Получение и анализ трансгенных растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh с повышенной экспрессией генов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Погорелко, Геннадий Владимирович

• Погорелко, Геннадий Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Погорелко, Геннадий Владимирович

1. Введение

1.1 Актуальность темы.

1.2 Цель и задачи работы.

1.2.1 Цель работы:

1.2.2 Задачи:

1.3 Научная новизна.

1.4 Практическая,значимость работы.

2. Обзор литературы 11 2.1 Состояние проблемы.

• 2.2 Определение взаимосвязи между последовательностями ДНК и их функциями

2.2.1 Инсерционный мутагенез.

2.2.1.1 Индукция инсерционных мутаций при помощи транспозонов

2.2.1.2 Индукция инсерционных мутаций при помощи Т-ДНК

2.2.1.3 Векторы для трансформации растений

2.2.1.4 Энхансеры.

2.2.1.5 Векторы специального назначения на основе фаговых систем рекомбинации.

2.3 Использование Arabidopsis thaliana в качестве модельного объекта молекулярно- ^у генетических исследований высших растений.

2.3.1 Общие характеристики

2.3.2 Коллекции инсерционных мутантов A.thaliana

2.3.2.1 Коллекции loss-of-function мутантов

2.3.2.2 Коллекции gain-of-function мутантов

2.3.3 Морфологические мутанты.

2.4 Методы агробактериальной трансформации растений

2.5 Идентификация генов, меченных с помощью Т-ДНК

2.5.1 Амплификация методом ПЦР последовательностей ДНК, нуклеотидный состав ^ которых неизвестен.

3.5.2 Метод инвертированного ПЦР (inverse PCR).

3.5.3 Метод «ТА1Ь»-ПЦР с адаптерами.

3.5.4 Метод «ТА1Ь»-ПЦР с вырожденными праймерами.

2.6 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК. 45 2.6.1 Интернет базы данных.

2.7 Итоги 47 Экспериментальная часть

3.Материалы и методы

3.1 Растительный материал

3.2 Штаммы бактерий и плазмиды, использованные в работе

3.2.1 Бактериальные штаммы

3.2.2 Плазмиды 49 3.3. Среды, использованные в работе. 50 3.3.1 Среды для культивирования бактерий. 50 3.3.2. Среды для выращивания растений А. thaliana.

3.3.2.1 Среда для выращиваниг растений A.thaliana in vitro

3.3.2.2 Среда для скрининга инсеционных мутантов A.thaliana in vitro

3.3.2.3 Среда для выращивания растений А.thaliana in vitro в присутствии A. tumefaciens

3.3.3 Антибиотики, использованные в работе. 52 3.4 Приготовление компетентных клеток E.coli 52 3.4.1 Приготовление клеток E.coli с низкой компетентностью.

3.4.2 Приготовление клеток E.coli со средней компетентностью.

3.4.3 Приготовление клеток E.coli с высокой компетентностью для электропорации.

3.5 Трансформация штаммов E.coli

3.5.1 Быстрая трансформация клеток с низкой компетентностью.

3.5.2 Трансформация клеток со средней компетентностью.

3.5.3 Трансформация клеток с высокой компетентностью (электропорация).

3.5.4 Отбор рекомбинантных плазмид.

3.6 Метод быстрого клонирования.

3.7 ПЦР-скрининг бактериальных колоний.

3.8 Трансформация A. tumefaciens.

3.8.1 Конъюгативный перенос.

3.8.2 Прямой перенос.

3.8.3 Трансформация при помощи электропорации.

3.9 Поверхностная стерилизация семян A. thciliana.

3.9.1 Быстрая стерилизация

3.9.2 Долгая стерилизация

3.10 Выращивание растений A. thaliana

3.10.1 Выращивание растений A. thaliana в стерильных условиях.

3.10.2 Выращивание растений A. thaliana в открытом грунте.

3.10.3 Выращивание трансгенных линий A. thaliana в стрессовых условиях.

3.11 Агробактериальная трансформация A. thaliana

3.11.1 Трансформация прорастающих семян.

3.11.2 Трансформация неопыленных бутонов взрослых растений.

3.12 Отбор трансгенных растений A. thaliana.

3.12.1 Отбор трансгенных растений A. thaliana in vitro.

3.12.2 Отбор трансгенных растений A. thaliana с помощью гербицида Баста.

3.12.2.1 Отбор трансгенных растений A. thaliana в почве. •

3.12.2.2 Отбор трансгенных растений A. thaliana на песке.

3.13 Выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana.

3.13.1 Выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana для ПЦР-тестирования.

3.13.2 Мини-препаративное выделение геномной ДНК из тканей A. thaliana

3.13.3 Выделение ДНК без примесей из тканей A.thaliana для клонирования и блот- ^ гибридизации.

3.13.4 Выделение ДНК без примесей из тканей A.thaliana для получения FST.

3.14 Выделение плазмидной ДНК из клеток бактерий.

3.14.1 Мини-препаративное выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток.

3.14.2 Препаративное выделение плазмидной ДНК из штаммов E.coli тепловым ^ методом.

3.14.3 Выделение плазмидной ДНК с минимальным количеством примесей.

3.15 Очистка ДНК от примесей белков.

3.16 Очистка ДНК от примесей РНК.

3.17 Уменьшение объема пробы изо-бутанолом

3.18 Хроматографическая очистка ДНК

3.19 Очистка ДНК от агарозы.

3.19.1 Очистка ДНК при помощи трубчатого электрофореза.

3.19.2 Очистка ДНК при помощи электроэлюирования.

3.19.3 Очистка ДНК при помощи центрифугирования.

3.20 Стадии клонирования: рестикция, модификация и лигирование фрагментов ДНК.

3.20.1. Клонирование ПЦР-фрагментов

3.20.2. Приготовление Т-вектора.

3.21 Блот-гибридизация по Саузерну.

3.21.1 Рестрикция геномной ДНК.

3.21.2 Электрофорез и перенос на мембрану переваренной геномной ДНК.

3.21.3 Приготовление меченного зонда.

3.21.4 Гибридизация и радиоавтографирование.

3.22 Тестирование ДНК растений при помощи ПЦР.

3.23 ПЦР-амплификация области геномной ДНК A. thaliana, примыкающей к Т-ДНК инсерции.

3.23.1 Модифицированный метод ПЦР для локализаций инсерций.

3.24 Выделение РНК из растений 7В

3.25 Синтез кД1 IK (обратная транскрипция).

3.25.1 Реакция обратной транскрипции.

3.25.2 Получение EST гена At3gl8780 (геи «домашнего хозяйства», актин)

3.25.3 Получение EST гена At5g 10080.

3.25.4 Получение EST reuaAtlg33390.

3.25.5 Получение EST гена At5g 13760.

3.25.6 Поучение полноразмерной кДНК гена At 1 g

3.26 Секвенирование Д1IK.

