Разработка подходов к повышению эффективности иммунологической диагностики туберкулеза легких тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат биологических наук Васильева, Елена Викторовна

• Васильева, Елена Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Васильева, Елена Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цели и задачи

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость исследования

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Глава 1 Эффективность применения метода QuantiFERON®-TB Gold in-tube в

диагностике туберкулеза легких

Глава 2 Установление информативных биомаркеров на основании изучения спонтанной и антиген-индуцированной продукции EGF, MIP-lß, VEGF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-la, IFN-a2, TGFa, TN Fa, sIL-2Ra, sCD40L, IP-10

2.1 Поиск альтернативных биомаркеров для выявления туберкулезного инфицирования

2.2 Поиск биомаркеров, позволяющих проводить дифференциальную диагностику активного ТБ легких и ЛТБИ

2.3 Диагностические возможности комбинированного применения биомаркеров активности туберкулезного процесса

Глава 3 Разработка иммуноферментной тест-системы на основе

различных антигенов Mtb

3.1 Оптимизация условий проведения иммуноферментного анализа для выявления IgG антител к антигенам Mtb

3.2 Изучение диагностических параметров иммуносорбентов на основе антигенов CBD-CFP10, CBD-ESAT6, ESAT6-CFP10, CBD-P38 и PPDN3

3.3 Диагностические параметры иммуноферментной тест-системы при комбинированном использовании антигенов Mtb

Глава 4 Сравнительная ценность QuantiFERON®-TB Gold in-tube, неоптерина и специфических противотуберкулезных антител для диагностики туберкулеза

легких

Глава 5 Разработка алгоритма иммунодиагностики туберкулеза легких

Заключение

Выводы

Практические рекомендации

Перспективы дальнейшей разработки темы

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Приложения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка подходов к повышению эффективности иммунологической диагностики туберкулеза легких»

Введение

Актуальность темы исследования

Туберкулез (ТБ) относят к числу социально-значимых инфекционных заболеваний. ?Тесмотря на то, что согласно данным ФГУ «ЦНИИОИЗ Минздравсоц-развития РФ» заболеваемость ТБ на 100 ООО населения в 2012 г. снизилась до 68,1 с 73,0 в 2011 г., растет распространенность туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя, в т.ч среди ВИЧ-инфицированных.

Точная и быстрая диагностика играет ключевую роль в контроле над заболеванием (Al-Zamel F. Detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis // Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2009. Vol.7, N 9. P. 1099-1108). В настоящее время в лабораторной диагностике ТБ применяют микробиологические и молекулярно-генетические методы исследования. Однако каждый из них имеет свои ограничения, связанные с трудоёмкостью, длительностью, а также с невозможностью выявления Mycobacterium tuberculosis (Mtb) в мокроте, в частности, при латентной туберкулезной инфекции (ЛТБИ). В этих случаях большое значение приобретают иммунологические методы исследования. На протяжении десятилетий с этой целью применяли кожно-аллергические пробы Манту и Пирке. Однако, с момента введения в нашей стране массовой вакцинации новорожденных авирулентным штаммом Mycobacterium bovis (М bovis) BCG в 1949 г., диагностическое значение пробы с туберкулином снизилось из-за перекрестной сенсибилизации организма вакцинным штаммом М. bovis BCG и вирулентными штаммами Mtb при инфицировании (Митинская JT.A. Новые технологии при профилактике, выявлении, диагностике и лечении туберкулеза у детей // Проблемы туберкулеза. 2003. №1. С. 1925), а также по той причине, что в качестве антигена используют PPD (purified protein derivate) - смесь более 200 антигенов, получаемых из микобактерий-возбудителей туберкулеза человека и крупного рогатого скота (Литвинов В.И. Латентная туберкулезная инфекция - миф или реальность? // Туберкулез и болезни легких. 2011. № 6. С. 3-9). В современных условиях доля ложноположительных реакций Манту составляет от 40 % до 90% (Белушков В.В. Значение диаскинтеста и

квантиферонового теста в диагностике туберкулеза у детей // Фундаментальные исследования. 2012. № 7 (часть 1). С. 34-39).

В результате полной расшифровки генома Mtb (Cole S.T. Deciphering the biology of Mycobacterium Tuberculosis from the complete genome sequence // Nature. 1998. Vol.393, N 6685. P. 537-544) и M. bovis BCG были идентифицированы гены, контролирующие экспрессию белков-антигенов, используемых в недавно разработанных тестах для оценки противотуберкулёзного клеточного иммунного ответа. К их числу следует отнести кожную пробу Диаскинтест® и клеточный тест in vitro QuantiFERON®TB Gold In-Tiibe. Последний основан на количественном определении специфической продукции интерферона-гамма (IFNyAc.), индуцированной антигенами ESAT6, CFP10 и ТВ 7.7 (р4). Оба теста показали высокую специфичность выявления туберкулезного инфицирования у здоровых вакцинированных лиц, однако они не позволяют дифференцировать активный туберкулез от латентного (Pai М. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update // Ann Intern Med. 2008. Vol.149, N 3. P. 177-184). В связи с этим активно ведется поиск новых альтернативных биомаркеров и методов оценки клеточного иммунного ответа у инфицированных и больных ТБ.

Определенные успехи были достигнуты и в разработке тестов для диагностики ТБ на основе оценки гуморального иммунного ответа с использованием различных видоспецифичных антигенов Mtb. Показано, что применение индивидуальных рекомбинантных антигенов для выявления специфических антител повышает специфичность анализа, значительно уменьшая при этом его чувствительность. Для решения этой проблемы предлагается использовать не один антиген, а их комбинацию, что позволяет значительно повысить чувствительность метода при сохранении его высокой специфичности (Wu X. et al. Comparision of antibody responses to seventeen antigens from Mycobacterium tuberculosis // Clinica Chim Acta. 2010. Vol. 411, Issues 19-20. P.1520-1528).

Таким образом, в связи с появлением новых методов оценки клеточного и гуморального иммунного ответа при ТБ легких требуется, с одной стороны, углубленное изучение их диагностической значимости, а с другой стороны, их

дальнейшее совершенствование в целях повышения эффективности дифференциальной диагностики активного ТБ и ЛТБИ.

Степень разработанности темы исследования

Возможности и ограничения основных методов диагностики туберкулеза

Туберкулез - это инфекционное заболевание, вызываемое микобактерией туберкулеза {Mycobacterium tuberculosis, Mtb).

На сегодняшний день применяются основные методы диагностики ТБ те же, что и в конце 19 века (микроскопия мокроты - 1882, культивирование - 1882 , радиография - 1896), и для диагностики латентной инфекции - туберкулиновая кожная проба (1890).

Микробиологические (а в последние годы - и молекулярно-биологические) методы идентификации микобактерий включают микроскопию мазка мокроты и культуральный метод на твердых или жидких средах (посев мокроты).

Микроскопические методы отличаются простотой, доступностью и быстрым получением результатов исследования. Вместе с тем, для того, чтобы обнаружить 1-3 микроорганизма в 300 полях зрения, концентрация бактерий должна быть 5 000-10 000 в мл мокроты; метод требует наличия квалифицированного персонала. Данный метод имеет ограничения при исследовании олигобацилляр-ного диагностического материала от больных, выделяющих малое количество микобактерий, а также для диагностики внелегочного туберкулеза, и не позволяет дифференцировать Mtb от нетуберкулезных (атипичных) микобактерий. В целом его чувствительность при исследовании отдельных мазков составляет 40-60% [109].

По сравнению с микроскопией мазка, культуральный метод является гораздо более чувствительным, для получения положительного результата достаточно нескольких десятков жизнеспособных клеток возбудителя в 1 мл диагностического материала [86,108].

Однако, методом посева на плотную питательную среду Левенштейна —

Ч KJ

Иенсена (ЛИ), являющимся «золотым стандартом» детекции микобактерий в

практических лабораториях, видимый рост МБТ можно получить в лучшем случае на 28 - 32 день с момента посева, а средними сроками для выделения культуры являются 6-10 недель [125].

С момента выделения культуры требуется ещё не менее 24 дней для определения лекарственной чувствительности МБТ методом абсолютных концентраций.

Длительные сроки получения результатов, обусловленные медленным ростом микобактериальной популяции, являются основным недостатком традиционных методов определения лекарственной чувствительности МБТ. На практике это означает, что химиотерапия больного туберкулезом в течение первых 2-3 месяцев проходит как бы «вслепую», без учета чувствительности выделенных у больного МБТ к противотуберкулезным препаратам. На плотных средах ЛЙ методом абсолютных концентраций тестирование на лекарственную чувствительность МБТ занимает от 45 до 90 дней с момента посева, что удлиняет сроки лечения больного и увеличивает стоимость [5, 14, 86].

Внедрение технологии ВАСТЕС MGIT 960 ("Becton Dickinson") позволило выйти бактериологической диагностике на принципиально новый уровень, позволяя выявлять рост культуры в диагностическом материале в течение 10-20 дней.

Автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960 зарекомендовала себя надежным методом микробиологической диагностики туберкулеза как в мире, так и во многих регионах России [57, 89].

Эталонные исследования эффективности использования автоматизированных систем культивирования на жидких питательных средах ВАСТЕС MGIT 960 и их преимуществ по сравнению с традиционным методом посева на плотные среды были проведены в Московском городском научно - практическом Центре борьбы с туберкулезом под руководством доктора медицинских наук В. И. Литвинова [15, 18].

По данным авторов, чувствительность автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 по выделению культур МБТ оказалась на 10% выше традиционного способа посева на среду ЛЙ. Система ВАСТЕС MGIT 960 продемонстрировала также более высокую высеваемость МБТ из бактериоскопически негатив-

ного материала, примерно на 15%, по сравнению с плотными средами. Для бакте-риоскопически позитивного материала чувствительность жидких и плотных сред для культивирования оказалась идентичной [15].

По данным других авторов, при положительных данных бактериоскопиче-ского исследования, рост М1Ъ обнаруживался радиометрически на 7-10-й день и на 14-21-й дни при отрицательных данных [2].

В свою очередь, к недостаткам этого метода, ограничивающим возможность его широкого применения, относятся высокая себестоимость исследования; необходимость применения радиоактивных изотопов и специального радиометрического оборудования и сложность работы с изотопной технологией.

Прорывом в микробиологической диагностике стал быстрый молекулярный тест ХрейМТВ/ЯШ, способный диагностировать ТБ и выявлять устойчивость к рифампицину в течение 100 минут [143], который был одобрен к применению ВОЗ при работе с материалами от пациентов вне зависимости от их вида, в то время как тест-система СепоТуре МТВОЯрЫз (версия 1) была одобрена для использования только при работе с положительными по мазку материалами от пациентов.

Вместе с тем, несмотря на определенные успехи в совершенствовании микробиологических и молекулярно-генетических методов диагностики ТБ, основные ограничения микробиологических методов остаются прежними. Они связаны с невозможностью выявления М(Ь в мокроте у впервые выявленных больных с умеренным и скудным бактериовыделением, а так же при латентной инфекции, поскольку при латентной инфекции количество нереплецирующихся микобакте-рий невелико и единственным инструментом диагностики ЛТБИ являются иммунологические методы [56], применение которых направлено на улучшение диагностики туберкулеза и его дифференциальной диагностики с другими легочными заболеваниями.

Клеточные тесты in vivo для выявления латентной туберкулезной инфекции

Выявление туберкулезного инфицирования представляется актуальным не только у детей. Проводить диагностику необходимо и у взрослых, а именно, у лиц с повышенным риском развития активного ТБ (людей, у которых был установлен контакт с больным ТБ; лиц с изменениями в легких, обусловленными перенесенным ранее туберкулезом и видимыми на рентгенографии; пациентов после трансплантации органа; больных с иммунодефицитами различной этиологии - в том числе ВИЧ-инфицированных). Вопросы ранней диагностики ТБ крайне важны и в ревматологии. Революционным достижением фармакотерапии РЗ конца XX в. стала разработка принципиально новой группы лекарственных средств, получивших название генно-инженерных биологических препаратов (ГИБП), в частности моноклональных антител против провоспалительных цитокинов (в т.ч.ингибиторов ФИО а) [4].

Так, в ряде работ показано [68, 46, 82, 53, 107], что на фоне терапии ГИБП увеличивается вероятность развития различных инфекционных заболеваний, в том числе и ТБ. В связи с этим при планировании и в ходе лечения блокаторами ФНО а необходимо иметь быстрые и падежные методы для выявления латентной туберкулезной инфекции и активного туберкулеза у больных РЗ.

Наиболее широко используемым методом диагностики туберкулезного инфицирования является туберкулиновая кожная проба.

Туберкулиновая кожная проба является диагностическим тестом, при помощи которого определяют уровень специфической чувствительности к туберкулину с целыо диагностики туберкулеза (ежегодно), определения уровня инфицирования населения микобактериями туберкулеза (ежегодно) и отбора континген-тов, подлежащих противотуберкулезным прививкам [19].

Первоочередной задачей массовой туберкулинодиагпостики является выделение из общего числа обследованных лиц, наиболее подверженных риску развития туберкулеза и нуждающихся в рентгенологическом обследовании. К этой категории относятся дети и подростки с "виражом" туберкулиновых реакций (впер-

вые положительная реакция на пробу Манту с 2 ТЕ ППД-Л, не связанная с иммунизацией против туберкулеза), усиливающейся реакцией на туберкулин (увеличение инфильтрата на б мм и более за последний год или постепенное в течение нескольких лег), с гиперергической чувствительностью к туберкулину (наличие инфильтрата размером 17 мм и более или любого размера с везикулонекротической реакцией или лимфангитом).

Однако, с введением в нашей стране с 1949 года массовой вакцинации новорожденных БЦЖ, диагностическое значение пробы с туберкулином снизилось из-за перекрестной сенсибилизации организма вакцинным штаммом М. bovis BCG и вирулентными штаммами Mtb при инфицировании [22]. Другой причиной является то, что в качестве антигена используют PPD (purified protein derivate) - смесь более 200 антигенов, получаемых из микобактерий видов humanus и bovis (в России), которые также присутствуют и в других микобактериях [20, 75, 87].

В современных условиях, по данным некоторых авторов, количество лож-ноположительных реакций Манту, составляет от 40 до 90%. [16].

Важным этапом в совершенствовании методов диагностики ТБ стали секве-нирование и полная расшифровки генома Mtb. Исследователи установили, что геном Mtb включает 4 411 529 пар нуклеотидиых остатков и содержит порядка 4000 генов [59]. Далее были расшифрованы геномы других видов микобактерий комплекса Mtb (M bovis, M. africamim, M. canettii, M. microti, M. pinnipedii и M. caprae). При сравнении генетической последовательности Mtb и M.bovis, с атте-нуированой BCG, была обнаружена делеция трех геномных участков в вакцинном штамме (RDI, RD2, RD3, region of difference). В отличие от других, геномный участок RDI (размером 9500 п.н.) не был выявлен ни в одном из субштаммов BCG, но был обнаружен во всех протестированных лабораторных штаммах и клинических изолятах Mtb [54]. Позже были идентифицированы белки, синтез которых кодируется этой областью - ESAT6 и CFP10.

Возможность использования этих белков в диагностике ТБ была изучена в лабораториях США, Дании и Германии [44, 63, 90, 101].

На основе гибридного белка, состоящего из двух ранних белков Mtb -CFP10 и ESAT6 у нас в стране, впервые в мировой практике, группой специалистов НИИ молекулярной медицины ММА им. И.М. Сеченова был разработан препарат Диаскинтест® (ДСТ), промышленный выпуск которого осуществляется на базе ЗАО "Фармацевтическая фирма "J1EKKO" (Владимирская обл.)

Он предназначен для внутрикожного применения (как для пробы Манту). В настоящее время ДСТ прошел доклинические и клинические испытания и внедрен в практическое здравоохранение как препарат для индивидуальной аллерго-диагностики туберкулеза (Приказ МЗСР РФ №855, 2009).

ДСТ дает положительный результат только у зараженных и больных туберкулезом. По мнению ряда исследователей Диаскинтест® является более специфичным и эффективным методом диагностики туберкулеза легких, чем проба Манту [30].

В то же время информативность теста для выявления туберкулезного инфицирования и для диагностики активного ТБ у людей, имеющих контакт с инфекцией, остается пока неясной. К другим ограничениям теста следует отнести его проведение в условиях in vitro, что ограничивает его использование у детей аллергиков и лиц с выраженной иммуносупрессией, а также риск сенсибилизации при повторных постановках.

Биомаркеры туберкулеза

Перспективным направлением для совершенствования методов клинической диагностики туберкулеза является идентификация биомаркеров данного заболевания. При этом особое значение имеет идентификация биомаркеров в венозной крови. Преимуществом их использования является сокращение времени для получения окончательного результата диагностики, большая безопасность для больного по сравнению с радиологическими методами, снижение инфекционной опасности для персонала, работающего с биологическим материалом (использование крови вместо мокроты).

