Полиморфные молекулярно-генетические маркеры и определение их аллельного статуса в сложных смесях молекул нуклеиновых кислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, доктор биологических наук Ребриков, Денис Владимирович

• Ребриков, Денис Владимирович
• доктор биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации доктор биологических наук Ребриков, Денис Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Методы сравнения двух образцов ДНК

1.2. Методы ПЦР «в реальном времени»

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование возможностей метода вычитающей 70 гибридизации нуклеиновых кислот.

3.2. Создание метода определения однонуклеотидных 80 полиморфизмов с использованием термостабильной дуплекс-специфичной нуклеазы.

3.3. Усовершенствование технологии детекции однонуклеотидных полиморфизмов на основе аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием ПЦР «в реальном времени» с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными пробами или праймерами.

3.4. Разработка алгоритма проведения исследования и анализа 112 результатов ПЦР «в реальном времени», повышающего точность и воспроизводимость метода.

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Полиморфные молекулярно-генетические маркеры и определение их аллельного статуса в сложных смесях молекул нуклеиновых кислот»

Актуальность темы. Одной из актуальных задач современной молекулярной биологии является сравнение двух близких по составу образцов нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) из одного организма или разных организмов внутри одного вида с целью обнаружения различий между ними. Различия могут заключаться как в наличии (отсутствии) молекул нуклеиновых кислот с определенной последовательностью в одном из образцов, так и в количественных (концентрационных) вариациях последовательностей, присутствующих в обоих сравниваемых образцах.

Выявление индивидуальных или видоспецифичных генетических особенностей является комплексной технологической задачей, осложненной тем, что особенности эти могут составлять лишь малую часть генетического материала сравниваемых организмов (вплоть до одного нуклеотида). Поэтому подходы к выполнению такого рода исследований, чаще всего, базируются на методе полимеразной цепной реакции, позволяющем нарабатывать молекулы ДНК определенной последовательности начиная с минимальных количеств стартового материала.

Так, различия геномов близкородственных штаммов бактерий представляют большой интерес для исследователей, поскольку могут определять наличие у данного штамма уникальных черт (патогенности, повышенной вирулентности, устойчивости к антибиотикам и т.д.). Благодаря появлению полных последовательностей геномов близкородственных бактериальных штаммов стало возможным определение эффективности прямого сравнения бактериальных геномов методами вычитающей гибридизации.

Исследование полиморфных участков генома человека, ассоциированных с развитием заболеваний или определенными фенотипическими особенностями, требует создания высокопроизводительных и недорогих методов определения аллельного состояния этих регионов. Появление оборудования, позволяющего регистрировать накопление ДНК в ходе полимеразной цепной реакции, создало предпосылки для развития простых и высокопроизводительных методов генотипирования при помощи ПЦР.

Вместе с тем, появившаяся возможность снятия кинетики накопления продукта ПЦР в ходе реакции позволяет с высокой точностью оценивать количество определенных молекул ДНК в исследуемом образце, что дало толчок к разработке подходов к измерению концентрации отдельных нуклеиновых кислот при помощи полимеразной цепной реакции с регистрацией результатов «в реальном времени».

В связи с вышеизложенным, особенно актуальным является создание новых методов определения генетических различий трех типов: 1) методов поиска последовательностей нуклеиновых кислот, присутствующих лишь в одном из сравниваемых образцов (дифференциально представленные последовательности), 2) высокопроизводительных методов детекции определенных генетических полиморфизмов и 3) методов количественного определения отдельных последовательностей ДНК или РНК при помощи полимеразной цепной реакции с регистрацией результатов «в реальном времени».

Цель работы. Целью данной работы являлось создание новых методов выявления уникальных и полиморфных последовательностей в сложных смесях молекул нуклеиновых кислот, а именно: 1) методов сравнения сложных образцов нуклеиновых кислот для поиска дифференциально представленных последовательностей, 2) методов детекции определенных генетических полиморфизмов и 3) методов количественного определения отдельных нуклеиновых кислот при помощи полимеразной цепной реакции «в реальном времени».

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать возможности применения метода вычитающей гибридизации нуклеиновых кислот при а) поиске последовательностей, отличающих близкородственные бактериальные геномы и б) поиске транскриптов с различной представленностью в сравниваемых образцах.

2. Создать метод определения однонуклеотидных полиморфизмов с использованием нового фермента с уникальными свойствами — термостабильной дуплекс-специфичной нуклеазы.

3. Усовершенствовать технологию детекции однонуклеотидных полиморфизмов на основе аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием ПЦР «в реальном времени» с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными пробами или праймерами.

