Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Болдырев, Александр Николаевич

• Болдырев, Александр Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Болдырев, Александр Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Диагностика туберкулёза.

1.1.1. Микроскопическая и культуральная диагностика.

1.1.2. Туберкулинодиагностика.

1.1.3. Современные иммунологические методы диагностики туберкулёза.

1.2. Поиск иммуногенных белков для диагностики туберкулёза.

1.2.1. Поиск иммуногенов среди белков М. tuberculosis.

1.2.2. Поиск иммуногенов с помощью экспрессионных библиотек геномов микобактерий туберкулёзного комплекса.

1.2.3. Источник иммуногенов - области делеций при сравнительном анализе геномов микобактерий туберкулёзного комплекса и вакцинного штамма М. bovis BCG.

1.2.4. Источник иммуногенов - транспозонные библиотеки интактных патогенных микобактерий (генетически изменённые микобактерии туберкулёзного комплекса).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Основные компоненты для приготовления питательных сред, реактивы, реагенты и прочие материалы.г.

2.1.1. Основные компоненты для приготовления питательных сред и питательные среды.

2.1.2. Реактивы, реагенты.

2.1.3. Ферменты.

2.1.4. Бактериальные штаммы Е. coli.

2.1.5. Плазмиды.

2.1.6. Олигодезоксирибонуклеотиды.

2.1.7. Клинические изоляты культур клеток М. tuberculosis.

2.1.8. Образцы сывороток, крови и мокрот.

2.1.9. Концентрированные буферы / растворы.-.

2.1.10. Рабочие буферы / растворы'.

2.1.11. Тест-системы и наборы реактивов/реагентов.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение ДНК.

2.2.2. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.

2.2.3. Полимеразная цепная реакция.

2.2.4. Лигазиая реакция.

2.2.5. Трансформация компетентных клеток Е. coli.

2.2.6. Поиск рекомбинантных клонов.

2.2.7. Наработка, выделение рекомбинантных плазмидных ДНК и трансформация штамма Е. coli BL21.

2.2.8. Получение индуцированных культур штамма Е. coli BL21, содержащего рекомбинантные плазмиды, и поиск клонов, продуцирующих рекомбинантный белок.

2.2.9. Отбор клонов, продуцирующих рекомбинантный белок.

2.2.10. Электрофорез.

2.2.11. Иммуноблотинг белков.

2.2.12. Секвенирование клонированной нуклеотидной последовательности.

2.2.13. Наработка и выделение рекомбинантных GST-P-белков.

2.2.14. Иммуноферментный анализ.

2.2.15. у-ИФН-анализ.

2.2.16. Биочип-гибридизационный метод.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выбор видоспецифичных антигенов М. tuberculosis для тестирования в ИФА и у-ИФН-анализе.

3.2. Выбор экспрессирующего вектора для конструирования рекомбинантной молекулы, несущей ген, кодирующий аминокислотную последовательность целевого белка.

3.3. Информационный поиск генов esxA, esxB и mpt64 и дизайн праймеров для синтеза ампликонов, включающих эти гены.

3.4. Конструирование рекомбинантных молекул, несущих гены, кодирующие видоспецифичные белки М. tuberculosis.

3.5. Оптимизация условий для наработки рекомбинантных белков.

3.6. Подбор условий для выделения и очистки рекомбинантных белков.

3.7. Испытание рекомбинантных видоспецифичных белков М. tuberculosis в ИФА, у-ИФН-анализе на клинических изолятах крови.

3.7.1. Рекомбинантные белки в иммуноферментном анализе.

3.7.2. Рекомбинантные белки в у-ИФН-анализе.

3.8. Анализ изолятов мокроты с помощью ПЦР и биочип-гибридизационного метода.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и оценка рекомбинантных видеоспецифичных белков Mycobacterium tuberculosis для применения в диагностике туберкулёза»

Актуальность проблемы

Туберкулёз - социально опасная инфекционная болезнь человека.

Около трети населения в мире инфицировано преимущественно микобактериями вида М. tuberculosis, в России инфицированность превышает 80%. По заболеваемости и числу больных туберкулёзом Россия по-прежнему входит в число стран с самой неблагоприятной ситуацией по туберкулёзу. По данным ВОЗ за 2007 г., число впервые выявленных заболевших туберкулёзом в нашей стране составило 157 тыс. (заболеваемость 110 на 100000 населения). Из них 68 тыс. выявлены как положительные по результатам микроскопии мазка. Общее число больных туберкулёзом на конец 2007 г. составило 164000. Распространение ВИЧ-инфекции становится отягощающим фактором для активизации туберкулёзной инфекции: 26240 заболевших от общего числа больных туберкулёзом являлись ВИЧ-позитивными. Таким образом, доля ВИЧ-инфицированных больных туберкулёзом в нашей стране достигла 16 % (WHO Report 2009). Число смертей составило 20000 (среди не инфицированных ВИЧ) и 5100 - из числа ВИЧ-инфицированных. Смертность ВИЧ-позитивных пациентов в ~70 % случаев связана именно с туберкулёзом.

Возбудителем туберкулёза являются бактерии рода Mycobacterium, среди которых этиологическое значение имеют М. tuberculosis и реже М. africanum и М. bovis (Djelouadji Z. et. al., 2008). Возбудитель передаётся первично аэрогенным или алиментарным путём. В инфицированном организме при определённых условиях могут реализоваться гематогенный, лимфогенный и бронхогенный пути, поражая внутренние органы, а также повторно алиментарный (слюна, мокрота при заболевании лёгких) (Милькаманович В.К., 1997). В настоящее время зафиксирована передача М. bovis от человека человеку (Evans J.T. et. al., 2007), а не только от крупного рогатого скота. Заболевание характеризуется преимущественно поражением лёгких, интоксикацией и аллергизацией организма.

Особенностью туберкулёза, как одной из хронических инфекций, является преобладание случаев латентной, абациллярной форм и бактерионосительства. В связи с исключительно высокой медико-социальной опасностью распространения туберкулёзной инфекции первоочередной задачей остаётся выявление больных бациллярной формой туберкулёза лёгких, так как, являясь бактериовыделителями, они представляют наибольшую эпидемическую опасность для окружающих. Таким образом, для предотвращения распространения туберкулёза в настоящее время ещё большее актуальное значение приобретает своевременная и достоверная лабораторная диагностика этого заболевания даже при отсутствии или минимальном проявлении его клинических признаков. В настоящее время нет ни одного надёжного метода, с помощью которого можно было бы однозначно поставить диагноз туберкулёз.

