Поиск новых AKT-ингибиторов: Роль белка Bex 1 в действии комбинации новых стерических ингибиторов AKT (протеинкиназы B) в сочетании с Иматиниб Мезилатом на клетки гастроинтестинальной стромальной опухоли. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Козинова Марья Тимофеевна

• Козинова Марья Тимофеевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Козинова Марья Тимофеевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Степень разработанности темы

Цель исследования

Задачи исследования

Научная новизна

Научно-практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности

Апробация результатов

Публикации по теме диссертационной работы

Личный вклад автора

Объём и структура работы

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНОЙ СТРОМАЛЬНОЙ ОПУХОЛИ

1.1 Молекулярные типы и механизмы: классификация ГИСО

1.2 Ингибирование киназ, как терапевтическая стратегия таргетной терапии

1.3 Сигнальные киназы, принимающие участие в патогенезе ГИСО

1.4 Ингибиторы тирозинкиназ для терапии ГИСО

1.5 Эволюция аллостерических ингибиторов AKT

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.2 Анализ жизнеспособности клеток и синергии ингибиторов in vitro

2.3 Приготовление экстракта цельных клеток и анализы иммуноблоттинга

2.4 Высокопроизводительная жидкостная хроматография и тандемная масс-спектрометрия

2.5 Иммунофлуоресценция

2.6 Tрансфекция миРНК

2.7 Количественный анализ ПЦР в реальном времени (кПЦР)

2.8 Прививаемые подкожные ксенографтные опухоли

2.9. Моделирование роста опухоли

2.10. Статистика

2.11. Иммуногистохимический анализ

ГЛАВА 3. ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОЛИФЕРАТИВНОГО СИГНАЛИНГА И ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ИНГИБИТОРОВ

ГЛАВА 4. РОЛЬ БЕЛКА BEX1 В МЕХАНИЗМЕ ДЕЙСТВИЯ КОМБИНАЦИИ AKT ИНГИБИТОРОВ И ИМ

ГЛАВА 5. ПРОТЕОМНЫЕ СКРИНИГИ ДЛЯ ВЫЯСНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ АКТ ИНГИБИТОРОВ И

ВАЛИДАЦИИ ИХ АКТИВАЦИИ AKT ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ ПОДТИПОВ ГИСО

5.1 Роль транскрипционного фактора Elk1

5.2 Роль проапоптотического фактора PDCD4

5.3 Подтверждение наличия активации AKT в различных подтипах ГИСО

ГЛАВА 6. АКТИВНОСТЬ НОВЫХ АКТ ИНГИБИТОРОВ IN VIVO В МОДЕЛЯХ ГИСО С РАЗЛИЧНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ИМ

ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ГЛАВА 8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

8.1 Основные выводы

8.2 Научно-практические рекомендации

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск новых AKT-ингибиторов: Роль белка Bex 1 в действии комбинации новых стерических ингибиторов AKT (протеинкиназы B) в сочетании с Иматиниб Мезилатом на клетки гастроинтестинальной стромальной опухоли.»

Актуальность проблемы

Гастроинтестинальная стромальная опухоль (ГИСО) - раковое заболевание желудочно-кишечного тракта, вызываемое в 85% процентах случаев мутацией тирозин-киназного рецептора KIT (CD117) или PDGFRa (5-8% пациентов)[Rammohan и др., 2013]. Эти мутации приводят к появлению константно активированных (фосфорили-рованных) рецепторов, локализованных в плазматической мембране на поверхности клеток, что приводит к гиперпролиферации клеток и формированию опухоли. ГИСО является наиболее распространенным видом сарком в ЖКТ, наиболее часто поражая желудок (60% случаев) и тонкий кишечник (30%), толстый кишечник/прямую кишку (5%) [Charville, Longacre, 2017]. В РФ ежегодно диагностируют приблизительно 20002500 случаев с медианой возраста 60-65 лет [Орлова, Кащенко, Глузман, 2019]. Лечение этого вида опухоли предполагает хирургическое удаление самой опухоли и ее метастазов, в тех случаях, когда это возможно, а также неоадъювантную и адъювант-ную терапию таргетными ингибиторами мутированных тирозин-киназных рецепторов [Sankhala, 2017].