4. Разработать алгоритм проведения исследования и анализа результатов ПЦР «в реальном времени», повышающий точность и воспроизводимость количественного ПЦР-анализа в сравнении с существующими методами и оценить точность метода при проведении количественного исследования.

Научная новизна работы. Впервые определена полнота и эффективность метода гибридизационного сравнения геномов путем прямого сопоставления результатов shotgun секвенирования близкородственных прокариотических геномов (на 99%) и результатов их вычитающей гибридизации. На примере сравнения эукариотических транскриптомов продемонстрирована эффективность метода вычитающей гибридизации с использованием этапа зеркально-ориентированной селекции. Впервые обнаружен фермент с уникальными свойствами: термостабильная нуклеаза, неспецифичная к последовательности нуклеотидов, расщепляющая двуцепочечные ДНК и ДНК цепь в ДНК/РНК гетеродуплексах, но не действующая на одноцепочечные молекулы ДНК и любые РНК. Клонирован ген фермента, определена его последовательность, охарактеризована субстратная специфичность и физико-химические свойства нуклеазы. На основе уникальных свойств фермента разработана новая схема определения однонуклеотидных полиморфизмов при помощи коротких флуоресцентно-меченых гибридизационных проб. Усовершенствована технология детекции однонуклеотидных полиморфизмов на основе аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием ПЦР «в реальном времени» с флуоресцентно-мечеными олигонуклеотидными пробами или праймерами. Впервые продемонстрирована возможность эффективного различения аллелей при помощи нескольких флуоресцентно-меченых аллель-специфичных праймеров в одной реакционной смеси. Создан принципиально новый алгоритм проведения исследования и анализа результатов ПЦР «в реальном времени», основанный на считывании уровня флуоресценции дважды в течение одного цикла реакции. Создана математическая модель обработки полученных результатов. Впервые установлена точность метода ПЦР «в реальном времени», как инструмента количественного исследования на примере определения процентного содержания генетически модифицированных ингредиентов в пищевых продуктах и кормах. Показано, что точность относительного количественного исследования для метода ПЦР «в реальном времени» составляет около 30% вне зависимости от марки используемого оборудования и наборов реагентов.

Практическая ценность работы. Проведено обследование различных групп населения, включая выборки по региону проживания и национальности (16 популяций), выборки с определенными видами заболеваний, группы по профессиональной принадлежности. Впервые проведено обследование 7 популяций россиян на полиморфизм генов, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ и развитием СПИД. Для 4 российских популяций впервые определена частота генотипа по полиморфному маркеру С13910Т, ассоциированному с первичной гиполактазией. С целью количественной оценки корреляций генотипа и фенотипа (венозный тромбоз) проведено обследование выборки пациентов ФГУ Российский Кардиологический Научно-Производственный Комплекс Росздрава по ряду полиморфизмов, ассоциированных с заболеваниями сердечно-сосудистой системы. Впервые исследовано распределение частот аллелей генов, ассоциированных с физической активностью на выборках профессиональных спортсменов в различных видах спорта, в результате чего обнаружены корреляции определенных генотипов и реакции организма на физические нагрузки разного профиля. Установлен уровень точности метода ПЦР как инструмента для количественного определения примеси генетически модифицированного материала в пищевых продуктах.

Реализация и внедрение результатов работы. На основе усовершенствованной методики вычитающей гибридизации нуклеиновых кислот разработаны и выпускаются наборы реагентов для сравнения сложных смесей ДНК и кДНК (ЗАО «Евроген»). Разработаны и внедрены в серийное производство (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») тест-системы для определения диагностически значимых полиморфизмов в геноме человека методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) с использованием ПЦР «в реальном времени» (всего более 60 тест-систем, список разработанных тест-систем приведен в Приложении 1). Алгоритм анализа результатов ПЦР «в реальном времени» реализован в составе программного обеспечения для трех моделей серийных отечественных детектирующих ДНК-амплификаторов. Разработанные методики апробированы и применяются в Федеральном государственном учреждении «Лечебно-реабилитационный центр» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Росздрава, (г. Москва), Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (г. Москва), Институте общей генетики РАН (г. Москва), Научном центре акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН (г. Москва), Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова (г. Москва), Государственном учреждении научно-исследовательский институт питания РАМН (г. Москва), ряде областных и городских СЭС МЗСР РФ, широком спектре коммерческих диагностических лабораторий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Установлена полнота и эффективность метода гибридизационного сравнения геномов путем прямого сопоставления результатов секвенирования близкородственных прокариотических геномов (на 99%) и результатов их вычитающей гибридизации. Установлена эффективность метода гибридизационного сравнения эукариотических транскриптомов.

2. Предложен и реализован принципиально новый метод определения аллельного состояния полиморфных локусов, основанный на использовании термостабильной дуплекс-специфичной нуклеазы с уникальными свойствами.

