuchiya H, Mitsuyama H, Nakamura H, Katoh M, Ishiguro N. Transplantation of marrow-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma during distraction osteogenesis—a preliminary result of three cases. Bone. 2004 Oct; 35(4): 892-8.

99. Kneser, U., Schaefer, D., Polykandriotis, E., & Horch, R. Tissue engineering of bone: the reconstructive surgeon's point of view. J Cell Mol Med, 2006, 10(1): 7-19.

100. Kolar, P. et al. The early fracture hematoma and its potential role in fracture healing. Tissue Eng. Part B Rev. 2010; 16, 427^34.

101. Kolar, P., Gaber, T., Perka, C., Duda, G. N. & Buttgereit, F. Human early fracture hematoma is characterized by inflammation and hypoxia. Clin. Orthop. Relat. Res. 2011; 469, 3118-3126.

102. Kon, T. et al. Expression of osteoprotegerin, receptor activator of NF-kB ligand (osteoprotegerin ligand) and related proinflammatory cytokines during fracture healing. J. Bone Miner. Res. 2001; 16: 1004-1014.

103. Kuznetsov SA , Mankani MH , Gronthos S , Satomura K , Bianco P , Robey PG . Circulating skeletal stem cells. J Cell Biol 2001; 153: 1133 - 40.

104. Landers R, Hubner U, Schmelzeisen R, Mulhaupt R. Rapid prototyping of scaffolds derived from thermoreversible hydrogels and tailored for applications in tissue engineering. Biomaterials 2002; 23: 4437-47.

105. Langer R, Vacanti JP: Tissue engineering. Science 1993; 260, 920-926.

106. Laurencin CT. Bone graft substitutes. Laurencin CT, editor. W. Conshohocken, PA: ASTM International; 2003

107. Laurie S. W. S., L. B. Kaban, J. B. Mulliken, J. E. Murray, "Donor-site morbidity after harvesting rib and iliac bone," Plastic and Reconstructive Surgery, 1984; vol. 73, no. 6, pp. 933-938.

108. Lecka-Czernik B, Gubrij I, Moerman EJ, Kajkenova O, Lipschitz DA, Manolagas SC, Jilka RL. Inhibition of Osf2/Cbfal expression and terminal osteoblast differentiation by PPAR-y2. J Cell Biochem 1999; 74: 357-371

109. Lee JA, Parrett BM, Conejero JA, Laser J, Chen J, Kogon AJ, Nanda D, Grant RT, Breitbart AS. Biological alchemy: engineering bone and fat from fat-derived stem cells. Ann Plast Surg. 2003 Jun; 50(6): 610-7.

110. Lee JY, Choi B, Wu B, Lee M. Customized biomimetic scaffolds created by indirect three-dimensional printing for tissue engineering. Biofabrication. 2013 Dec; 5(4): 045003.

111. Lendeckel S, Jodicke A, Christophis P, Heidinger K, Wolff J, Fraser JK, Hedrick MH, Berthold L, Howaldt HP. Autologous stem cells (adipose) and fibrin glue used to treat widespread traumatic calvarial defects: case report. J Craniomaxillofac Surg. 2004 Dec; 32(6): 370-3.

112. Leong K.F., C.M. Cheah, C. K. Chua, Solid freeform fabrication of three-dimentional scaffolds for engineering replacement tissues and organs, Biomaterials, 2003, 24: 2363-2378.

113. Lienau, J. et al. Differential regulation of blood vessel formation between standard and delayed bone healing. J. Orthop. Res. 2009; 27, 1133-1140.

114. Lin L, Fu X, Zhang X, Chen LX, Zhang JY, Yu CL, Ma KT, Zhou CY. Rat adipose-derived stromal cells expressing BMP4 induce ectopic bone formation in vitro and in vivo. Acta Pharmacol Sin. 2006 Dec;27(12):1608-15.