3.26.1 Секвенирование в лаборатории

3.26.1.1. Подготовка стёкол 8 Г'

3.26.1.2. Приготовление геля.

3.26.1.3. Заливка '

3.26.1.4. Форез

3.26.1.5. Послефорезная обработка

3.26.1.6. Автограф

3.26.2 Автоматическое секвенирование

3.27 Активизация гена Сге в трансгенных линиях A.thaliana

3.27.1 Обработка дексометазоном в стерильных условиях.

3.27.2 Обработка дексометазоном в открытом грунте.

3.28 Тестирование растений на наличие эмбриональных леталей 82 4. Результаты и обсуждение. 83 4.0. Постановка задачи

4.1 Создание системы векторов для индукции супер-экспрессии генов у двудольных растений.

4.1.1. Создание вектора pEnLox для получения индуцирующих инсерционных мутаций.

4.1.1.1. Проверка вектора pEnLox

4.1.1.2. Свойства вектора pEnLox

4.1.2. Создание вспомогательного вектора рСге для реверсий мутаций супер-экспрессии генов, вызванных действием энхансера.

4.1.2.1. Проверка вектора рСге

4.1.2.2. Свойства вектора рСге

4.1.3. Система векторов pEnLox/pCre.

4.2 Расширение коллекции инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana. 98 4.2.1. Трансформация растений Arabidopsis thaliana.

4.3 Анализ инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana.

4.3.1. Отбор трансгенных растений.

4.3.2. Установление наличия и количества инсерций.

4.3.2.1. Анализ расщеплений в ТЗ поколении '

4.3.2.2. Проверка при помощи блот-гибридизации по Саузерну

4.3.2.3. Проверка наличия энхансера Т-ДНК, интегрированной в геном методом ПЦР

4.3.3. Установление точной локализации инсерций в геноме.

4.3.3.1. Модифицированный метод RC-PCR (miPCR)

4.3.3.2. Амплификация примыкающей к бордеру последовательности не известной геномной Д1IK

4.3.3.3. Определение нуклеотидной последовательности ПЦР фрагментов

4.3.3.4. Компьютерный анализ полученных данных. 111 4.4. Проверка работоспособности системы векторов pEnLox/pCre.

4.4.1. Скрещивание Е-линий с С-линиями.

4.4.2. Отбор мутантов по двум селективным маркерам.

4.4.3. Удаление энхансера из состава интегрированной в геном Т-ДНК.

4.4.4. Проверка эффективности удаления методом ПЦР 115 4.5 Морфологические мутанты Arabidopsis thaliana

4.5.1. Поиск мутантов с измененной морфологией.

4.5.2. Идентификация генов, супер-экспрессия которых влияет на морфогенез ^ ^ Arabidopsis thaliana.

4.5.2.1 Линия Е

4.5.2.2. Компьютерный анализ гена At5gl

4.5.2.3 Линия Е

4.5.2.4. Компьютерный анализ гена Atlg33390.

4.5.2.5. Линия El

4.5.2.6. Компьютерный анализ гена At5gl3760.

4.5.2.7. Поиск возможных гомологов исследуемых генов A.thaliana.

4.5.2.8. Поиск информации об экспрессии исследуемых генов.

4.5.2.9. Проверка уровня экспрессии близлежащих к инсерциям генов.

4.5.3. Реверсия Е-мутантов к фенотипу дикого типа.

4.5.4. Обсуждение проблемы дистального действия энхансеров

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и анализ трансгенных растений Arabidopsis thaliana (L.) Heynh с повышенной экспрессией генов»

1.1 Актуальность темы.

Расшифровка полной нуклеотидной последовательности генома Arabidopsis thaliana в конце 2000 года позволила реально перейти к решению центральной проблемы молекулярной генетики высших растений1 -идентификации функции генов: Для определения функций генов-используются методы как прямой, так и обратной генетики. В' случае использования подходов прямой генетики создается коллекция' мутантов, среди которой'проводится отбор-кандидатных генов* по > фенотипу. Подход обратной генетики используют уже полученные данные о состоянии генома, о наличии и локализации.мутаций. В этом случае возможен перенос-данных, полученных на любых растениях.

При изучении таких объектов, как микроорганизмы и животные для определения функциональной значимости отдельных генов, широко используется ген-направленный мутагенез, связанный с замещением интактных генов мутантными путем гомологичной рекомбинации (Bouchez, Höfte, 1998; Rijkers et al., 1998). Однако у высших растений применение такого подхода затруднено, если вообще возможно. Это связано с относительно низкой эффективностью гомологичной рекомбинации (Klutstein et al., 2008) и, напротив, высокой эффективностью незаконной рекомбинации в соматических клетках (Puchta, Hohn, 1996). В этой связи основным методом при определении функциональной значимости генов у i высших растений, и в первую очередь у A. thaliana, является метод инсерционного мутагенеза (Огаркова и др., 1997; Томилов и др., 1999).

Несмотря на то, что кроме A. thaliana существует ряд других видов высших растений, изучение структурной организации генома^ которых активно ведется во многих лабораториях мира, A. thaliana остается самым удобным объектом для функциональной геномики. Так, например, размеры геномов Arabidopsis thaliana и Oryza sativa отличаются в 4 раза, тогда как общее количество генов в гаплоидном состоянии у этих двух растений приблизительно одинаковое. Таким образом, эффективность, использования, инсерционного мутагенеза на О. Sativa значительно ниже.

В последние 15-20 лет были разработаны методы для эффективного массового получения инсерционных мутантов-Л. thaliana (Feldmann et: al., 1987, Bechtold et. al., 1993). В результате были созданы представительные коллекции мутантных линий A. thaliana, семена, которых собраны в коллекционных центрах ABRG (http://www.arabidopsis.org/abrc/), NASC (http://arabidopsis.info/); S ALK (http://signal.salk.edu/), SAIL http://www.tmri:org/en/partnership/sair collèction.aspx) и GABI http ://www. gabi-kat.de/).

Анализ этих коллекций приводит к тому, что число идентифицированных генов стремительно растет (D. Bouchez, H. Höfte, 1998). Если в начале 90-х годов их число исчислялось десятками, то в конце 90-х годов число таких генов составило уже около 1000 (Meinke, Koornneef, 1997), а в начале 2008г. в интернет базе данных TAIR содержалась информация о функциях более чем 6400 генов, разделенных" на 866 семейств (http://www.arabidopsis.org/info/genefamily/genefamily.htnil).