Во фтизиатрии большое значение имеют следующие задачи, для решения которых потенциально могут быть использованы биомаркеры: ранняя диагноста-

ка факта инфицирования М(Ь, выявление больных с активной формой туберкулеза, и дифференциальная диагностика активного ТБ и ЛТБИ.

Белки острой фазы воспаления

При оценке эффективности терапии, течения и прогноза туберкулеза легких, оценки активности туберкулезного процесса в первую очередь уделяется внимание характеристикам воспалительной реакции, все этапы которой сопровождаю! ся образованием свойственных им собственных комплексов биологически активных соединений, выделением медиаторов воспаления, высвобождением бел-ков-реактантов острой фазы, развитием эндотелиальной дисфункции, изменением систем свершвания крови, микроциркуляции и др. [1, 21, 42]. Во фтизиопульмо-нологии биохимические показатели широко используются для оценки остроты, активности и тяжести процесса в легких и эффективности терапии на различных этапах заболевания.

Титаренко О.Т. с соавт. в своей работе [39] изучала значения биохимических показателей крови, регистрируемых на начальных этапах заболевания (при впервые выявленном специфическом поражении) и после трехмесячной противотуберкулезной терапии. На основании комплексного проспективного обследования 66 больных с впервые выявленным нелеченным инфильтративным туберкулезом легких анализировалась возможность оптимизации оценки характера течения специфического воспалительного процесса по уровням белков-реактантов острой фазы. В качестве группирующих факторов использованы характеристики динамики кли-нико-рентгенологических данных и сроки наступления абациллирования по результатам трехмесячной противотуберкулезной терапии. Установлено, что наиболее прогностически информативной является констелляция трех из 12 исходных (до начала лечения) анализировавшихся показателей уровня - гаптоглобина, церу-лоплазмина и альбумина в крови. Их сочетанное использование по предлагаемому решающему правилу обеспечивает 90,6% эффективность прогнозирования результатов лечения у обсуждаемой категории больных.

Другим биомаркером, который потенциально может использоваться в диагностике ТБ, является неоптерии (НПТ) [38, 76]. НПТ [2-амино-4-гидрокси-6-(В-

эритро-Г,2',3'-тригидроксипропил) - птеридип] является промежуточным продуктом в синтезе биоптерипа, участвующего в активации лимфоцитов [33]. Согласно данным большинства исследователей, НПТ продуцируется моноцитами и макрофагами при воздействии на них IFNy. Так же индуцируют синтез ППТ IFNa и IFN(3, по их действие значительно меньше выражено. Концентрация НПТ в норме не превышает 10 нмоль/л [124]. При различных патологических состояниях человека, связанных с активацией клеточного иммунитета, концентрация НПТ в крови может увеличиваться на 2-3 порядка [33]. НПТ является интегральным маркером активации клеточного иммунитета, поэтому его значение особенно важно при инфекционных заболеваниях, опухолях, хронических воспалительных и системных ревматических заболеваниях, сопровождающихся активацией клеточного иммунитета. С момента его открытия в 1967 году [122] НПТ широко используется как биомаркер активации клеточного иммунного ответа, в частности при диагностике различных аутоиммунных и инфекционных заболеваний. При туберкулезе показано, что НПТ может использоваться в качестве маркера активности туберкулезного процесса [ 67, 76,137].

Однако следует отметить, что белки острой фазы воспаления и неоптерин являются неспецифическими биомаркерами и их содержание может быть повышено при ряде других заболеваний.

Клеточные тесты in vitro

Существующие интерфероновые тесты (ИТ) основаны на количественном измерении антиген-индуцированного интерферона-гамма (IFNyAG). IFNy является цитокином, продуцируемым активированными Т-лимфоцитами. Он является одним из ключевых факторов протективного иммунитета при туберкулезной инфекции [134, 148].

Его продукция стимулируется при взаимодействии Т-лимфоцитов с антигеном. Антиген-специфичность этой реакции используется в нескольких недавно разработанных и внедренных в практику интерфероновых тестах. Так, тест Т-SPOT (Oxford Immunotec, Великобритания USPTO Applicaton № 20070196878) основан на определении количества клеток, продуцирующих IFNy и тест

QuantiFERON-TB Gold ¡n-tube (Cellestis, Австралия) - па определении уровня продукции IFNy в цельной крови. Поскольку в данных тестах уровень продукции IFNy определяется после стимуляции клеток антигенами микобактерий, данные методы могут считаться аналогами кожных реакций замедленного типа.

Данные методы широко используются в США и странах Европы с 2001 г [105, 110] и предназначены для выявления туберкулезного инфицирования. В России тесты IGRAs стали применяться с 2009 г в качестве дополнительного диагностического теста.

В качестве специфических индукторов в этих тестах используют белки MTB, в частности ESAT6 (ранний секретируемый антиген), CFP10 (белок культу-рального фильтрата) и ТВ 7.7 (р4), которые отсутствуют у микобактерий вакцинного штамма М. bovis (BCG) и большинства нетуберкулезных микобактерий окружающей среды, за исключением Mycobacterial mar i тип и Mycobacterial kansasii. В связи с этим, предварительная БЦЖ-вакцинация не оказывает значительного влияния на результаты интерфероновых тестов [23].

Мордовская Л.И. разработала отечественный аналог тест-системы на основе антиген-индуцированной продукции интерферона-гамма (IFNy) в образцах цельной крови ex vivo. Тест-система Тубинферон предназначена для определения первичного туберкулезного инфицирования у детей и подростков. Главным отличием этой тест-системы является то, что в качестве индуктора IFNy применяют не только специфические рекомбинантные антигены ESAT-6 и CFP-10, но и туберкулин PPD, что позволяет определять как первичное туберкулезное инфицирование, так и идентифицировать поствакцинальную БЦЖ аллергию, при установле-непном пороговом уровне концентрации IFNy - 70 пг/мл [24].

В сравнении с пробой Манту КФТ продемонстрировал большую специфичность [62].

Так при обследовании больных ТБ легких (п=32) и 23 здоровых доноров в Бразилии была установлена чувствительность КФТ 86% и специфичность 100%), при этом за пороговое значение было принято значение 0,2 ME/мл (пороговое значение производителя 0,35 ME/мл). Так же было показано, что у больных с от-

рицательным результатом микроскопии и посева результат в тесте был положительным^].

Так же на сегодняшний день имеется ряд отечественных работ, целыо которых было сравнить информативность и коикордантпость ДСТ и КФТ при диагностике ТБ у детей, так по большому счету эти 2 теста оценивают один и тот же иммунологических феномен, только в первом случае in vivo, а в другом in vitro. Сравнительная ценность КФТ и ДСТ была изучена в ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия», с участием 106 детей. Сопоставление результатов ДСТ и КФТ (положительный или отрицательный) выявило их совпадение у 90 детей (84,9%) случаев [6]. Высокая степень согласованности этих тестов гак же была продемонстрирована в исследовании Слогацкой J1.B. с соавт. [34]. При обследовании 122 детей результаты обоих тестов совпали у 115 больных, что составило 94,3 %. Таким образом, у детей, склонных к аллергическим реакциям, вместо выполнения кожной пробы может быть проведен КФТ, но стоит учитывать, что стоимость проведения кожного теста гораздо ниже.

Результаты сравнительного анализа ДСТ, КФТ и лучевых методов в диагностике туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов у детей, проведенного в СПб НИИ Фтизиопульмонологии, так же показали высокую информативность ДСТ (83,5), КФ-теста (83,6), а также лучевых методов диагностики (94,6)[37]. Данные отечественной литературы, посвященные КФТ при диагностике ТБ у взрослых малочисленны и достаточно фрагментарны [25, 26].

В работе Борисова С.Е. [7] представлены результаты скринингового исследования с помощью ДСТ и КФТ, в сравнении с пробой Манту 2ТЕ перед началом лечения и в ходе терапии ГИБП. Установлена высокая специфичность новых иммунологических тестов выявления латентной туберкулезной инфекции, которая позволила воздержаться от превентивного противотуберкулёзного лечения у 33,8% больных с положительными результатами пробы Манту с 2 ТЕ перед началом лечения и более чем у 80% больных в ходе терапии ГИБП.

Обобщенные аналитические данные показывают, что при обследовании вакцинированных лиц интерфероновые тесты обладают высокой специфичностью, достигающей 99%, при этом чувствительность выявления больных ТБ составляет лишь 78% [96, 113].

Объяснением недостаточно высокой чувствительности ИТ может, в том числе служить то, что согласно результатам полученным Кисиной Т.Е., у больных имеющих дефект пролиферативного ответа мононуклеаров крови на антигены Mtb снижена секреция трех основных провоспалительных Thl-цитокинов: JL-2, IFNy и TNFa (для стимуляции мононуклеаров использовали туберкулин PPD производства НИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург). Таким образом моно-нуклеары больных, дефектные по пролиферативному ответу, имеют сопутствующие дефекты механизмов продукции или секреции IL-2, IFNy и TNFa в ответ на специфические антигены Mtb\\l\

Так же мало изученным остается вопрос о том, какова вероятность развития активной формы туберкулеза у лиц с положительным результатом КФТ. Так в исследовании Rangaka М.Х. et all. Было показано, что КФТ и туберкулиновая кожная проба имеют примерно одинаковую предсказывающую способность[114].

Кроме того, пороговое значение концентрации IFNy, рекомендуемое производителем, достаточно низкое (0,35 МЕ/мл или 14 пг/мл) и для его количественного обнаружения требуклея очень чувствительные и дорогостоящие тест-системы. Так же низкое пороговое значение увеличивает количество сомнительных результатов. Так, в недавней публикации [97], посвященной применению теста "QuantiFERON-TB Gold In-Tube"(QFN-GIT) было показано, что существует значительный риск ложноположительных и ложноотрицательных результатов теста.

Также следует отметить, что основным недостатком данного метода, по данным ряда исследователей, является то, что он не позволяет проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и латентной туберкулезной инфекции (ЛТБИ) [56,61, 106, 113, 139].

Поиск альтернативных биомаркеров для выявления активного ТБ легких и ЛТБИ

Ввиду широкого распространения в нашей стране туберкулезного инфекци-рования, чрезвычайно актуален поиск биомаркеров, применение которых позволит проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и Л ГБИ.

На сегодняшний день основными перспективами развития Т-клеточных тесто является либо применение других антигенов, кроме тех, которые используются на сегодняшний день, либо поиск альтернативных биомаркеров ШЫу, поскольку при стимуляции иммунокомпетентных клеток образуется целый ряд биомолекул, которые потенциально могут быть использованы как для выявления инфицирования М(Ь так и для разработки иммунологических тестов, которые позволят оценивать активность туберкулезного процесса.

С развитием технологии мультиплексного анализа хМАР (Ьиттех, США) появилась возможность относительно быстрого проведения пилотных исследований по поиску информативных биомаркеров различных заболеваний. Так с помощью этой технологии Братцева Е.В., впервые изучила широкий профиль из 27 ци-токинов в сыворотке крови больных грибовидным микозом. В результате работы было показано, что у больных грибовидным микозом определяется значительное увеличение концентрации 4 цитокинов: 1Ь-1га, в-СБР, 1Р-10 (р<0,001) и 1Ь-4 (р<0,05) по сравнению с результатами здоровых лиц, и цитокина 1Р-10 (р<0,001) -по сравнению с больными псориазом. Итогом диссертационной работы стала разработка алгоритма диагностики грибовидного микоза, основанный на определении концентрации цитокина 1Р-10 и дифференциальной диагностики грибовидного микоза и псориаза, основанного на последовательном определении в сыворотке крови концентрации цитокинов 1Р-10 и 1Ь-6 и имеющего вид «древа принятия решений» [8].

В области поиска информативных биомаркеров туберкулезного инфицирования и активности туберкулезного процесса в геометрической прогрессии растет число работ и на сегодняшний день можно говорить об определенных успехах [117], однако результаты, полученные разными группами ученых, зачастую бы-

вают противоречивы, что связано в том числе с использованием реагентов различных производителей и гетерогенностью групп больных туберкулезом.

На сегодняшний день в качестве нового биомаркера, альтернативного IFNy, рассматривают хемокин IP-10. IP-10 (IFNy - inducible protein 10 / IFNy индуцируемый протеин-10) принадлежит к семейству а СХС- хемокинов, молекулярная масса составляет 8,7 Да. IP-10 продуцируется моноцитами/макрофагами, фибробластами и эндотелиальными клетками. Экспрессия IP-10 индуцируется в основном IFNy, но так же и рядом других цитокинов - IL-2, IL-27 , IL-17 , IL-23 и IL- lb.

IP -10, как полагают, действует как хемоаттрактант на моноциты и Т-клетки в воспалительные очаги [64]. Было установлено, что его уровень в плазме крови повышен у пациентов с активным ТБ и значительно снижается после успешного лечения туберкулеза, что позволяет его применять для мониторинга активности заболевания и эффективности специфической терапии [45, 115]. Более того, некоторые исследования показали, что определение антиген-индуцированной продукция IP-10 имеет аналогичную чувствительность с интерфероновыми тестами [91, 112, 118, 119, 121, 142, 178]. Однако, лишь немногие исследования были направлены на изучение диагностической значимости IP-10 для обнаружения латентного туберкулеза у пациентов с высоким риском заболевания ТБ [116].

Так же в нескольких исследованиях было показано, что антиген-индуцированная продукция IL-2 значительно выше у больных туберкулезом, чем у здоровых лиц и на сегодняшний день IL-2 может также рассматриваться в качестве потенциального биомаркера для диагностики туберкулезной инфекции [83, 66, 92]. Известно, что IL-2 повышает Т-клеточную репликацию и важен при клеточном иммунном ответе, в частности при образовании гранулемы при микобак-териальной инфекции [65].

Biselli, R. с соавт. в своей работе [51] продемонстрировали возможность применения IL-2 для дифференциальной диагностики активного ТБ и ЛТБИ при проведении анализа с увеличенным временем инкубации до 72 часов.

При изучении 20 здоровых, 20 контактных лиц с ЛТБИ (положительные результаты КФТ и туберкулинового кожного теста) и 20 больных с активным туберкулезом легких было показано, что после 18 часов инкубации клеток крови с антигенами МЛ (согласно стандартному протоколу КФТ) антиген-индуцированная продукция ШЫу, так же как и 1Ь-2, была значительно выше у больных активными формами ТБ и лиц с ЛТБИ, по сравнению с группой здоровых лиц. Но если при увеличении времени инкубации до 72 часов закономерности остались прежними для №N7, т.е. группа больных активным ТБ и лиц с ЛТБИ достоверно не различались, то при измерении 1Ь-2 у лиц с ЛТБИ наблюдали достоверно более высокие значения этого цитокина, по сравнению с больными активным ТБ и здоровыми лицами. Таким образом, если продлить время инкубации до 3-х дней, антиген-индуцированная продукция 1Ь-2 увеличивается только у пациентов с ЛТБИ.

Эти данные согласуются с результатами МПНг^оп К.А. с соавт. [99], которые указываютна то, что №N7 - секретирующие Т-клегки преобладают во время активной туберкулезной инфекции. Появление 1Ь-2 - секретирующих клеток у больных после лечения антибиотиками может рассматриваться как следствие расширения центральной Т-клеток памяти , вызванной пониженной микобактерий туберкулеза антиген нагрузке, которые могут преобладать также при ЛТБИ.

Вместе с тем ряде исследований 1Ь-2 не продемонстрировал впечатляющих результатов, которые позволили бы рассматривать его в качестве потенциального биомаркера, который можно было бы применять одиночно в диагностике туберкулеза [136, 120].

В дополнение к ИФА и технологии хМар другие методы, такие как ПЦР [50, 94] и проточная цитометрия [52, 123] так же применялись для изучения данного вопроса.

Ввиду высокой стоимости исследований, лишь в некоторых статьях представлены результаты сравнительного анализа 1Р-10, 1Ь-2 и КФТ.

Так в исследовании, проведенном в Китае в 2012 году, с участием 66 больных активным ТБ легких, 73 контактных лиц и 76 здоровых доноров в дополнение к КФТ изучали споптантанную и антиген-индуцированную продукцию 1Р-10,

IL-2 и TGFa. Согласно полученным результатам чувствительность выявления больных активным ТБ легких с применением указанных цитокинов составила 86,4%, 89,4% и 86,4%, соответственно, а при комбинированном определение IP-10 и IL-2 - 95,5 %, при этом наблюдалось снижение неопределенных результатов. Так же было показано, что спонтанная продукция IP-10 была достоверно выше в группе контактных лиц, по сравнению с больными ТБ и здоровыми донорами, а количественное отношение антиген-индуцированной продукции IL-2 и IFNy позволило дифференцировать активный ТБ и ЛТБИ с чувствительностью 77,2% и специфичностью 87,2%[140].

Как отмечалось выше, поиск биомаркеров, которые бы позволили проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и ЛТБИ, является весьма актуальным. В большинстве исследований авторы указывают на перспективность комбинированного определения биомаркеров активности, гак как их изолированное использование не позволяет достичь высокой чувствительности и специфичности.