115. Liu HY, Wu AT, Tsai CY, Chou KR, Zeng R, Wang MF, Chang WC, Hwang SM, Su CH, Deng WP: The balance between adipogenesis and osteogenesis in bone regeneration by platelet rich plasma for age-related osteoporosis. Biomaterials. 2011 Oct; 32(28): 6773-80.

116. Liu P, Oyajobi BO, Russell RG, Scutt A: Regulation of osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells: interaction between transforming growth factor-beta and l,25(OH)(2) vitamin D(3) in vitro. Calcif Tissue Int 1999, 65: 173-180.

117. Liu Y, Wang L, Kikuiri T, Akiyama K, Chen C, Xu X, et al. Mesenchymal stem cell-based tissue regeneration is governed by recipient T lymphocytes via IFN-gamma and TNF-alpha. Nat Med 2011; 17: 1594-601.

118. Liu ZJ, Zhuge Y, Velazquez OC. Trafficking and differentiation of mesenchymal stem cells. J Cell Biochem. 2009 Apr 15; 106(6): 984-91.

119. Locke M, Windsor J, Dunbar PR. Human adipose-derived stem cells: isolation, characterization and applications in surgery. ANZ J Surg. 2009 Apr; 79(4): 235-44.

120. Ma P. X. and J. W. Choi. Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical pore network. Tissue Eng. 7:23-33, 2001.

121. Ma P. X., R. Langer. Fabrication of Biodegradable Polymer foams for cell transplantation and tissue engineering. In: Tissue Engineering Methods and Protocols, edited by M. Yarmush and J. Morgen. Totowa, NJ: Humana Press, 1998, pp. 47-56.

122. Mackie EJ. Osteoblasts: novel roles in orchestration of skeletal architecture. Int J Biochem Cell Biol 2003; 35: 1301-1305.

123. Makino S, Fukuda K, Miyoshi S, Konishi F, Kodama H, Pan J, Sano M, Takahashi T, Hori S, Abe H, Hata J, Umezawa A, Ogawa S. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro. J Clin Invest 1999; 103: 697-705.

124. Malladi P, Xu Y, Yang GP, Longaker MT. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in adipose-derived mesenchymal cells. Tissue Eng. 2006 Jul; 12(7): 2031-40.

125. Marx RE, Carlson ER, Eichstaedt RM, Schimmele SR, Strauss JE, Georgeff KR. Platelet-rich plasma: growth factor enhancement for bone grafts. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 1998; 85(6): 638^16.

126. Marx RE. Platelet-rich plasma: evidence to support its use. J Oral Maxillofac Surg. 2004; 62: 498-93.

127. Mcintosh K, Zvonic S, Garrett S, Mitchell JB, Floyd ZE, Hammill L, Kloster A, Halvorsen YD, Ting JP, Storms RW, Goh B, Kilroy G, Wu X, Gimble JM. The immunogenicity of human adipose derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 2006; 24: 1245-1253.

128. McKibbin, B. The biology of fracture healing in long bones. J. Bone Joint Surg. Br. 1978; 60.B, 150-162.

129. Mesimaki K, Lindroos B, To.rnwall J, Mauno J, Lindqvist C, Kontio R, et al. Novel maxillary reconstruction with ectopic bone formation by GMP adipose stem cells. Int J Oral Maxillofac Surg 2009; 38: 201-9.

130. Mitchell JB, Mcintosh K, Zvonic S, Garrett S, Floyd ZE, Kloster A, Di Halvorsen Y, Storms RW, Goh B, Kilroy G, Wu X, Gimble JM. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 2006 Feb; 24(2): 376-85.

131. Miura M, Gronthos S, Zhao M , et al . SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: 5807 - 12.

132. Mizuno H, Itoi Y, Kawahara S, Ogawa R, Akaishi S, Hyakusoku H: In vivo adipose tissue regeneration by adipose-derived stromal cells isolated from GFP transgenic mice. Cells Tissues Organs 2008; 187: 177—185.

133. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983 Dec 16; 65(1-2): 55-63.