Однако большинство созданных коллекций, инсерционных мутантов содержат линии, несущие ям/-мутации, или так называемые loss-of-fimction мутации, которые позволяют определять функции только стабильно экспрессирующихся в ходе развития растений генов. Этот факт заранее .свидетельствует о том, что исследовать функции всех генов, используя только loss-of-fimction тип мутаций-, невозможно. Это ограничение спектра инсерционных мутаций является»осложняющим моментом при исследовании связи между событиями в ДНК хромосомой их фенотипическим выражением. В частности, инсерционные мутации этого типа в генах, функционирующих в экстремальных условиях среды, в стандартных условиях не приводят к проявлению мутантного фенотипа. В этой связи актуальной является'задача расширения спектра мутаций, вызванных инсерцией в геном клеток растений. Этим обусловлен интерес к индукции мутаций другого типа, например, мутаций, вызывающих суперэкспрессию генов. Индукция мутаций такого рода достигается с помощью векторов, Т-ДНК которых содержит около одного из бордеров сильный промотор (или энхансер транскрипции). Инсерция Т-ДНК в этом случае может вызывать увеличение во много раз экспрессии как близлежащих генов, так и, в некоторых случаях, генов, располагающихся за несколько тысяч пар оснований нуклеотидов (Weigel et al., 2000). Такой тип мутаций получил название gain-of-function мутаций.

Однако когда структура инсерции содержит энхансер транскрипции, при ее встраивании в геном растения, могут возникать мутации двух типов: nul-мутации, связанные с инактивацией гена при встраивании в него инсерции, и мутации, обусловленные наличием сильного промотора в структуре инсерции. При массовом получении и анализе инсерционных мутаций, полученных с помощью такого рода векторов, необходимо иметь относительно простую и эффективную систему идентификации loss-of-function и gain-of-function мутаций.

В этой связи в данной работе были поставлены следующие цели и задачи.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Погорелко, Геннадий Владимирович

6. Выводы

1. Создана и проверена уникальная система векторов рЕпЬох/рСге для получения и анализа мутантов АлкаИапа, характеризующихся повышенной экспрессией, близлежащих к Т-ДНК, генов. Впервые фаговая система рекомбинации Сге/1ох была использована в активационном векторе для трансформации растений с целью определения функций генов растений, экспрессия которых отсутствует в норме в растениях дикого типа. Показана высокая эффективность удаления 35Б промотора из состава встроенной в геном Т-ДНК плазмиды рЕпЬох, что гарантирует эффективное получение ревертантов трансгенных растений.

2. При помощи системы векторов рЕпЬох/рСге создана базовая коллекция инсерционных мутантов АлкаНапа, состоящая из 156 трансгенных линий, в 21 из которых, при помощи специально разработанного модифицированного метода пиРСИ, определена локализация инсерций.

3. Установлена функциональная значимость 3-х новых генов АлНаИапа: At5gl0080, Аг]^33390 и Аг5^13760, изменение уровня экспрессии которых влияет на морфогенез АлкаИапа. Впервые было показано, что изменение экспрессии независимых генов, продукты которых аннотированы как члены семейств аспартиловых протеаз, ЭЕАН-Ьох АТФ-зависимая хеликаз и пролин богатых белков приводит к нарушению нормального морфогенеза растений АлИаИапа.

4. Благодаря созданию уникального суперэкспрессирующего мутанта АлкаИапа, линия Е78, впервые получена полноразмерная кДНК гена Аь1^33390 и определена ее нуклеотидная последовательность, продукт которого относится к классу БЕАН-Ьох АТФ-зависимых хеликаз АлНаНапа. Впервые экспериментально были определены сайты сплайсинга, 5' и 3' некодирующие области РНК, а также точный размер мРНК.

7. Публикации I

1. Фурсова OB, Погорелко ГВ, Авсюк АИ, Томилова НБ, Томилов АА, Тарасов ВА, Огаркова OA. Идентификация потенциального гена контролирующего развитие семядолей у проростков Arabidopsis thaliana. Докл. Ак. Наук. 2004. 395:161-2

2. Огаркова OA, Томилов АА, Томилова НБ, Погорелко ГВ, Тарасов ВА. Идентификация гена, мутация в котором приводит к нарушению развития гипокотиля у Arabidopsis thaliana. Генетика. 2005. т.41 №2: 165-170

3. Огаркова OA, Томилов АА, Томилова НБ, Погорелко ГВ, Тарасов В А'. Идентификация гена, мутация в котором приводит к возникновению летальных проростков у Arabidopsis thaliana. Онтогенез. 2005. т.36 №3

4. Погорелко ГВ, Фурсова ОВ, Огаркова OA, Тарасов В А. Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений. Генетика. 2007. т.43 №2: 194-202

5. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. A new technique for activation tagging in Arabidopsis. Gene. 2008. v. 414, №1-2, p. 67-75.

6. Огаркова ОА, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Фурсова ОВ, Тарасов В А. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis МаИапа: коллекция морфологических инсерционных мутантов. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 138-141

7. Огаркова ОА, Фурсова ОВ, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Тарасов ВА. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis МаИапа: идентификация нового гена вовлеченного в контроль развития семядолей. Материалы международной ' научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 142-145.

Te3HCi>i KOH^epeHi^HH, ycnn>ie h CTenAOBBie /1, oicjiaAt»i

1. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. New Mutant of Arabidopsis thaliana resistant to high concentration of hydrogen peroxide. «Free Radicals, Nitric Oxide, and Inflammation: Molecular, Biochemical, and Clinical Aspects», September 23 - October 3, 2001, Antalya, Turkey

2. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Functional Genomics of Arabidopsis thaliana. Cloning of genes. «Gene manipulation of microbial production of valuable products». Thessaloniki, Greecc, September 1 - 7, 2002

3. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Functional Genomics of Arabidopsis thaliana. Cloning of genes. «Forces, Growth and Form in Soft Condensed Matter: At the Interface between Physics and Biology», 24 March - 3 April, 2003, Geilo, Norway

4. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding New Genes Involved in Peroxides Response. «Receptors and Cell Signaling in Oxidative Stress», Hungarian Academy of Sciences, April 3-5, 2003, Budapest, Hungary

5. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Transgenic plants as the way to discover and validate novel genes and they functions. «Frontiers in Neurodegenerative Disorders and Aging: Fundamental Aspects, Clinical Perspectives and New Insights», May 26 - June 1, 2003, Antalya, Turkey

6. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding genes of controlling of lipid signaling in transgenic plants. «Lipid Signaling and Membrane Transport», June 20-25, 2003, Chieti, Italy

7. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA.Investigation of Genes Controlling Protein Phosphorilation. «EuroPhosphatases 2003», June 29 -July 3, 2003, Barcelona, Spain

8. Огаркова OA, Томилова НБ, Томилов AA, Погорелко ГВ, Фурсова OB, Тарасов ВА. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis thaliana: коллекция морфологических инсерционных мутантов. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 138-141

9. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov УА. Functional Genomics of Arabidopsis thaliana. «Atomic Force Microscopy Applications in Biology», July 7-9, 2004. Instituto Gulbenkian de Ciencia, Oeiras, Portugal

10. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Studying of House Keeping Genes on A.thalina. «Dynamics of Complex Interconnected Systems: Networks and Bioprocesses», April 11-21, 2005, Geilo, Norway

11. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Comparative Genomics. Finding Orthologeous Genes in Human and Plants. «Nuclear Receptors and their Ligands in Metabolism and Disease». July 31 - August 4, 2005. Bregenz, Austria

12. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA.Transgenic plants as the way to discover and validate novel genes and their functions in different organisms. «ABC Proteins: From Multidrug Resistance to Genetic Disease». Innsbruck, Austria, March 4-10, 2006

13. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding Orthologeous Genes in Human and Plants Controlling Disease Development. "Human and Microbial Genomics: DNA Arrays applied to Human Pathogens and Diseases", Hellenic Pasteur Institute, March 30 - April 7, 2006, Athens, Greece

14. Фурсова OB, Погорелко ГВ, Огаркова OA, Тарасов BA. Убиквитин-зависимый протеолиз. «14я Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии"», Май 31 - Июнь 9, 2006, Крым, Гурзуф, Украина.