В работе Chegou N.N. с соавт. комбинированное определение EGF и MIP-1J3 позволило правильно идентифицировать 96 % больных активным ТБ легких и 92% лиц с ЛТБИ. Комбинации между EGF, sCD40L, VEGF, TGF-a и IL-la также показали результаты дискриминации лучше, чем при их изолированном применении [55]

Mihret А. с соавт. получили лучшие результаты дискриминации при комбинированном использовании IFNy, IL-4, IP-10 и TNFa [98]. Изучение уровня продукции TNFa в работе Владимирского М.А. показало значительно более высокий уровень индукции этого провоспалительного цитокина при активном туберкулезе легких по сравнению с завершенным неактивным туберкулезным процессом или при латентной инфекции у инфицированных МБТ детей.

Определение степени дифференцировки клеток

Вместе с тем не только способность лимфоцитов Thl продуцировать ряд цитокинов в ответ на введение специфических антигенов Mtb может применяться для установления биомаркеров инфицирования и активности ТБ процесса.

С появлением проточной цитометрии появилась возможность определять содержание различных популяций и субпопуляций лимфоцитов (В-лимфоциты, Т-лимфоциты CD4+, Т-лимфоциты CD8, NIC клетки). Однако данный подход не позволяет получить информацию о функциональном состоянии иммунитета и перспективным направлением является оценка степени дифференцировки клеток, а не количества продуцирующих клеток.

Исследования поздних этапов дифференцировки Т-лимфоцитов CD8, проведенные при вирусных инфекциях, показали, что на этих этапах Т-лимфоциты последовательно меняют экспрессию поверхностных маркеров CD28, CD27, CD57 [Papagno L. et al., 2004; Аррау V. et al., 2008], переходя от состояния CD28'CD27+CD57" к состоянию CD28"CD27"CD57" и затем - CD28"CD27"CD57f и постепенно увеличивая свой цитотоксический потенциал. Процентное содержание указанных субпопуляций эффекторных клеток отражает степень дифференцировки эффекторных лимфоцитов. Показано [Brenchley J.M. et al., 2003; Strioga M. et al., 2011]., что степень дифференцировки эффекторных лимфоцитов CD8 зависит от тяжести инфекционного процесса и ее оценка может быть использована для мониторинга за развитием заболевания [27].

В результате исследований степени дифференцировки лимфоцитов при ТБ было установлено, что что процентное содержание в периферической крови лимфоцитов, CD4+ , экспрессирующих фенотип CD62L-CD27-, зависит о г активности туберкулезного процесса и целостности полостей распада в легочной ткани. Эффекторные лимфоциты CD4 (лимфоциты CD4+CD62L-) образуются из наивных лимфоцитов при стимуляции последних антигеном и костимуляционными сигналамих [28, 29, 103].

Начальные стадии дифференцировки эффекторных лимфоцитов происходят за пределами легочной ткани, в лимфоидных органах. На этих стадиях эффекторные лимфоциты CD4 экспрессируют маркер CD27 и имеют фенотип CD62L-С027+[79].При попадании в очаг инфекции, находящийся в легочной ткани, эффекторные лимфоциты С062Ь-С027+теряют экспрессию молекул CD27 и превращаются в эффекторные лимфоциты CD62L-CD27-.

Исходя из этого коллективом авторов в ЦЫИИТ РАМН запатентован подход, позволяющий дифференцировать больных активным туберкулезом от лиц с инфицированием Mtb на основании определения процентного содержания Mtb-специфичных лимфоцитов CD4, имеющих фенотип CD27.

Методы оценки гуморального иммунного ответа

После установления ведущей роли клеточного иммунного ответа в защите организма от Mtb, силы исследователей были сконцентрированы на изучении факторов, способствующих дифференцировке иммунокомпетентых клеток и межклеточном взаимодействии. Значению антител, как потенциальным диагностическим биомаркерам при ТБ стали уделять определенно меньшее внимание. Вместе с тем, столь тонкий инструмент иммунорегуляции как антителообразование, едва ли может быть запущен вхолостую [3]. И на сегодняшний день вопросами поиска антигенных детерминант и антител, реагирующих с ними посвящено значительное число работ, особенно в зарубежной литературе, так как определение современными методами уровня и спектра противотуберкулезных антител (ПТА) далеко не исчерпало себя в качестве средства иммунодиагностики и характеристики особенностей течения туберкулеза [32].

В диагностике туберкулеза используют серологические методы, основанные на выявлении антител к антигенам микобактерий, или самих антигенов мико-бактерий в крови или других средах организма. Преимуществами данных методов являются быстрота и простота постановки теста, относительно низкая стоимость и выполнение в условиях in vitro. Из серологических методов, применяемых в лабораторной диагностике туберкулёза, чаще используется комбинация классических тестов, основанных на реакциях непрямой гемагглютинации (РИГА), поглощения комплемента (РПК) и пассивного гемолиза (РПГ). Несколько реже используются различные варианты определения циркулирующих антител (AT) к антигенам микобактерий, основанные на методе иммуноферментного анализа (ИФА) [12].

В 1976 году E.Nassau с соавт. первыми изучили возможности иммунофер-ментного анализа для серодиагностики туберкулеза, использовав в качестве антигена фильтрат М. tuberculosis H37Rv[102].

В России в первая отечественная ИФА тест-система была разработана в 1992 году в Санкт-Петербурге, которая до сих пор используется в практике СПб НИИ Фтизиопульмонологии [10]. На сегодняшний коммерчески доступна тест-система АТ-Туб-Бест1 (ЗАО "Вектор-Бест", Новосибирск) для выявления суммарных антител (G+A+M), в которой в качестве антигена применяется компонент М. bovis BCG. По результатам испытаний 13 сертифицированных ИФА тест-систем, проведенных в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ), чувствительность тест-системы у больных с бактериовыделением была достаточно высокой и достигала 83%, при этом специфичность составила 68% [31].

В 2011 году были опубликованы результаты мета-анализа, проведенного Steingart K.R et all. В анализ вошли результаты 67 исследований с использованием различных серологических тестов(преимущественно anda-ТВ IgG, 19%). Общая чувствительность составила 0-100%, специфичность 31-100% [130]. Похожая ситуация и при диагностике внелегочного туберкулеза. При анализе результатов 21 исследования, в которых применяли серологические методы для диагностики внелегочного ТБ (48%-Anda-TB IgG) так же показано, что все коммерческие тесты имеют различную чувствительность (0-100%) и специфичность (59-100%) [128].

В работе Kassa-Kelembho Е. был проведен сравнительный анализ информативности иммунохромотографического серологического теста (SDHO Laboratories Inc., Canada) и метода микроскопии. В исследование было включено 99 пациентов (медиана-31 год) с туберкулезом легких, подтвержденным культуральным методом (посев мокроты). Чувствительность серологического теста оказалась ниже, чем метода микроскопии (20,6% против 80,9%, Р < 0.000001). Следует отметить, что у 55 пациентов был положительный результат в тесте на ВИЧ [81].

Несмотря на то, что диагностические тесты, основанные на определении специфических антител используются достаточно давно, па сегодняшний день серологические методы диагностики ТБ не нашли широкого применения в медицинской практике в связи со значительным количеством неопределенных результатов тестирования [56, 113, 126, 130, 141] и ни одно существующее руководство не рекомендовало их к использованию.

Серологические тесты имеют различные показатели чувствительности и специфичности при обследовании различных групп пациентов и с использованием тест-систем различных производителей [73, 111, 129, 132].

Так министром здравоохранения Индии был введен запрет на импорт тест-систем для серологической диагностики ТБ [131], в связи с тем, что Всемирная Организация Здравоохранения рекомендовала не использовать серологические тесты для диагностики ТБ [80].

Вместе с тем на сегодняшний день политика ВОЗ настоятельно рекомендует дальнейшие целенаправленные исследования, направленные на разработку серологических тестов, которые смогут будут отвечать современным требованиям и помогут в диагностике ТБ, так как эти методы экспрессны, низкозатратны и подлежат автоматизации.

Проблема специфичности является краеугольным камнем при разработке тест-систем. Она связана, в том числе, с кросс-реактивностыо белковых антигенов Mtb с гомологичными белками других родственных микроорганизмов. Недостаточная чувствительность объясняется тем, что микобактерия способна синтезировать несколько сотен антигенов и экспрессия их генов на разных стадиях инфекции, при легочной и других формах ТБ, а также на фоне иммунодефицитных состояний (например, ВИЧ-инфекции) неодинакова. Кроме того, есть основания полагать, что иммунный ответ на инфекцию Mtb связан с аллотипами антигенов HLA класса II. HLA участвует в распознавании антигенов и у разных пациентов идет распознавание различных антигенов; и вероятность того, что у всех пациентов «распознается» один антиген, крайне мала. Это является серьезной проблемой для создания диагностикумов на основе антител (Boehme С., 2005).

После полной расшифровки генома Mtb [59], были достигнуты значительные успехи в идентификации антигенов Mtb, которые могут быть использованы для создания высокочувствительных и специфичных тестов оценки противотуберкулёзного гуморального иммунно ответа [40, 60, 77, 95, 141, 146, 147].

Наиболее изученными из них являются белки 38 кДа, 16кДа, katG, МРТ63, МРТ64, ESAT6, CFP10, МТС28, Mtb39, Mtb81 и РРЕ68, которые включены в большое количество исследований, направленных на создание диагностических тест-систем.

В существующих в настоящее время на рынке коммерческих серологических тестах используются такие антигены как - 38kDa, 16kDa, А60, LAM, ES-31, Kp-90 и др. [41, 49]. Широко изученным является антиген 38кДа Mtb - уникальный белок, специфичный для патогенных микобактерий возбудителей туберкулеза (М. tuberculosis , М. bovis и М. africamtm) [13].

Применение индивидуальных видоспецифичных рекомбинантных антигенов, отсутствующих в вакцинном штамме БЦЖ, позволяет минимизировать количество ложноположительных результатов, связанных с предварительной БЦЖ -вакцинацией [35]. Тем не менее, их применение помимо увеличения чувствительности значительно уменьшает специфичность проведения анализа. Для решения этой проблемы ряд исследователей предлагает использовать не одиночные антигены, а их комбинацию, что позволяет [144, 145] повысить чувствительность проведения анализа. Неоднократно было показано, что тест-системы, в которых используется комбинация различных антигенов Mtb, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с тест-системами, сконструированными на основе только одного антигена [74, 100, 133, 138, 139, 144, 145].

Таким образом, для совершенствования подходов к диагностике туберкулеза, в том числе иммунологических, силы исследователей должны быть направлены на проведение сравнительных испытаний существующих тестов и поиск новых биомаркеров, которые позволили бы решать различные вопросы лабораторной диагностики ТБ легких.

Цель исследования

Поиск информативных иммунологических биомаркеров и разработка алгоритма, позволяющего дифференцировать активный туберкулез легких от латентной туберкулезной инфекции.

Задачи исследования

1. Оценить информативность определения специфической антиген-индуцированной продукции 1РЫу в плазме крови при туберкулезе легких у взрослых.

2. Изучить спонтанную и специфическую антиген-индуцированную продукцию ЕСБ, М1Р-1р, УЕвР, 1Е-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-1а, №N^2, ТСБа, ТЫРсх, з1Ь-211а, зС040Ь, 1Р-10 в плазме крови больных ТБ легких, контактных лиц и здоровых доноров.

3. Оценить эффективность использования комбинации биомаркеров активного ТБ легких при исследовании цитокинового профиля с применением технологии хМар.

4. Разработать иммуноферментную тест-систему для определения специфических антител класса к рекомбинантным антигенам СЕЮ-СИРЮ, СЕШ-ЕБАТб, Е8АТ6-СРР10, СВО-Р38 и лизатному антигену РРЭЮ МЛ.

5. Оценить значимость определения неоптерина и специфических антител класса

в сыворотке крови для лабораторной диагностики ТБ легких.

6. Разработать алгоритм иммунодиагностики ТБ легких с использованием наиболее информативных биомаркеров.

Научная новизна

- впервые разработан алгоритм дифференциальной диагностики активного ТБ и ЛТБИ на основе определения комплекса специфической антиген-индуцированной продукции 1Ь-6 и №N7 и спонтанной продукции ТвРа;

- для диагностики туберкулезного инфицирования доказана эффективность определения специфической антиген-индуцированной продукции 1Р-10 и 1Ь-2 в плазме крови, в качестве альтернативных цитокину №N7;

- разработана иммуноферментная тест-система для определения специфических антител класса к двум антигенам Мб - рекомбинантному белку СВО-Р38 и лизатному антигену РРОШ, которая позволяет диагностировать активный ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии;

- впервые разработан двухступенчатый алгоритм иммунодиагностики ТБ, в котором на 1 этапе выявляют туберкулезное инфицирование путем определения специфической антиген-индуцированной продукции ШЫу, 1Р-10 и/или 1Ь-2, а на втором этапе, для диагностики активного ТБ легких проводят количественное определение цитокинов 1Р^/ТСРа/1Ь-6, неоптерина и/или специфических антител класса к рекомбинантному белку СВБ-Р38 и лизатному антигену РРОЮ.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Проведено сравнительное исследование эффективности современных иммунологических методов лабораторной диагностики ТБ легких.

Разработана иммуноферментная тест-система для определения специфических антител класса к двум антигенам М(Ь, которая позволяет диагностировать активный ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии.

Разработан алгоритм дифференциальной диагностики латентной туберкулезной инфекции и активного ТБ легких. Применение разработанного алгоритма иммунологической диагностики туберкулеза позволяет повысить эффективность выявления лиц с ЛТБИ, которые являются «группой риска» по развитию данного заболевания, для диспансерного наблюдения.

Разработанный в рамках настоящего диссертационного исследования алгоритм может быть основой для проведения дальнейших валидационных исследований на различных группах пациентов. Материалы диссертации могут быть включены в учебные программы медицинских высших учебных заведений и факультетов усовершенствования врачей.

Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре технологии микробиологического синтеза ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)», а именно, на практических занятиях по учебной дисциплине «Иммунобиотехнология» для магистрантов 1 курса, обучающихся по направлению 240700.68 - «Биотехнология».

Получено решение о выдаче двух патентов Российской Федерации на изобретения: «Способ диагностики туберкулеза легких» (заявка №2012128311, решение о выдаче патента от 25.07.2013, авторы Васильева Е.В., Вербов В.Н., Тотолян Арег А., Лядова И.В., Никитина ИЛО.) и «Способ диагностики туберкулезного инфицирования» (заявка №2012128312, решение о выдаче патента от 26.07.2013, авторы Васильева Е.В., Вербов В.Н., Тотолян Арег А., Лядова И.В., Никитина И.Ю.).

Методология и методы исследования

Работа выполнялась на клинической базе СПБГУЗ ПТД, СПбПТД №3, ЦНИИТ РАМН и ГМПБ №2 в период с 2010-2012 гг. Все исследования были одобрены комитетом по этике ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера и проведены в соответствии с принципами Хельсинской декларации.

Характеристика клинического материала

Характеристика больных, включенных в исследование

В соответствии с поставленной целью и задачами нами были обследованы пациенты с туберкулезом легких (п=321), проходившие стационарный этап лечения в СПб ГУЗ ПТД, в ЦНИИТ РАМН и обратившиеся в СПб ПТД №3 с целью дифференциальной диагностики с сентября 2011 по май 2012 года, в возрасте от 18 до 76 лет (54 % мужчин, 46 % женщин), средний возраст составил 38 лет (30-для мужчин и 48-для женщин), в соответствии со следующими критериями:

• возраст от 18 лет и старше,

• информированное согласие на участие в исследовании,

® отсутствие специфической противотуберкулезной терапии на момент взятия крови,

® отсутствие следующих патологических состояний: тяжелый инфекционный процесс, наличие онкологических и аутоиммунных заболеваний.

У 71 % больных имел место инфильтративный ТБ легких, у 14% - фиброз-но-кавернозный ТБ. Оставшиеся 15% составили больные казеозной пневмонией, очаговым ТБ, диссеминированным ТБ и туберкулемой. У 86% больных диагноз ТБ был подтвержден микроскопией мокроты или культуральным методом (посев мокроты). 52 % составили больные впервые выявленным ТБ, оставшиеся 48 % - с хроническим ТБ процессом. Также были обследованы больные с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии (НЗЛ): больные саркоидозом (п=40) и пневмонией (п=28), находившиеся на лечении в СПБ ГУЗ ГМПБ № 2.

Характеристика контактных лиц и здоровых доноров

В качестве контактных лиц в исследование были включены сотрудники противотуберкулезных учреждений (КЛ) со стажем работы более 1 года (п=47), имеющие профессиональный контакт с больными ТБ, не имеющие клинических и радиографических признаков активного ТБ легких, в возрасте от 25 до 73 лет (18 % мужчин, 82 % женщин), средний возраст составил 48 лет (37,5-для мужчин и 57-для женщин). Контрольную группу составили 366 условно здоровых людей (ЗЛ). Все лица, включенные в исследование (п=797) не были инфицированы ВИЧ.