134. Muguruma Y, Yahata T, Miyatake H, Sato T, Uno T, Itoh J, Kato S, Ito M, Hotta T, Ando K. Reconstitition of the functional human hematopietic microenvironment derived from human mesenchymal stem cells in the murine bone marrow compartment. Blood 2006; 107: 1878-87.

135. Murphy CM, O'Brien FJ, Little DG, Schindeler A. Cell-scaffold interactions in the bone tissue engineering triad. Eur Cell Mater. 2013 Sep 20;26:120-32.

136. Muschler GF, Lane JM, Dawson EG: The biology of spinal fusion, in Cotler JM, Cotler HP (eds): Spinal Fusion Science and Technique. Berlin: SpringerVerlag, 1990, pp 9-21.

137. Nam, Y. S., and T. G. Park. Porous biodegradable polymeric scaffolds prepared by thermally induced phase separation. J. Biomed. Mater. Res. 1999; 47: 8-17.

138. Niemeyer Ph, Fechner K, Milz, Richter, Suedkamp, Mehlhorn A, Pearce C, Kasten Ph. Comparison of mesenchymal stem cells from bone marrow and adipose tissue for bone regeneration in a critical size defect of the sheep tibia and the influence of platelet-rich plasma. Biomaterials 2010; 31: 3572-3579.

139. Noel D, Gazit D, Bouquet C, Apparailly F, Bony C, Plence P, Millet V, Turgeman G, Perricaudet M, Sany J, Jorgensen C. Short-term BMP-2 expression is sufficient for in vivo osteo-chondral differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells 2004; 22: 74-85.

140. Oldberg A, Franzen A, Heinegard D. J Biol Chem.The primary structure of a cell-binding bone sialoprotein. 1988 Dec 25;263(36)-.19430-2.

141. Otaki S, Ueshima S, Shiraishi K, et al. Mesenchymal progenitor cells in adult human dental pulp and their ability to form bone when transplanted into immunocompromised mice. Cell Biol Int 2007; 31: 1191-7.

142. Ouyang XY, Qiao J. Effect of platelet-rich plasma in the treatment of periodontal intrabony defects in humans. Chin Med J 2006; 119(18): 1511-21.

143. Pak J. Autologous Adipose Tissue-Derived Stem Cells Induce Persistent Bone-Like Tissue in Osteonecrotic Femoral Heads. Pain Physician 2012; 15: 7585.

144. Pak J. Regeneration of human bones in hip osteonecrosis and human cartilage in knee osteoarthritis with adipose-tissue-derived stem cells. J Med Case Rep. 2011; 5: 296.

145. Piemontese M, Aspriello SD, Rubini C, Ferrante L, Procaccini M. Treatment of periodontal intrabony defects with demineralized freeze-dried bone allograft in combination with platelet-rich plasma: a comparative clinical trial. J Periodontol 2008; 79(5): 802-10.

146. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simoneti DW, Craig S, Marshak DR. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143-147.

147. Probst A, Spiegel HU. Cellular mechanisms of bone repair. J Invest Surg, 1997; 10(3): 77-86.

148. Prockop DJ, Gregory CA, Spees JL. One strategy for cell and gene therapy: harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100, Suppl 1:11917-23.

149. Prolo DJ: Biology of bone fusion. Clin Neurosurg 1990; 36: 135-146.

150. Quarto N, Longaker MT. FGF-2 inhibits osteogenesis in mouse adipose tissue-derived stromal cells and sustains their proliferative and osteogenic potential state. Tissue Eng. 2006 Jun; 12(6): 1405-18.

151. Quarto N, Wan DC, Longaker MT. Molecular mechanisms of FGF-2 inhibitory activity in the osteogenic context of mouse adipose-derived stem cells (mASCs). Bone. 2008 Jun; 42(6): 1040-52.

152. Quarto R., M. Mastrogiacomo, R. Cancedda et al. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells. New England Journal of Medicine, 2001; vol. 344, no.5, 385-386.