Иматиниба Мезилат (ИМ) является препаратом первого выбора для лечения ГИСО, он селективно ингибирует мутантный KIT рецептор, что позволяет контролировать динамику опухолевого процесса в течение нескольких лет [Blanke и др., 2008; Demetri и др., 2002; Eisenberg, Trent, 2011; Jakob, Hohenberger, 2018; Tuveson и др., 2001]. Использование ИМ значительно улучшает прогноз для пациентов с ГИСО, однако после двух - пяти лет терапии примерно у половины пациентов с ГИСО развивается резистентность к этому препарату [Patel, 2013b]. KIT является активатором

нескольких каскадов вторичных мессенджеров, активация которых обеспечивает выживание и пролиферацию клеток ГИСО [Abbaspour Babaei и др., 2016; Bauer и др., 2007]. Ряд работ показывает, что ингибирование более, чем одного узла в каскаде вторичного сигналинга позволяет такой терапии быть более устойчивой к развитию резистентности и делает ее более эффективной [Palmer, Chidley, Sorger, 2019; Palmer, Sorger, 2017]. Было показано, что семейство серин-треониновых протеинкиназ AKT (протеинкиназ В) - один из самых важных элементов в активации пролиферации клеток ГИСО. Единственное исследование эффекта комбинации AKT ингибитора (MK-2206) и ИМ на ГИСО показало, что ингибирование AKT усиливает антипролифера-тивный эффект ИМ in vitro, а также in vivo на ксенографтной модели ГИСО с высокой чувствительностью к ИМ [Tarn и др., 2006; Zook и др., 2017]. Соединения ARQ092 и ARQ751 являются новыми селективными стерическими AKT ингибиторами первого и второго поколения, соответственно [Yu и др., 2015]. Они обладают большей селективностью, чем их предшественник MK-2206, ранее использованный в экспериментах с ГИСО.

ARQ092, также известный как Мирансертиб, является пероральным активным, сильным и селективным ингибитором AKT первого поколения со значениями IC50: 5.0 нМ (AKT1); 4.5 нМ (AKT2); 16 нМ (AKT3)[Yu и др., 2015]. ARQ092 ингибирует активность AKT, не конкурируя с АТФ (стерический ингибитор), что приводит к ин-гибированию сигнального пути PI3K/AKT. Это может снижать пролиферацию опухолевых клеток и индуцировать апоптоз. ARQ092 одобрен FDA для лечения синдрома протея и в настоящий момент находится в фазах 1-2 клинических испытаний для ряда AKT-мутантных онкологических заболеваний. ARQ751 является аллостерическим ингибитором AKT второго поколения [Yu и др., 2015]. Он эффективно ингибирует AKT1, 2 и 3 со значениями IC50: 0.55 нМ, 0.81 нМ и 1.31 нМ соответственно. Кроме того, ARQ751 имеет очень высокую избирательность; он не ингибирует ни одну другую киназу (из 245 протестированных) более чем на 50% при концентрации ARQ751

5 мкМ. ARQ751 в данный момент находится на 1 фазе клинических испытаний против ряда солидных опухолей. Оба описанных новых ингибитора никогда ранее не исследовались в целях терапии ГИСО.

В последнее время внимание ученых привлек Bex1 - малоизученный белок, преимущественно экспрессируемый в ткани головного мозга [Brown, Kay, 1999; Khazaei и др., 2010; Lindblad и др., 2015]. Опубликованные данные показывают, что экспрессия этого белка увеличивается в клетках ГИСО в ответ на лечение комбинацией AKT ингибитора и ИМ [Zook и др., 2017]. Роль этого белка в реакции ГИСО на терапию никогда не была описана, однако, некоторые литературные данные указывают на возможное взаимодействие между Bex1 и анти-апоптотическим белком Bcl-2 [Lindblad и др., 2015; Xiao и др., 2014].

Приведенные данные указывают на индивидуальные молекулярные особенности развития ГИСО и необходимость разработки принципов персонализированной терапии этого заболевания. Персонализированная медицина - модель фармакотерапии, которая позволяет подобрать препарат и режим лечения с учетом генетических и индивидуальных особенностей конкретного пациента. Наибольшего успеха этот подход достиг в области лечения онкологических заболеваний, многие из которых вызываются определенными мутациями или аномалиями в функционировании внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих деление клеток. Фосфорилирование белков протеинкиназами является универсальным механизмом сигналинга в эукариотиче-ских клетях, поэтому точечное ингибирование киназ позволяет регулировать активацию деления и выживания раковых клеток. Было показано, что таргетная терапия тирозинкиназных рецепторов может приводить к тому, что раковая клетка будет накапливать дополнительные компенсирующие мутации или компенсаторно перестраивать нижележащие сигнальные каскады [Li и др., 2015; Liegl и др., 2008; Wu, Shih, 2018].