Характеристика антигенов М1Ь

Рекомбинантные антигены

В работе были использованы рекомбинантные химерные антигены «СВБ-СРР10», «СВО-ЕБАТб», «ЕБАТб-СРРЮ» и «СВБ-Р38», полученные в лаборатории генной инженерии ФГБУ НИИ биохимии СО РАМН (г. Новосибирск) в рамках договора о научном сотрудничестве с ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера:

1. Рекомбинантный химерный антиген «СВО-Р38» М1Ь

(Выделен 20.12.2011)

Состоит из 579 а.о. имеет М\¥= 59373 Да.

N-концевая область химера состоит из 220 а.о., содержащих сигнал секреции (43 а.о.), целлюлозосвязывающий сайт «CBD» (114 а.о.) и участок кодируемый полилинкером (63 а.о.). В С-концевой области расположена аминокислотная последовательность зрелого антигена р38 Mtb (449 а.о.) и 8-His-tag. Концентрация химерного антигена: 2.2мг/мл

Теоретические величины физико-химических показателей химера:

- Изоэлектрическая точка полипептида: 5.59

- Заряд полипептида при рН 7.0: -11.84

2. Рекомбинантный химерный антиген «CFP-ESAT6» Mtb (Выделен 16.01.2012)

Состоит из 227 а.о. имеет MW= 24336 Да.

N-концевая область химера состоит из 116 а.о., содержащих сигнал секреции (15 а.о.), аминокислотную последовательность ESAT-6 Mtb (95 а.о.) и участок кодируемый полилинкером (6 а.о.).

В С-концевой области расположена аминокислотная последовательность антигена CFP-10 Mtb (100 а.о.) и 8-His-tag. Концентрация химерного антигена: 1,1мг/мл

Теоретические величины физико-химических показателей химера:

- Изоэлектрическая точка полипептида: 5.08

- Заряд полипептида при рН 7.0: -11.41

3. Рекомбинантный химерный антиген «CBD-CFP10» Mtb (Выделен 16.02.2012)

Состоит из 276 а.о. имеет MW= 28829 Да.

N-концевая область химера состоит из 220 а.о., содержащих сигнал секреции (43 а.о.), целлюлозосвязывающий сайт «CBD» (114 а.о.) и участок кодируемый полилинкером (9 а.о.).

В С-концевой области расположена аминокислотная последовательность антигена

CFP10 Mtb (100 а.о.) и 8-His-tag.

Концентрация химерного антигена: 0,24 мг/мл

Теоретические величины физико-химических показателей химера:

- Изоэлектрическая точка полипептида: 6.13

- Заряд полипептида при рН 7.0 = -3.44

4. Рекомбинантный химерный антиген «CBD-ESAT6» Mtb

(Выделен 10.02.2012)

Состоит из 281 а.о. имеет MW= 28976 Да.

N-концевая область химера состоит из 160 а.о., содержащих сигнал секреции (43 а.о.), целлюлозосвязывающий сайт «CBD» (114 а.о.) и связующего участка из 3 а.о.

В С-концевой области расположена аминокислотная последовательность антигена ESAT6 Mtb (95 а.о.), аминокислотная последовательность (18 а.о.), кодируемая полилинкером, и 8-His-tag. Концентрация химерного антигена 1,3 мг/мл

Теоретические величины физико-химических показателей химера:

- Изоэлектрическая точка полипептида: 6.90

- Заряд полипептида при рН 7.0 = -0.28

Препараты белков, содержащих аминокислотные последовательности полноразмерных белков ESAT6 и CFP10 и зрелого белка Р38 Mtb, состыкованные с аминокислотной последовательностью целлюлозосвязывающего домена эндог-люконазы A (CBD) из Cellumonas fimi, были получены в полипропиленовых пробирках в 20 мМ фосфатном буфере, рН 7.0, содержащем 250 мМ NaCl, 8М мочевину, 1 мМ PMSF, 250 - 500 мМ имидазол. Рекомбинантные белки были очищены методом аффинной хроматографии на колонке с Ni-NTA-сефарозе 6B-CL. На рисунке 1 представлены схемы структур полипептидов, кодируемых сконструированными химерными генами. Лизатный антиген

В работе был использован природный лизатный антиген PPDN-3, который представляет собой ультрафильтрат лизированных культур Mtb штаммов DTST и Valee и используется в тест-системе "ИФА-анти-ТУБ", выпускаемой Отделом

Artificia signal (15 a.a.) ESATB (95 a.a.) CFP10 (100 a.a.)

A

Chimeric protein: ESAT6-CFP10 (226 a.a.)

Signal (43 a.a.) CBD (114 a.a.) ESATB (95 a.a.)

Б

Chimeric protein: CBD-ESAT6 (281 a.a.)

Signal (43 a.a.) CBD (114 a.a.) CFP10 (100 a.a.)

В

Chimeric protein: CBD-CFP10(276 a.a.)

Signal (114 a.a.) CBD (114 a.a.) MCS (63 a.a.) mature P38 (349 a.a.)

Chimeric protein: CBD-matureP38 (579 a.a.)

Рисунок 1 - Схемы структур химерных белков.

Примечание - условные обозначения, используемые в рисунке: Signal: N-концевая лидерная аминокислотная последовательность сигнала секреции; CBD: аминокислотная последовательность целлюлозосвязывающего домена эндоглю-коназы А из Cellumonas fimi; ESAT6: аминокислотная последовательность белка ESAT6 из М.tuberculosis', CFP10: аминокислотная последовательность белка CFP10H3 Mtb;

Р38: аминокислотная последовательность зрелого белка Р38 из Mtb\ MCS: аминокислотная последовательность, кодируемая полилинкером вектора рЕТ36Ь(+); 8xHis: С-концевая аминокислотная последовательность из 8-ми гистидиновых остатков. В скобках указано количество аминокислотных остатков (а.а.), входящих в полипептид.

Новых Технологий ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (г. Санкт-Петербург).

Коммерческие тест-системы и наборы реактивов

Метод Quanti FER ON©- ТВ Gold

Данный метод основан на определении методом иммуноферментиого анализа (ИФА) уровня продукции IFNy клетками периферической крови в ответ на стимуляцию образцов крови смесыо белков ESAT-6, CFP-10 и ТВ7.7 (р4). Образцы цельной периферической крови (1мл), стабилизированной гепарином (50 ед/мл), инкубировали в течение 24 часов при температуре 37°С в присутствии антигенов Mtb (антиген-индуцированная продукция, AG), в нулевой контрольной пробирке (отрицательный контроль, NIL) и в пробирке с митогеном (митоген-индуцированная продукция - положительный контроль, MIT). После окончания инкубации для отделения плазмы образцы центрифугировали в течение 15 мин при скорости 3500 об/мин, отбирали плазму и хранили при температуре (-20°С) до момента постановки. В день постановки ИФА образцы плазмы и реагенты доводили до комнатной температуры в течение 60 мин и выполняли тест в соответствии с протоколом производителя (Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia). Обработку результатов производили с помощью автоматизированной программы «QuantiFERON-ТВ Gold Analysis Software 2.62». Для конвертирования концентрации IFNy из МЕ/мл в пг/мл использовали коэффицент 40 [55]. Результаты теста считали положительными, если разность между антиген - индуцированной и спонтанной продукцией IFNy составляла более 0,35 МЕ/мл (14 пг/мл) и разность между митоген-индуцированной и спонтанной продукцией IFNy - более 0,5 МЕ/мл (20 пг/мл).

Мультиплексный анализ. Количественное определение EGF\ MIP-1/3, VEGF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-la, IFN-a2, TGFa, TNFa, sIL-2Ra и sCD40L

Для анализа на мультиплексном aнaлизaтope"MagPix" ("Millipore", США) , основанном на технологии хМАР компании Luminex (США) с использованием магнитных частиц "Milliplex Mag" , была выбрана панель из 12 аналитов в составе коммерческой тест-системы MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine

Magnetic Bead Panel, HCYTOMAG-6OK ("Millipore", США). В исследуемую панель входили следующие цитокины: EGF, MIP-lß, VEGF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-la, IFN-a2, TGFa, TNFa, а так же sIL-2Ra, sCD40L Измерения проводили в соответствии с инструкцией производителя. При статистической обработке результатов значения уровня цитокинов, выходящие за нижнюю границу чувствительности метода, принимались за значение нижней границы пг/мл. Если значение концентрации цитокина превышало верхнюю границу чувствительности, то его концентрацию принимали равной верхней границе.

Определение концентрации IP-10 и неоптерина

Содержание неоптерина (НПТ) и IP-10 определяли иммуноферментным методом с использованием набора реагентов IBL (Гамбург, Германия) и Bender Medsystems (Вена, Австрия) соответственно, согласно инструкциям производителей.

Иммуноферментный анализ

Для оценки диагностической значимости антигенов различных Mtb использовали модель непрямого варианта твердофазного иммуноферментного анализа, имеющего следующую схему проведения: ] - АГ - AT- К*,

где ] - твердая фаза; АГ - иммобилизованный антиген; AT - антитела, выявляемые в сыворотке крови; К* - конъюгат: антитела к иммуноглобулинам человека, меченные ферментом пероксидаза хрена.

В качестве твердой фазы мы применяли 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола.

Растворы для проведения ИФА

На этапах инкубации и при промывках использовали следующие растворы:

• фосфатный буферный раствор, рН=7,2. Состав: натрий фосфорнокислый двух-замещенный 12 водн. (Na2HP04-12H20); натрий хлористый; соляная кислота 6М, твин 20; фенол; вода дистиллированная.

• субстратный раствор:

- 0,05 М цигратный буфер (ЦБП), рН=4,0. Состав: лимонная кислота одноводная (C6H807-II20); гидроксид натрия 1 М; гидроперит (комплекс перекись водорода -мочевина); 2-хлорацетамид (C2H4CINO); вода дистиллированная.

- 0,006 М раствор тетраметилбензидина (ТМБ). Состав: диметилсульфоксид; 3,3',5,5'- тетраметилбензидин (С 16H20N2) 98,0%; вода дистиллированная.

• коныогат: моноклональные антитела к IgG человека, меченные пероксидазой хрена (ООО Биотехнологическая компания Капель)

• раствор для исследуемых проб (РИП) с добавлением лизата Е. coli

Состав: ФСРТ, 0,3% пептон основной щелочной; краситель бром феноловый синий, азид натрия (NaN3) 1 г/л.

• карбонат-бикарбонатный буферный раствор (КБК), используемый для сорбции АГ на планшет, 0,05М, рН=9,5-9,6. Состав: 0,05М карбонат натрия (Ыа2СОз); 0,05М гидрокарбонат натрия (КаНСОз).

Для приготовления специфического иммуносорбента планшеты сенсибилизировали отдельными рекомбинантными белками в оптимальных концентрациях. Сорбцию проводили из сантимолярного карбонатно-бикарбонатного буфера (КБК) pH 9,5 в течение 16-20 часов при температуре 4-8°С. После сорбции раствор вытряхивали, лунки промывали дистиллированной водой и помещали в вакуумную бочку на 8 часов. Далее планшеты запаивали в герметичные полиэтиленовые пакеты и хранили при температуре 2 -4 °С. Непосредственно перед проведением анализа во все лунки вносили по 250 мкл ФСРТ на 1-2 мин, затем раствор удаляли насосом.

Методика проведения ИФА

Процедуру ИФА проводили по инструкции, прилагаемой к тест-системе иммуноферментной для обнаружения IgG к Mtb (ИФА-анти-ТУБ), выпускаемой Отделом Новых Технологий ФБУН НИИЭМ имени Пастера со следующими модификациями.

Одну из лунок (AI) заполняли ФСРТ - 100 мкл (контроль субстрата). В лунку А2 вносили 100 мкл раствора отрицательного контроля (НК - пул сывороток здоровых доноров, не содержащий IgG-антител к Mtb), в следующую лупку 100

мкл положительного контроля (ПК - пул сывороток, содержащий IgG-аптитела к Mtb). Во все остальные лунки вносили по 90 мкл раствора РИП, в который предварительно добавляли лизат Е. coli. При использовании в ИФА рскомбинантных белков в РИП необходимо добавлять лизат Е. coli, т.к. рекомбинантные белки, полученные с помощью геино-модифицированной культуры Е. coli, могут содержать в виде примеси белки этого микроорганизма, антитела к которым всегда находятся в крови человека. Затем в лунки с раствором РИП вносили по 10 мкл исследуемых проб, тщательно (не менее 3-х раз) перемешивая пипетированием, при этом цвет изменяет окраску от темно-фиолетового до изумрудного. Планшет закрывали крышкой и инкубировали при температуре 37 [С в течение 30 мин в тер-мостатируемом шейкере ("BIOSAN"). После инкубации лунки промывали 3-х кратно раствором ФСРТ. Далее во все лунки, кроме AI, вносили по 100 мкл рабочего раствора конъюгата, в лунку AI - 100 мкл ФСРТ (контроль субстрата). Планшет закрывали крышкой и инкубировали при температуре 37LC в течение 15 мин в термостатируемом шейкере ("BIOSAN"). После инкубации лунки промывали 6-ти кратно раствором ФСРТ. Далее во все лунки вносили по 100 мкл субстратного раствора. Планшет закрывали крышкой и выдерживали в темноте при температуре (15-25)°С в течение 15 мин. Реакцию останавливали внесением в каждую лунку по 50 мкл раствора серной кислоты. При правильном проведении всех стадий анализа содержимое лунок с НК оставалось бесцветным или бледно-желтым, а содержимое лунок с ПК приобретало желто-коричневую окраску. Измерение оптической плотности (OD) проводили при длине волны 450 нм непосредственно в лунках планшета с помощью вертикального фотометра MR 4000 фирмы DyNaTECH. В качестве кюветы сравнения служила лунка AI с контролем субстрата.

Получение лизата клеток Е. coli

При проведении ИФА с использованием в качестве иммуносорбепта реком-бинантных антигенов необходимо проводить процедуру истощения сывороток от антител к антигенам E.coli, в связи с тем, что рекомбинантные белки, продуцируемые клетками E.coli, содержат примеси антигенов E.coli.

Получение лизата (соииката) клеток E.coli проводили по общепринятой методике, используемой в лаборатории генной инженерии ФГБУ «НИИ биохимии» СО РАМН. На первом этапе готовили питательную среду ЛБ. Для этого вносили в коническую колбу 10 г. Bacto®-tryptone, 5 г. Bacto®-yeast extract и 5 г. NaCI и растворяли в 1 л деионизованной воды. До рН=7.5 доводили добавляя ЮМ NaOH. Среду разливали по колбам или пробиркам в требуемых объёмах, автоклавирова-лп и хранили при комнатной температуре. Далее тонким шпателем, прожженным над спиртовкой после споласкивания в спирте, отбирали в стерильных условиях (микробиологический бокс или ламинарный шкаф 2 класса) из флакона с высушенной культурой £.co//BL-21(DE3) небольшой кусочек лиофилизага и помещали его в пробирку с ватно-марлевой пробкой вместимостью 15-20 мл, содержащую 2 мл стерильной среды ЛБ. Пробирку помещали в орбитальный шейкер и растили клетки ночь (16-18 час) при 120-150 об/мин при +37°С. Выросшую культуру (2 мл) с помощью стерильной пипетки переносили в коническую колбу с ватио-марлевой пробкой объёмом 300 мл, содержащую 50 мл проавтоклавирован-ной среды ЛБ. Колбу помещали в шейкер и растили клетки ночь (16-18 час) при 120-150 об/мин при +37°С. В пять микробиологических колб объёмом по 800-1000 мл, содержащих по 200 мл проавтоклавированной среды ЛБ, вносили с помощью стерильной пипетки по 10 мл культуры E.coli BL-21(DE3), выращенной на предыдущей стадии и растили в шейкере при 120-150 об/мин +37°С до оптической плотности при 600 нМ 0,8-1,0 o.e. Далее добавляли изопропил-ß-D-l-тиогалактопиранозид, MW = 238.3) до конечной концентрации 0,5-1 мМ и выращивали клетки культуры штамма Е.coli до оптической плотности, при 600 нм, 1,52,0 o.e. После осаждали клетки центрифугированием при 5000g в течение 15 минут, суспендировали осадок клеток в буфере для озвучивания [50 тМ Na-фосфат pH 8.0 (или 25 тМ трис-HCl, pH 8.0), 300 mM NaCI] из расчёта 3-5 мл буфера на 1 г веса клеток и переносили суспензию в пластиковую пробирку объёмом 15 мл. На следующем этапе вносили в суспензию клеток лизоцим до конечной концентрации 1-2 мг/мл, инкубировали во льду 30 мин и затем озвучивали суспензию в течение 20-30 сек на максимальной мощности (200-300 Ватт) УЗ-дезинтегратора.

После переносили суспензию в водяную баню на +20°С, вносили в неё растворы IM MgCb, ДНК;13Ы1 и РНКазыА до конечной концентрации 5 мМ, 10 мкг/мл и 50 мкг/мл, соответственно, и инкубировали 10 мин при +20°С. Далее охлаждали пробирку с суспензией во льду, повторно озвучивали в течение 15-20 сек и вновь охлаждали суспензию в ледяной ванне. Прежде, чем центрифугировать "озвученный" и охлаждённый во льду лизат при (l-2)xl0000g и собирать супернатант, который после расфасовывали его аликвотами по 1-2 мл в центрифужные пробирки с завинчивающимися крышками, процедуру озвучивания повторяли 6-7 раз. Полученные расфасованные соникаты (лизаты)хранили при (-20 - -70)°С.