3. Предложен и реализован новый алгоритм проведения исследования и анализа результатов ПЦР «в реальном времени», основанный на двойном считывании уровня флуоресценции при разных температурах в ходе одного цикла реакции, повышающий точность исследования в 3 раза в сравнении с традиционно применяемым подходом.

4. Предложена и реализована технология детекции однонуклеотидных полиморфизмов с использованием нескольких флуоресцентно-меченых аллель-специфичных праймеров в одной реакции за счет использования дополнительных кросс-мутаций, что повышает эффективность дифференцировки аллелей более чем в 2 раза.

5. Установлена точность метода ПЦР «в реальном времени» при проведении количественного исследования на примере определения процентного содержания генетически модифицированных ингредиентов (ГМИ) в пищевых продуктах и кормах.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на более чем 20 отечественных и 8 международных конференциях, в том числе: съездах общества биотехнологов России им. Ю.А.Овчинникова (Москва, Россия, 2003-2005), симпозиуме «Молекулярная диагностика» Н-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, Россия, 2005), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, Россия, 2006), конференции Human Genome Meeting (Хельсинки, Финляндия, 2006), VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, Россия, 2006), 21-й международной конференции Европейской Федерации Иммуногенетиков (Барселона, Испания, 2007), XI Всероссийском Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, Россия, 2007), 6-ой ежегодной конференции «Цитокины и воспаление» (Орландо, США, 2008) и многочисленных приглашенных научных семинарах в научно-исследовательских учреждениях в России и за рубежом.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, включая методическое пособие издательства Колд Спринг Харбор и методическое пособие по анализу бактериальных патогенов серии «Научные книги НАТО». В том числе 18 работ в журналах, рекомендованных ВАК.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в разработке дизайна экспериментов, отработке методик и обобщении полученных результатов. Автор руководил работами по приложению созданных методик на практике. Личный вклад автора в данном исследовании составляет около 80%.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БСА бычий сывороточный альбумин

ВИЧ вирус иммунодефицита человека

ДЦ дифференциальный дисплей

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПП дифференциально представленная последовательность

ДТТ дитиотрейтол ед. акт. единица активности

ИКП инвертированный концевой повтор кДНК комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота мРНК матричная рибонуклеиновая кислота

ОТ-ПЦР обратная транскрипция - ПЦР п.н. пара нуклеотидов

ПЦР полимеразная цепная реакция рРНК рибосомальная рибонуклеиновая кислота

РНК рибонуклеиновая кислота

СПИД синдром приобретенного иммунодефицита т.п.н. тысяча пар нуклеотидов

Трис трис[гидроксиметил]аминометан тРНК транспортная рибонуклеиновая кислота

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота, динатриевая соль

АТР рибоаденозинтрифосфат

CCR2 рецептор класса СС хемокиновых-2

CCR5 рецептор класса СС хемокиновых-5

Ct cycle threshold (пороговый цикл). На графике накопления ДНК: место пересечения кривой накопления продукта реакции и пороговой линии (threshold) dATP дезоксирибоаденозинтрифосфат dNTP смесь дезоксириботрифосфатов аденозина, тимидина, гуанозина и цитидина

IPTG изопропил-тио-Р-Б-галактопиранозид

MOS зеркально ориентированная селекция

ORF открытая рамка считывания

PCR полимеразная цепная реакция qPCR количественная полимеразная цепная реакция

SDF1 фактор клеток стромы-1, лиганд для рецептора класса СХС хемокинновых-4 (CXCR4)

SSH супрессионная вычитающая гибридизация

TEMED N,N,N' ,N' ,-тетраметил этилен диамин

UNAIDS программа Организации объединенных наций по ВИЧ/СПИД

Заключение диссертации по теме «Генетика», Ребриков, Денис Владимирович

выводы

1. Впервые показано, что при поиске последовательностей, отличающих близкородственные геномы, эффективность обнаружения дифференциально представленных последовательностей методом вычитающей гибридизации превышает эффективность метода сравнения «полных» последовательностей геномов (с известными 99% последовательности генома). При сравнении близкородственных бактериальных геномов процент ложнодифференциальных локусов в случае биоинформационного сравнения составил 12%, а метод вычитающей гибридизации дал только истинно дифференциальные последовательности. Использование метода зеркально-ориентированной селекции при поиске дифференциально представленных транскриптов повышает процент дифференциальных клонов в результирующей библиотеке на порядок.