15. Огаркова OA, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Фурсова ОВ, Тарасов В А. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis thaliana: коллекция морфологических инсерционных мутантов. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 138-141

16. Огаркова OA, Фурсова ОВ, Томилова НБ, Томилов АА, Погорелко ГВ, Тарасов ВА. Инсерционный мутагенез у Arabidopsis thaliana: идентификация нового гена вовлеченного в контроль развития семядолей. Материалы международной научно-практической конференции «Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур», 22-25 марта, 2004. Москва. 142-145.

17. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. A New System of Vectors for Plant Transformation., «International Scientific Conference "Genetics in Russia and in a World"», June 28 - July 2, 2006, N1 Vavilov Institute of General Genetics, Moscow, Russia

18. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov УА. Creation and Analyzing of Collection of Gain-of-Function mutants of A.thaliana. Microarray & Genosensor Techniques in Biomedical Applications, September 22 - 30, 2006, Prague, Czech Republic

19. Pogorelko GV. Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. A New System of Vectors for Creation and Analyzing of Gain-of-Function Mutants of A.thalina. «Plant Genomic European Meeting: Plant GEMs 5», October 11-14, 2006, Venicc, Italy. (*Постерная презентация была признана одной из пяти лучших презентаций молодых ученых и удостоена премии).

20. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA.From the variety to the integrity. Studying genes functions of higher plants on model object Arabidopsis thaliana. Bridging the Gap Between Gene Expression and Biological Function, 11-14 October, 2006, Luxembourg

21. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Studying genes functions of higher plants on model object Arabidopsis thaliana. New concepts in lipidology: from lipidomics to disease, October 21 - 25, 2006, Congress Center 'Leeuwenhorst', Noordwijkerhout, The Netherlands

22. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding Orthologeous Genes in Human and Plants Controlling Disease Development. «EMBL 8th International PhD Student Symposium "Biology of Disease - A Molecular Battlefield"», 30 November - 2 December 2006, EMBL, Heidelberg, Germany

23. Fursova OV, Pogorelko GV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Identification of Transcription Factors Involved in Regulation in the Cold. Plant Transformation Technologies. February 4-7, 2007, Vienna, Austria

24. Фурсова OB, Погорелко ГВ, Томилова НБ, Томилов АА, Брускин СА, Огаркова OA, Тарасов ВА. Создание трансгенных растений с суперэкспрессией генов, кодирующих регуляторы индуцируемых холодом транскриптом, отвечающих за устойчивость к заморозкам. 4-ый московский международный конгресс «Биотехнологии». Март 12-16. 2007. Москва, Россия.

25. Pogorelko GV, Fursova OV, Ogarkova OA, Tarasov VA. Finding Genes of Cell Metabolism Control. Systems Dynamics of Intracellular Communication -Overcoming Distance in Signalling Networks. Maale HaChamisha, Jerusalem Hills, Israel, March 18-22, 2007

9. Зарегистрированные данные I

Название Описание GenBank ID pEnLox Вектор для трансформации растений DQ645630 рСгс Вектор для трансформации растений DQ645631

El FST мутантной линии A.thaliana DX575973

Е4 FST мутантной линии A. thaliana DX573828

Е7 FST мутантной линии A.thaliana DX575974

ЕЮ FST мутантной линии A.thaliana DX575046

Е12 FST мутантной линии A.thaliana DX575040

Е13 FST мутантной линии A. thaliana DX575041

Е14 FST мутантной линии A.thaliana ' DX575045

Е15 FST мутантной линии A.thaliana DX575034

Е17 FST мутантной линии A.thaliana DX575042

Е18 FST мутантной линии A.thaliana DX575035

Е20 FST мутантной линии A.thaliana DX575036

Е21 FST мутантной линии A.thaliana DX575039

Е23 FST мутантной линии A.thaliana DX575942

Е30 FST мутантной линии A.thaliana DX575037

Е31 FST мутантной линии A.thaliana DX575943

Е35 FST мутантной линии A.thaliana DX575944

Е37 FST мутантной линии A.thaliana DX575043

Е40 FST мутантной линии A.thaliana DX575038

Е9 FST мутантной линии A.thaliana DX575044

Е78 FST мутантной линии A.thaliana Ell83464

Е134 FST мутантной линии A.thaliana EI232171

Atlgl2860l EST мутантной линии A.thaliana EG030730

Atlgl28602 EST мутантной линии A.thaliana EH643295

At5g61270 Arabidopsis thaliana O-linc EST гена At5g61270 A.thaliana EH669233

Atlgl2850 Arabidopsis thaliana X-line EST гена Atlgl2850 A.thaliana EH667252

E9PartialcDNA EST гена At5gl0080 A.thaliana EL740208

Arabidopsis thaliana helicase-like (AtJg33390) mRNA, complete sequence Полноразмерная кДНК гена AtJg33390 EF630362

5. Заключение

На современном этапе развития функциональной геномики высших растений использование методов «knock out» для исследования функций экспрессирующихся генов не может позволить охватить весь геном из-за присутствия, так называемых, «молчащих», в стандартных условиях развития растения, генов. Созданные на данный момент вектора для получения» суперэкспрессирующих мутантов не используются широко из-за неудобств анализа такого типа мутантов. Описанная в данной работе уникальная система векторов позволяет обойти такого рода проблемы. На примере 3-х мутантов показана работоспособность новой системы, которая позволила уже на первых этапах определить 3 гена, изменение уровня экспрессии которых влияет на морфогенез A.thaliana. Этому способствовала также разработка высокоэффективного модифицированного метода определения локализаций инсерций в геноме растения. Также было 'продемонстрировано, что суперэкспрессирующие мутанты являются удобным инструментом для получения полноразмерных кДНК генов, экспрессия которых очень низкая или вовсе отсутствует в растениях дикого типа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Погорелко, Геннадий Владимирович, 2008 год

1. Гапеева Т.А., Огаркова O.A., Тарасов В.А., Волотовский И.Д. Новые вектора для трансформации двудольных растений // Генетика. 1995. Т. 31. № 8. С. 1085-1091.