Определение концентрации белка

Концентрацию белка в лизате клеток E.coli и рекомбинантных белков определяли по методу Лоури [93] либо флуоресцентным методом при помощи прибора и набора Qubit® (Invitrogen, USA) согласно инструкции производителя.

Статистические методы исследования

Статистическая обработка данных производилась с помощью пакета программ MS Excel, SPSS (версия 13.0), Prizm 5.0 (GraphPad Software Inc.), JMP 9.0. Для описания полученных результатов использовались стандартные методы непараметрической статистики. Полученные количественные данные представлены в виде медианы с указанием первого и третьего квартиля Me [Ql; Q3]. Для сравнения парных количественных значений использовали непараметрический критерий Манна - Уитни. Гипотезы рассматривались как статистически достоверные при р<0,05. Для выявления корреляционных связей между двумя количественными параметрами использовали непараметрический метод ранговой корреляции по Спирмену с указанием коэффициента корреляции R и р.

Для сравнения двух различных диагностических тестов и выбора значения оптимальной точки разделения проводили анализ кривых операционной характеристики (receiver-operating-characteristic curve-ROC,) и вычисляли площадь под характеристической кривой операционной характеристики (ППК). Качество диаг-

ностических маркеров оценивалась по экспертной шкале (таблица 1) для значений ИПК [70, 71, 149].

Для определения риска заболевания в случае положительного (или отрицательного) результата теста рассчитывали значение отношения правдоподобия положительного результата (01II1) и отношение правдоподобия отрицательного результата (ОПО) соответственно. Расчет производился по формулам, представленным в таблице 2 Показатель ОПП имеет важное значение в определении полезности диагностического теста, поскольку при ОПП в диапазоне от 2 до 5 диагностическая ценность теста низка, в диапазоне от 6-10 - тест может рассматриваться как полезный, а при ОПП более 10 - тест крайне ценен для лабораторной диагностики. С целью нахождения оптимальной комбинации биомаркеров был применен метод построения классификационных деревьев решений ^МР 9.0).

Таблица 1 - Экспертная шкала для значений ППК

Интервал ППК Качество модели

0,9-1,0 Отличное

0,8-0,9 Очень хорошее

0,7-0,8 Хорошее

0,6-0,7 Среднее

0,5-0,6 Неудовлетворительн ое

Таблица 2 - Формулы расчета статистических показателей

Референтный диагноз

болен здоров Итого

Изучаемый метод здоровы а Ь а+Ь

выявлено заболевание с й с+а

Итого а+с Ъ+6 а+с+ Ь+с1

Чувствительность = с/а+с

Специфичность = Ь/Ь+ё

Отношения правдоподобия положительного результата

(ОПП )= чувствительность / (1-специфичность)

Отношение правдоподобия отрицательного результата

(ОПО) = 1 - чувствительность/ специфичность.

Примечание - а, Ь, с, с! - количество обследованных людей

Основные положения, выносимые на защиту

1. Биомаркерами, альтернативными IFNy, при выявлении туберкулезного инфицирования вне зависимости от активности ТБ легких (бактериовыделения) могут служить TP-10 и IL-2, а комбинированное определение трех цитокинов (TGFa, IL-6 и IFNy), по разработанному алгоритму, позволяет дифференцировать активный ТБ легких и ЛТБИ.

2. Разработанная иммунофермептпая тест-система для определения специфических антител класса IgG к двум антигенам Mtb: рекомбинантному белку CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3, позволяет выявлять больных активным ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику ТБ с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии.

3. Двухступенчатый алгоритм иммунодиагностики ТБ позволяет на первом этапе выявлять контингент лиц, инфицированных Mtb, при определении специфической антиген-индуцированной продукции IFNy, TP-10 и/или IL-2, и на втором этапе проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и латентной туберкулезной инфекции при определении комбинации IFNy/TGFa/IL-б, специфических антител класса IgG и/или неоптерина.

Степень достоверности и апробация результатов

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 7 в журналах, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ для публикаций основных результатов диссертационных исследований.

Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (протокол № 6 от 29 мая 2013 года). Основные положения диссертационной работы были представлены на III научной школе-конференции «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011); X конференции иммунологов Урала (Тюмень, 2012); II всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012); научно-

практической конференции молодых учёных, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулёза взрослых и детей» (Москва, 2013); 15 международном конгрессе по иммунологии (Милан, Италия, 2013).

Микробиологические, серологические, иммунологические, экспериментальные исследования, систематизация и статистический анализ данных проведены лично автором в лаборатории биопрепаратов ФБУН «Санкт-Петербургский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера». Синтез рекомбинант-ных химерных антигенов проведен в лаборатории генной инженерии НИИ Биохимии СО РАМН. Подбор групп больных ТБ и предоставление информации, в соответствии с протоколом исследования, осуществляли врачи-фтизиатры СПБГУЗ ПТД, СПбПТД №3, ЦНИИТ РАМН, СПБ ГУЗ ГМБ № 2.

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Васильева, Елена Викторовна

Выводы

1. Определение уровня специфической антиген-индуцированной продукции №N7 является информативным тестом для диагностики туберкулезного инфицирования (чувствительность (Ч)=60-77 %, специфичность (С)=81-86 %) вне зависимости от активности процесса (бактериовыделения) и может использоваться для контроля за эффективностью терапии у лиц с положительным результатом теста до начала лечения.

2. 1Р-10 и 1Ь-2 являются информативными биомаркерами, альтернативными №N7, для диагностики туберкулезного инфицирования. Определение 1Р-10 и ТЬ-2 позволяет работать в более широком диапазоне концентраций и при более высоких пороговых значениях, что может позволить избежать получения сомнительных результатов и повысить надежность диагностики.

3. Выявлены 6 биомаркеров (sIL2-R.cc, ^N7, 1Е-6, ТвРос, 1РК-а2, ТОТа) уровень специфической продукции которых достоверно различается у больных активным ТБ и лиц с ЛТБИ, что позволяет применять их для оценки активности ТБ легких.

4. Комбинированное определение специфической антиген-индуцированной продукции 1Ь-6 и 1РЫ7 и спонтанной ТвБа в плазме крови, по разработанному алгоритму, позволяет дифференцировать активный ТБ и латентную туберкулезную инфекцию (4=73-96 %, С=80-90 %).

5. Изучение диагностической значимости иммупосорбентов на основе антигенов СВО-СРРЮ, СВО-Е8АТ6, Е8АТ6-СРР10, СВО-Р38 и РРОЫЗ показало, что конструирование иммуноферментной тест-системы, сочетающей антигены СВЭ-Р38 и РРЭЮ, позволяет выявлять больных активным ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику ТБ с другими легочными патологиями с удовлетворительной чувствительностью и специфичностью анализа.

6. Определение неоптерина и специфических антител класса ^С к рекомбипант-ному белку СВБ-Р38 и лизатному антигену РРЭ№ информативно при выявлении лиц с активным ТБ легких (4=46-63%, С=92-100 % и 4=74-92 %, С=76-100 % соответственно).

7. Комбинированное определение 1РЫу/ТСРа/1Е-6 и оценка специфических антител класса к рекомбинантному белку СВБ-Р38 и лизатному антигену РРОЮ у лиц с установленным на 1 этапе туберкулезным инфицированием, повышается специфичность проведения дифференциальной диагностики активного ТБ и ЛТБИ (на 21 и 14 % соответственно). В свою очередь, на показатели чувствительности и специфичности определения НПТ не влияет последовательность выполнения тестов.

8. Разработан двухступенчатый алгоритм иммунодиагностики ТБ, в котором на первом этапе предлагается проводить количественное определение специфической антиген-индуцированной продукции №N7, 1Р-10 и/или 1Ь-2 в плазме крови, тем самым выявляя контингент лиц с туберкулезным инфицированием, а на втором этапе предлагается проводить количественное определение комбинации 1РЫу/ТСРа/1Ь-6, специфических антител класса 1§С к рекомбинантному белку СВБ-Р38 и лизатному антигену РРОЮ и/или неоптерина для определения активности туберкулеза легких.

Практические рекомендации

1. Определение уровня специфической антиген-индуцированной продукции ШЫу рекомендуется для диагностики туберкулезного инфицирования (чувствительность 60-77%, специфичность 81-86%).

2. Для оценки эффективности лечения больных ТБ легких, с исходно положительным результатом определения уровня специфической антиген-индуцированной продукции IFNy в начале лечения, этот тест рекомендуется использовать в динамике после двухмесячного курса проведенной терапии.

3. Для установления туберкулезного инфицирования определение специфической продукции IL-2 (пороговое значение 36 пг/mji) и IP-10 (пороговое значение 1087 пг/мл) может служить альтернативой IFNy.

4. Определение неоптерина, специфических противотуберкулезных антител класса IgG к рекомбинантному белку CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3 в сыворотке крови и/или комбинированное определение специфической антиген-индуцированной продукции IL-6, IFNy и спонтанной TGFa в плазме крови, по разработанному алгоритму, рекомендуется для проведения дифференциальной диагностики активного ТБ и ЛТБИ.

Перспективы дальнейшей разработки темы

Разработанный алгоритм дифференциальной диагностики латентной туберкулезной инфекции и активного ТБ легких может быть основой для проведения дальнейших валидационных исследований на различных группах пациентов.

Список сокращений и условных обозначений

БЛ - больные туберкулезом

ВП - впервые выявленные больные туберкулезом

ГИБГТ - генно-инженерные биологические препараты

ДИ - доверительный интервал

ЗЛ - здоровые лица

ИФА - иммуноферментный анализ

ИТ - интерфероновые тесты

КЛ - контактные по ТБ лица

КФТ - квантифероновый тест (QuantiFERON®TB Gold In-Tube) ЛЙ - питательная среда Левенштейна - Йенсена МБТ (-) - больной туберкулезом без бактериовыделения МБТ (+) - больной туберкулезом с бактериовыделением НЗЛ - заболевания легких нетуберкулезной этиологии НПТ - неоптерин

ОПО - отношение правдоподобия отрицательного результата теста

ОПП - отношение правдоподобия положительного результата теста

ПИК - площадь под кривой операционной характеристики

ПТА - специфические противотуберкулезные антитела

РИП - раствор для разведения исследуемых проб

ТБ - туберкулез

ТМБ - тетраметилбензидин

ФСРТ - фосфатно-солевой буферный раствор с твином-20

ХР - больные с хроническим туберкулезом

ЦБП - цитратный буферный раствор с перекисью водорода

ПК - положительный контроль в ИФА

НК - отрицательный контроль в ИФА

AG - антиген-индуцированная продукция

CBD - аминокислотная последовательность целлюлозосвязывающего домена эндоглюконазы А из Cellumonas fimi.

EGF - эпидермальный рос товой фактор

IFN-a2 - интерферон-альфа2

IFNy - интepфepoн-гамма(interferon-gаmmа)

IL - интерлейкин(т1ег1еикт)

IP-10 - (IFN-y-inducible protein 10 или у-1Р10, CXCL10) хемокин

МНС - главный комплекс гистосовместимости(та]ог histocompatibility complex)

MIP-lp - макрофагальный воспалительный протеин - 1(3

М IT - митоген-индуцированная продукция (положительный контроль)

Mtb - Mycobacterium tuberculosis

NIL - спонтанная продукция (отрицательный контроль) OD - оптическая плотность

PPDN-3 - ультрафильтрат культур возбудителя туберкулеза штаммов DTST и Valee

ROC - кривая операционной характеристики (receiver-operating-characteristic curve) sCD40L - растворимая форма лиганда CD40 sIL-2Ra - растворимый рецептор интерлейкина-2-альфа

TCR - Т- клеточный рецептор (T-cell receptor)

TGFa - трансформирующий ростовой фактор-альфа

Th 1 - Т-хелперы первого типа

Th2 - Т-хелперы второго типа

TNFa - фактор некроза опухоли-альфа

VEGF - васкулоэндотелиальный фактор роста хМар - мультиплексный анализ

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Васильева, Елена Викторовна, 2013 год

Список литературы

1. Абдуллаев, Р. 10. Особенности системного воспалительного ответа у подростков с впервые выявленным туберкулезом / Р.Ю. Абдуллаев, Н.Г. Ершов, Г.О. Каминская, М.Ф. Губкина, Е.С. Овсянкина // Проблемы туберкулеза. - 2008. - № 1. - С.11-17.

2. Абдуллаева, Г.Б. Трудности диагностики туберкулеза легких в клинике внутренних болезней / Г.Б. Абдуллаева, К.Ю. Колосова, О. А. Цветкова // Русский медицинский журнал. - 2005. - Т. 13, №27.-С. 1908-1916.

3. Авдиенко, В.Г Получение и характеристика моноклональных антител против микобактерий бычьего вида и антиидиотипов к ним: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.00.36 / Авдиенко, Вадим Григорьевич. - М., 1992. - 25 с.

4. Александрова, E.H. Инновационные технологии в лабораторной диагностике ревматических заболеваний / E.H. Александрова, E.J1. Насонов // Научно-практическая ревматология. - 2010. - №2. - С. 13-20.

5. Балабанова, Я.М. Использование автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 в диагностике лекарственной устойчивости к резервным препаратам в г. Самара / Я.М. Балабанова, И.М. Федорин, II. А. Маломанова, Ф. Дробниевский, В. В. Николаевский, X. Сун, Ю.А. Машкова, Т.Г. Симак, И.С. Концевая, O.A. Игнатьева, С. А. Миронова // Туберкулез и болезни легких. - 2009. - №9. - С.63-70.

6. Белушков, В.В. Значение диаскинтеста и квантиферонового теста в диагностике туберкулеза у детей / В.В. Белушков, М.Э.Лозовская, Г.А.Новик, О.П.Турина, Н.Д. Шибакова // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 7 (часть 1). - С. 34-39.

7. Борисов, С.Е. Скрининг и мониторинг туберкулезной инфекции у ревматологических больных, получающих генно-инженерные биологические препараты / С.Е. Борисов, Г.В. Лукина, Л.В. Слогоцкая, Я.А.Кочетков, Л.Д. Гунтупова, Н.В. Куликовская // Туберкулез и болезни легких. - 2011.- № 6. - С. 42-50.

8. Братцева, Е.В. Протеомные технологии в диагностике грибовидного микоза: автореф. дис. ... канд. мед. наук: 14.01.10 / Братцева Екатерина Валерьевна. - М., 2010.-24 с.

9. Вербов, В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа // Сборник научных трудов. -Л.,Изд. Института им. Пастера. - 1988.

10. Вербов, В.Н. Сравнительная оценка иммуноферментной тест-системы при использовании для серодиагностики туберкулезных и петуберкулезных заболеваний / В.Н. Вербов, O.A. Якунова, Р.И. Шендерова, А.И. Артюхов // Пробл. туберкулеза. -1990.-№10.-С. 60-62.

11. Владимирский, М.А. Антигенспецифическая индукция фактора некроза опухоли в оценке активности туберкулёзной инфекции / М.А. Владимирский, Л.И. Мордовская, Л.К. Шипина, А.Ю. Сазыкин, С.А. Недоспасов // Туберкулез и болезни легких. - 2011. - N 11. - С.45-49.

12. Гладкова, С.Е. Опыт применения тест-системы "АТ-Туб-Бест" для диагностики туберкулеза / С.Е.Гладкова, С.С. Решетников, В.Н. Пряхина // Медицина и здоровье-2011. -№ 5(61). С.?-?, http://www.medicinarf.ru/journals/707/8530/.

13. Деркачёва, С.А.Получение рекомбинантного антигена р38 М.tuberculosis и оценка возможности его применения в серодиагностике туберкулёза / С.А. Деркачёва, В.И. Ткаченко, А.Б. Беклемишев // Бюллетень СО РАМН. - 2007. - № 5 (127) . -С. 62-68.

14. Иртуганова, О. А. Определение чувствительности MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS к пиразинамиду на бактериологическом анализаторе ВАСТЕС 960 /

0. А. Иртуганова, Н. С. Смирнова, Л. В. Слогоцкая // Пробл.туб. - 2003. - № 7. - С. 40-42.

15. Иртуганова, O.A. Ускоренная культуральная диагностика туберкулеза с использованием автоматизированных систем ВАСТЕС MGIT 960 и МВ/ВАСТ / O.A. Иртуганова, Н.С. Смирнова, A.M. Мороз, В.И. Литвинов. // Пробл. туб. - 2002. - №

1.-С. 58-62.

16. Киселев, В.И. Клинические исследования нового кожного геста «диаскинтест» для диагностики туберкулеза / В.И. Киселев, П.М. Барановский, И.В. Рудых, A.M. Шустер, В.А. Мартьянов // Туберкулез и болезни легких. - 2009. - №2. - С. 11-16.