2. Клонирован ген термостабильной дуплекс-специфичной нуклеазы камчатского краба и определены свойства фермента. Показано, что фермент является неспецифичной нуклеазой, расщепляющей двуцепочечные ДНК и ДНК цепь в ДНК/РНК гетеродуплексах, но не действующей на одноцепочечные молекулы ДНК. Температурный оптимум работы фермента находится в интервале 55 — 65°С. На основе уникальных свойств фермента разработан метод определения однонуклеотидных полиморфизмов. Новый подход позволяет сократить время исследования с использованием обычных (не детектирующих) амплификаторов до двух раз и, за счет отсутствия стадии электрофореза, полностью автоматизировать процесс.

3. Усовершенствована технология детекции однонуклеотидных полиморфизмов на основе аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием ПЦР «в реальном времени». Впервые показана возможность эффективного использования нескольких флуоресцентно-меченых аллель-специфичных праймеров в одной реакции за счет использования дополнительных кросс-мутаций. Предложена методика исключения ложноположительных результатов при использовании аллель-специфичных праймеров за счет использования дополнительной флуоресцентно-меченой гибридизаццонной пробы.

4. Разработан принципиально новый метод повышения точности ПЦР «в реальном времени» за счет нормировки флуоресцентного сигнала с использованием двухтемпературного чтения. Доказано преимущество данного подхода перед существующими методиками обработки данных ПЦР «в реальном времени».

5. Установленная точность метода ПЦР «в реальном времени», как инструмента относительного количественного определения, позволяет уточнить существующие нормативные требования по измерению процентного содержания генетически модифицированных ингредиентов в пищевых продуктах и кормах.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубочайшую благодарность всем своим учителям и в особенности Льву Абрамовичу Остерману, человеку, определившему методическую направленность научной деятельности автора.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Ребриков, Денис Владимирович, 2008 год

1. Козлов А.И., Балановская Е.В., Нурбаев С.Д., Балановский О.П. Геногеография пер-1вич-,ной гиполактазии в популяциях Старого Света // Генетика. 1998. Т. 34, 4. С. 551-561.

2. Козлов А.И. Гиполактазия: распространенность, диагностика, врачебная тактика. М.: АркгАн-С, 1996. 70 с.

3. Abarzua, P., LoSardo, J.E., Gubler, M.L., and Neri, A. (1995) Microinjection of monoclonal antibody PAb421into human SW480 colorectal carcinoma cells restores the transcription activation function to mutant p53. Cancer Res. 55, 3490-3494.

4. Akopyants NS, Fradkov A, Diatchenko L, Hill JE, Siebert PD, Lukyanov SA, Sverdlov ED, Berg DE., (1998) PCR-based subtractive hybridization and differences in gene content among strains of Helicobacter pylori. ProcNatl Acad Sci U S A. 95, 13108-13113.

5. Auricchio S., Rubino A., Murset G. Intestinal glycosidase activities in the human embryo, fetus and newborn // Pediatrics. 1965. 35. P. 944-948.

6. Ausubel F.M. (1992) Short Protocols in Molecular Biology. N.Y. Harvard Medical School.

7. Bautz E. K. and Reilly E. (1966) Gene-specific messenger RNA: isolation by deletion method. Science, 151, 328-330.

8. Buning C., Genschel J., Jurga J., Fiedler Т., Voderholzer W., Fiedler E.M., Worm M., Weltrich R., Lochs H., Schmidt H., and Ockenga J., Introducing genetic testing for adult-type hypolactasia // Digestion. 2005. 71, 4. P. 245-250.

9. Chang Y, Cesarman E, Pessin MS, Lee F, Culpepper J, Knowles DM, Moore PS., (1994) Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science. 266, 1865-1869.

10. Chomczynski, P., and Sacchi, N. (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chlorophorm extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159.

11. Coche Th. and Dewer M. (1994) Reducing bias in cDNA sequence representation by molecular selection. Nucl. Acids Res., 22, 4545-4546.

12. Coral M. (1986) Isolation and characterisation of complementary cDNA clones for genes overexpressed in chemically induced rat hepatomas. Cancer Res., 46, 5119-5124.

13. Davis RW, Thomas M, Cameron J, St John TP, Scherer S, and Padgett RA. (1980) Rapid DNA isolations for enzymatic and hybridization analysis. Methods Enzymol, 65, 404-411.

14. Debouck, C. (1995) Curr. Opinion Biotechnol., 6, 597-599.

15. Diatchenko,L., Lukyanov,S., Lau,Y.F.C. and Siebert,P.D. (1999) Suppression subtractive hybridization: a versatile method for identifying differentially expressed genes. Meth. Enzymol., 303, 349-380.

16. Donnison IS, Siroky J, Vyskot B, Saedler H, Grant SR., (1996) Isolation of Y chromosome-specific sequences from Silene latifolia and mapping of male sex-determining genes using representational difference analysis. Genetics. 144, 1893-901.