Степень разработанности темы

В настоящее время в отечественной и зарубежной практике нет ни одного одобренного способа лечения ГИСО с помощью комбинации препаратов. Для лекарственной терапии ГИСО одобрено пять препаратов ингибиторов тирозинкиназных рецепторов. ИМ, одобренный в 2001 году, является препаратом первой линии терапии уже в течение двадцати лет [Lostes-Bardaji и др., 2021]. Резистеность к ИМ развивается в течение двух лет после начала терапии [Patel, 2013b]. Препараты второй и третьей линий (сунитиниб, регорафениб) назначают после того, как развивается резистентность к ИМ, однако они предоставляют дополнительную стабилизацию размера опухоли на период от месяца до полугода [Demetri и др., 2006; Demetri и др., 2013]. Пока еще нет достаточных данных о скорости развития резистентности к препарату четвертой линии, рипретинибу [Falkenhorst, Hamacher, Bauer, 2019; Nemunaitis и др., 2019]. ИМ обладает наибольшей избирательностью к мутантному рецептору KIT, по сравнению с остальными линиями терапии, поэтому вопрос предотвращения развития резистентности, или отсрочка развития резистентности, представляет огромную практическую значимость. Одна из стратегий в этом направлении состоит в комбинировании ИМ с другими ингибиторами киназ или химиотерапевтическими агентами [Bosbach и др., 2017; Floris и др., 2013; Garcia-Valverde и др., 2020; Looy Van и др., 2014]. Известно, что AKT киназа часто активируется в ИМ-резистентном ГИСО, а также может играть роль в развитии резистентности [Bauer и др., 2007; Ihle и др., 2015; Li и др., 2015; Quattrone и др., 2014; Zook и др., 2017]. Было показано, что в ИМ-чув-ствительных ГИСО комбинирование ИМ и ингибитора АКТ приводит к лучшей стабилизации размера опухоли [Zook и др., 2017]. Следует отметить, что в этом исследовании использовался ингибитор MK-2206, который является АКТ-ингибитором первого поколения. С момента публикации на рынке появилось два более новых и более селективных ингибитора АКТ, которые пока еще не были исследованы в контексте

ГИСО ^и и др., 2015]. Особенный практический интерес представляет изучение эффекта комбинации АКТ-ингибиторов и ИМ в ИМ-резистентных ГИСО, однако на настоящий момент таких исследований опубликовано не было. Кроме того, научный интерес представляет изучение молекулярных механизмов, обеспечивающих более высокую эффективность лечения комбинацией ингибиторов по сравнению со стандартной терапией ИМ, поскольку такие исследования могут пролить свет на новые потенциальные мишени для фармакетерапии. Одним из многообещающих направлений исследований является изучение функций и партнеров по взаимодействию белка Вех1, который, как было показано в вышеупомянутой работе, значительно экспрес-сировался в опухолях и клеточных линиях ГИСО в ответ на терапию АКТ-ингибитором в комбинации с ИМ.

Цель исследования

Целью данной работы является исследование эффективности применения комбинации новых стерических пан-АКТ-ингибиторов (ARQ092 и ARQ751) и Имати-ниба Мезилата при лечении гастроинтестинальной стромальной опухоли (ГИСО), а также выявление молекулярного механизма действия этой комбинации.

Для достижения поставленной цели были решены следующие основные задачи.

Задачи исследования

1. Определить эффективность ингибирования патогенетических звеньев внутриклеточного каскада вторичных мессенджеров на клеточных линиях ГИСО при использовании новых АКТ-ингибиторов и ИМ в комбинации и по отдельности;

исследовать цитотоксическую активность новых ингибиторов АКТ в виде монотерапии и комбинации с использованием панели ГИСО клеточных линий с разной чувствительностью к ИМ; проанализировать эффективность новых ингибиторов в преодолении резистентности к ИМ, оценить синергизм между новыми ингибиторами и ИМ;

2. Разработать новую ксенографтную модель ГИСО с первичной устойчивостью к лечению ИМ посредством приживления лабораторным животным свежих образцов опухолей с подходящими характеристиками от пациентов.

3. Исследовать эффективность и цитотоксичность заявленных комбинаций на моделях с разными типами чувствительности к ИМ (первичная чувствительность, первичная резистентность, приобретенная резистентность); сравнить эффективность использования первого и второго поколения AKT ингибиторов по уменьшению размеров опухолей у модельных животных;

4. Исследовать изменение уровня экспрессии белка Bexl в ходе лечения и эффекты искусственной сверхэкспрессии или нокаута гена Bexl на выживаемость и морфологию клеток ГИСО; определить белки-партнеры Bexl, через которые комбинация АКТ-ингибиторов с ИМ оказывает цитотоксический эффект на ГИСО;

5. Определить возможный молекулярный механизм действия новой комбинации, помимо белка Bexl.

6. Оценить потенциальную применимость AKT ингибиторов, для использования в терапии "дикого типа" и PDGFRa - мутантных подтипов ГИСО.