Традиционные методы диагностики, такие как флюорография и бактериоскопия мокроты, не всегда эффективны. Бактериологический метод занимает много времени - даже основывающийся на обнаружении роста микобактерий в присутствии флуоресцентного красителя (Ardito F. et al., 2001). Ежегодная туберкулинодиагностика - основной и до сих пор единственный метод в нашей стране, с помощью которого определяется напряжённость иммунной системы у детей и подростков, - также не всегда отвечает предъявляемым требованиям. Молекулярно-биологические методы позволяют достаточно быстро с высокой специфичностью и чувствительностью проводить выявление и типирование микобактерий в различных клинических образцах. Но даже ПЦР, один из самых чувствительных современных методов молекулярной диагностики, не позволяет выявить всех больных, так как для его проведения требуются микобактерии или ДНК/РНК, выделенная из них. Существенным недостатком ПЦР также является невозможность оценить активность туберкулёзного процесса. Пбскольку туберкулёз поражает, кроме лёгких, и другие органы, диагностика ещё в большей степени осложняется. Наряду с этими методами основная роль принадлежит, несомненно, методам серологической диагностики, направленным на определение антител, а также антигенов возбудителя в крови и других биологических жидкостях организма. Её основной проблемой остаётся низкая специфичность и чувствительность применяемых антигенов. Причиной кросс-реактивности белковых антигенов М. tuberculosis является присутствие гомологичных белков других микроорганизмов, дающих перекрёстные реакции с иммуноглобулинами сыворотки здоровых .пациентов. Поэтому результаты рутинного иммунологического обследования' группы вакцинированных больных обычно оказываются малоинформативными. ч

Для постановки окончательного диагноза туберкулёз требуется сравнение результатов, полученных разными методами. Развитие новых методов Т-клеточной иммунологии напрямую связано с разработкой новых методов идентификации Т-клеточных компонентов крови, имеющих прямое отношение к иммунной системе. Разрабатываемые в мире в течение последних десяти лет эти методы диагностики туберкулёза, например гамма-интерфероновый анализ, на сегодняшний день оказывается и своевременным, и в значительной степени достоверным: время выполнения анализа занимает не более 2-х суток (чувствительность в пределах 90 %, а специфичность приближается к 100 %). у-ИФН-анализ в настоящее время является одним из самых эффективных методов для детекции у-ИФН, секретирующегося при стимуляции Т-клеток in vitro белковыми антигенами М. tuberculosis. Высокая разрешающая способность этого метода позволяет оценивать антигенстимулированную продукцию цитокинов, что очень важно для оценки специфического иммунного ответа. Так, если за рубежом в наиболее развитых странах проблема диагностики туберкулёза с помощью этих методов практически решена (имеются тест-системы), в России её решение находится на начальном этапе. Новый тест, основанный на исследовании антигенспецифических Т-лимфоцитов, позволяет раньше диагностировать туберкулёз, чем кожные туберкулиновые пробы. Разработка иммунологических Т-клеточных тест-систем является крайне важной для нашей страны и в настоящее время входит в разряд наиболее актуальных проблем современной медицины. Цель работы

Целью настоящего исследования являлись получение и оценка пригодности рекомбинантных видоспецифичных белков М. tuberculosis для диагностики туберкулёза с помощью ИФА и у-ИФН-анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести, руководствуясь литературными данными, теоретический анализ по выбору видоспецифичных высокоиммуногенных антигенов М. tuberculosis',

- сконструировать рекомбинантные молекулы, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis,;

- оптимизировать условия для биосинтеза рекомбинантных белков;

- подобрать условия для выделения и очистки рекомбинантных белков;

- оценить полученные рекомбинантные видоспецифичные белки М. tuberculosis на пригодность для использования их в диагностике туберкулёза;

- провести сравнительный анализ результатов, полученных с использованием рекомбинантных видоспецифичных белков М. tuberculosis, с результатами, полученными с помощью ПЦР-анализа.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые на основе плазмиды pGEX-2T были сконструированы рекомбинантные плазмиды, несущие гены, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis, такие как ESAT-6, CFP10 и МРТ64.

Введение новых плазмид в экспрессирующий штамм Е. coli BL21 позволило получить штаммы-продуценты рекомбинантных белков, несущих в своей Nконцевой части аминокислотную последовательность глутатионтрансферазы в качестве белка-носителя. Полученные штаммы-продуценты обеспечивали продукцию слитных белков в растворимой форме.

Впервые для проведения иммуноферментного и у-интерферонового анализа для выявления больных туберкулёзом и подтверждения (опровержения) диагноза туберкулёз в диагностических целях использованы рекомбинантные белки, содержащие на N-конце АП глутатионтрансферазы в качестве вспомогательного белка. v Применение рекомбинантных белков без проведения протеолитического расщепления его на два фрагмента - белок-носитель и целевой белок - сокращает существенно время до получения целевого белка, необходимого для проведения ИФА и у-ИФН-анализа.

Таким образом, продвижение в клиническую практику диагностических методов, использующих Т-клеточные технологии, вооружит медицину новым мощным диагностическим средством, которое необходимо совершенствовать в связи с возрастанием доли больных абациллярной формой туберкулёза и ВИЧ-инфицированных больных туберкулёзом, распространением лекарственно устойчивых штаммов, вызывающих туберкулёз.

Результаты диссертационной работы могут служить основанием для того, чтобы, используя полученные рекомбинантные белки (rESAT-б и rCFPIO), приступить к разработке тест-системы для диагностики туберкулёза, основывающейся на у-ИФН-анализе, и внедрению её в клинико-диагностические лаборатории специализированных лечебных учреждений вообще и общей лечебной сети, в частности (постановка метода занимает от 1,5 до 2-х суток, чувствительность рекомбинантных белков находится в пределах 80-100 %, а специфичность - в пределах 82-100 %).

Положения, выносимые на защиту

1. Плазмиды pTSE6, рТВ232 и рТВ323 содержат гены, кодирующие рекомбинантные видоспецифичные высокоиммуногенные белки М. tuberculosis. При введении этих плазмид в клетки Е. coli (BL21) обеспечивается продукция рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64 в растворимой форме в количествах, достаточных для проведения диагностики туберкулёза.

2. Рекомбинантные белки rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64 применимы в качестве компонента в иммуноферментном и у-интерфероновом анализе при диагностике туберкулёза (без проведения протеолитического отщепления аминокислотной последовательности белка-носителя от аминокислотной последовательности целевого белка).

3. Разработанная методика получения, выделения и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPIO и гАМРТ64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов, обязательными компонентами которых являются полученные рекомбинантные генетические конструкции на основе плазмиды pGEX-2T, включающих гены, кодирующие секретируемые белки М. tuberculosis, и экспрессирующий штамм BL21, может быть использована в качестве технологической схемы как составная часть для разработки лабораторного регламента по производству этих белков. Личный вклад автора

Работа выполнена автором самостоятельно при участии коллег ГНЦ ВБ «Вектор», которое сводилось к отдельным методическим моментам и обсуждению полученных результатов. Основные результаты, изложенные в диссертации, получены при непосредственной помощи и в соавторстве с сотрудниками отдела иммунотерапевтических препаратов ГНЦ ВБ «Вектор»: к.х.н. Ю.В. Тумановым, к.б.н. О.Ю. Смирновой, к.б.н. О.В. Носаревой, к.б.н. А.Ю. Сивковым, к.б.н., доц. М.Ш. Азаевым и д.б.н. С.И. Татьковым. Автор им искренне благодарен. Также хочется поблагодарить отдельных сотрудников Центра, которые способствовали продвижению и завершению этого исследования: н.с. Горбунова Ю.А., Азаеву Ф.З. (ЗАО «Вектор-Бест»), н.с. Боднева С.А., к.б.н. Шустова А.В., к.б.н. Тернового В.А., к.ф.-м.н. Сафатова А.С., Буряк Г.А. и в особенности своих рецензентов, бескорыстный труд которых всегда почему-то остаётся в тени, - д.б.н. Тикунову Нину Викторовну и к.б.н. Протопопову Елену Викторовну.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Болдырев, Александр Николаевич

выводы

1. Сконструированы 4 рекомбинантные плазмиды на основе векторной плазмиды pGEX-2T, несущие полные гены esxA, esxB, а также полный и укороченный (без нуклеотидной последовательности, кодирующей лидерный пептид) ген mpt64, кодирующие видоспецифичные высокоиммуногенные белки Mycobacterium tuberculosis. Идентичность каждого клонированного гена природному, соответствующего штамму H37Rv, подтверждена секвенированием.