153. Ramalho-Santos M, Yoon S, Matsuzaki Y, Mulligan RC, Melton DA. "Sternness": transcriptional profiling of embryonic and adult stem cells. Science 2002; 298: 597-600

154. Recker RR. Embryology, anatomy, and microstructure of bone, in Coe FL, Favus MJ (eds): Disorders of Bone and Mineral Metabolism. New York: Raven, 1992, pp 219-240.

155. Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, Pell CL, Johnstone BH, Considine RV, March KL. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004 Mar 16; 109(10): 1292-8.

156. Rodbell M. Localization of lipoprotein lipase in fat cells of rat adipose tissue. J Biol Chem. 1964 Mar; 239: 753-5.

157. Rosada C , Justesen J , Melsvik D , Ebbesen P , Kassem M . The human umbilical cord blood: a potential source for osteoblast progenitor cells. Calcif Tissue Int 2003; 72: 135 - 42.

158. Ross SE, Hemati N, Longo KA, Bennett CN, Lucas PC, Erickson RL, MacDougald OA Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science 2000; 289: 950-953.

159. Rubio D, Garcia-Castro J, Martin MC, de la Fuente R, Cigudosa JC, Lloyd AC, Bernad A. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 2005 Apr 15; 65(8): 3035-9.

160. Safford KM, Hicok KC, Safford SD, et al.: Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochem Biophys Res Commun 2002; 294: 371-379.

161. Salgado AJ, Coutinho OP, Reis RL. Bone tissue engineering: state of the art and future trends. Macromol Biosci. 2004 Aug 9; 4(8):743-65.

162. Sandor G.K., Tuovinen V.J., Wolff J., Patrikoski M., Jokinen J., Nieminen E., Mannerstrom B., Lappalainen O.P., Seppanen R., Miettinen S. Adipose Stem Cell Tissue-Engineered Construct Used to Treat Large Anterior Mandibular Defect: A Case Report and Review of the Clinical Application of Good Manufacturing Practice-Level Adipose Stem Cells for Bone Regeneration Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, Volume 71, Issue 5, May 2013, Pages 938-950.

163. Scheller EL, Krebsbach PH, Kohn DH. J Tissue engineering: state of the art in oral rehabilitation. Oral Rehabil. 2009 May; 36(5):368-89.

164. Schieker M, Seitz H, Drosse I, Seitz S, Mutschler W. Biomaterials as Scaffold for Bone Tissue Engineering. Eur J Trau ma 2006; 32:114-24.

165. Schipper BM, Marra KG, Zhang W, Donnenberg AD, Rubin JP. Regional anatomic and age effects on cell function of human adipose-derived stem cells. Ann Plast Surg. 2008 May; 60(5):538-44.

166. Schliephake H. Bone growth factors in maxillofacial skeletal reconstruction. Int J Oral Maxillofac Surg 2002; 31:469-84.

167. Sekiya I, Vouristo TJ, Larson BL, Prockop DJ In vitro cartilage formation by human adult stem cells from bone marrow stroma defines the sequence of

cellular and molecular events during chondrogenesis. Proc Natl Acad Sei USA 2002; 99: 4397-4402.

168. Semba I, Nonaka K, Takahashi I, Takahashi K, Dashner R, Shum L, Nuckolls GH, Slavkin HC. Positionallydependent chondrogenesis induced by BMP4 is co-regulated by Sox9 and Msx2. Dev Dyn 2000; 217: 401-414

169. Seo MJ, Suh SY, Bae YC, Jung JS: Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineage in vitro a nd in vivo. Biochem Biophys Res Commun 2005; 328: 258—264.

170. Skalak R, Fox CF. Tissue engineering. Granlibakken, Lake Tahoe: Proc wrkshop; New York: Liss; 1988. p 26-29.

171. Song Insun, Kim Byung-Soo, Kim Chang-Sung, Im Gun-Il. Effects of BMP-2 and vitamin D3 on the osteogenic differentiation of adipose stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 2011; 408: 126-131.