Научная новизна

В данной научно-исследовательской работе впервые описан эффект AKT ингибиторов в качестве монотерапии и в сочетании с ИМ на рост опухолей ГИСО в моделях in vivo, имеющих первичную и приобретенную резистентность к ИМ.

Новые селективные стерические AKT ингибиторы первого и второго поколения, ARQ092 и ARQ751, были впервые исследованы в контексте ГИСО.

Впервые методом прямой ксенотрансплантации от пациента получена in vivo новая модель ГИСО, клетки которой несут первичную ИМ-резистентную мутацию гена KIT в экзоне 9, встречающуюся у 10-15% пациентов.

В ходе экспериментов впервые выполнен скрининг партнеров по взаимодействию белка Bexl в живых клетках методом биотиновой идентификации (BioID); выявлены признаки взаимодействия с супрессором апоптоза Bcl-XL. Опровергнуто предположение о критической роли экспрессии Bexl в ответе опухолей на лечение комбинацией ИМ и AKT ингибитора.

Анализ дифференциальной экспрессии белков в результате обработки комбинацией AKT ингибиторов в сочетании с ИМ методом масс спектрометрии белковых лизатов с последующим анализом на обогащение выявил понижение экспрессии генов-мишеней транскрипционного фактора Elkl. Статистический анализ этого же набора данных выявил значительную сверхэкспрессию белка PDCD4 при лечении комбинацией по сравнении с монолечением. В данной работе мы подтвердили ассоциацию восстановления экспрессии PDCD4 в ГИСО с апоптозом и остановкой клеточного цикла.

Активация киназ, на ингибировании которых основано это исследование (AKT1, AKT2, AKT3), была подтверждена методом киномного профилирования в образцах опухолей ГИСО разных подтипов ("дикий тип", PDGFRa- и KIT-мутантные) Это

первое киномное профилирование ГИСО опухолей, которое может облегчить поиск новых мишеней для таргетной терапии всех подтипов ГИСО.

Научно-практическая значимость работы

Новая модель первичной резистентности к ИМ доступна для доклиничеких исследований новых препаратов в ГИСО; модель в настоящее время используетсся в нескольких исследованиях в Онкологическои Центре Фокс Чейза.

На основании полученных результатов доклинического исследования AKT ингибиторов и их сочетаний с ИМ на рост опухолей ГИСО в моделях in vivo, имеющих первичную и приобретенную резистентность к ИМ было получено разрешение на проведение клинических испытаний AKT ингибитора ARQ092 в комбинации с иммунотерапией PD1 ингибитором у больных с ГИСО.

Оба исследованных ингибитора продемонстрировали синергизм in vitro в отношении выживаемости клеток ГИСО. Использование комбинации продемонстрировало тренд к лучшей стабилизации размера опухолей во всех использованных моделях, однако статистическая значимость при сравнении комбинации и стандартной терапии ИМ была достигнута только в ИМ-чувствительной модели. Стоит подчеркнуть активность комбинации и положительную динамику у животных с первично ИМ-ре-зистентными KIT-мутантными опухолями, которые представляют особую сложность в клинической практике. Низкая эффективность комбинации новых АКТ-ингибиторов и ИМ в моделях, резистентных к ИМ не является удивительной, однако полученная положительная динамика дает обоснования для доклинического (и клинического) исследования АКТ-ингибиторов в сочетании с новым ингибитором KIT, рипретини-бом (он не был одобрен на момент проведения нашего исследования).

Кроме того, полученные данные показали, что Bexl достаточно мало экспрес-сируется в ГИСО, однако играет роль в поддержании клеточной жизнеспособности. Данные не подтвердили предположения о роли Bexl в ответе на комбинацию AKT ингибитора, однако выявили его взаимодействие и, возможно, секвестрацию анти-апоптотического фактора Bcl-XL. Это оказалось не основным механизмом действия новых ингибиторов, однако эти данные могут оказаться критически важными для изучения лейкозов и глиом, а также других онкологических заболеваний головного мозга, где Bexl экспрессируется на высоком уровне.

Значительную роль в действии комбинации АКТ-ингибитора и ИМ по результатам представленной работы играет PDCD4, этот белок вовлечен в регуляцию клеточного цикла и апоптоза. Эти данные указывают на целесообразность исследований ингибиторов АКТ в комбинации с химиотерапевтическими препаратами, регулирующими эти процессы. Киномное профилирование и масс спектрометрия указывают на возможность и обоснованность использования AKT ингибиторов для лечения различных подтипов ГИСО, помимо использованных в этой работе KIT-мутантного подтипа ГИСО. Кроме того, полученные в ходе работы данные способствуют поиску новых мишений для фармакологического ингибирования в терапии ГИСО.