2. Подобраны оптимальные условия для продукции в штамме Escherichia coli BL21 3 рекомбинантных белков - rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64, которые накапливаются в растворимой форме в цитоплазме бактериальной клетки, а также условия для их выделения и очистки.

3. Впервые показана принципиальная возможность использования рекомбинантных белков в иммуноферментном и у-интерфероновом анализе без предварительного отщепления N-концевой аминокислотной компоненты, используемой в качестве белка-носителя, при установленном уровне выявления антител к N-концевой компоненте рекомбинантного белка -глутатионтрансферазе, не более 1,3 % среди исследованных сывороток.

4. На примере rESAT-6 и rCFPIO установлено, что эти рекомбинантные белки способны выявлять положительные сыворотки по антителам IgG, IgA и IgM среди разных групп обследуемых. Наиболее высокий показатель выявляемое™ иммуноглобулинов определён для IgG-антител и составил 70 % (для IgA — 31,4 %, IgM-11,8%).

5. При использовании панели сывороток, полученных от больных туберкулёзом и здоровых доноров, показано, что чувствительность ИФА при испытании rESAT-6 и rCFPIO составила 65-79 %, гДМРТ64 - 81 %, специфичность - соответственно 92-98, 95-98 и 76 %.

6. Показано, что чувствительность у-ИФН-метода при стимуляции Т-лимфоцитов rESAT-6, rCFPIO и гАМРТ64 составила соответственно 84-100, 80-95 и 60-78 %, а специфичность - соответственно 86-100, 82-100, 76-97 %. При сочетанном использовании трёх рекомбинантных белков (rESAT-6, rCFPIO и гДМРТ64) специфичность составила 96,2 %, а чувствительность - 89,1 %.

7. Предложена технологическая схема для наработки и очистки рекомбинантных белков rESAT-6, rCFPIO и гАМРТ64 в растворимой форме из штаммов-продуцентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По данным ВОЗ 2007 г., заболеваемость туберкулёзом в мире продолжает возрастать. Более того, рост её опережает рост народонаселения. Смертность так же продолжает расти. Туберкулёз, являясь социально опасным инфекционным заболеванием, не всегда протекает в острой фазе - болезнь иногда длится годами. Это так называемая хроническая форма течения болезни (пассивное бактерионосительство). И как только заболевание переходит в активную фазу, человек становится социально опасным, поскольку сам, того не подозревая, становится активным бактерионосителем и заражает других.

Появление нового типа диагностических иммунологических тестов - Т-клеточных - вряд ли является случайным. Это закономерный эволюционный процесс развития диагностических тест-систем. Попробуем это объяснить следующими рассуждениями. Для проведения серологических реакций при выявлении инфекционного заболевания (в более широком смысле, и диагностирования аутоиммунных заболеваний) в сыворотке необходимо присутствие специфических антител или антигенов, вызвавших образование этих антител. В нашем случае - наличие противотуберкулёзных видоспецифических иммуноглобулинов или антигенов М. tuberculosis. Первые обнаруживают в количествах, достаточных для их измерения, только при активном протекании туберкулёзного процесса, когда требуется подтверждение диагноза заболевания. Для обнаружения антигенов в сыворотке крови требуется ещё большая чувствительность применяемого иммунологического метода. Вот почему серологические тесты с выявлением антигена менее применимы в медицинской практике, хотя и являются более достоверными, так как напрямую выявляют антиген. Однако и в первом, и во втором вариантах для постановки метода требуются моноклональные антитела, которые могут быть получены с помощью гибридомной технологии. И чем больше вовлекается в анализ иммуногенных белков, тем большее требуется разнообразие моноклональных антител.

Т-клеточные иммунологические тесты принципиально отличаются от тестов, использующих специфичные к антигену иммуноглобулины или антигены, присутствующие в крови, а точнее в сыворотке крови. Т-клеточные тесты не являются по своей сути серологическими, поскольку в основе их лежит обнаружение у-ИФН (или другого цитокина, выбранного в качестве прогностического маркёра заболевания), продуцируемого Т-лимфоцитами. Продукция у-ИФН возможна только при активации той субпопуляции Т-лимфоцитов, которые на своей поверхности несут Т-специфический(е) к антигену рецептор(ы), или, как говорят иначе, праймированы специфическим к антигену Т-рецептором. Более того, эти лимфоциты не только активируются, но и оказываются способными к митотическому делению. Другие, непраймированные Т-лимфоциты не активируются и не пролиферируют, а значит, и не продуцируют у-ИФН. Последний можно обнаружить с помощью специфических иммуноглобулинов к у-ИФН человека или животного (если заболевание хотят диагностировать у животного). Следует понимать, что кровь, представляя собой жидкую ткань организма, для постановки Т-клеточного теста является лишь диагностическим материалом для выделения Т-лимфоцитов в чистом виде, а специфические к у-ИФН иммуноглобулины - инструментом для обнаружения у-ИФН. Секретируемый у-ИФН в данном методе является умножителем. Выделенные *из крови ,в чистом виде Т-лимфоциты ничего общего не имеют с сывороткой крови, содержащей видоспецифические к туберкулёзу иммуноглобулины. Теоретически одной праймированной клетки в анализируемом материале достаточно для выявления заболевания, в частности туберкулёза. Таким образом, этот метод представляется весьма перспективным для ранней диагностики туберкулёза, а значит и для профилактики этого опасного заболевания. В крови здоровых людей всегда будет присутствовать некоторое количество у-ИФН, продуцируемое в результате активации Т-специфических лимфоцитов антигенами, отличающимися от антигенов М tuberculosis. Это количество следует рассматривать как фоновое значение, превышение которого будет указывать на развитие патологического процесса (и необязательно туберкулёзного). Очень важно для убедительности при постановке окончательного диагноза провести повторный анализ (наблюдение за туберкулёзным процессом в динамике). Используя мононуклеарные клетки при проведении у-ИФН-анализа, мы переходим на качественно новый уровень диагностирования туберкулёза, поскольку, выделяя мононуклеарные клетки из плазмы крови, избавляемся от эндогенного у-ИФН. Вот почему у-ИФН-Т-клеточный тест для выявления заболевших туберкулёзом наиболее перспективен для внедрения в нашей стране и в особенности для обследования детей, для которых в настоящее время единственным разрешённым диагностическим методом является ежегодная туберкулинодиагностика (до 15 лет).

Огромное преимущество у-ИФН-Т-клеточного теста перед ИФА (ИФлА) в том, что с выявлением новых иммуногенных белков, поиск которых неустанно продолжается, не требуется получения моноклональных антител к каждому из них для оценки их пригодности.