17. Кисина, Т.Е.: авгореф. дис. ... канд. биол. наук: 14.00.36 / Кисина Татьяна Евгеньевна. - Спб., 2006. - 18 с.

18. Лабораторная диагностика туберкулеза / Под ред. В. И. Литвинова, А. М. Мороза / М.: МНПЦБТ, 2001. - 184 с.

19. Леви, Д.Т. Туберкулинодиагностика: От Р.Коха до наших дней / Д.Т.Леви, П.М.Барановский // Кожная проба с препаратом "ДИАСКИНТЕСТ"- новые возможности идентификации туберкулезной инфекции / Под ред. Академика РАН и РАМН М.А. Пальцева. Второе издание, переработанное и дополненное. - М.: Издательство "Шико" - 2011 - 256 с. - С.23.

20. Литвинов, В.И. Латентная туберкулезная инфекция - миф или реальность? / В.И. Литвинов // Туберкулез и болезни легких. - 2011 - № 6. - С.3-9.

21. Макинский, А.И. Эластаза нейтрофилов в сыворотке крови и активность ее ингибиторов у больных туберкулезом легких / А.И. Макинский, В.А. Доценко, А.Я. Спирина // Проблемы туберкулеза. - 2000. - № 4. - С.36-39.

22. Митинская, Л.А. Новые технологии при профилактике, выявлении, диагностике и лечении туберкулеза у детей // Проблемы туберкулеза. - 2003. - №1. - С. 19-25.

23. Мордовская, Л.И. Индукция гамма-интерферона в образцах цельной венозной крови in vitro-тест для определения туберкулезного инфицирования детей и подростков / Л.И. Мордовская, М.А. Владимирский, В.А. Аксенова, Е.Е. Ефремов, Г.И. Игнашенкова, Т.Н. Власик // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2009. - №6. -С. 19-24.

24. Мордовская, Л.И. Иммунодиагностика и иммунотерапия туберкулезной инфекции у детей и подростков: дис. ... д-ра мед. наук: 14.01.16; 14.03.09 / Мордовская Лариса Викторовна. - М., 2010. - 220 с.

25. Никитина, И.10. Использование «интерфероновых тестов» для диагностики и оценки активности туберкулеза легких / И.Ю. Никитина, H.A. Кондратюк, H.A. Васильева, И.В. Лядова // Совершенствование медицинской помощи больных туберкулезом: материалы Всерос. науч.-практ. конф. - СПб. - 2011. - С. 451 -452.

26. Никитина, И.Ю. Исследование возможности применения метода «QuantiFERON-TB Gold In-Tube» для диагностики туберкулеза легких / И.Ю. Никитина // Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза

взрослых и детей: материалы научно-практической конференция молодых ученых, посвященной Всемирному Дню Борьбы с туберкулезом. - 2012. - С. 81.

27. Никитина, И.Ю. Особенности дифференцировки лимфоцитов CD4 у больных туберкулезом легких: авгореф. дне. ... канд. мед. наук: 14.03.09 / Никитина Ирина Юрьевна. - М., 2013. - 24 с.

28. Никитина, И.Ю. Степень дифференцировки лимфоцитов CD4 как новый показатель состояния Т-клеточного иммунитета у больных туберкулезом легких / И.Ю. Никитина // Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулеза взрослых и детей: материалы научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 90-летию ЦНИИТ РАМН и Всемирному дню борьбы с туберкулезом. -2011.-С. 62.

29. Никитина, И.Ю Степень дифференцировки Т-лимфоцитов CD4 у больных туберкулезом легких / И.Ю. Никитина, Н.С. Шмитова, H.A. Кондратюк, И.А. Васильева, И.В. Лядова // Медицинская Иммунология. - 2011. - Т. 13. - № 4-5. - С. 402.

30. Овсянкина, Е.С. Опыт применения нового кожного теста (диаскинтеста) для диагностики туберкулеза органов дыхания у детей и подростков в туберкулезном отделении / Е.С. Овсянкина, М.Ф. Губкина, Н.Г. Ершова, М.Г. Кобулашвили // Туберкулез и болезни легких. - 2010. - № 1. - С. 16-19.

31. Пальцев, М.А. Кожная проба с препаратом "Диаскинтест® / М.А. Пальцев, В.И. Киселев, П.М. Барановский // Пособие для врачей. М. - 2009. - С. 37—40.

32. Салина, Т.Ю. Иммунологические методы в дифференциальной диагностике / Т.Ю. Салина, Т.П. Морозова // Туберкулез и болезни легких. -2011. - №11. - С. 5053.

33. Свиридов, Е.А. Неоптерин и его восстановленные формы: биологическая роль и участие в клеточном иммунном ответе / Е.А. Свиридов, Т.А, Телегина // Успехи биологической химии. - 2005. - т. 45. - С. 355-390.

34. Слогацкая, Л.В. Сравнительные результаты кожного теста с препаратом, содержащим рекомбинантный белок CFP-10-ESAT-6, и лабораторного теста QuantiFERON - GIT/ Л.В. Слогацкая, Д.А. Иванова, Я.А. Кочетков, Н.В. Куликов-

екая, Т.В. Ванеева, А.В. Филиппов // Туберкулез и болезни легких. - 2012. -№ 10. -С. 27-32.

35. Слогоцкая, J1.B. Инфицированность туберкулезом детей и подростков - взгляд через столетие / Л. В. Слогоцкая // Туберкулез и болезни легких. - 2011. - N 3. - С. 21-28.

36. Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом (Материалы Всероссийской науч. - практ. конф. Под ред. профессора П.К.Яблонского). - СПб. -2011.-468 с.

37. Старшинова, А.А. Новый подход в диагностике туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов с применением иммунологических и лучевых методов / А.А. Старшинова, И.Ф.Довгалюк, П.В.Гаврилов, О.А.Якунова // Практическая медицина. -2012.-№61.-С. 32-36.

38. Титаренко, О. Т. Сравнительная ценность биохимических маркеров клеточного иммунитета в диагностике туберкулезного плеврита / О. Т. Титаренко, Д. С. Эсмед-ляева, Т. Л. Перова, Н. П. Алексеева, М. Е. Дьякова, М. Ю. Попов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010. - № 1. - С. 46-49.

39. Титаренко, О.Т. Клинико-лабораторные сопоставления в оценке прогноза лечения больных инфильтративным туберкулезом легких / Титаренко О.Т., Дьякова М.Е., Павлова М.В., Эсмедляева Д.С., Алексеева Н.П., Перова Т.Л. // Клиническая лабораторная диагностика - 2012. - № 5. - С. 31-34.

40. Элдер, А. Способ получения антигена молекулярной массой 45кДа из Mycobacterium tuberculosis // А. Элдер, В. И. Вершинина, К .С. Хаертынов , С.В. Герасимова, Н.Г Уразов, И.М. Хаертынова / Журнал Фундаментальные исследования.-2013.-№ 1-1.-С.18-22.

41. Abebe, F. Progress in serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection / F. Abebe, Holm- C. Hansen, H.G. Wiker, G. Bjune // Scand J Immunol. - 2007 -Vol. 66, N 2-3-P. 176-191.

42. Almeida, M.L. alphal-acid glycoprotein and alpha 1-antitrypsin as early markers of treatment response in patients receiving the intensive phase of tuberculosis therapy / M.L. Almeida, M.A. Barbieri, R.Q. Gurgel, S.T. Abdurrahman, U.A. Baba, C.A. Hart, A.

Shenkin, A.M. Silva, L. de Souza, L.E. Cuevas // Trans R Soc Trop Med I-Iyg - 2009. -Vol. 103, N 6.-P. 575-580.

43. Al-Zamel, F.A. Detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis / F.A. Al-Zamel // Expert Rev. Anti Infect. Ther. - 2009. - Vol.7, N 9. -P. 1099-1108.

44. Arend, S.M. Uncommon presentations of tuberculosis: the potential value of a novel diagnostic assay based on the Mycobacterium tuberculosis-specific antigens ESAT-6 and CFP-10/ S.M. Arend , Т.Н. Ottenhoff, P. Andersen , J.T. van Dissel // Int J Tuberc Lung Di. - 2001. - Vol.5, N 7. - P. 680-686.

45. Azzurri, A. IFN-gammainducible protein 10 and pentraxin 3 plasma levels are tools for monitoring inflammation and disease activity in Mycobacterium tuberculosis infection / A. Azzurri, O.Y. Sow, A. Amedei, B. Bah, S. Diallo, G. Peri, M. Benagiano, M.M. D'Elios,

A. Mantovani, G. Del Prete // Microbes Infect. - 2005. - Vol. 7, N 1. - P. 1 -8.

46. Bansard, C. Can rheumatoid arthritis responsiveness to methotrexate and biologies be predicted? / C. Bansard, T. LequerrC] M. Daveau, O. Boyer, F. Tron, J.P. Salier, O.Vittecoq , X. Le-LoQ // Rheumatology (Oxford). - 2009. - Vol.48, N 9. - P. 1021-1028.

47. Baumann, R. Serodiagnostic markers for the prediction of the outcome of intensive phase tuberculosis therapy / R. Baumann, S. Kaempfer, N.N. Chegou,N.F. Nene, H. Veenstra, R. Spallek, C.T. Bolliger, P.T. Lukey, P.D. van Flelden, M. Singh, G. Walzl // Tuberculosis (Edinb).- 2013. - Vol. 93, N 2. - P. 239-245.

48. Berlin, L. Tuberculosis: resurgent disease, renewed liability/ L. Berlin // AJR Am J Roentgenol.-2008.-Vol.190, N. 6-P. 1438-1444.

49. Bhatia, A.S. Immunodiagnosis of tuberculosis: An update / A.S. Bhatia, S. Kumar,

B.C. Harinath //Indian J Clin Biochem.-2003 -Vol. 18, N 2 - P. 1-5.

50. Bibova, I. Detection of immune cell response to M. tuberculosis-specific antigens by quantitative polymerase chain reaction / I. Bibova, I. Linhartova, O. Stanek, V. Rusnakova, M. Kubista, M., Suchanek, M. Vasakova, P. Sebo // Diagn Microbiol Infect Dis. - 2012. -Vol. 72, N 1. - P. 68-78.

51. Biselli, R. Detection of interleukin-2 in addition to interferon-gamma discriminates active tuberculosis patients, latently infected individuals, and controls / R. Biselli, S. Mariotti, V. Sargentini, I. Sauzullo, M. Lastilla, F. Mengoni, V. Vanini, E. Girardi, D.

Goletti, R. D' Amelio, R. Nisini // Clin Microbiol Infect.- 2010. - Vol. 16, N 8. - P. 12821284.

52. BorgstrCin, E. Immune responses to ESAT-6 and CFP-10 by FASCIA and multiplex technology for diagnosis of M. tuberculosis infection: IP-10 is a promising marker [Электронный ресурс] / E. BorgstrCm, P. Andersen , F. Atterfelt , I. Julander, G. KCllenius , M. Maeurer , I. Rosenkrands , M. Widfeldt, J. Bruchfeld , H. Gaines // PLoS ONE. - 2012. - Vol.7, N 11. - Режим доступа: http://www.plosone.org/article/ info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0043438.

53. Bossuyt, X. Standardisation in clinical laboratory medicine: an ethical reflection / X.Bossuyt, C. Louche, A. Wiik A.// Ann Rheum Dis. - 2008. -Vol, 67, N 1061. - P. 10611063.

54. Brusasca, P.N. Immunological characterisation of antigens encoded by the RD1 region of the Mycobacterium tuerculosis genome / P.N. Brusasca , R. Colangeli , K.P. Lyashchenko, X. Zhao , M. Vogelstein , J.S. Spencer , D.N. McMurray , M.L. Gennaro // Scand. J. Immunol. - 2001. - Vol.54, N 5. - P.448-452.

55. Chegou, N.N. Host markers in QuantiFERON supernatants differentiate active ТВ from latent ТВ infection: preliminary report [Электронный ресурс] / N.N Chegou , G.F. Black , M. van Helden , G. Walzl // BMC Pulm Med. - 2009. - Vol. 9, N 21. - Режим доступа: - http://www.biomedcentral.eom/1471-2466/9/21.

56. Chegou, N.N. Tuberculosis assays: past, present and future / N.N. Chegou, K.G. Hoek, M. Kriel, R.M. Warren , T.C. Victor, G. Walzl // Expert Rev Anti Infect Ther. -2011. - Vol.9, N 4. - P. 457-469.

57. Chien, H.P. Comparison of the BACTEC MGIT 960 with LLwenstein-Jensen medium for recovery of mycobacteria from clinical specimens / H.P. Chien, M.C. Yu, M.II. Wu, T.P. Lin, K.T. Luh // Int J Tuberc Lung Dis. - 2000. - Vol.4, N 9. - P. 866-870.

58. Cok, G. Pleural fluid neopterin levels in tuberculous pleurisy / G. Cok, Z. Parildar, C. Kabaroglu, U. Bayindir, S. Habif, O. Bayindir // Clinical Biochemistry. - 2007. - Vol. 40.-P. 876-880.

59. Cole, S.T. Deciphering the biology of Mycobacterium Tuberculosis from the complete genome sequence / S.T. Cole, R. Brosch, J. Parkhill // Nature. - 1998. - Vol.393, N 6685. - P. 537-544.

60. Davidovv, A. Antibody profiles characteristic of Mycobacterium tuberculosis infection state / A. Davidow, G.V. Kanaujia, L. Shi, J. Kaviar, X. Guo, N. Sung, G. Kaplan, D. Menzies, M.L. Gennaro // Infect Immun. - 2005. - Vol.73, N 10. - P. 6846-6851.

61. Diel, R. Interferon-y release assays for the diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection: a systematic review and meta-analysis / R. Diel , D. Goletti , G. Ferrara , G. Bothamley , D. Cirillo, B. Kampmann , C. Langc , M. Losi, R. Markova, G.B. Migliori, A. Nienhaus, M. Ruhwald, D. Wagner, J.P. Zellweger, E. Huitric, A. Sandgren, D. Manis-sero // Eur Respir J. — 2011 - Vol. 37, N 1.-P.88-99.

62. Dinnes, J. A. systematic review of rapid diagnostic tests for the detection of tuberculosis infection / J. Dinnes, J. Deeks, H. Kunst, A. Gibson, E. Cummins, N. Waugh, F. Drobniewski, A. Lalvani // Health Technol Assess. - 2007. - Vol. 11, N 3. - P. 1-196.

63. Doherty, T.M. Immune responses to the Mycobacterium tuberculosis-specific antigen ESAT-6 signal subclinical infection among contacts of tuberculosis patients / T.M. Doherty, A. Demissie, J. Olobo, D. Wolday, S. Britton, T. Eguale, P. Ravn, P. Andersen //J Clin Microbiol. - 2002. - Vol.40, N 2. - P.704-706.

64. Dufour, J.H. IFNgamma-inducible protein 10 (IP-10; CXCL10)-deficient mice reveal a role for IP-10 in effector T cell generation and trafficking / J.H. Dufour, M. Dzie-jman, M.T. Liu, J.H. Leung, T.E. Lane, Luster A.D. // J Immunol. - 2002. - Vol. 168, N 7. -P. 3195-3204.

65. Flynn, J.L. Tuberculosis: latency and reactivation / J.L Flynn., J. Chan // Infect Immun. - 2001. - Vol. 69, N 7. - P. 4195-4201.

66. Frahm, M. Discriminating between latent and active tuberculosis with multiple biomarker responses / M. Frahm, N.D. Goswami, K. Owzar, E. Hecker, A. Mosher, E. Cadogan, P. Nahid, G. Ferrari, J.E. Stout // Tuberculosis (Edinb). - 2011. - Vol. 91, N 3. -P. 250-256.

67. Fuchs, D. Neopterin as an index of immune response in patients with tuberculosis /

D. Fuchs, A. Hausen, M. Kolfer, IT. Kosanowski, G. Reibegger, H. Wachter // Lung. -1984.-Vol. 162.-P. 337-346.

68. Gibbons, L.J. Biologic therapy for rheumatoid arthritis: clinical efficacy and predictors of response / L.J. Gibbons , K.L. liyrich // BioDrugs. - 2009. - Vol.23, N 2. -P.l 11-124.

69. Guler, M. The role of serum neopterin level in the evaluation of activation and response to treatment in the patients with pulmonary tuberculosis / M. Guler, D. Iiuddam,

E. Unsal, B. Ciftci, N. Bukan, Y. erdogan, N Capan // Tuberk Toraks. - 2006. - Vol. 54 (4).-P. 330-335.

70. Hanley, J.A. A method of comparing the areas under receiver operating characteristic curves derived from the same cases / J.A. Hanley, B.J. McNeil // Radiology. 1983. -Vol. 148, №3.- P. 839-843.

71. Hanley, J.A. The meaning and use of the area under a receiver operating characteristic (ROC) curve / J.A. Hanley, B.J. McNeil // Radiology. -1982. -143, № 1. - P. 29-36.