Полученный в ходе экспериментов опыт и новые знания о молекулярных процессах лежащих за эффективностью фармакологических агентов используется в педагогической практике при обучении студентов на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П. В. Сергеева медико-биологического факультета государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Методология и методы исследования

Исследование включало постановку опытов in vivo и in vitro.

Определения летальных доз и определение синергизма (через определение комбинаторного индекса) проводилось in vitro на трех различных клеточных линиях ГИСО, имеющих разные степени чувствительности к ИМ. Молекулярно-биологиче-ское исследование механизма действия новых ингибиторов проводилось с использованием временной трансфекции, ингибирования экспресии генов с помощью мик-роРНК, иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции. Исследования изменений в про-теоме проводилось с использованием BioID, профилирования кинома и тотального протеома методом масс-спектрометрии. Все in vitro эксперименты проводились минимум в трех биологических повторностях.

Для определения эффективности новых ингибиторов были использованы мыши линий CB.17/SCID и NSG-SGM3 с привитыми ксенографтными опухолями с разной чувствительностью к ИМ. Лекарственные вещества вводились внутрижелудочно. Регистрация размера опухолевых узлов в динамике производилась с помощью штангенциркуля дважды в неделю.

Положения, выносимые на защиту

1. Оба ингибитора AKT (ARQ092 и ARQ751) эффективно ингибируют звенья патогенетически активированного сигнального каскада PI3K/AKT/MAPK в клетках ГИСО in vitro в терапевтических концентрациях (3мкМ). Ингибирующий эффект особенно высок при использовании комбинации ингибиторов, и это позволяет

преодолеть резистентность к ИМ in vitro. Цитотоксическая активность обоих новых ингибиторов АКТ (ARQ092 и ARQ751) в виде монотерапии практически не превышает эффективности ИМ in vitro в четырех различных линиях клеток ГИСО с разной чувствительностью к ИМ, но в комбинации с ИМ оба ингибитора показывают сильный эффект и синергизм. В соотношении 1:3 комбинация K^AKT ингибитор демонстрирует наибольший синергизм в сравнении с монотерапией одним ингибитором в ИМ-чувствительном и в двух ИМ-резистентных линиях ГИСО.

2. Разработана новая ксенографтная модель ГИСО с первичной резистентностью к лечению ИМ; модель была получена приживлением образца опухоли от пациента мышам реципиентам и успешно перенесла многократные пассажи новым мышам; опухоль имеет мутацию экзона 9 рецептора KIT, подобные мутации встречаются у 15% пациентов с ГИСО.

3. Эффективность заявленных комбинаций ингибиторов AKT (ARQ092 и ARQ751) и ИМ протестирована на моделях с разными типами чувствительности к ИМ (первичная чувствительность, приобретенная резистентность и новая модель с первичной резистентностью). Ингибиторы не оказывают видимого побочного действия на модельных животных. Максимальная переносимая доза и эффективная доза ARQ751 (ингибитор второго поколения) была ниже, чем у ARQ092. При этом ARQ751 ингибитор в комбинации с ИМ на ИМ-чувствительной модели ГИСО вызывал уменьшение размера опухолей, тогда как ARQ092 только стабилизировал их размер. Комбинация АКТ ингибиторов с ИМ в моделях вторичной и первичной устойчивости к ИМ не дала статистически значимого улучшения по сравнению с монотерапией ИМ, однако там была тенденция к стабилизации размера.

4. Экспрессия гена Bex1 при обработке клеток ингибиторами AKT и ИМ воспроизводимо увеличивалась, однако, это проявлялось только на уровне мРНК во всех модельных линиях клеток. Эндогенного белка Bex1 в клетках не обнаружено. Подавление экспрессии гена Bex1 уменьшало выживаемость клеток, но не

затрагивало реакцию на обработку ингибиторами. Выявленное взаимодействие сверхэкспрессированого белка Bexl с анти-апоптотическим белком Bcl-XL, может быть интересно в контексте лечения глиом ИМ, поскольку основное место экспрессии Bexl — ткани мозга.

5. Скрининг на изменения, вызванные обработкой ИМ и ингибиторами АКТ, в тотальном протеоме ИМ-чувствительных и ИМ-резистентных клеток, позволил выявить увеличение уровня белка PDCD4, который активирует ингибитор клеточного цикла p27 и апоптоз. Активация PDCD4 была ассоциирована с лучшим эффектом комбинации ИМ/АКТ ингибитор. Эти же данные выявили инактивацию транскрипционного фактора Elkl и падения уровня экспрессии его мишеней, среди которых есть киназы (BMP2K), элементы каскада NfkB (CHUK) и регуляторы деградации самого рецептора КИТ (Cbl). Эти изменения могут представлять интерес для исследования терапии ГИСО, но явно не являются определяющими для эффекта исследованных ингибиторов.