Для нашего исследования - оценки применимости рекомбинантных туберкулёзных белков в диагностике туберкулёза - мы решили получить генно-инженерным путём те белки, которые были хорошо изучены в других странах мира и зарекомендовали себя в ИФА и у-ИФН-анализе, такие как ESAT-6, CFP10 и МРТ64. Несмотря на то, что некоторые экспрессирующие конструкции, с помощью которых можно продуцировать эти рекомбинантные белки, уже созданы в ряде стран, остаются нерешённые задачи: это получение целевых белков, приближенных к структуре нативного целевого белка, получение рекомбинантных конструкций, которые давали бы высокие выходы рекомбинантного белка и, как следствие, целевого и одновременно рекомбинантного белка в растворимой форме и др.

Те конструкции, которые уже имеются в мировой практике, будучи введёнными в экспрессирующие штаммы клеток бактерий Е. coli, продуцируют, как правило, рекомбинантный белок в нерастворимой форме: белок накапливается в тельцах включения. При выделении таких белков требуется провести денатурацию (растворение телец включения), а затем ренатурацию рекомбинантного белка и, наконец, отщепление с помощью протеазы АП целевого белка от тэга - АП, необходимой для осуществления выделения белка с помощью аффинной хроматографии (или наоборот, сначала - расщепление денатурированного белка, затем - рефолдинг), или использования рекомбинантного белка в том виде, какой он имеет после ренатурации. Далее в ходе исследования возникает вопрос: насколько рекомбинантный белок или полученный целевой соответствует третичной структуре природного белка? Чтобы избежать этого вопроса, мы решили использовать в качестве вектора плазмиду, которая позволяет в большинстве случаев, как следует из литературы, получать растворимые рекомбинантные белки. Однако выход таких белков оказывается ниже. На наш с « взгляд, такие белки должны в большей степени быть приближенными (если не соответствовать полностью) нативной упаковке целевого белка. И второе, — чтобы ускорить получение ответа на вопрос о пригодности целевого белка в ИФА и у-ИФН-анализе для диагностики туберкулёза, мы решили провести их испытание в виде полученного рекомбинантного белка, так как третичная структура целевого белка до и после обработки протеазой должна сохраняться, т.е. в ходе протеолиза не подвергается денатурации. Третье - мы решили оценить влияние N-концевой компоненты (конкретно глутатионтрансферазы) рекомбинантного белка на результат с помощью двух иммунологических методов. Решив эту задачу, можно дать ответ, следует проводить отщепление целевого белка от N-концевой компоненты или использовать такого типа рекомбинантные белки непосредственно в анализе. На сегодняшний день неизвестно, происходит ли в растворе изменение третичной структуры отщеплённого целевого белка от той, которую его АП имеет в составе рекомбинантного?

Современные высокопроизводительные методы клонирования в настоящее время (Dieckman L. et al., 2002) позволяют одновременно провести клонирование в автоматическом режиме до 400 ПЦР-фрагментов. Если эту процедуру выполнять в ручном варианте, то значение снизится до 10 как минимум разных фрагментов при использовании какого-либо одного выбранного вектора. Это означает, что одновременно можно вести испытание 10 иммуногенных белков. Правда, выполнение эксперимента по клонированию (включая стадию получения рекомбинантных экспрессирующих клонов) уже не будет укладываться в три дня - затянется до 1 недели - 10 дней. Далее - 1 неделя на наработку рекомбинантных белков в количествах, достаточных для испытания в у-ИФН- и/или у-ИФН-ELISpot-анализе. Скорость-лимитирующей стадией тестирования рекомбинантных белков будут Т-клеточные тесты, поскольку результат этих исследований зависит от выборки изолятов крови, полученных от больных туберкулёзом (или ВИЧ-ассоциированным туберкулёзом) и здоровых доноров. Поскольку Т-клеточные тесты используют интактные (жизнеспособные клетки крови), то изоляты крови для испытания необходимо использовать свежими или иметь надёжный банк консервированной крови или выделенных мононуклеарных клеток из отобранных изолятов.

Перспективным направлением в области повышения чувствительности у-ИФН-и/или у-ИФН-ELlSpot-анализа для диагностики туберкулёза является как продолжение предыдущих испытаний выявление высокоиммуногенных этитопов (антигенных детерминант) в АП каждого из зарекомендовавших себя белков, и создание на их основе генетических конструкций, включающих различные ассоциации (объединения) эпитоп-кодирующих последовательностей в одной генетической конструкции.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Болдырев, Александр Николаевич, 2009 год

1. Богун А.Г., Анисимова В.А., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Структура делеций, выявленных в геномах клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis II Пробл. туберк. болезн. лёгких. 2007. № 12. С. 42-47.

2. Визель А.А., Гурылёва М.Э. Туберкулёз / под ред. М.И. Перельмана. М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. 208 с. (В помощь практикующему врачу).

3. Гладкова С.Е., Решетников С.С., Пряхина В.Н. Опыт применения тест-системы "АТ-Туб-Бест" для"диагностики туберкулёза // Новости "Вектор-Бест". 2006. № 4(42). С. 3-7.

4. Лукьянов С.А., Гурская Н.Г., Лукьянов К.А, Тарабыкин B.C., Свердлов Е.Д. Высокоэффективная вычитающая гибридизация кДНК // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. №6. С. 701-704.

5. Малярова Е.Ю., Мушкин А.Ю., Коваленко К.Н., Кондратенко И.В. Лечение множественных костных поражений у ребёнка с генерализованной BCG-инфекцией // Пробл. туберк. болезн. лёгких. 2005. №. 11. С. 34-36.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж, Методы генетической инженерии.-Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

7. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976. 436 с.

8. Милькаманович В.К. Диагностика и лечение болезней органов дыхания. Минск: Полифакт-Альфа, 1997. 360 с. (Практическое руководство).

9. Решетников С.С. Применение набора реагентов "АТ-Туб-Бест" для диагностики туберкулёза (вопросы и ответы) // Новости "Вектор-Бест". 2007. № 4(46). С. 89.

10. Ю.Решетников С.С., Гладкова С.Е., Офицеров В.И. Новая тест-система для серодиагностики туберкулёза // Новости "Вектор-Бест". 1998. № 3(9). С. 3-7.

11. П.Свердлов Е.Д., Ермолаева О.Д. Вычитающая гибридизация. Теоретический анализ и принцип ловушки // Биоорган, химия. 1993. Т. 19. № 11. С. 1081—1088.

12. Юнкеров В.И., Григорьев С.Г. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований СПб.: ВМедА, 2002. 266 с.

13. Гланц С. Медико-биологическая статистика М.: Практика, 1998. 459 с.

14. Adams J.F., Scholvinck Е.Н., Gie R.P., Potter P.C., Beyers N., Beyers A.D. Decline in total serum IgE after treatment for tuberculosis // Lancet. 1999. V. 353. № 9169. P. 2030-2033.

15. Al-Attiyah R., Mustafa A.S. Characterization of Human Cellular Immune Responses to Novel Mycobacterium tuberculosis Antigens Encoded by Genomic Regions Absent in Mycobacterium bovis BCG // Infect. Immun. 2008. V. 76. № 9. P. 41904198.