2. Гловер Д. Клонирование ДНК // М.: Мир, 1988. 538 с.

3. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика // М.: Мир, 1991.544 с.

4. Дрейпер Дж., Скотт Р., Армитидж Ф., Уолден Р. Генная инженерия растений // М.: Мир, 1991.408 с.

5. Ли А., Тинланд Б. Интеграция Т-ДНК в геном растений: прототип и реальность // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. С. 354-359.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование // М.: Мир, 1984. 480 с.

7. Огаркова O.A., Томилова Н.Б., Томилов А.А, Тарасов В.А. Создание коллекции морфологических инсерционных мутантов Arabidopsis thaliana II Генетика. 2001. Т. 37. № 8. С. 1081-1087.

8. Патрушев Л.И. Экспрессия генов // М.: Наука, 2000. 526 с.

9. Погорелко Г.В., Фурсова О.В., Огаркова O.A., Тарасов В.А. Новая система векторов для индукции суперэкспрессии генов у двудольных растений // Генетика. 2007. Т. 43. №2. С. 194-201

10. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии // С.-П.: СПбГТУ, 1999. 360381 с.

11. П.Сингер М., Берг П. Гены и геномы // М.: Мир, 1998. Т. 1-2. 765 с.

12. Спирин A.C., Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот // М.: Высшая школа, 1990. 201-210 с.

13. Томилов А.А, Томилова Н.Б., Огаркова O.A., Тарасов В.А. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: Увеличение эффективности трансформациипрорастающих семян в результате предобработки их ультразвуком // Генетика. 1999. Т. 35. № 9. С. 1214-1222.

14. Томилов А.А, Томилова Н.Б., Огаркова О.А., Тарасов В.А. Идентификация гена, включенного в контроль развития корневой системы у Arabidopsis thaliana //Генетика. 2001. Т. 37. №4. С. 1-10.

15. Томилова Н.Б., Томилов А.А, Огаркова О.А., Тарасов В.А. Идентификация гена, мутация в котором обуславливает возникновение некрозов семядолей при развитии проростков Arabidopsis thaliana II Генетика. 2001. Т. 37. №1. С. 36-45.

16. Филипенко Е.А., Филипенко M.JL, Мурашева С.В., Денеко Е.В., Загорская А.А., Сидорчук Ю.В. Анализ сайтов встраивания Т-ДНК у трансгенных растений табака с мутантным фенотипом // Доклады Академии Наук. Т.370. № 2. С. 273-276.

17. Abremski К., Hoess R., Sternberg N. Studies on the properties of PI site-specific recombination: evidence for topologically unlinked products following recombination // Cell. 1983. V. 32 № 4. P.1301-11

18. Aeschbacher RA, Hauser MT, Feldmann KA, Benfey PN. The SABRE gene is required for normal cell expansion in Arabidopsis.Genes Dev. 1995 Feb 1;9(3):330-40.

19. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10.

20. An G. High efficiency transformation of culture tobacco cells // Plant Physiol. 1985. V. 79. P. 568-570%

21. An, Gynheung. Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis. Methods in Enzymol. 1987. 153: 292-305

22. Azpiroz-Leehan R., Feldmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: going back and forth II TIG. 1997. V. 13. № 4. C. 152-156.

23. Baulcombe D.C. RNA as a target and an initiator of post-transcriptional gene silencing in transgenic plants // Plant Mol. Biol. 1996. V. 32. P. 79-88.

24. Bechtold N., Ellis J., Palletier G. In planta Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. // Paris: C.R. Acad. Sci. Sciences de la vie / Life sciences, 1993. V. 316. P. 1194-1199

25. Benson DA, Boguski MS, Lipman DJ, Ostell J, Ouellette BF. GenBank. Nucleic Acids Res. 1998 Jan l;26(l):l-7.

26. Bevan M., Bancroft I., Bent E., Love K., Goodman H., Dean C., Bergkamp R., Dirkse W., Vanstaveren M., Stiekema W. Analysis of a 1.9 Mb of contigous sequence from chromosome 4 of Arabidopsis thaliana II Nature. 1998. V. 391. P. 485-488.

27. Blackwood EM, Kadonaga JT. Going the distance: a current view of enhancer action. // Science 1998 Jul 3; V. 281(5373): P. 61-3

28. Borner, G., Lilley, K., Stevens, T., Dupree, P., 2003. Identification of Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Proteins in Arabidopsis. A Proteomic and Genomic Analysis. Plant Physiol. 132-2, 568—577

29. Bouchez D., Camilleri C., Caboshe M. A binary vector based on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana // Paris: C.R. Acad. Sei. Sciences de la vie / Life sciences, 1993. V. 316. P. 1188-1193

30. Bouchez D., Höfte H. Functional genomics in plants // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 725-732.

31. Brendel V, Kleffe J, Carle-Urioste JC, Walbot V. Prediction of splice sites in plant pre-mRNA from sequence properties. J Mol Biol. 1998 Feb 13;276(1):85-104.

32. Brian Sauer. Inducible Gene Targeting in Mice Using the Crdlox System. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 14, 381-392 (1998)

33. Burge C, Karlin S. Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J Mol Biol. 1997 Apr 25;268(l):78-94.

34. Castle L.A., Meinke D.W. Fusca gene of Arabidopsis encodes a novel protein essential for plant development // Plant Cell. 1994. V. 6. № 1. P. 15-41.

35. Chalfun-Junior A, Mes JJ, Mlynarova L, Aarts MG, Angenent GC. Low frequency of T-DNA based activation tagging in Arabidopsis is correlated with methylation of CaMV 35S enhancer sequences // FEBS Lett. 2003. V. 18;555(3). P. 459-63.

36. Cheng S., Chang S.-Y., Gravitt P., Respess R. Long PGR II Nature. 1994. V. 369. P. 684-685.

37. Chunlin S, Zhen Z, Guifang X, Altosaar I, Pingzhang F. Construction of plant vectors withhigh level expressionofBit; toxin gene andstudies on their expression behavior in transgenic tobaccos. // Chin J Biotechnol 1999;15(4):203-10

38. Corneille S., Lutz K., S vab Z;, Maliga P. Efficient elimination of selectable marker genes from the plastid genome by the CRE-lox site-specific recombination system; The Plant Journal, 2001. 27 (2), 171-178

39. Davis S., Vierstra R. Soluble, highly fluorescent variants of green fluorescent protein (GFP) for use in rhigher plants // Plant Molecular Biology, 1998. 36: 521' 528 .' ■

40. Feidmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis. Mutational spectrumi // Plant J. 1991. V. 1. P. 71-82 ' '

41. Feidmann K.A., Marks M.D; Agrobacterium-mediated' transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: A. non-tissue culture approach // Molt, Gen. Genet. 1987. V. 208. P. 1-9. ;

42. Finkelstein R., Somerville C.R. Introduction of transposable elements into Arabidopsis II J. Cell Biochem. UCLA Symp. Molec. Cell Biol.: Abstr. New York: A.R. Liss, 1987. Suppl lib. P. 16.