17. Duguid J. R. and Dinauer M.C. (1990) Library subtraction of in vitro cDNA libraries to identify differentially expressed genes in scrapie infection. Nucl. Acids Res., 18,2789-2792.

18. Duguid J. R., Rohwer R. G. and Seed B. (1988) Isolation of cDNAs of scrapie-modulated RNAs by subtractive hybridization of a cDNA library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5738-5742.

19. Enattah N.S., Sahi Т., Savilahti E., Terwilliger J.D., Peltonen L., Jarvela I. Identification of a variant associated with adult-type hypolactasia // Nat. Genet. 2002. 30, 2. P. 233-237.

20. Enbom M., (2001) Multiple sclerosis and Kaposi's sarcoma—chronic diseases associated with new human herpesviruses? Scand J Infect Dis. 33:648-658.

21. Endoh D, Cho КО, Tsukamoto K, Morimura T, Kon Y, Hayashi M. (2000) Application of representational difference analysis to genomic fragments of Marek's disease virus. J Clin Microbiol. 38, 4310-4.

22. Everts RE, Versteeg SA, Renier C, Vignaux F, Groot PC, Rothuizen J, van Oost В A. (2000) Isolation of DNA markers informative in purebred dog families by genomic representational difference analysis (gRDA). Mamm Genome. 11, 741-7.

23. Fauci AS. Host factors and the pathogenesis of HIV-induced disease. // Nature. 1996; 384(6609): 529-34.

24. Fiandaca M.J., Hyldig-Nielsen J.J., Gildea B.D., et al. (2001) Self-reporting PNA/DNA primers for PCR analysis. Genome Res. 11, 609-613.

25. Friedhoff, P., Meiss, G., Kolmes, В., Pieper, U., Gimadutdinow, O., Urbanke, C., and Pingoud, A. (1996) Kinetic analysis of the cleavage of natural and synthetic substrates by the Serratia nuclease. Eur. J. Biochem. 241, 572—580.

26. Fujisawa M, Hayashi K, Nishio T, Bando T, Okada S, Yamato KT, Fukuzawa H, Ohyama K. (2001) Isolation of X and Y Chromosome-Specific DNA Markers From a Liverwort, Marchantia polymorpha, by Representational Difference Analysis. Genetics. 159, 981-985.

27. Galau G., Klein W., Britten R. and Davidson E. (1977) Significance of rare mRNA sequences in liver. Arch. Biochem. Biophys., 179, 584-599.

28. Gastel J. and Sutter T. (1996) A control system for cDNA enrichment reactions. Biotechniques, 20, 870-875.

29. Gibbs, M. J., and G. F. Weiller. (1999) Evidence that a plant virus switched hosts to infect a vertebrate and then recombined with a vertebrate-infecting virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 8022-8027.

30. Gorbalenya, A. E., E. V. Koonin, and Y. I. Wolf. (1990) A new superfamily of putative NTP-binding domains encoded by genomes of small DNA and RNA viruses. FEBS Lett. 262, MS-MS.

31. Gorbalenya, AE, Koonin, EV (1993) Helicases: Amino acid sequence comparisons and structure-function relationship. Curr. Opin. Struct. Biol., 3,419-429

32. Gu W, Aguirre GD, Ray K., (1998) Detection of single-nucleotide polymorphism. Biotechniques. 24, 836-7.

33. Hampson I., Pope L., Cowling G., Dexter T. (1992) Chemical cross linking subtraction (CCLS): a new method for the generation of subtractive hybridisation probes. Nucl. Acids Res., 20, 2899.

34. Hanai, R., and J. C. Wang. (1993) The mechanism of sequence-specofoc DNA cleavage and strand transfer by ФХ174 gene A protein. J. Biol. Chem. 268, 23830-23836.

35. Нага Е., Kato Т., Nakada S., Sekiya S. and Oda K. (1991) Subtractive cDNA cloning using oligo(dT)3o-Latex and PCR: isolation of cDNA clones specific to undifferentiated human embryonal carcinoma cells. Nucleic Acids Res., 19, 7097-7104.

36. Harland RM. (1991) In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-95.

37. Hedrick S. M., Cohen, D. I., Nielsen E. L. and Davis M. M. (1984) Isolation of cDNA clones encoding T cell-specific membrane-associated proteins. Nature. 308,149-153.

38. Hesse H., Frommer W. B. and Willmitzer L. (1995) An improved method for generating subtracted cDNA libraries using phage lambda vectors. Nucl. Acids Res. 23, 3355-3356.

39. Ho, H.C. and Liao, Т.Н. (1999) Protein structure and gene cloning of Syncephalastrum racemosum nuclease. Biochem. J. 339, 261-267.