16. Al-Attiyah R., Shaban F.A., Wiker H.G., Oftung F., Mustafa A.S. Synthetic peptides identify promiscuous human Thl cell epitopes of the secreted mycobacterial antigen MPB70 // Infect. Immun. 2003. V. 71. № 4. P. 1953-1960.t

17. Amara R.R., Satchidanandam V. Analysis of a genomic DNA expression library of Mycobacterium tuberculosis using tuberculosis patient sera: evidence for modulation of host immune response // Infect. Immun. 1996. V. 64. № 9. P. 3765-3771.

18. Andersen A.B., Hansen E.B. Structure and mapping of antigenic domains of protein antigen b, a 38,000-molecular-weight protein of Mycobacterium tuberculosis 11 Infect. Immun. 1989. V. 57. № 8. P. 2481-2488.

19. Barenholz A., Hovav A.H., Fishman Y., Rahav G., Gershoni J.M., Bercovier H. A peptide mimetic of the mycobacterial mannosy-lated lipoarabinomannan: characterization and potential applications // J. Med. Microbiol. 2007. V. 56. № 5. P. 579-586.

20. Behr M.A., Wilson M.A., Gill W.P., Salamon H., Schoolnik G.K., Rane S., Small P.M. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray // Science. 1999. V. 284. № 5419. P. 1520-1523.

21. Betts J.C., Dodson P., Quan S., Lewis A.P., Thomas P.J., Duncan K., McAdam R.A. Comparison of the proteome of Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv with clinical isolate CDC 1551 //Microbiology. 2000. V. 146. № 12. P. 3205-3216.

22. Bhaskar S., Khanna S.P., Mukherjee R. Isolation, purification and immunological characterization of novel low molecular weight protein antigen CFP 6 from culture filtrate of M. tuberculosis // Vaccine. 2000. V. 18. № 25. P. 2856-2866.

23. Billman-Jacobe H., Sloan J., Coppel R.L. Analysis of isoniazid-resistant transposon mutants of Mycobacterium smegmatis // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V. 144. № 1. P. 47-52.

24. Brock I., Munk M.E., Kok-Jenson A., Anderson P. Performance of whole blood IFN-y test for tuberculosis diagnosis based on PPD or the specific antigen ESAT-6 and CFP-10 // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2001. V. 5. № 5. P. 462-467.

25. Brock I., Weldingh K., Leyten E.M., Arend S.M., Ravn P., Andersen P. Specific T-cell epitopes for immunoassay-based diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection // J. Clin. Microbiol. 2004. V. 42. № 6. P. 2379-2387.

26. Brock I., Weldingh K., Lillebaek T.,'Follmann F., Anderson P. Comparison of tuberculin skin test and new specific blood test in tuberculosis contacts. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2004. V. 170. № 1. P. 65-69.

27. Brosch R., Gordon S.V., Billault A., Gamier Т., Eiglmeier K., Soravito C., Barrell

28. B.G., Cole S.T. Use of a Mycobacterium tuberculosis H37Rv bacterial artificialichromosome library for genome mapping, sequencing, and comparative genomics // Infect. Immun. 1998. V. 66. № 5. P. 2221-2229.

29. Brosch R., Gordon S.V., Buchrieser C., Pym A.S., Gamier Т., Cole S.T. Comparative genomics uncovers large tandem chromosomal duplications in Mycobacterium bovis BCG Pasteur//Yeast. 2000. V. 17. №2. P. 111-123.

30. Camacho L.R., Ensergueix D., Perez E., Gicquel В., Guilhot C. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis // Mol. Microbiol. 1999. V. 34. № 2. P. 257-267.

31. CDC Trends in tuberculosis United States, 1998-2003 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. (MMWR). 2004. V. 53. S. 209-214.

32. Chaitra M.G., Hariharaputran S., Chandra N.R., Shaila M.S., Nayak R. Defining putative T cell epitopes from PE and PPE families of proteins of Mycobacterium tuberculosis with vaccine potential // Vaccine. 2005. V. 23. № 10. P. 1265-1272.

33. Chakravorty S., Tyagi J.S. Novel multipurpose methodology for detection of mycobacteria in pulmonary and extrapulmonary specimens by smear microscopy, culture, and PCR // J. Clin. Microbiol. 2005. V. 43. № 6. P. 2697-2702.

34. Cho S.N. Current issues on molecular and immunological diagnosis of tuberculosis // Yonsei Med. J. 2007. V. 48. № 3. P. 347-359.

35. Chung C.T., Niemela S.L., Miller R.H. One-step preparation of competent Escherichia coli: Transformation and storage of bacterial cells in the same solution // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. V. 86. № 7. P. 2172-2175.

36. Daniel T.M., Debanne S.M., van der Kuyp F. Enzyme-linked immunosorbent assay using Mycobacterium tuberculosis antigen 5 and PPD for the erodiagnosis of tuberculosis I I Chest. 1985. V. 88. № 3. P. 388-392.

37. Delogu G., Sanguinetti M., Pusceddu C., Bua A., Brennan M.J., Zanetti S., Fadda G. PEPGRS proteins are differentially expressed by Mycobacterium tuberculosis in host tissues // Microbes Infect. 2006. V. 8. № 8. P. 2061-2067.

38. Desem N., Jones S. L. Development of a human gamma interferon enzyme immunoassay and comparison with tuberculin skin testing for detection of Mycobacterium tuberculosis infection // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998. V. 5. № 4. P. 531-536.

39. Dieckman L., Gu M., Stols L., Donnelly M.I., Collart F.R. High throughput methods for gene cloning and expression // Protein Expr. Purif. 2002. V. 25. № 1. P. 1-7.

40. Djelouadji Z., Raoult D., Daffe M., Drancourt M. A Single-Step Sequencing Method for the Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex Species // PLoS Negl. Trop. Dis. 2008. V. 2. № 6. e253. P. 1-8.

41. Drancourt M., Carrieri P., Gevaudan M.J., Raoult D. Blood agar and Mycobacterium tuberculosis: the end of a dogma // J. Clin. Microbiol. 2003. V. 41. № 4. P. 1710— 1711.

42. Dorokhov Y.L., Sheveleva A.A., Frolova O.Y., Komarova T.V., Zvereva A.S., Ivanov P.A., Atabekov J.G. Superexpression of tuberculosis antigens in plant leaves //Tuberculosis (Edinb). 2007. V. 87. № 3. P. 218-224.

43. Drancourt M., Raoult D. Cost-effectiveness of blood agar for isolation of mycobacteria // PLoS Negl. Trop. Dis. 2007. V. 1. № 2. e83. P. 1-5.

44. Flores A.R., Parsons L.M., Pavelka M.S. Jr. Characterization of novel Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium smegmatis mutants hypersusceptible to beta-lactam antibiotics //J. Bacteriol. 2005. V. 187. № 6. P. 1892-1900.

45. Gao L.Y., Guo S., McLaughlin В., Morisaki H., Engel J.N., Brown E.J. A mycobacterial virulence gene cluster extending RD1 is required for cytolysis, bacterial spreading and ESAT-6 secretion // Mol. Microbiol. 2004. V. 53. № 6. P. 1677-1693.