72. Harari, A. Dominant TNF-alpha+ Mycobacterium tuberculosis-specific CD4+ T cell responses discriminate between latent infection and active disease / A. Harari, V. Rozot,

F.B. Enders, M. Perreau, J.M. Stalder, L.P. Nicod, M. Cavassini, T. Calandra, C.L. Blanchet, K. Jaton,M. Faouzi, C.L. Day, W.A. Hanekom, P.A. Bart, G. Pantaleo // Nat Med. - 2011. - Vol. 17, N 3. - P. 372-376.

73. Harries, A. How does the diagnosis of tuberculosis in persons infected with HIV differ from diagnosis in persons not infected with HIV? / A. Harries // In: Frieden T, editor. Toman's tuberculosis: case detection, treatment, and monitoring - questions and answers. 2nd ed. Geneva: World Health Organization. - 2004. - P. 80-83.

74. He, X.Y. Assessment of five antigens from Mycobacterium tuberculosis for serodiagnosis of tuberculosis / X.Y. He, J. Li, J. Hao, H.B.Chen, Y.Z. Zhao, X.Y.Huang, K.He, L. Xiao, L.P.Ye, Y.M.Qu, L.PI. Ge // Clin Vaccine Immunol. - 2011. - Vol.18, N 4. -P. 565-570.

75. Huebner, R.E. The tuberculin skin test / R.E. Huebner, M.F. Schein, J.B. Jr. Bass // Clin Infect Dis.- 1993.-Vol. 17, N6.-P. 968-975.

76. Immanuel, С. Neopterin as a marker for cell-mediated immunity in patients with pulmonary tuberculosis / С. Immanuel, R. Swamy, M. Kannapiran // Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 1997.-Vol.2.-P. 175 - 180.

77. Ireton, G.C. Identification of Mycobacterium tuberculosis antigens of high sérodiagnostic value / G.C. Ireton , R. Greenwald, H. Liang , J. Esfandiari, K.P. Lyashchenko, S.G. Reed//Clin Vaccine Immunol.-2010.-Vol. 17,N 10.-P. 1539-1547.

78. Kabeer, B.S. IP-10 response to RDI antigens might be a useful biomarker for monitoring tuberculosis therapy [Электронный ресурс] / В.S.Kabeer, A. Raja, В. Raman, S. Thangaraj, M. Leportier, G. Ippolito, E. Girardi, P.H. Lagrange, D. Goletti // BMC Infect Dis. - 2012. - Vol. 19, N 11 - Режим доступа: http://www.biomedcentral.com/1471-2334/11/135.

79. Kapina, М.А. CD271ow CD4 T Lymphocytes That Accumulate in the Mouse Lungs during Mycobacterial Infection Differentiate from CD27high Precursors In Situ, Produce IFN-y, and Protect the Host against Tuberculosis Infection/ M.A. Kapina, G.S. Shepelkova, P.V. Bogacheva, V.V. Mischenko, P. Sayles, G. Winslow, A.S. Apt , I.V. Lyadova // J. Immunol. - 2007. - Vol. 178. - P. 976-985.

80. Karen, R. Commercial Serological Tests for the Diagnosis of Active Pulmonary and Extrapulmonary Tuberculosis: An Updated Systematic Review and Meta-Analysis [Электронный ресурс] / R. Karen, K.R. Steingart, L. L. Flores, N.Dendukuri, I.Schiller, S.Laal, A. Ramsay, P.C. Hopewell, M.Pai // PLoS Medicine. - 2011. - Vol.8, N 8. - Режим доступа: http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed. 1001062.

81. Kassa-Kelembho, E. Poor Performance of a Novel Serological Test for Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis in Bangui, Central African Republic / E. Kassa-Kelembho, E. Kassa, G. Zandanga, A. Ignaleamoko, A.Talarmin // Clin Vaccine Immunol. - 2006. -Vol.13, N6.-P. 702-703.

82. Kavanaugh, A. Biomarkers in rheumatology: promise and pitfalls / A.Kavanaugh, G.S. Firestein, D. Boyle // Future Rheumatol. -2008. -Vol.3, N 4. - P.303-305.

83. Kellar, K.L. Multiple cytokines are released when blood from patients with tuberculosis is stimulated with Mycobacterium tuberculosis antigens / K.L. Kellar, J. Gehrke, S.E.

Weis, A. Mahmutovic-Mayhew, B, Davila, M.J. Zajdowicz, R. Scarborough, P.A. LoBue, A.A. Lardizabal, C.L. Daley, R.R. Reves, J. Bernardo, B.H. Campbell, W.C. Whitworth, G.H. Mazurek // PLoS One. - 2011. - Vol. 6, N П.- Режим доступа: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0026545.

84. Kelly, А.К. Enhancement of Diagnostic Efficiency by a Gamma Interferon Release Assay for Pulmonary Tuberculosis / A.K. Kelly, O.H. Munhoz Leite, M. I. Lopes, M. Litvoc,A.W. Ferreira//Clin Vaccine Immunol. - 2008. - Vol.15, N 6. -P. 1028-1030.

85. Khan, I.H. Plasma antibody profiles as diagnostic biomarkers for tuberculosis / I.H. Khan, R. Ravindran, V.V. Krishnan, I.N. Awan, S.K. Rizvi, M.A. Saqib, M.I. Shahzad, S. Tahseen,G. Ireton, C.W. Goulding, P. Feigner, K. DeRiemer, A. Khanum, P.A. Luciw // Clin Vaccine Immunol.-2011. - Vol. 18, N 12. - P. 2148-2153.

86. Kim, T.C. Acid-fast bacilli in sputum smears of patients with pulmonary tuberculosis. Prevalence and significance of negative smears pretreatment and positive smears post-treatment / T.C. Kim, R.S. Blackman, K.M. Heatwole, T. Kim, D.F. Rochester // Acid Am Rev Respir Dis. - 1984. - Vol. 129. - P.264-268.

87. Kunnath-Velayudhan, S. Immunodiagnosis of tuberculosis: a dynamic view of biomarker discovery / S. Kunnath-Velayudhan, M.L. Gennaro // Clin Microbiol Rev. -2011. - Vol.24, N 4. - P.792-805.

88. Lalvani, A. A 100 year update on diagnosis of tuberculosis infection / A. Lalvani , M. Pareek // Br Med Bull. - 2010. -Vol.93. - P. 69-84.

89. Lee, J.J. Comparative evaluation of the BACTEC MGIT 960 system with solid medium for isolation of mycobacteria / J.J. Lee, J. Suo, C.B. Lin, J.D. Wang, T.Y. Lin, Y.C. Tsai // Int J Tuberc Lung Dis. - 2003. - Vol.7, N.6. - P. 569-574.

90. Lein, A.D. Cellular immune responses to ESAT-6 discriminate between patients with pulmonary disease due to Mycobacterium avium complex and those with pulmonary disease due to Mycobacterium tuberculosis / A.D. Lein, C.F. von Reyn, P. Ravn, C.R. Horsburgh Jr., L.N. Alexander, P. Andersen // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1999. - Vol.6, N4.-P. 606-609.

91. Lighter, J. Chemokine IP-10: an adjunct marker for latent tuberculosis infection in children / J. Lighter, M. Rigaud, M. Huie, C.H. Peng, II. Pollack // Int J Tuberc Lung. -2009. - Vol. 13, N 6. - P. 731 -736.

92. Lighter-Fisher, J. Cytokine responses to QuantiFERON peptides, purified protein derivative and recombinant ESAT-6 in children with tuberculosis / J. Lighter-Fisher, C.H. Peng, D.B. Tse // Int J Tuberc Lung Dis. - 2010. - Vol. 14, N 12. - P. 1548-1555.

93. Lowry, O.FI. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.II.Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol.Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

94. Lu, C. Novel biomarkers distinguishing active tuberculosis from latent infection identified by gene expression profile of peripheral blood mononuclear cells [Электронный ресурс] / С. Lu, J. Wu, H. Wang, S. Wang, N. Diao // PLoS One. - 2011. - Vol. 6, N 8. -Режим доступа: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F 10.1371 %2F journal.pone.0024290.

95. Manca, C., Lyashchenko K., Wiker H.G., Usai D., Colangeli R., Gennaro M.L. Molecular cloning, purification, and serological characterization of MPT63, a novel antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis // Infect Immun. - 1997. - Vol. 65, N 1. - P. 16-23.

96. Menzies, T. Meta-analysis: New tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research march / T. Menzies, M. Pai, G. Comstock // Annals. Intern. Med. - 2007. - Vol.146 - P. 340-354.

97. Metcalfe, J.Z. Test Variability of the QuantiFERON-TB Gold In-Tube Assay in Clinical Practice / J.Z. Metcalfe , A. Cattamanchi, С. E. McCulloch, J.D. Lew, N.P. Ha, E.A. Graviss.. // Am J Respir Crit Care Med. - 2013. - Vol. 187, N 2. - P. 206-211.

98. Mihret, A. Plasma cytokines and chemokines differentiate between active disease and non-active tuberculosis infection / A. Mihret, Y. Bekele, K. Bobosha, M. Kidd, A. Aseffa, R. Howe,G. Walzl // J Infect. - 2013. - Vol. 66, N 4. - P. 357-365.

99. Millington, K.A. Dynamic relationship between IFN-gamma and IL-2 profile of Mycobacterium tuberculosis-specific T cells and antigen load /К.А. Millington, J.A. Innes, S. Hackforth,T.S. Hinks,J.J. Deeks, D.P. Dosanjh, V. Guyot-Revol, R. Gunatheesan, P. Klenerman, A. Laivani // J Immunol.- 2007. - Vol. 178, N 8. - P. 5217-5226.

100. Min, F. Serum antibody responses to 10 Mycobacterium tuberculosis proteins, purified protein derivative, and old tuberculin in natural and experimental tuberculosis in rhesus monkeys / F. Min, Y. Zhang, R. Huang, W. Li, Y.Wu, J. Pan, W. Zhao, X. Liu// Clin Vaccine Immunol. - 2011. - Vol. 18, N 12. - P. 2154-2160.

101. Munk, M.E. Use of ESAT-6 and CFP-10 ntigens or diagnosis f extrapulmonary tuberculosis / M.E. Munk , S.M. Arend ,1. Brock, Т.Н. Ottenhoff, P.Andersen // J. Infect. Dis. - 2001. - Vol. 183, N 1. - P. 175-176.

102. Nassau, E. The detection of antibodies to Mycobacterium tuberculosis by microplate enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / E. Nassau, E.R. Parsons , G.D. Johnson.// Tubercle. - 1976 - Vol.57, N 1. - P. 67-70.

103. Nikitina, I.Y. Mtb-specific CD271ow CD4 T cells as markers of lung tissue destruction during pulmonary tuberculosis in humans [Электронный ресурс] / I.Y. Nikitina, N.A. Kondratuk, G.A. Kosmiadi, R.B. Amansahedov, I.A. Vasilyeva, V.V. Ganusov, I.V. Lyadova // PLoS ONE. - 2012. - Vol.7, N 8. - Режим доступа: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0043733.

104. Ozdemir, D. Serum neopterin concentrations in healthy healthcare workers compares with healthy controls and patients with pulmonary tuberculosis / D. Ozdemir, S. Cesur, A. N. Annakkaya, G. Tarhan, N. Т. Носа, Т. Asian, I. Ceyhan, O. Bylbay, E. Guclu // Med Sci Monit. 2006. -Vol. 12, N 12. - P. 521 -524.

105. Pai, M. Interferon-gamma assays in the immunodiagnosis of tuberculosis: a systematic review / M. Pai, L.W. Riley, J.M. Jr. Colford // Lancet Infect Dis. - 2004. - Vol. 4, N 12.-P. 761-776.

106. Pai, M. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update / M. Pai , A. Zwetiing , D. Menzies // Ann Intern Med. - 2008. -Vol.149, N 3.-P. 177-184.

107. Paluch-Oles, J. Identification of latent tuberculosis infection in rheumatic patients under consideration for treatment with anti-TNF-a agents / J. Paluch-Oles, A. Magrys, M. Koziol-Montewka, A. Koszarny, M. Majdan // Arch Med Sci. - 2013. - Vol. 9, N 1. - P. 112-117.

108. Parry, C.M. Sputum smear negative pulmonary tuberculosis / C.M. Parry/ / Trop Doct.-Vol. 23.-P. 145-146.

109. Patel, M. Laboratory diagnosis of tuberculosis [Электронный ресурс] /М. Patel, A. Joshi, U. Padigel // Clinical laboratory international. - 2009. - Режим доступа: http://www.cli-online.com/featured-articles/laboratory-diagnosis-of-Tuberculosis /trackback/l/index.html#messages_list.

110. Pathan, A.A. Direct ex vivo analysis of antigen-specific IFN-gamma-secreting CD4 T cells in Mycobacterium tuberculosis-infected individuals: associations with clinical disease state and effect of treatment / A.A. Pathan, K.A. Wilkinson, P. Klenerman, H. McShane,R.N. Davidson,G. Pasvol, A.V. Hill, A. Lalvani // J Immunol. - 2001. - Vol. 167, N 9.-P. 5217-5225.

111. Perkins, M.D. Facing the crisis: improving the diagnosis of tuberculosis in the HIV era / M.D. Perkins, J. Cunningham // J Infect Dis. - 2007. - Vol.196. -P. 15-27.

112. Petrucci, R. Interferon gamma, interferon-gamma-induced-protein 10, and tuberculin responses of children at high risk of tuberculosis infection / R. Petrucci, N. Abu Amer, R.Q. Gurgel, J.B. Sherchand, L. Doria, C. Lama, P. Ravn, M. Ruhwald, M. Yassin, G. Harper, L.E. Cuevas//Pediatr Infect Dis J. - 2008. - Vol. 27, N 12.-P. 1073-1707.

113. Pinto, L.M. Immunodiagnosis of Tuberculosis: State of the Art /L.M. Pinto, J. Grenier, S.G. Schumacher, C.M. Denkinger, K.R. Steingart, M. Pai // Med Princ Pract. -2012. -N 21. - P. 4-13.

114. Rangaka, M.X. Interferon release does not add discriminatory value to smear-negative HIV-tuberculosis algorithms / M.X. Rangaka, H.P. Gideon, K.A. Wilkinson, M. Pai, Mwansa-Kambafwile J, G. Maartens, J.R. Glynn, A. Boulle, K. Fielding, R. Goliath, Titus R., S.Mathee, R.J. Wilkinson//Eur Respir J. - 2012. - Vol.39, N 1.-P.163-171.

115. Riou, C. Effect of standard tuberculosis treatment on plasma cytokine levels in patients with active pulmonary tuberculosis [Электронный ресурс] / С. Riou, В. Perez Peixoto, L. Roberts, K. Ronacher, G. Walzl, C. Manca, R. Rustomjee, T. Mthiyane, D. Fallows, C.M. Gray, G. Kaplan // PLoS One. - 2012. - Vol. 7, N 5. - Режим доступа: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0036886.

116. Rubbo, P.A. Multicytokine detection improves latent tuberculosis diagnosis in health care workers / P.A. Rubbo, N. Nagot, V. Le Moing, M. Brabet, A. Bourdin, E. NoguLj K. Bollorri J.P. Vendrell, P. Van De Perre, E. Tuaillon // J Clin Microbiol. - 2012. - Vol. 50, N 5.-P. 1711-1717.

117. Ruhwald, M. Biomarkers of latent ТВ infection / M. Ruhwald, P. Ravn // Expert Rev Respir Med. - 2009. - Vol. 3, N 4. - P. 387-401.

118. Ruhwald, M. CXCL10/IP-10 release is induced by incubation of whole blood from tuberculosis patients with ESAT-6, CFP10 and TB7.7 / M. Ruhwald, M. Bjerregaard-Andersen, P. Rabna, K. Kofoed, J. Eugen-Olsen, P. Ravn // Microbes Infect. - 2007. - Vol. 9, N7.-P. 806-812.

119. Ruhwald, M. Evaluating the potential of IP-10 and MCP-2 as biomarkers for the diagnosis of tuberculosis / M. Ruhwald, T. Bodmer, C. Maier, M. Jepsen, M.B. Haaland, J. Eugen-Olsen, P. Ravn, TBNET // Eur Respir J. - 2008. - Vol. 32, N 6. - P. 1607-1615.

120. Ruhwald, M. Improving T-cell assays for the diagnosis of latent ТВ infection: potential of a diagnostic test based on IP-10 [Электронный ресурс] / M. Ruhwald, J. Petersen, K. Kofoed, H. Nakaoka, L.E. Cuevas, L. Lawson, S.B. Squire, J. Eugen-Olsen, P. Ravn // PLoS One. - 2008. - Vol. 3, N 8. -http://www.plosone.org/article/info%3A doi%2F 10.1371%2Fjournal.pone.0002858.

121. Ruhwald, M. IP-10 release assays in the diagnosis of tuberculosis infection: current status and future directions / M. Ruhwald , M.G. Aabye , P. Ravn // Expert Rev. Mol. Diagn. .-2012,-Vol. 12, N2.-P. 175-187.