172. Srouji S, Kizhner T, Livne E. 3D scaffolds for bone marrow stem cell support in bone repair. Regen Med. 2006 Jul; 1(4): 519-28.

173. Studitsky, A.N. Uber das Wachstum des Knochengewebes und Periostis in vitro und auf der Allantois / A.N. Studitsky / / Archiv fur experimentelle Zellforschung besonders Gewebezuchtung (Explantation). 1933. Bd. XIII. S. 390406.

174. Tan KH, Chua CK, Leong KF, Cheah CM, Cheang P, Baker MS, et al. Scaffold development using selective laser sintering of polyetheretherketone-hydroxyapatite biocomposite blends. Biomaterials 2003; 24: 3115-23.

175. Tayton E, Purcell M, Aarvold A, Smith JO, Briscoe A, Kanczler JM, Shakesheff KM, Howdle SM, Dunlop DG, Oreffo RO. A comparision of polymer and polymer-hydroxyapatite composite tissue engineered scaffolds for use in bone regeneration. An in vitro and in vivo study. J Biomed Mater Res A. 2013; Aug 21.

176. Timper K, Seboek D, Eberhardt M, et al.: Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells differentiate into insulin, somatostatin, and glucagon expressing cells. Biochem Biophys Res Commun 2006; 341: 1135—1140.

177. Tobita M, Uysal AC, Ogawa R, Hyakusoku H, Mizuno H. Periodontal tissue regeneration with adipose-derived stem cells. Tissue Eng Part A. 2008 Jun; 14(6): 945-53.

178. Tobita M, Uysal CA, Guo X, Hyakusoku H, Mizuno H. Periodontal tissue regeneration by combined implantation of adipose tissue-derived stem cells and platelet-rich plasma in a canine model. Cytotherapy. 2013 Dec; 15(12): 1517-26.

179. Tong Q, Dalgin G, Xu H, Ting CN, Leiden JM, Hotamisligil GS Function of GATA transcription factors in preadipocyte-adipocyte transition. Science 2000; 290: 134-138.

180. Troum S, Dalton ML Jr. Osteogenesis in a rat model: use of bone marrow cells and biodegradable gelatin matrix carrier. J South Orthop Assoc. 2001 Spring; 10(1): 37-43.

181. Ueda M, Yamada Y, Kagami H, Hibi H. Injectable bone applied for ridge augmentation and dental implant placement: human progress study. Implant Dent 2008; 17: 82-90.

182. Ueda M, Yamada Y, Ozawa R, Okazaki Y. Clinical case reports of injectable tissue-engineered bone for alveolar augmentation with simultaneous implant placement. Int J Periodontics Restorative Dent. 2005 Apr; 25(2): 129-37.

183. Wan C, Gilbert SR, Wang Y, et al. Activation of the hypoxia-inducible factor-1 alpha pathway accelerates bone regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2008; 105(2): 686-91.

184. Weibrich G, Kleis WKG, Hafner G, Hitzler WE. Growth factor levels in platelet rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J Cranio Maxillofacial Surg 2002; 30: 97-102.

185. Whang, K., C. H. Thomas, K. E. Healy, and G. Nuber. A novel method to fabricate bioabsorbable scaffolds. Polymer 1995; 36: 837-842.

186. Whitman DH, Berry RL, Green DM. Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery. J Oral Maxillofac Surg 1997; 55: 1294-9.

187. Xing, Z. et al. Multiple roles for CCR2 during fracture healing. Dis. Model. Mech. 2010; 3: 451—458.

188. Xu W, Zhang X, Qian H, Zhu W, Sun X, Hu J, Zhou H, Chen Y. Mesenchymal stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in vitro. Exp Biol Med (Maywood) 2004; 229: 623-631.

189. Yamada Y, Ueda M, Naiki T, Nagasaka T. Tissue-engineered injectable bone regeneration for osseointegrated dental implants Clin. Oral Impl. Res. 2004; 15: 589-597.