46. Geluk A., Lin M.Y., van Meijgaarden K.E., Leyten E.M.S., Franken K.L.M.C., Ottenhoff T.H.M., Klein M.R. T-Cell Recognition of the HspX Protein of

47. Mycobacterium tuberculosis Correlates with Latent M. tuberculosis Infection but Not with M. bovis BCG Vaccination // Infect. Immun. 2007. V. 75. № 6. P. 2914-2921.

48. Geourjon C., Deleage G. SOPMA: significant improvement in protein secondary structure prediction by consensus prediction from multiple alignments // Comput. Appl. Biosci. 1995. V. 11. №6. P. 681-684.

49. Giri P.K., Schorey J.S. Exosomes derived from M. bovis BCG infectcd macrophages activate antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells in vitro and in vivo // PLoS ONE. 2008. V. 3.№6. c2461.

50. Global tuberculosis control: surveillance, planning, financing. WHO report 2007. Geneva, World Health Organization, 2007 (WHO/HTM/TB/2007.376).

51. Goldsby R.A., Kindt T.J., Kuby J., Osborne В .A. Immunology. 5th ed. N.-Y.: W.H. Freeman & Co., Amherst College, MA, 2003. (Immunology textbook for students).

52. Gordon S.V., Brosch R., Billault A., Gamier Т., Eiglmeier K., Cole S.T. Identification of variable regions in the genomes of tubercle bacilli using bacterial artificial chromosome arrays // Mol. Microbiol. 1999. V. 32. № 3. P. 643-655.

53. Guilhot С., Otal I., Van Rompaey I., Martin C., Gicquel B. Efficient transposition in mycobacteria: construction of Mycobacterium smegmatis insertional mutant libraries //J. Bacteriol. 1994. V. 176. № 2. P. 535-539.

54. Harboe M., Malin A.S., Dockrell H.S., Wiker H.G., Ulvund G., Holm A., Jorgensen M.C., Andersen P. B-cell epitopes and quantification of the ESAT-6 protein of Mycobacterium tuberculosis II Infect. Immun. 1998. V. 66. № 2. P. 717-723.

55. He X.Y., Zhuang Y.H., Zhang X.G., Li G.L. Comparative proteome analysis of culture supernatant proteins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv and H37Ra // Microbes Infect. 2003. V. 5. № 10. P. 851-856.

56. Hendrix R.W., Smith M.C., Burns R.N., Ford M.E., Hatfull G.F. Evolutionary relationships among diverse bacteriophages and prophages: all the world's a phage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 5. P. 2192-2197.

57. Hernandez Pando R., Aguilar L.D., Infante E., Cataldi A., Bigi F., Martin C., Gicquel B. The use of mutant mycobacteria as new vaccines to prevent tuberculosis // Tuberculosis (Edinb). 2006. V. 86. № 3/4. P. 203-210.

58. Honda I., Seki M., Ikeda N., Yamamoto S., Yano I., Koyama A., Toida I. Identification of two subpopulations of Bacillus Calmette-Guerin (BCG) Tokyo 172 substrain with different RD16 regions // Vaccine. 2006. V. 24. № 23. P. 4969-4974.

59. Infante E., Aguilar L.D., Gicquel В., Pando R.H. Immunogenicity and protective efficacy of the Mycobacterium tuberculosis fadD26 mutant // Clin. Exp. Immunol. 2005. V. 141. № 1. P. 21-28.

60. Jackett P.S., Bothamley G.H., Batra H.V., Mistry A., Young D.B., Ivanyi J. Specificity of antibodies to immunodominant mycobacterial antigens in pulmonary tuberculosis // J. Clin. Microbiol. 1988. V. 26. № 11. P. 2313-2318.

61. Jenkin G.A., Stinear T.P., Johnson P.D., Davies J.K. Subtractive hybridization reveals a type I polyketide synthase locus specific to Mycobacterium ulcerans II J. Bacteriol. 2003. V. 185. № 23. P. 6870-6882.

62. Jungblut P.R., Miiller E.C., Mattow J., Kaufmann S.H. Proteomics reveals open reading frames in Mycobacterium tuberculosis H37Rv not predicted by genomics // Infect. Immun. 2001. V 69. № 9. P. 5905-5907.

63. Jurzak M., Boer R, Fritzsch G., Kojro E., Fahrenholz F. Monoclonal antibodies against different epitopes of peptide hormones. Use of photoreactivc analogues in studies on vasopressin // Eur. J. Biochem. 1990. V. 190. № l.P. 45-52.

64. Kalpana G.V., Bloom B.R., Jacobs W.R. Jr. Insertional mutagenesis andiillegitimate recombination in mycobacteria // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V. 88. № 12. P. 5433-5437.

65. Kashyap R.S., Dobos K.M., Belisle J.T., Purohit H.J., Chandak N.H., Taori G.M., Daginawala H.F. Demonstration of components of antigen 85 complex in CSF of Tuberculous meningitis patients // Clinical Diagn. Lab. Immunol. 2005. V. 12. № 6. P. 752-758.

66. Kato-Maeda M., Rhee J.T., Gingeras T.R., Salamon H., Drenkow J., Smittipat N., Small P.M. Comparing genomes within the species Mycobacterium tuberculosis II Genome Res. 2001. V. 11. №4. P. 547-554.

67. Katti M.K. Assessment of RD 1-encoded mycobacterial antigens in the immunodiagnosis of pulmonary, extrapulmonary, and latent tuberculosis infections // J. Infect. Dis. 2001. V. 184. № 11. P. 1497-1498.

68. Kutlu A., Bozkanat E., Cift<?i F., Bozkurt В., Gorur R., Ardi? N., Taskapari O. Effect of active tuberculosis on skin prick allergy tests and serum IgE levels // J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 2008. V. 18. № 2. P.113-118.

69. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-685.

70. Lalvani A. Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century: new tools to tackle an old enemy // Chest. 2007. V. 131. № 6. P. 1898-1906.

71. Lamichhane G., Tyagi S., Bishai W.R. Designer arrays for defined mutant analysis to detect genes essential for survival of Mycobacterium tuberculosis in mouse lungs // Infect. Immun. 2005. V. 73. № 4. P. 2533-2540.

72. Lemus D., Martin A., Montoro E., Portaels F., Palomino J.C. Rapid alternative methods for detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis II J. Antimicrob. Chemother. 2004. V. 54. № 1. P. 130-133.

73. Lewis K.N., Liao R., Guinn K.M., Hickey M.J., Smith S., Behr M.A., Sherman D.R. Deletion of RD1- from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation // J. Infect. Dis. 2003. V. 187. № 1. P. 117-123.

74. Leyten E.M.S., Prins C., Bossink A.W.J., Thijsen S., Ottenhoff T.H.M., van Dissel J.T., Arend S.M. Effect of tuberculin skin testing on a Mycobacteriumtuberculosis-specific interferon-y assay // Eur. Respir. J. 2007. V. 29. № 6. P. 1212— 1216.

75. Lim R.L., Tan L.K., Lau W.F., Ming M.C., Dunn R, Too H.P., Chan L. Cloning and Expression of Immunoreactive Antigens from Mycobacterium tuberculosis II Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. V. 7. № 4. P. 600-606.

76. Litwin C.M. In vitro gamma interferon tests for the detection of tuberculosis infection // J. Immunotoxicol. 2007. V. 4. № 3. P. 219-224.