40. Но, H.C., Shiau, P.F., Liu, F.C., Chung, J.G., and Chen, L.Y. (1998) Purification, characterization and complete amino acid sequence of nuclease С1 from Cunninghamella echinulata var. echinulata. Eur. J. Biochem. 256, 112-118.

41. Hubank M. and Schatz D.G. (1994) Identifying differences in mRNA expression by representational difference analysis of cDNA. Nucleic Acids Res., 22, 5640-5648.

42. Ilyina, Т. V., and E. V. Koonin. (1992). Conserved sequence motifs in the initiator proteins for rolling circle DNA replication encoded by diverse replicons from eubacteria, eucaryotes and archaebacteria. Nucleic Acids Res. 20, 3279-3285.

43. Ivanova, N., and Belyavsky, A. (1995) Identification of differentially expressed genes by restriction endonuclease-based gene expression fingerprinting. Nucleic Acids Res., 23, 29542958.

44. Kato, K. (1996) RNA fingerprinting by molecular indexing. Nucleic Acids Res., 24, 394-395.

45. Ко M.S. (1990) An equalized cDNA library by the reassociation of short double-stranded cDNAs. Nucl. Acids. Res., 18, 5705-5711.

46. Kuklin A, Munson K, Gjerde D, Haefele R, Taylor P., (1997) Detection of single-nucleotide polymorphisms with the WAVE DNA fragment analysis system. Genet. Test; 1,201-206

47. Kunkel L., Monaco A. Middlesworth W., Ochs Hans D. and Latt S.A. (1985) Specific cloning of DNA fragments absent from the DNA of a male patient with an X chromosome deletion. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 4778-4782.

48. Kuokkanen M., Enattah N.S., Oksanen A., Savilahti E., Orpana A., Jarvela I. Transcriptional regulation of the lactase-phlorizin hydrolase gene by polymorphisms associated with adult-type hypolactasia // Gut. 2003. 52, 5. P. 647-652.

49. Lamar E. and Palmer E. (1984) Y-encoded, species-specific DNA in mice: evidence that the у chromosome exists in two polimorphic forms in inbred strains. Cell, 37, 171-177.

50. Laufs, J., I. Jupin, C. David, S. Schumacher, F. Heyraud-Nitchke, B. Gronenborn. (1995) Geminivirus replication: genetic and biochemical characterization of Rep protein function. Biochimie. 77, 765-773.

51. Li W.-B., Gruber C., Lin J., Lim R., Alessio J. and Jessee J. (1994) The isolation of differential expressed genes in fibroblast growth factor stimulated BC3HI Cells by subtractive hybridization. Biotechnique, 16, 722-729.

52. Liang, P., and Pardee, A. (1992) Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 257, 967-971.

53. Liang, P., and Pardee, A. (1995) Recent advances in differential display. Current Opinion Immunol., 7, 274-280.

54. Lin F, Yu YP, Woods J, Cieply K, Gooding B, Finkelstein P, Dhir R, Krill D, Becich MJ, Michalopoulos G, Finkelstein S, Luo JH., (2001) Myopodin, a synaptopodin homologue, is frequently deleted in invasive prostate cancers. Am J Pathol. 159, 1603-1612.

55. Liotta L. A. (1991) Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of possitive and negative regulation. Cell, 64, 327-336.

56. Lisitsyn N., Lisitsyn N. and Wigler M. (1993) Cloning the differences between two complex genomes. Science, 259, 946-951.

57. Luk'yanov S.A., Gurskaya N.G., Luk'yanov K.A., Tarabykin V.S., and Sverdlov E.D. (1994) Highly efficient subtractive hybridization of cDNA. Journal of Bioorganic Chemistry, 20, 386388.

58. Luo J.-H., Puc J.A. Solsberg E.D., Yao Y., Bruce J.N., Wright T.C., Becich M.J., and Parsons R. (1999) Differential subtraction chain, a method for identifying differences in genomic DNA and mRNA. Nucleic Acids Res. 27:el9.

59. Mankertz, A., J. Mankertz, K. Wolf, and H.-J. Buhk. (1998) Identification of a protein essential for replication of porcine circovirus. J. Gen. Virol. 79,381-384.

60. Matz M, Usman N, Shagin D, Bogdanova E, Lukyanov S. (1997) Ordered differential display: a simple method for systematic comparison of gene expression profiles. Nucleic Acids Res. 25, 2541-2542.

61. McClelland, M., Honeycutt, R., Mathieu-Daude, F., Vogt, Т., Welsh, J. (1997) Fingerprinting by arbitrarily primed PCR. Methods Mol. Biol., 85,13-24.