122. Sacurai, A. Neopterin: isolation from human urine / A.Sacurai, M.Goto/ J.Biochem. - 1967.-Vol.61.-P. 142-145.

123. Sargentini, V. Cytometric detection of antigen-specific IFN-gamma/IL-2 secreting cells in the diagnosis of tuberculosis [Электронный ресурс] / V. Sargentini, S. Mariotti, S. Carrara, M.C. Gagliardi, R. Teloni, D. Goletti, R. Nisini // BMC Infect Dis. - 2009. - Vol. 9, N 99. - Режим доступа: http://www.biomedcentral.eom/1471-2334/9/99.

124. Shaw, A. C. Serum C-reactive protein and neopterin concentrations in patients with viral or bacterial infection / A. C. Shaw //J Clin Pathol. - 1991. - Vol. 44. - P. 596-599.

125. Siddiqi, К. Clinical diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis in low-income countries: the current evidence / K. Siddiqi , M.L. Lambert , J. Walley // Lancet Infect Dis. - 2003. - Vol.3, N 5. - P. 288-296.

126. Singh, S. Poor performance of serological tests in the diagnosis of pulmonary tuberculosis: evidence from a contact tracing field study [Электронный ресурс] / S.Singh, J.Singh, S.Kumar, K.Gopinath, V.Balooni, N.Singh, K.Mani // PLoS One. - 2012. - Vol. 7, N 7. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3393741.

127. StatSoft, Inc. Электронный учебник по статистике. StatSoft. WEB [Электронный ресурс]. - М. - 2012. - Режим доступа: http://www.statsoft.ru/home/textbook/ default.htm.

128. Steingart, K.R. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis / K.R.Steingart, M. Henry, S. Laal, P.C. Hopewell, A. Ramsay, D. Menzies, J. Cunningham, K. Weldingh, M. Pai // Thorax. -2007.-Vol.62, N 10.-P. 911-918.

129. Steingart, K.R. Commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: a systematic review [Электронный ресурс] /K.R. Steingart, M. Henry, S. Laal, P.C. Hopewell, A. Ramsay, D. Menzies, J. Cunningham,K. Weldingh, M. Pai // PLoS Med. - 2007. - Vol.4, N 6. - http://www.plosmedicine.org/article/ info%3Adoi%2F 10.137l%2Fjournal.pmed.0040202. - Дача обращения: 14.09.13. -Загл. с экрана.

130. Steingart, K.R. Commercial serological tests for the diagnosis of active pulmonary and extrapulmonary tuberculosis: an updated systematic review and meta-analysis [Электронный ресурс] / K.R. Steingart, L.L. Flores, N. Dendukuri, I. Schiller, S. Laal, A. Ramsay, P.C. Hopewell, M. Pai // PLoS Med. - 2011. - Vol.8, N 8. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3153457.

131. Steingart, K.R. Serological tests for the diagnosis of active tuberculosis: relevance for India / K. R. Steingart, A. Ramsay, D.W. Dowdy, M. Pai // Indian J Med Res. - 2012. -Vol.135, N 5.- P.695-702.

132. Steingart, K.R. Sputum processing methods to improve the sensitivity of smear microscopy for tuberculosis: a systematic review / K.R. Steingart, V. Ng, M. Henry, P.C.

Hopewell, A. Ramsay, J. Cunningham, R. Urbanezik, M.D. Perkins, M.A. Aziz, M. Pai // Lancet Infect Dis. -2006 . - Vol.6, N 10. - P.664-74.

133. Steingart, K.R. Performance of purified antigens for serodiagnosis of pulmonary tuberculosis: a meta-analysis / K.R. Steingart, N. Dendukuri, M. Henry, I. Schiller, P. Nahid, P.C. Hopewell, A. Ramsay, M. Pai, S. Laal // Clin Vaccine Immunol. - 2009. -Vol. 16, N2.-P. 260-276.

134. Strieter, R.M. Cytokines in innate host defense in the lung / R.M. Strieter, J.A. Belperio, M.P. Keane // J Clin Invest.-2002 -Vol. 109, N 6 - P. 699-705.

135. Sutherland, J.S. Production of TNF-alpha, IL-12(p40) and IL-17 can discriminate between active ТВ disease and latent infection in a West African cohort [Электронный ресурс] / J.S. Sutherland, B.C. de Jong , D.J. Jeffries, I.M. Adetifa, M.O. Ota // PLoS One. - 2010. - Vol. 5, N 8. - Режим доступа: http://www.plosone.org/article/info%3A doi%2F 10.137 l%2Fjournal.pone.0012365.

136. Toossi, Z. Defective interleukin 2 production and responsiveness in human pulmonary tuberculosis / Z. Toossi, M.E. Kleinhenz, J.J. Ellner // J Exp Med. - 1986. -Vol. 163, N 5.-P. 1162-1172.

137. Turgut, T. Serum interleukin-2 and neopterin levels as useful markers for treatment of active pulmonary tuberculosis / T. Turgut, H. Akbulut, F. Deveci, Kacar, M.H. Muz // Tohoku J. Exp. Med. - 2006. - Vol. 209, N 4. - P. 321-328.

138. Wallis, R.S. Biomarkers and diagnostics for tuberculosis: progress, needs, and translation into practice / R.S. Wallis, M. Pai, D. Menzies, T Mark Doherty, G. Walzl, M. D Perkins, A. Zumla // Lancet. - 2010. - Vol.375, N 9729. - P. 1920-1937.

139. Walzl, G. Immunological biomarkers of tuberculosis / G. Walzl, K. Ronacher, W. Hanekom, T.J. Scriba, A. Zumla // Nat Rev Immunol. - 2011. - Vol. 11, N 5. - P.343-354.

140. Wang, S. Evaluation of the diagnostic potential of IP-10 and IL-2 as biomarkers for the diagnosis of active and latent tuberculosis in a BCG-vaccinated population [Электронный ресурс] / S. Wang, N. Diao, C. Lu, J. Wu, Y. Gao, J. Chen, Z. Zhou, H. Huang, L. Shao, J. Jin, X. Weng, Y. Zhang, W. Zhang // PLoS ONE. - 2012. - Vol.7, N 12. - Режим доступа: http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F 10.1371 %2Fjoumal.pone.0051338.

141. Weldingh, K.Assessing the sérodiagnostic potential of 35 Mycobacterium tuberculosis proteins and identification of four novel serological antigens / K. Weldingh, I. Rosenkrands, L.M. Okkels, T.M. Doherty, P. Andersen // J Clin Microbiol. - 2005. -Vol.43, N l.-P. 57-65.

142. Whittaker, E. Is IP-10 a better biomarker foractive and latent tuberculosis in children than IFNgamma? [Электронный ресурс] / E. Whittaker, A. Gordon, B. Kampmann // PLoS One. - 2008. - Vol. 3, N 12. - Режим доступа: http://www.plosone.org/article/ info%3 Adoi%2F 10.1371%2Fjournal.pone.0003901.

143. WHO Global Tuberculosis Control: Epidemiology, Strategy, Financing, WHO report [Электронный ресурс] - 2012. - Режим доступа: http://www.who.int/tb/publications/ global_report/en.

144. Wu, X. Comparision of antibody responses to seventeen antigens from Mycobacterium tuberculosis / X. Wu, Y. Yang, J. Zhang, B. Li, Y. Liang, C. Zhang, M. Dong // Clinica Chim Acta. - 2010. - Vol. 411, Issues 19-20. - P. 1520-1528.

145. Wu, X. Humoral immune responses against the Mycobacterium tuberculosis 38-kilodalton, MTB48, and CFP-10/ESAT-6 antigens in tuberculosis / X. Wu, Y. Yang, J. Zhang, B. Li, Y. Liang, C. Zhang, M. Dong, H. Cheng, J. He // Clin Vaccine Immunol. -2010.-Vol. 17, N3.-P. 372-375.

146. Xu, J.N. Serodiagnosis efficacy and immunogenicity of the fusion protein of Mycobacterium tuberculosis composed of the 10-kilodalton culture filtrate protein, ESAT-6, and the extracellular domain fragment of PPE68 / J.N. Xu, J.P. Chen, D.L. Chen // Clin Vaccine Immunol.-2012.-Vol. 19, N4.-P. 536-544.

147. Zhu, C. Evaluation of the clinical value of ELISA based on MPT64 antibody ap-tamer for serological diagnosis of pulmonary tuberculosis [Электронный ресурс] / С Zhu, J. Liu, Y. Ling, H. Yang, Z. Liu, R. Zheng, L. Qin, Z. Hu // BMC Infect Dis. - 2012. - Vol. 12 : 96. - Режим доступа: http://www.biomedcentral.com/1471-2334/12/96.

148. Zu Higa, J Cellular and humoral mechanisms involved in the control of tuberculosis [Электронный ресурс] / J. ZuCiga, D. Torres-Garcfa, T. Santos-Mendoza, T.S. Rodriguez-Reyna, J. Granados, E.J. Yunis // Clin Dev Immunol. - 2012. - Режим доступа: http://www.hindawi.com/journals/cdi/2012/193923.

149. Zweig, H. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: a fundamental evaluation tool in clinical medicine / M.H. Zweig, G. Campbell // Clin Chem. - 1993. - Vol.39, №4. -P. 561-577.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1- Результаты мультиплексного анализа, пг/мл

Показатель, Больные ТБ (п=54) Контактные по ТБ (п=47) Здоровые доноры (п=43)

Ме [01^3] 1шп - шах Ме [СЛ^З] гшп — тах Ме [01^3] гшп - тах

ЕОБ МЬ 113,9 [54,9; 174,31 6,8-709,8 103,6 [60,2; 158,51 12,6-548,5 111,8 [61,2; 181,6] 10,9-369,1

АС 89,5 [51,0; 140,21 3,0-264,4 88,7 [57,5; 165,51 12,5-638,0 100,5 [55,5; 188,0] 6,9-389,1

Ав-МЬ -16,3 [-39,3;-0,51 -617,4-32,4 -8,5 [-29,0; 3,2] -190,5- 126,3 -3,9 [-35,6; 10,1] -105,1 - 147,0

М1Р-1|3 МЬ 571,3 [276,8; 915,4] 64,4-4737,0 533,5 [353,1; 1170,0] 68,4- 11972,0 816,6 [323,2; 1512,0] 66,1 - 13766,0

Ай 1316,0 [572,6; 2135,0] 40,5- 12414,0 1354,0 [668,9; 2376,0] 180,510000,0 2340,0 [1134,0; 4860,0] 344,0-36310,0

АС-№Ь 381,3 [37,4; 1460,0] -1217,011552,0 548,2 [1,2; 1276,0] -7730,07755,0 1453,0 [412,3; 3613,0] -1265,030671,0

бСШОЪ 3313,0 [1614,0; 8370,0] 378,232900,0 2548,0 [855,5; 14156,0] 64,7-40588,0 3553,0 [240,0; 13126,0] 29,4- 154728,0

Ай 3356,0 [1266,0; 6386,0] 531,028418,0 2110,0 [907,4; 9469,0] 140,1 -30048,0 4808,0 [1247,0; 11816,0] 26,8-51123,0

Ав-МЬ -277,1 [-2113,0; 677,4] -11102,010575,0 -136,2 [-2098,0; 518,8] -29738,012273,0 -416,4 [-1956,0; 2279,0] -142912,034389,0

УЕОР NIL 154,5 [3,0; 280,8] 3,0-670,4 59,3 [3,0; 236,3] 0,0-736,5 80,8 [55,5; 134,4] 3,0-310,7

Ав 81,2 [3,0; 238,1] 0,0-689,3 3,0 Г3,0; 230,41 0,0-629,1 69,3 [48,8; 113,6] 3,0-234,1

Ав-МЬ -16,8 -436,1 -393,2 0,0 -162,6-97,3 -10,6 -238,9-73,4

[-105,9; 0,0] [-43,7; 0,0] [-45,1; 7,9]

TGFa NIL 12,6 [9,4; 18,4] 2,9-147,4 10,8 [7,8; 12,9] 0,1 -22,7 5,2 [3,6; 7,51 2,0-24,5

AG 16,1 [12,6; 20,6] 3,6-149,0 12,1 [8,3; 15,1] 4,1 -26,0 7,1 [4,0; 10,21 1,3-30,1

AG-NIL 2,4 [0,5; 5,4] -7,9-13,0 2,1 [-0,8; 4,4] -3,7-10,3 1,2 [-0,1; 2,8] -2,6-7,6

IL-la NIL 20,0 [3,0; 86,9] 0,0-1178,0 39,6 [3,0; 93,4] 2,6-802,8 - -

AG 47,0 [3,0; 130,7] 1,0- 1570,0 19,7 [3,0; 167,5] 2,2-2463,0 - -

AG-NIL 7,1 [-0,3; 75,0] -186,6- 578,6 0,0 [-17,9; 29,4] -180,1 - 1784,0 - -

IFNa2 NIL 3,0 [3,0; 9,5] 0,0-358,5 3,0 [3,0; 10,11 0,0-59,3 - -

AG 5,3 [3,0; 10,3] 1,6-293,6 3,0 [3,0; 10,11 0,0-40,4 - -

AG-NIL 0,0 [0,0; 2,3] -64,9-17,6 0,0 r-3,7; 0,01 -18,8-15,4 - -

TNFa NIL 82,1 [41,3; 181,71 6,3-1418,0 74,3 [29,3; 174,0] 4,5-1671,0 162,2 [40,8; 522,9] 6,7-7701,0

AG 144,8 [59,8; 301,7] 10,5- 1879,0 101,9 [41,1; 195,8] 12,0-10924,0 179,4 [84,0; 450,9] 14,7-9013,0

AG-NIL 52,6 [-5,6; 177,3] -503,7-644,2 17,0 [-13,2; 45,31 -1344,010701,0 10,9 [124,1; 185,2] -5299,0 -8490,0

sIL-2Ra NIL 18,5 [3,0; 101,3] 0,0-543,2 3,0 [3,0; 13,7] 0,0-129,1 280,8 [207,7; 404,7] 59,8 -775,0

AG 29,9 [3,0; 103,7] 0,0-505,3 3,0 [3,0; 15,3] 0,0-64,1 318,6 [180,1; 437,7] 59,8-662,1

AG-NIL 2,6 ГОД 16,81 -43,4- 106,4 0,0 [0,0; 3,6] -129,1 -27,3 -7,6 [-37,1; 54,31 -123,9- 176,6

IL-2 NIL 3,0 [3,0; 3,3] 0,0-96,5 3,0 [3,0; 3,01 0,0 - 277,2 3,0 [3,0; 3,01 2,5-3,0

AG 59,8 [16,2; 200,2] 0,0-2259,0 42,4 [3,0; 132,9] 0,7-935,1 3,0 [3,0; 3,01 0,4-55,4

AG-NIL 56,8 [12,2; 197,21 -3,0-2256,0 39,4 [0,0; 130,2] -2,3 - 657,9 0,0 [0,0; 0,0] -2,6-52,9

IL-4 NIL 3,0 [3,0; 8,71 0,0-173,8 3,0 [3,0; 10,1] 0,0-3450,0 3,0 [3,0; 3,0] 3,0-18,3

AG 3,0 Г3,0; 17,41 0,0-162,0 3,0 [3,0; 10,11 0,0-3626,0 3,0 [3,0; 3,01 3,0-25,8

AG-NIL 0,0 [-0,6; 5,71 -91,3-120,6 0,0 [-1,0; 2,2] -55,1 - 176,4 0,0 [0,0; 0,0] -4,7-7,5

IL-6 NIL 560,7 [200,2; 1463,0] 0,0- 10000,0 449,0 [138,6; 1338,0] 3,0- 10000,0 1049,0 [184,8; 3097,0] 1,5- 12820,0

AG 959,8 [526,8; 2538,0] 3,0-10000,0 788,7 [357,7; 1596,0] 31,6-10100,0 2261,0 [559,4; 6302,0] 35,2-18613,0 1 > *

AG-NIL 372,8 [-5,6; 1209,0] -1823,09701,0 158,3 [-49,4; 669,7] -3372,09168,0 884,4 [0,0; 2521,0] -2669,0 -16074,0

1500 1000 -1 500

г га и.

е>

40' 20 0'

БЛ

КЛ

ЗЛ

17о

©О

20000 15000

5 Ю000'

<

)

— 5000

о

о <

со

00

°ос оо°

БЛ

КЛ

ЗЛ

_ 36%

©О"©

Р30

е 25 —' 20 5 15 ^ 10Х

- 10Т

^

г

О 5- '

Г

и. 0'-

6,4

\------®---------------

БЛ КЛ ЗЛ

4%

>о

60 50 40

-О

О 30-

- 20

^ 20 О.

£ 15

8 Ю+-

" 1 о-

-2а

?о0с

о2-

БЛ

КЛ

ЗЛ

8%

48°(с| О

4%

В

1500

56%

40 30 20 10

141 ОТ

2 3-1

3 2^

11 •

0

®©°Г®® >

—i—

БЛ

—|—

КЛ

ЗЛ

с

о ю «

3'

о

о

со 2' со

О-■

О со о

й-—-

ООО

БЛ

КЛ

ЗЛ

о*

ФО

13%

'О©