43. Forsthoefel N.R., Wu Y., Schulz B., Bennett M.J., Feldmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: prospects and perspectives // Aust. J. Plant Physiol. 1992. V. 19. P. 353-366.

44. Fortunati A, Piconese S, Tassone P, Ferrari S, Migliaccio F. A new mutant of Arabidopsis disturbed in its roots, right-handed slanting, and gravitropism defines a gene that encodes a heat-shock factor // J Exp Bot. 2008;59(6): 1363-74. Epub 2008 Apr 1.

45. Franzmann L.H., Yoon E.S., Meinke D.W. Saturating the genetic map of Arabidopsis thaliana with embryonic mutations // Plant J. 1995. V. 7. P. 341-350.

46. Frey M., Stettner C., Gierl A. A general method for gene isolation in tagging approaches: amplification of insertion mutagenised sites (AIMS) // Plant J. 1998. V. 13. P. 717-721.

47. Fridborg I., Kuusk S., Moritz T., Sundberg E. The Arabidpsis dwarf mutant shi exibits reduced gibberellin responses conferred by overexpression of a new putative zinc finger protein//Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1019-1031.

48. Gailus-Durner V, Scherf M, Werner T. Experimental data of a single promoter can be used for in silico detection of genes with related regulation in the absence of sequence similarity. // Mamm Genome 2001 Jan; V. 12(1): P. 67-72

49. Gallois J.-L., Woodward C., Reddy G., Sablowski R. Combined SHOOT MERISTEMLESS and WUSCHEL trigger ectopic organogenesis in Arabidopsis II Development. 2002. V. 129. 3207-3217.

50. Gish W, States DJ. Identification of protein coding regions by database similarity search.

51. Nat Genet: 1993 Mar;3(3):266-72.

52. Gleave A.P. A versatile binary vector system with a T-DNA organizational structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome // Plant Mol Biol. 1992. V.20. № 6. P. 1203-7.

53. Gondor A, Ohlsson R. Chromatin insulators and cohesions // EMBO Rep. 2008; 9(4):327-9.

54. Gui-Li W, Wen ZQ, Xu WP, Wang ZY, Du XL, Wang F. Inhibition of Lysophosphatidic Acid Receptor-2 Expression by RNA Interference Decreases Lysophosphatidic Acid-induced Urokinase Plasminogen Activator Activation,

55. Gell Invasion, and Migration in Ovarian; Cancer SKOV-3 Cells // Croat Med J: 2008; 49(2): 175-181 •

56. Herman PX., Jacobs A., Van Montagu M;, Depicker A. Plant chromosome marker, gene fusion assay for study of normal and truncated T-DNA integration events // Mol: Gen. Genet. 1990; V. 224; № 2. P: 148-156. '

57. Herman P;L., Marks M: D. Trichome development in Arabidopsis thaliana. II. Isolation and complementation of the GIABROUS I gene // Plant Cell. 1989; V. l . P. 1051-1055.

58. Hoff T., Schnorr! K.M., Mundy J. A recombinase-mediated transcriptional; induction system:in transgenic Plants // Plant Molecular Biology. 2001. V. 45.P.' ,41-49:., ■ . ' , . •'. ' ' '' '; . '

59. Hiei Y, Komari T. Agrobacterium-mediated transformation- of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nat Protoc. 2008;3(5):824-34.* ' f

60. Holrnberg N., Btillow L. Improving stress tolerance in: plants by gene transfer //

61. Jefferson R A., Kavanagh T.A., Bevan M.V. GUS fusions: ß-glucuronidase as a sensitive'and versatile gene fusion marker in higher plant // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3901-3907.

62. Keplinger BL, Guo X, Quine J, Feng Y, Cavener DR. Complex Organization of Promoter and Enhancer Elements Regulate the Tissue- and Developmental Stage-Specific Expression of the Drosophila melanogaster Gld Gene. // Genetics 2001 Feb; 157(2):699-716

63. Kerbach S, Lorz H, Becker D. Site-specific recombination in Zea mays // Theor Appl Genet. 2005;111(8):1608-16.

64. Kertbundit S., De Greve H., Deboeck F., Van Montagu M., Hernalsteens J. In vivo random (3-glucoronidase gene fusions in Arabidopsis thaliana // Proc. Natl Acad. Sci. 1991. V. 88. P. 5212-5216.

65. Kleckner N, Chan RK, Tye BK, Botstein D. Mutagenesis by insertion of a drug-resistance element carrying an inverted repetition. J Mol Biol. 1975 Oct 5;97(4):561-75.

66. Kleffe J, Hermann K, Vahrson W, Wittig B, Brendel V. Logitlinear models for the prediction of splice sites in plant pre-mRNA sequences. Nucleic Acids Res. 1996 Dec 1;24(23):4709-18.

67. Klutstein M, Shaked H, Sherman A, Avivi-Ragolsky N, Shema E, Zenvirth D, Levy AA, Simchen G. Functional Conservation of the Yeast and Arabidopsis RAD54-Like Genes // Genetics. 2008; 178(4):2389-97.

68. Kojima M, Arai Y, Iwase N, Shirotori K, Shioiri H, Nozue M. Development of a simple and efficient method for transformation of buckwheat plants (Fagopyrum esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. // Biosci Biotechnol Biochem 2000 Apr;64(4):845-7

69. Koncz C., Martini N., Mayerholer R., Koncz-Kalman Z., Korber H., Redei G.P., Schell J. High-frequency T- DNA mediated gene tagging in plants // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. V. 86. P. 8467-8471.

70. Koncz C., Martini N., Szabados L., Hrouda M., Bachmair A., Schell J. Specialized vectors for gene tagging and expression studies // In Plant Molecular Biology Manual. V. B2. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Press, 1994. P. 122.

71. Koncz C., Mayerhofer R., Koncz-Kalman Z., Nawrath C., Reiss B., Redei G. P., Schell J. Isolation of a gene encoding a novel chloroplast protein by T-DNA tagging in Arabidopsis thaliana IIEMBO J. 1990. V. 9. P. 1337-1346.

72. Koncz C., Nemeth K., Redei G.P., Schell J. T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis II Plant Mol. Biol. 1992. V. 20. P. 963-976. 1

73. K00 JT, Choe J, Moseley SL.HrpA, a DEAH-box RNA helicase, is involved in mRNA processing of a fimbrial operon in Escherichia coli. Mol Microbiol. 2004 Jun;52(6): 1813-26

74. Kooter J.M., Mol J.N.M. 7ran.v-inactivation of gene expression in plants // Current Opinion in Biotechnology. 1993. V. 4. P. 166-171.

75. Krysan P.J., Young J.C., Sussman M.R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis II The Plant Cell. 1999. V. 11 P. 2283-2290.