6. Данные киномного профилирования показывают активацию AKT не только в KIT-мутантных, но и в других типах ГИСО: "дикого типа" и PDGFRa - мутантных. Эти данные могут служить обоснованием для клинических испытаний AKT ингибиторов в терапии всех видов ГИСО. Комбинация AKT ингибитора с ИМ не позволяет преодолеть резистентность к ИМ, обусловленную стерической мутацией KIT рецептора, однако наши данные указывают на целесообразность комбинирования АКТ-ингибиторов с новыми ингибиторами рецепторных киназ (рипретинибом и авапритини-бом). Таким образом, сочетание AKT ингибиторов и авапритиниба может быть рекомендовано для изучения в PDGFRa-мутантных ГИСО.

Степень достоверности

Работа проводилась в соответствии с принципами надлежащей лабораторной практики. В качестве биологического объекта для экспериментальных исследований использованы линейные лабораторные животные, а также культуры опухолевых клеток, полученные из сертифицированных питомников и опухолей. Содержание, хранение, культивирование и все манипуляции с биологическими объектами выполнялись в строгом соответствии с требованиями национального законодательства и иных регулирующих нормативно-правовых актов. Лекарственные вещества приобретались у официальных дистрибуторов (ИМ) или предоставлялись производителем (А^и1е). Репрезентативность полученных итоговых данных подтверждена достаточным количеством животных в составе опытных групп, использованием корректных и общепринятых методов сбора, обработки, хранения и статистического анализа информации, необходимым количеством повторений экспериментов с верификацией полученных данных, а также сходством с литературными данными по тематике исследования.

Апробация результатов

Апробация результатов диссертации проведена на заседании кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии имени академика П.В. Сергеева МБФ ФГАОУ ВО РНИМУ им.Н.И. Пирогова Минздрава России, протокол N01 от 20.04.2021 г.

Основные результаты исследований были представлены на 21-ой, 23-ей, 24ой-ей и 25-ой ежегодных научных конференциях студентов и аспирантов Фокс Чейзов-ского Онкологического центра (Филадельфия, США, 2016-2021); Симпозиуме по поиску новых лекарств Медицинской Школы имени Льюиса Каца университета Тэмпл

(Филадельфия, США, 2017); на международной ежегодной конференции по Американской ассоциации по исследованию рака (Чикаго, США, 2018); на международной конференции Общества по изучению раков соединительной ткани (Гавайи, США, 2017), У1-ой конференции «Молекулярные и Биологические аспекты Химии, Фармацевтики и Фармакологии» (Нижний Новгород, 2020).

Публикации по теме диссертационной работы

По теме диссертационной работы было опубликовано 5 научных работ, в том числе 2 публикации в рецензируемых научных журналах, входящих в перечень ВАК, 1 тезисы в журнале, входящем в перечень ВАК и 1 тезисы, индексируемые системой РИНЦ.

Личный вклад автора

Идея выполнения настоящей работы принадлежит М.Т. Козиновой. Автор диссертации самостоятельно сформулировала цели и задачи работы, разработала ее план и дизайн. Автор лично обобщила зарубежный и отечественный литературный материал и написала литературный обзор. Ею были поставлены эксперименты по эффективности новых ингибиторов и молекулярно-биологических механизмов эффективности. Сбор, хранение, статистическая обработка первичных данных проведены лично автором работы. Автор непосредственно участвовала в подготовке научных публикаций по материалам исследований.

Объём и структура работы

Диссертация написана в соответствие с требованиями к рукописям диссертационных работ, включает введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, использованных в работе. Раздел собственных результатов изложен в шести главах. В заключении отражены перспективы дальнейшего развития темы, сформулированы выводы и практические рекомендации. Диссертация изложена на 139 станицах компьютерного текста, иллюстрирована двадцатью шестью рисунками и семью таблицами. Библиографический список включает 177 источников, из них 6 отечественных и 171 иностранных.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ ГАСТРОИНТЕСТИНАЛЬНОЙ СТРОМАЛЬНОЙ ОПУХОЛИ