62. McClelland, M., Mathieu-Daude, F., and Welsh, J. (1995) RNA fingerprinting and differential display using arbitrarily primed PCR. Trends in Genet., 11, 242-246.

63. Meiss, G., Franke, I., Gimadutdinow, O., Urbanke, C., and Pingoud, A. (1998) Biochemical characterization of Anabaena sp. strain PCC 7120 non-specific nuclease NucA and its inhibitor NuiA. Eur. J. Biochem. 251, 924-934.

64. Meszaros M. and Morton D.B. (1996) Subtractive hybridization strategy using paramagnetic oligo(dT) beads and PCR. Biotechnique, 20,413-418.

65. Milner J., Cecchini E., Dominy P.J. (1995) A kinetic model for subtractive hybridization. Nucl. Acids Res., 23, 176-187.

66. Muller K, Heller H, Doerfler W., (2001) Foreign DNA integration. Genome-wide perturbations of methylation and transcription in the recipient genomes. J Biol Chem. 276, 14271-8.

67. Myers R.M. (1993) The Pluses of Subtraction, Science, 259, 942-943.

68. Navin A, Prekeris R, Lisitsyn NA, Sonti MM, Grieco DA, Narayanswami S, Lander ES, Simpson EM., (1996) Mouse Y-specific repeats isolated by whole chromosome representational difference analysis. Genomics. 36, 349-53.

69. Nishizawa T, Okamoto H, Konishi К, Yoshizawa H, Miyakawa Y, Mayumi M., (1997) A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. Biochem Biophys Res Commun. 241, 92-97.

70. Patanjali S.R., Parimoo S., and Weissman Sh.M. (1991) Construction of a uniform-abundance (normalized) cDNA library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 1943-1947.

71. Putilina Т., Smith S., Gentleman S. and Chader G. (1992) Rapid PCR-based construcion of specifically enriched libraries from small retina samples. Letter. Exp. Eye Res. 54, 825-826.

72. Rebagliati M., Weeks D., Harvey R. and Melton D. A. (1985) Identification and cloning of localized maternal RNAs from Xenopus Eggs. Cell, 42, 769-777.

73. Rivolta M.N. and Wilcox E. R. (1995) A novel and simple methodology to generate subtracted cDNA libraries. Nucl. Acids Res. 23, 2565-2566.

74. Robinson M., Simon M.I. (1991) Determining transcript number using the polymerase chain reaction: Pgk-2, mP2, and PGK-2 transgene mRNA levels during spermatogenesis. Nucleic Acid Res. 19, 1557-1562.

75. Rosenberg M., Przybylska M. and Straus D. (1994) TI RFLP subtraction: A method for making libraries of polymorphic markers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6113-6117.

76. Ross PL, Lee K, Belgrader P., (1997) Discrimination of single-nucleotide polymorphisms in human DNA using peptide nucleic acid probes detected by MALDI-TOF mass spectrometry. Anal Chem. 15, 4197-4202.

77. Rubenstein J.L.R., Brice A.E.J., Ciaranello R.D., Denney D., Porteus M.H. and Usdin T.B. (1990) Subtractive hybridization system using single-stranded phagemids with directional inserts. Nucleic Acids Res., 18, 4833-4842.

78. Sahi Т., Launiala K., Laitinen H. Hypolactasia in a fixed cohort of young Finnish adults. A follow-up study // Scand.J.Gastroenterol. 1983. 18, .7. P. 865-870

79. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab. Press, Cold Spring Harbor.

80. Sargent T. and Dawid I. B. (1983) Differencial gene expression in the gastrula of Xenopus laevis. Science, 222,135-139.

81. Sargent T.D. (1987) Isolation of differentially expressed genes. Methods Enzymol., 152, 423432.

82. Sasaki Y.F., Ayusava D., Oishi M. (1994) Construction of a normalized cDNA library by introduction of a semi-solid mRNA-cDNA hybridization system. Nucl. Acids Res. 22, 987-992.

83. Scrimshaw N.S., Murray E.B. The acceptability of milk and milk products in populations with a high prevalence of lactose intolerance // Am.J.Clin.Nutr. 1988. 48 (4 suppl.). P. 1079-1159.

84. Shiosoka T. and Saunders G. F. (1982) Differential expression of selected genes in human leukemia leukocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,4668-4571.

85. Shummer M., Scheurlen I., Schaller C., Galliot В., (1992) HOM/HOX homeobox genes are present in hydra (Chlorohydra viridissima) and are differentially expressed during regeneration. EMBO. 11, 1815-1823.

86. Siebert, P.D., Chenchik, A., Kellogg, D.E., Lukyanov,K.A. and Lukyanov,S.A. (1995) An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res., 23, 10871088.