76. Kubo H., Peeters A. J.M., Aarts M.G.M., Pereira A., Koornneef M. ANTHOCYANINLESS2, a homeobox gene affecting anthocyanin distribution and root development in Arabidopsis II Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1217-1226.

77. Kushiro T., Shibuya M., Ebizuka Y. Beta-amyrin synthase cloning of oxidosqualene cyclase that catalyzes the formation of the most popular triterpene among higher plants // Eur. J. Biochem. 1998. V. 256. № 1. P. 238-244.

78. Laat WL, Appeldoorn E, Sugasawa K, Weterings E, Jaspers NGJ, Hoeijmakers JHJ. DNA-binding polarity of human replication protein A positions nucleases in nucleotide excision repair. Genes & Dev. 1998 12: 2598-2609

79. Laibach F. Zür frage nach der individualitai der Chromosomen im pflanzeinreich II Beich. Bot. Col. I Abt 1907. V. 22. P. 191-210.

80. Laibach F., 1943. In Meyerowitz E.M. History of Arabidopsis thaliana II http/www.arabidopsis.org. 1998.

81. Lee L, Sadowski PD. Directional resolution of synthetic holliday structures by the Cre recombinase. J Biol Chem. 2001 Aug 17;276(33):31092-8.

82. Leutwiler L.S., Hough-Evans B.R., Meyerowitz E.M. The DNA of A. thaliana II Mol. Gen. Gen. 1984. V. 194. P. 15-23.

83. Li S, Hartman GL, Domier LL, Boykin D. Quantification of Fusarium solani f. sp. glycines isolates in soybean roots by colony-forming unit assays and real-time quantitative PCR // Theor Appl Genet. 2008 Epub ahead of print.

84. Liao BY, Zhang J. Null mutations in human and mouse orthologs frequently result in different phenotypes // Proc Natl Acad ScL 2008 USA. Epub ahead of print.

85. Liu Y.G., Mitsukawa N., Vazquez-Tello A., Whittier R.F. Generation of a high quality PI library of Arcibidopsis thaliana-suitable for chromosome walking // Plant J. 1995. V.7. P. 351-358.

86. Liu YG, Whittier RF. Thermal asymmetric interlaced PCR: automatable amplification and sequencing of insert end fragments from PI and YAC clones for chromosome walking//Genomics. 1995 Feb 10;25(3):674-81

87. Lloyd A.M., Bamanson A.R., Rogers S.G. Transformation of Arabidopsis thaliana with Agrobacterium tumefaciens // Science. 1986. V. 234. №4775. P. 464-466

88. Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore, Darnell. Molecular Cell Biology, 2000. Chapter 12. DNA Replication, Repair, and Recombination. Section 12.5. Recombination between Homologous DNA Sites

89. Masclaux FG, Pont-Lezica R, Galaud JP. Relationship between allelic state of T-DNA and DNA methylation of chromosomal integration region in transformed Arabidopsis thaliana plants // Plant Mol Biol. 2005. V. 58(3). P. 295-303.

90. Mark D. Curtis, Ueli Grossniklaus. A Gateway Cloning Vector Set for High-Throughput Functional Analysis of Genes in Planta // Plant Physiology. 2003. V. 133. P. 462-469

91. McClintock B. Mutable locus in maize // Carnegie Inst. Wash. Yearbook. 1948. V. 47. P. 155-169.

92. McCormac AC, Elliott MC, Chen DF. pBECKS2000: a novel plasmid series for the facile creation of complex binary vectors, which incorporates "clean-gene" facilities. // Mol Gen Genet 1999 Mar;261(2):226-35

93. McKinney E.C., Ali N., Traut A., Feldmann K.A., Belostotsky D.A., McDowell J.M., Meagher R.B. Sequence-based identification of T-DNA insertion mutations in Arabidopsis: actin mutants act2-l and act4-l II Plant J. 1995. V. 8. P. 613-622.

94. Meinke, D.W., Koornneef M. Community Standards for Arabidopsis Genetics // Plant J. 1997. V. 12. № 2. P. 247-253.

95. Mejia J.E., Larin Z. The Assembly of Large BACs by in Vivo Recombination. Genomics, 2000. 70, 165-170

96. Mullins L., Kotelevtseva N., Boyd A.C., Mullins J.J. Efficient Cre-lox linearisation of BACs: applications to physical mapping and generation of transgenic animals. ©1997 Oxford University Press, 2539-2540

97. Mullis K.B., Faloona F.A. Specific systhesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. // Methods Enzymol. 1987. V. 155. P. 335-348.

98. Nimmo DD, Alphey L, Meredith JM, Eggleston P. High efficiency site-specific genetic engineering of the mosquito genome // Insect Mol Biol. 2006, 15(2): 129-36.

99. Oono Y, Chen Q.G., Overvoorde P.J., Köhler C., Theologis A. age mutants of Arabidopsis exhibit altered auxin-regulated gene expression // Plant Cell. 1998. V. 10. P. 1649-1662.

100. Pandey S, Monshausen GB, Ding L, Assmann SM. Regulation of Root-Wave Response by Extra Large and Conventional G Proteins in Arabidopsis thaliana. Plant J. 2008 Apr 4 Epub ahead of print.

101. Pan X, Li Y, Stein L. Site Preferences of Insertional Mutagenesis Agents in Arabidopsis // Plant Physiology. 2005. V. 137. P. 168-175

102. Pang P.P., Meyerowitz E.M. Arabidopsis thaliana: a model system for plant molecular biology//Biotechnology. 1987. V. 5. № 11. P. 1177-1181.

103. Parinov S., Sevugan M., Ye D., Yang W.C., Kumaran M., Sundaresan V. Analysis of flanking sequences from Dissociation insertion lines: a database for reverse genetics in Arabidopsis II The Plant Cell. 1999. V. 11. P. 2263-2270.

104. Pickett FB, Champagne MM, Meeks-Wagner DR. Temperature-sensitive mutations that arrest Arabidopsis shoot development. Development. 1996 Dec;122(12):3799-807.

105. Pruilt R.E., Meyerowitz E.M. Characterization of the genome of Arabidopsis thaliana II J. Mol. Biol. 1986. V. 187. № 1. P. 169-183.

106. Puchta H., Hohn B. From centimorgans to base pairs: homologous recombination in plants // Trends Plant Sci. 1996. V. 1. P. 340-348.

107. Rastegar S, Hess I, Dickmeis T, Nicod JC, Ertzer R, Hadzhiev Y, Thies WG, Scherer G, Strahle U. The words of the regulatory code are arranged in a variable manner in highly conserved enhancers // Dev Biol. 2008 Epub ahead of print.

108. Reinholz E., 1947. In: Meyerowitz E.M. History of Arabidopsis thaliana II http/www.arabidopsis.org. 1998.

109. Richmond TA, Bleecker AB. A defect in beta-oxidation causes abnormal inflorescence development in Arabidopsis. Plant Cell. 1999 Oct;ll(10):1911-24.