190. Yamada Y, Nakamura S, Ito K, Kohgo T, Hibi H, Nagasaka T, et al. Injectable tissue-engineered bone using autogenous bone marrow-derived stromal cells for maxillary sinus augmentation: clinical application report from a 2-6-year follow-up. Tissue Eng Part A, 2008; 14: 1699-707.

191. Yamada Y, Nakamura S, Ueda M, Ito K. Osteotome technique with injectable tissue-engineered bone and simultaneous implant placement by cell therapy. Clin Oral Implants Res, 2013 Apr; 24(4): 468-74.

192. Yamada Y, Ueda M, Hibi H, Baba S. A novel approach to periodontal tissue regeneration with mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma using tissue engineering technology: a clinical case report. Int J Periodontics Restorative Dent 2006; 26: 363-9.

193. Yamada Y, Ueda M, Hibi H, Nagasaka T. Translational research for

injectable tissue-engineered bone regeneration using mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: from basic research to clinical case study. Cell Transplant 2004; 13: 343-55.

194. Yang X, Ricciardi BF, Hernandez-Soria A, et al. Callus mineralization and maturation are delayed during fracture healing in interleukin-6 knockout mice. Bone. 2007; 41(6):928-36.

195. Ye X, Yin X, Yang D, Tan J, Liu G.Ectopic bone regeneration by human bone marrow mononucleated cells, undifferentiated and osteogenically differentiated bone marrow mesenchymal stem cells in beta-tricalcium phosphate scaffolds Tissue Eng Part C Methods. 2012 Jul; 18(7): 545-56.

196. Yoon E, Dhar S, Chun DE, Gharibjanian NA, Evans GR. In vivo osteogenic potential of human adipose-derived stem cells/poly lactide-co-glycolic acid constructs for bone regeneration in a rat critical-sized calvarial defect model. Tissue Eng. 2007 Mar; 13(3): 619-27.

197. Yuan, M. Van Den Doel, S. Li, C. A. Van Blitterswijk, K. De Groot and J. D. De Bruijn, "A comparison of the osteoinductive potential of two calcium phosphate ceramics implanted intramuscularly in goats," Journal of Materials Science, vol. 13, no. 12, pp. 1271-1275, 2002.

198. Yuan, W. J. Zhang, G. Liu et al., "Repair of canine mandibular bone defects with bone marrow stromal cells and coral," Tissue Engineering A, vol. 16, no. 4, pp. 1385-1394, 2010.

199. Zanetti AS, Sabliov C, Gimble JM, Hayes DJ. Human adipose-derived stem cells and three-dimensional scaffold constructs: a review of the biomaterials and models currently used for bone regeneration. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2013 Jan; 101(1): 187-99.

200. Zeng Q, Li X, Beck G, Balian G, Shen FH Growth and differentiation factor-5 (GDF-5) stimulates osteogenic differentiation and increases vascular

endothelial growth factor (VEGF) levels in fat-derived stromal cells in vitro. Bone. 2007 Feb; 40(2): 374-81.

201. Zhang N, Wu YP, Qian SJ, Teng C, Chen S, Li H. Research progress in the mechanism of effect of PRP in bone deficiency healing. Scientific World Journal. 2013 Apr 4; 2013: 134582.

202. Zhou YS, Liu YS, Tan JG. Is 1, 25-dihydroxyvitamin D3 an ideal substitute for dexamethasone for inducing osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived stromal cells in vitro? Chin Med J (Engl). 2006 Aug 5; 119(15):

203. Zhu, Choi, Huh, Jung, Kim, Lee. A comparative qualitative histological analysis of tissue-engineered bone using bone marrow mesenchymal stem cells, alveolar bone cells, and periosteal cells. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 2006; 101: 164-9

204. Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001 Apr;7(2): 211-28.

205. Zuk, P. A., Zhu, M., Ashjian, P., De Ugarte, D. A., Huang, J. I., Mizuno, H., Alfonso, Z. C., Fraser, J. K., Benhaim, P., and Hedrick, M. H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell 2002; 13: 4279^1295.

1278-86.

/