87. Sive H.L. and St. John T. (1988) A simple subtractive hybridization technique employing photoactivatable biotin and phenol extraction. Nucl. Acids Res. 16, 10937.

88. Soares M.B., Bonaldo M.F., Jelene P., Su L., Lawton L., Efstratiadis A. (1994) Construction and characterization of a normalized cDNA library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91, 9228-9232.

89. Straus D. and Ausubel F.M. (1990) Genomic subtraction for cloning DNA corresponding to deletion mutations. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87,1889-1893.

90. Suzuki, H., Yaoi, Т., Kawai, J., Hara, A., Kuwajima, G., Watanabe, S. (1996) Restriction landmark cDNA scanning (RLCS): a novel cDNA display system using two-dimensional gel electrophoresis. Nucleic Acids Res., 24,289-294.

91. Sverdlov ED, Ermolaeva OD. (1993) Subtractive hybridization. Theoretical analysis, and a principle of the trap. Bioorg Khim. 19, 1081-1088. Russian

92. Sverdlov ED, Ermolaeva OD., (1994) Kinetic analysis for subtractive hybridization of transcripts. Bioorg Khim. 20, 506-514. Russian.

93. Tautz, D. (1990) Genomic finger printing goes simple. Bioessays. 12:44-46.

94. Timberlake W. E. Developmental gene regulation in Aspergillus nidulans, Dev. Biol., 1980, 78, 497-500.

95. Tishkoff S.A., Reed F.A., Ranciaro A. et al. Convergent adaptation of human lactase persistence in Africa and Europe. //Nat Genet. 2007. 39, 1. P. 31-40.

96. Timblin C., Battley J. and Kuehl W. H. (1990) Application of PCR technology to subtractive cDNA cloning: identification of genes expressed specifically in murine plasmacytoma cells. Nucl. Acids Res., 18, 1587-1593.

97. ToyotaM, UshijimaT, Suzui M, Murakumo Y, Imai K, SugimuraT, Matsuyama M., (1998) Generation of polymorphic markers tightly linked to the thymus enlargement loci by phenotype-directed representational difference analysis. Mamm Genome. 9, 735-739.

98. Travis G.H. and Sutcliffe J. G. (1988) Phenol emulsion-enchanced DNA-driven subtractive cDNA cloning: Isolation of low-abundance monkey cortex-specific mRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1696-1700.

99. Ueki T, Toyota M, Skinner H, Walter KM, Yeo CJ, Issa JP, Hruban RH, Goggins M., (2001) Identification and Characterization of Differentially Methylated CpG Islands in Pancreatic Carcinoma. Cancer Res. 61:8540-8546.

100. UN AIDS 2006 Report on the global AIDS epidemic. // 2006

101. Wang Z. and Brown D.D. (1991) A gene expression screen. Proc.Natl. Acad. USA, 88, 11505-11509.

102. Welsh, J., Chada, K., Dalai, S.S., Ralph, D., Cheng, R., McClelland, M. (1992) Arbitrarily primed PCR fingerprinting of RNA. Nucleic Acids Res., 20, 4965-4970.

103. Welsh, J., McClelland, M. (1990) Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. . Nucleic Acids Res. 18, 7213-7218.

104. Wieland I., Bolger, G., Asouline G. and Wigler M. (1990) A method for difference cloning: gene amplification following subtractive hybridization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 27202724.

105. Winn-Deen, E.S. (1998) Direct fluorescence detection of allele-specific PCR products using novel energy-transfer labeled primers // Molecular Diagnosis. 3, 217-222.

106. Williams, J.,G.,K., Kubelic, А.Д., Livak, K.,J., Rafalski, J.,A., Tingey, S.,V. (1990) DNA polymorphysms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18, 6531-6535.

107. Zaraisky A.G., Lukyanov S.A., Vasiliev O.L., Smirnov Y.V., Belyavsky A.V. and Kazanskaya,O.V. (1992) A novel homeobox gene expressed in the anterior neural plate of Xenopus embryo. Devel. Biol., 152, 373-382.

108. Zeng J., Gorski R. A. and Hamer D. (1994) Differential cDNA cloning by enzymatic degrading subtraction (EDS). Nucleic Acids Res., 22,4381-4385.

109. Zimmerman C., Orr W., Leclerc R., Barnard E., Timberlake W. (1980) Molecular cloning ans selection of genes regulated in Aspergillus development, Cell, 21,709-714.

110. Wang, W.Y., Liaw, S.H., and Liao, Т.Н. (2000). Cloning and characterization of a novel nuclease from shrimp hepatopancreas, and prediction of its active site. Biochem. J. 346, 799804.