Персонализированная медицина - это такая модель фармакотерапии, которая позволяет подобрать максимально эффективный препарат и режим лечения с учетом генетических и индивидуальных особенностей конкретного пациента [Дедов и др., 2012]. Наибольшего успеха этот подход достиг в области лечения онкологических заболеваний, многие из которых вызываются определенными мутациями или аномалиями в функционировании внутриклеточных сигнальных путей, регулирующих деление клеток [Р.А. Хвастунов, Г.В. Скрыпников, 2016]. Фосфорилирование белков про-теинкиназами является универсальным механизмом сигналинга в эукариотических клетках, поэтому точечное ингибирование киназ позволяет регулировать активацию деления и выживания опухолевых клеток [Hunter, 2000]. Первым значимым результатом в этой области стала разработка в конце 1990-х годов ингибитора тирозинкиназ-ных рецепторов -иматиниба мезилата (ИМ, Гливека) для лечения хронического мие-лобластного лейкоза (вызывается присутствием мутантной BCR-ABL тирозинки-назы) и гастроинтестинальной стромальной опухоли (ГИСО), которая вызывается мутациями в тирозин-киназных клеточных рецепторах [Cohen и др., 2002; Croom, Perry, 2003]. Тирозинкиназные рецепторы являются первой ступенью в каскаде внутриклеточных сигнальных путей, поэтому таргетная терапия, как показал анализ исследований, именно этих мишеней может приводить к тому, что опухолевая клетка будет накапливать дополнительные компенсирующие мутации или компенсаторно перестраивать нижележащие сигнальные каскады [DeMatteo и др., 2000]. В последующем для этих первых в области таргетной и персонализированной медицины нозологий были разработаны персонализированные подходы выбора препаратов среди ИМ,

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Козинова Марья Тимофеевна, 2021 год

// ■ / /

тт —

Рисунок 17. Эффект сверхэкспресии и подавления экспрессии гена Bex1 в клетках ГИСО.

А. Репрезентативный иммуноблот белковых лизатов полученных из клеточной линий GIST-T1/829 с и без сверхэкспрессии Вех1, а так же с обработкой ингибиторами протеасомной деградации и комбинацией ИМ/ARQ751; видно, что хотя протеасомные ингибиторы влияют на накопление сверхэспрессированного белка, эндогенный Вех1 в клетках не детектируется, в том числе после обработки предположительно индуцирующей экспрессию комбинацией ИМ/ARQ751; ШПа окрашивание использовано в качестве маркера эффективного ингибирования протеасомной деградации. Б. кПЦР валидация эффективности подавления экспрессии Вех1 в клетках GIST-T1 и GIST-T1/829 с помощью миРНК трансфекции; НМ - миРНК, у которой нет мишени, отрицательный контроль. В, Г. Эффект от подавления экспрессии Вех1 и Bcl-XL в клетках GIST-T1 и GIST-T1/829 с помощью миРНК трансфекции; видно, что хотя каждый из генов и важен для жизнеспособности клеток, подавление их экспрессии не меняет цитотоксической эффективности комбинации ИМ/ARQ751 Д. Иммуноблот-валидация эффективности подавления экспрессии Bcl-XL в клетках GIST-T1 и GIST-T1/829 с помощью миРНК трансфекции.

Согласно нашей первоначальной гипотезе, Bex1 мог играть важную роль в ответе на обработку ГИСО комбинацией ингибиторов AKT и ИМ, в том числе за счет секвестрации антиапоптотического белка Bcl-XL. Мы подавили экспрессию обоих белков с помощью миРНА трансфекции, эффективность которой показана на Рисунке 17 (панели Б и Д). Жизнеспособность клеток линий GIST-T1 и GIST-T1/829 в результате подавления экспрессии обоих генов упала, что говорит об их важной роли для жизнеспособности клеток. Однако в результате действия комбинации ингибиторов жизнеспособность клеток падала еще больше, что говорит о том, что, по крайней мере, Bex1 не играет важной роли в молекулярном механизме действия этих двух ингибиторов.

ГЛАВА 5. ПРОТЕОМНЫЕ СКРИНИГИ ДЛЯ ВЫЯСНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ АКТ ИНГИБИТОРОВ И ВАЛИДАЦИИ ИХ АКТИВАЦИИ AKT ДЛЯ РАЗЛИЧНЫХ ПОДТИПОВ

ГИСО

Для того, чтобы найти молекулярный механизм, посредством которого комбинация ИМ и AKT ингибитора может преодолевать резистентность ГИСО к терапии, мы провели скрининг изменений в тотальном протеоме клеток GIST-T1 и GIST-T1/829, подвергнутых 20-часовой обработке с комбинацией ИМ/ARQ751 и контрольных (не обработанных ингибиторами). Ни в одном из образцов не было обнаружено белка Bex1, что подтвердило наши выводы о его невовлеченности в молекулярные изменения при обработке клеток ингибиторами.

Для того, чтобы найти новые потенциальные фармакологические мишени, результаты скрининга были обработаны сходным образом с предыдущим скринингом. Наиболее значительно измененные белки по результатам статистического анализа и визуализации типа Volcano диаграммы были проанализированы с помощью инструмента GSEA, чтобы найти задействованные сигнальные каскады или определить транскрипционные регуляторы. Схема анализа представлена Рисунке 18.