77. Liu J., Tran V., Leung A.S., Alexander D.C., Zhu B. BCG vaccines: Their mechanisms of attenuation and impact on safety and protective efficacy // Hum. Vaccin. 2009. V. 5. № 2. P. 70-78.

78. LoBue P., Sizemore C., Castro K.G. Plan to Combat Extensively Drug-Resistant Tuberculosis // Morb. Mortal. Wkly. Rep. (MMWR). 2009. V. 58. № RR-3. P. 1-48.

79. MacGum J.A., Cox J.S. A genetic screen for Mycobacterium tuberculosis mutants defective for phagosome maturation arrest identifies components of the ESX-1 secretion system // Infect. Immun. 2007. V. 75. № 6. P. 2668-2678.

80. Mahairas G.G., Sabo P.J., Hickcy M.J., Singh D.C., Stover C.K. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis И J. Bacteriol. 1996. V. 178. № 5. P. 1274-1282.

81. Malen H., Softeland Т., Wiker H.G. Antigen analysis of Mycobacterium tuberculosis H37Rv culture filtrate proteins // Scand. J. Immunol. 2008. V. 67. № 3. P. 245-252.

82. Manca C., Lyashchenko K., Colangeli R., Gennaro M.L. MTC28, a novel 28-kilodalton proline-rich secreted antigen specific for the Mycobacterium tuberculosis complex // Infect. Immun. 1997. V. 65. № 12. P. 4951-4957.

83. Manca C., Lyashchenko K., Wiker H.G., Usai D., Colangeli R., Gennaro M.L. Molecular cloning, purification, and serological characterization of MPT63, a novel antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis II Infect. Immun. 1997. V. 65. № 1. P. 16-23.

84. Maus C.E., Plikaytis B.B., Shinnick T.M. Mutation of tlyA confers capreomycin resistance in Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. 2005. V. 49. №2. P. 571-577.

85. Mostowy S., Tsolaki A.G., Small P.M., Behr M.A. The in vitro evolution of BCG vaccines // Vaccine. 2003. V. 21. № 27/30. P. 4270-4274.

86. Mustafa A.S., Al-Attiyah R. Tuberculosis: Looking Beyond BCG Vaccines // J. Postgrad. Med. 2003. V. 49. № 2. P. 134-140.

87. Nagai S., Matsumoto J., Nagasuga T. Specific skin-reactive protein from culture filtrate of Mycobacterium bovis BCG // Infect. Immun. 1981. V. 31. № 3. P. 1152— 1160.

88. Nagai S., Wiker H.G., Harboe M., Kinomoto M. Isolation and partial characterization of major protein antigens in the culture fluid of Mycobacterium tuberculosis II Infect. Immun. 1991. V. 59. № 1. P. 372-382.

89. Nakamura R.M., Einck L., Velmonte M.A., Kawajiri K., Ang C.F., Delasllagas C.E., Nacy C.A. Detection of active tuberculosis by an MPB64 transdermal patch: a field study // Scand. J. Infect. Dis. 2001. V. 33. № 6. P. 405^107.

90. O'Farrell P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. № 10. P. 4007^1021.

91. Pai M., Kalantri S., Dheda K. New tools and emerging technologies for the diagnosisof tuberculosis: Part I. Latent tuberculosis // Expert Rev. Mol. Diagn. 2006. V. 6. №3. P. 413-422.

92. Pai M., Kalantri S., Dheda K. New tools and emerging technologies for the diagnosis of tuberculosis: Part II. Active tuberculosis and drug resistance // Expert Rev. Mol. Diagn. 2006. V. 6. № 3. P. 423-432.

93. Pai M., Riley L.W., Colford J.M. Jr. Interferon gamma assays in the immunodiagnosis of tuberculosis: a systematic review // Lancet Infect. Dis. 2004. V. 4. № 12. P.761-776.

94. Pethe K., Swenson D.L., Alonso S., Anderson J., Wang C., Russell D.G. Isolation of Mycobacterium tuberculosis mutants defective in the arrest of phagosome maturation//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. № 37. P. 13642-13647.

95. Petroff S.A., Branch A. Bacillus Calmette-Guerin (B.C.G.): Animal Experimentation and Prophylactic Immunization of Children // Am. J. Public Health Nations Health. 1928. V. 18. № 7. P. 843-864.

96. Pina-Vaz С., Costa-de-Oliveira S., Rodrigues A.G. Safe susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis by flow cytometry with the fluorescent nucleic acid stain SYTO 16 // J. Med. Microbiol. 2005. V. 54. № 1. P. 77-81.

97. Pitarque S., Larrouy-Maumus G., Payre В., Jackson M., Puzo G., Nigou J. The immunomodulatory lipoglycans, lipoarabinomannan and lipomannan, are exposed at the mycobacterial cell surface // Tuberculosis (Edinb). 2008. V. 88. № 6. P. 560-565.

98. Pym A.S., Brodin P., Brosch R., Huerre M., Cole S.T. Loss of RD1 contributed to the attenuation of the live tuberculosis vaccines Mycobacterium bovis BCG and Mycobacterium microti II Mol. Microbiol. 2002. V. 46. № 3. P. 709-717.

99. Reisner A.H. Gel protein stains: a rapid procedure // Methods Enzymol. 1984. V. 104. P. 439-441.

100. Reisner A.H., Nemes P., Bucholtz C. The use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels //Anal. Biochem. 1975. V. 64. № 2. P. 509-516.

101. Reisner B.S., Gatson A.M., Woods G.L. Evaluation of mycobacteria growth indicator tubes for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis to isoniazid and rifampin // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1995. V. 22. № 4. P. 325-329.

102. Rengarajan J., Bloom B.R., Rubin E.J. Genome-wide requirements for Mycobacterium tuberculosis adaptation and survival in macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. № 23. P. 8327-8332.

103. Reuter H., Burgess L., van Vuuren W., Doubell A. Diagnosing tuberculous pericarditis // Quarterly journal of medicine (QJM). 2006. V. 99. № 12. P. 827-839.

104. Rezai M.S., Khotaei G., Mamishi S., Kheirkhah M., Parvaneh N. Disseminated Bacillus Calmette-Guerin Infection after BCG Vaccination // J. Trop. Pediatr. 2008. V. 54. №6. P. 413-416.

105. Rezwan M., Laneelle M.-A., Sander P., Daffe M. Breaking down the wall: Fractionation of mycobacteria//J. Microbiol. Meth. 2007. V. 68. № 1. P. 32-39.

106. Richeldi L. An update on the diagnosis of tuberculosis infection // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2006. V. 174. № 7. P. 736-742.

107. Roche P.W., Feng C.G., Britton W.J. Human T-cell epitopes on the Mycobacterium tuberculosis 'secreted protein MPT64 // Scand. J. Immunol. 1996. V. 43. № 6 P. 662-670.

108. Roche P.W., Peake P.W., Billman-Jacobe H., Doran Т., Britton W.J. T-cell determinants and antibody binding sites on the major mycobacterial secretory protein MPB59 of Mycobacterium bovis H Infect. Immun. 1994. V. 62. № 12. P. 5319-5326.