110. Riechmann J.L., Meyerowitz E.M. MADS domain proteins in plant development II J. Biol. Chem. 1997. V. 378. P. 1079-1101.

111. Rijkers T, Ouweland JVD, Morolli B, Rolink AG, Baarends WM, Sloun P, Lohman P, Pastink A. Targeted Inactivation of Mouse RAD52 Reduces Homologous Recombination but Not Resistance to Ionizing Radiation // Mol Cell Biol. 1998; 18(11): 6423-6429.

112. Roe JL, Rivin CJ, Sessions RA, Feldmann KA, Zambryski PC. The Tousled gene in A. thaliana encodes a protein kinase homolog that is required for leaf and flower development. Cell. 1993 Dec 3;75(5):939-50.

113. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition"// Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

114. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed syntesis with DNA polymerase, J. Mol. Biol., 1975, v. 94, p. 444-448.

115. Santarem E.R., Trick H.N., Essing J.S., Finer J.J. Sonication-assisted Agrobacterium-med\ate,d transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient expression // Plant Cell Reports. 1998. V. 17. P. 752759.

116. Sauer B. Inducible Gene Targeting in Mice Using the Crdlox System // Methods. 1998. V.14. №4. P.381-92

117. Shaikh A.C., Sadowski P.D. The Cre Recombinase Cleaves the lox Site in trans.Volume 272, Number 9, Issue of February 28, 1997 pp. 5695-5702. JBC by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.

118. Shang CH, Zhu F, Li N, Ou-Yang X, Shi L, Zhao MW, Li YX. Cloning and Characterization of a Gene Encoding HMG-CoA Reductase from Ganoderma lucidum and Its Functional Identification in Yeast // Biosci Biotechnol Biochem. 2008 Epub ahead of print.

119. Shibata F, Matsusaki Y, Hizume M. AT-richsequences containing Arabidopsis-type telomere sequence and their chromosomal distribution in Pinus densiflora // Theor Appl Genet. 2005. V. 110(7). P. 1253-8

120. Shibuya M., Zhang H., Endo A., Shishikura K., Kushiro T., Ebizuka Y. Two branches of the lupeol synthase gene in the molecular evolution of plant oxidosqualene cyclascs // European Journal Biochemistry. 1999. V. 266. № 1. P. 302-307.

121. Singh-Gasson S., Green R.D., Yue Y., Nelson C., Blattner F., Sussman M.R., Cerrina F. Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using a digital micromirror array // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 974-978.

122. Souer E., Quattrocchio F., de Vetten N., Mol J., Koes R. A general method to isolate genes tagged by a high copy number transposable element // Plant J. 1995. V. 7. P. 677-685.

123. Speulman E., Metz P. L. J., Van Arkel G., Hekkert B.L., Stiekema W.J., Pereira A. Two-component Enhancer-Inhibitor transposon mutagenesis system for functional aanalysis of the Arabidopsis genome // The Plant Cell. 1999. V. 11. P. 1853-1866.

124. Spradling AC, Stern DM, Kiss I, Roote J, Laverty T, Rubin GM. Gene disruptions using P transposable elements: an integral component of the Drosophila genome project.

125. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Nov 21 ;92(24): 10824-30.

126. Strizhov N, Li Y, Rosso MG, Viehoever P, Dekker KA, Weisshaar B. High, throughput generation of sequence indexes from T-DNA mutagenized

127. Arabidopsis thaliana lines // Biotechniques. 2003. V. 35(6). P. 1164-8.

128. Sugita K, Kasahara T, Matsunaga E, Ebinuma H. A transformation vector for the production of marker-free transgenic plants containing a single copy transgene at high frequency.// Plant J 2000 Jun;22(5):461-9

129. Takeda K., Akira S. STAT family of transcription factors in cytokine-mediated biological responses // Reviews. 2000. V. 11. P. 199-207.

130. Tani H, Chen X, Nurmberg P, Grant JJ, SantaMaria M, Chini A, Gilroy E, Birch PR, Loake GJ. Activation tagging in plants: a tool for gene discovery // Funct Integr Genomics. 2004. V. 4(4). P. 258-66.

131. Tinland B. The integration of T-DNA into plant genomes // Trends in Plant Science. 1996. V. 1. № 6. 1360-1385.

132. Topping J.F., Wei W., Lindsey K. Functional tagging of regulatory elements in the plant genome//Development. 1991. V. 112. P. 1009-1019.

133. Van Lijsebettens M., Vanderhaughen R., Van Montagu M. Insertional mutagenesis in Arabidopsis thaliana: isolation of a T-DNA-linked mutation that, alters leaf morphology // Theor. Appl. Genet. 1991. V. 81. № 1. P. 177-284.

134. Vergunst AC, Hooykaas PJ. Cre/lox-mediatcd site-specific integration of Agrobacterium T-DNA in Arabidopsis thaliana by transient expression of ere. // Plant Mol Biol 1998 Dec;38(6):1269

135. Wan F, Miao X, Quraishi I, Kennedy V, Creek KE, Pirisi L.Gene expression changes during HPV-mediated carcinogenesis: a comparison between an in vitro cell model and cervical cancer // Int J Cancer. 2008 ;123(1):32-40

136. Wang Y, Yin G, Yang Q, Tang J, Lu X, Korban SS, Xu M. Identification and isolation of Mu-flanking fragments from maize // J Genet Genomics. 2008; 35(4):207-13.

137. Wheeler JC, Shigesada K, Gergen JP, Ito Y. Mechanisms of transcriptional regulation by Runt domain proteins. // Semin Cell Dev Biol 2000 Oct; V. 11(5): P. 369-75

138. Xiang C, Han P, Lutziger I, Wang K, Oliver DJ. A mini binary vector series for plant transformation.// Plant Mol Biol 1999 Jul;40(4):711-7

139. Yamaguchi H, Nagaoka K, Imakawa K, Sakai S, Christenson RK. Enhancer regions of ovine interferon-tau gene that confer PMA response or cell type specific transcription. // Mol Cell Endocrinol 2001 Feb 22;173(l-2): 147-155

140. Yanofsky M.F., Ma H., Bowman J.L., Drews J.N., Feidmann K.A., Meyerowitz E.M. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene agamous resembles transcription factors // Nature. 1990. V. 346. P. 35-39.

141. Zhang K, Wang G, Zou Z, Jia X, Wang S, Lin P, Chen Y, Zhang Z, Wang Y. Cloning, characterization and TBT exposure response of CuZn superoxide dismutase from Haliotis diversicolor supertexta // Mol Biol Rep. 2008 Mar 24 Epub ahead of print.

142. Zhiming R, Zheng M, Wei S, Huiying F, Jian Z. Transformation of Industrialized Strain Candida glycerinogenes with Resistant Gene zeocin via Agrobacterium tumefaciens // Curr Microbiol. 2008 Epub ahead of print.