109. Rom W.N., Yie T.A., Tchou-Wong K.M. Development of a suicide gene as a novel approach to killing Mycobacterium tuberculosis II Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997. V. 156. № 6. P. 1993-1998.

110. Rosenkrands I., Aagaard C., Weldingh K., Brock I., Dziegiel M.H., Singh M., Hoff S., Ravn P., Andersen P. Identification of Rv0222 from RD4 as a novel serodiagnostic target for tuberculosis // Tuberculosis (Edinb). 2008. V. 88. № 4. P. 335-343.

111. Salamon II., Kato-Maeda M., Small P.M., Drenkow J., Gingeras T.R. Detection of deleted genomic DNA using a semiautomated computational analysis of GeneChip data // Genome Res. 2000. V. 10. № 12. P. 2044-2054.

112. Sassetti C.M., Boyd D.H., Rubin E.J. Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis // Mol. Microbiol. 2003. V. 48. № 1. P. 77-84.

113. Senaratne R.H., Mougous J.D., Reader J.R., Williams S.J., Zhang Т., Bertozzi C.R., Riley L.W. Vaccine efficacy of an attenuated but persistent Mycobacterium tuberculosis cysH mutant // J. Med. Microbiol. 2007. V. 56. № 4. P. 454-458.

114. Sharma A., Saha A., Bhattacharjee S., Majumdar S., Das Gupta S.K. Specific and randomly derived immunoactive peptide mimotopes of mycobacterial antigens // Clin. Vaccine Immunol. 2006. V. 13. № 10. P. 1143-1154.

115. Sherman D.R., Guinn K.M., Hickey M.J., Mathur S.K., Zakel K.L., Smith S. Mycobacterium tuberculosis H37Rv: Delta RD1 is more virulent than M. bovis bacille Calmette-Guerin in long-term murine infection // J. Infect. Dis. 2004. V. 190. № 1. P. 123-126.

116. Shizuya H., BirrenB., Kim U.J., Mancino V., Slepak Т., Tachiiri Y., Simon M. Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in

117. Escherichia coli using an F-factor-based vector // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. № 18. P. 8794-8797.

118. Singh S.K., Shah N.K., Bisen P.S. A synthetic gag p24 epitope chemically coupled to BSA through a decaalanine peptide enhances HIV type 1 serodiagnostic ability by several folds // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2007. V. 23. № 1. P. 153— 160.

119. Sorensen A.L., Nagai S., Houen G., Andersen P., Andersen A.B. Purification and characterization of a low-molecular-mass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis II Infect. Immun. 1995. V. 63. № 5. P. 1710-1717.

120. Stewart G.R., Patel J., Robertson B.D., Rae A., Young D.B. Mycobacterial mutants with defective control of phagosomal acidification // PLoS Pathog. 2005. V. 1. № 3. P. 269-278.

121. Straus D., Ausubel F.M. Genomic subtraction for cloning DNA corresponding to deletion mutations // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. V. 87. № 5. P. 1889-1893.

122. Taggart E.W., Hill H.R., Ruegner R.G., Martins T.B., Litwin C.M. Evaluation of an in vitro assay for gamma-interferon production in response to Mycobacterium tuberculosis infections // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004. V. 11. № 6. P. 10891093.

123. Talarico S., Zhang L., Marrs C.F., Foxman В., Cave M.D., Brennan M.J., Yang Z. Mycobacterium tuberculosis PEPGRS16 and PEPGRS26 genetic polymorphism among clinical isolates // Tuberculosis (Edinb). 2008. V. 88. № 4. P. 283-294.

124. Terpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 60. № 5. P. 523-533.

125. Tortoli E., Cichero P., Piersimoni C., Simonetti M.T., Gesu G., Nista D. Use of BACTEC MGIT 960 for recovery of mycobacteria from clinical specimens: multicenter study // J. Clin. Microbiol. 1999. V. 37. № 11. P. 3578-3582.

126. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V. 76. № 9. P. 4350-4354.

127. Van Pinxteren L.A., Ravn P., Agger E.M., Pollock J., Andersen P. Diagnosis of tuberculosis based on the two specific antigens ESAT-6 and CFP10 // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. V. 7. № 2. P. 155-160.

128. Vani J., Shaila M.S., Chandra N.R., Nayak R. A combined immuno-informatics and structure-based modeling approach for prediction of T cell epitopes of secretory proteins of Mycobacterium tuberculosis И Microbes Infect. 2006. V. 8. № 3. P. 738746.

129. Veenstra H., Crous I., Brahmbhatt S., Lukey P., Beyers N., van Helden P.D., Walzl G. Changes in the kinetics of intracellular IFN-gamma production in ТВ patients during treatment// Clin. Immunol. 2007. V. 124. № 3. P. 336-344.

130. Wallis R.S., Aide S.L., Havlir D.V., Amir-Tahmasseb M.H., Daniel T.M., Ellner J.J. Identification of antigens of Mycobacterium tuberculosis using human monoclonal antibodies // J. Clin. Invest. 1989. V. 84. № 1. P. 214-219.

131. Wang A., Clapper J., Guderian J.A., Foy T.M., Fanger G.R., Retter M.W., Skeiky Y.A. A novel method for increasing the expression level of recombinant proteins // Protein Expr. Purif. 2003. V. 30. № 1. P. 124-133.

132. Wang B.L., Xu Y., Wu C.Q., Xu Y.M., Wang H.H. Cloning, expression, and refolding of a secretory protein ESAT-6 of Mycobacterium tuberculosis // Protein Expr. Purif. 2005. V. 39. № 2. P. 184-188.

133. Wang J., Zganiacz A., Xing Z. Enhanced immunogenicity of BCG vaccine by using a viral-based GM-CSF transgene adjuvant formulation // Vaccine. 2002. V. 20. № 23/24. P. 2887-2898.

134. Weldingh K., Andersen P. Immunological evaluation of novel Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1999. V. 23. №2. P. 159-164.

135. West N.P., Wozniak T.M., Valenzuela J., Feng C.G., Sher A., Ribeiro J.M., Britton W.J. Immunological diversity within a family of cutinase-like proteins of Mycobacterium tuberculosis I/ Vaccine. 2008. V. 26. № 31. P. 3853-3859.

136. WHO Report 2009. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing. P. 1-314.

137. Williams-Bouyer N., Yorke R., Lee H.I., Woods G.L. Comparison of the ВАСТЕС MGIT 960. and ,ESP culture system II for growth and detection of mycobacteria//J. Clin. Microbiol. 2000. V. 38. № 11. P. 4167-4170.

138. Yang Z., Barnes P.F., Chaves F., Eisenach K.D., Weis S.E., Bates J.H., Cave M.D. Diversity of DNA fingerprints of Mycobacterium tuberculosis isolates in the United States // J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36. № 4. P. 1003-1007.

139. Young R.A., Bloom B.R., Grosskinsky C.M., Ivanyi J., Thomas D., Davis R.W. Dissection of Mycobacterium tuberculosis antigens using recombinant DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. V. 82. № 9. P. 2583-2587.

140. Yiice A., Yucesoy M., Gen? S., Sayan M., U?an E.S. Serodiagnosis of, tuberculosis by enzyme immunoassay using A60 antigen // Clin. Microbiol. Infect. 2001. V. 7. №7. P. 372-376.