А G15Т-Т1: ера внен ие MM/ARQ751 с контролем

Cl

О

пл

о -

PDCD4 atp5d

Б GIST-T1/829: сравнение MM/ARQ751 с контролем

■j j -h о i т » i 1

log2(разница) Повышение экспрессии в результате обработки ингибиторами

ODC1 TCAF1

Gene Set Enrichment Analysts

Б и ои нфо рматич еск и й анализ на обогащение по элементам сигнальные путей:

Обогащение мишенями транскрипционного фактора Е1к1

Рисунок 18. Анализ изменений в тотальных белках в клетках линий С18Т-Т1 и GIST-T1/829 после обработки комбинацией ИМ/ARQ751 в течение 20 часов.

Белки, интенсивность регистрации которых на ВЭЖХ/МС изменилась наиболее значительно в клетках линий GIST-T1 и GIST-T1/829 (А, Б), были проанализированы с помощью инструмента GSEA, который выявил значительное изменение интенсивности генов-мишеней транскрипционного фактора Е1к1 (В); экспрессия двух белков упала в обеих линиях в результате обработки ингибиторами - ODC1, ТСАБ1; экспрессия двух белков повысилась в обеих линиях в результате обработки ингибиторами - PDCD4, ATP5D.

В Таблице 5 представлены белки, изменения в интенсивности которых были наиболее значимы. Так, по результатам статистического анализа интенсивность 40 белков значительно упала, а интенсивность 13 белков значительно увеличилась в результате обработки клеток GIST-T1 комбинацией ИМ/ARQ751. В ИМ-резистентной клеточной линии GIST-T1/829 изменения в результате обработке комбинацией ИМ/ARQ751 были ожидаемо более слабыми, интенсивность экспрессии 7 белков

упала, и только интенсивность 5 белков увеличилась. Подробный перечень названий белков представлен в Таблице 5.

Таблица 5. Белки, экспрессия которых статистически значимо изменилась под

воздействием 20-часовой инкубации клеток ГИСО с комбинацией ингибиторов

ИМ/ARQ 751

GIST-T1 GIST-T1/829

Белки, экспрессия которых уменьшилась после обработки ингибиторами

ABCF2 FADS2 ЖК167 SQLE ASAИ1

ACACA FBN1 NAV1 SQSTM1 ODC1

AGFG1 HMGCS1 ODC1 TACC3 PTGS2

ARMC9 ИШ PFN2 TAX1BP3 RAC2

ATAD2 HSBP1 PRкa TCAF1 RPL35A

BMP2K IRF2BP2 PRRC2A TGFBШ SPAG5

CASP7 КШ11 RRM2 ТРХ2 TCAF1

CBX1 KPNA2 SEC62 TYMS

EIF1 LSM14B SLC4A1A ZFYVE16

EMC8 MAGT1 Р ZPR1

SPRY4

Белки, экспрессия которых увеличилась после обработки ингибиторами

ATP5D И1FX MRPL22 PBXIP1 ATP5D NDUFAB1

BANF1 ИIST1И1C NDUFA4 PDCD4 ИMGCR PDCD4

DERL1 ИIST1И4A NDUFS4 TMEM109 1ТШС

GSTM2

5.1 Роль транскрипционного фактора Elk1

Протеомные данные были проанализированы на обогащение белками, принадлежащими к известным сигнальным, регуляторным путям или функциональным

группам с помощью инструмента GSEA. Среди белков, интенсивность экспрессии которых упала в результате инкубации с комбинацией MM/ARQ751, было выявлено обогащение мишенями транскрипционного фактора Elkl.

Среди мишеней Elkl, интенсивность которых упала в GIST-T1 были: BMP2K, ARFIP2, CHUK, STX6, COG4. Среди Elkl мишеней в GIST-Tl/829 GSEA были вы-явилены: CBL, MED14, MTIF2. Для выполнения своей функции как транскрипционного фактора, Elkl должен быть активирован путем форфорилирования; согласно литературным данным, он может фосфорилироваться MAPK [Besnard и др., 2011; Cruzalegui, Cano, Treisman, 1999; Gao и др., 2019; Li и др., 2003; Tian, Karin, 1999]. Поэтому мы проверили уровень активации Elk1 методом иммуноблоттинга. Результаты представлены на Рисунке 16. Из них следует, что обработки ИМ достаточно для подавления активности Elk1 в ИМ-чувствительной линии клеток GIST-T1, однако резистентные GIST-T1/829 клетки лишь незначительно реагируют уменьшением активации Elk1 на монотерапию ИМ или ARQ751. Более значительная инактивация Elk1 наблюдается только при использовании комбинации ингибиторов.

Elk1 может играть различные роли в клетках, как связанные с выживаемостью, так и связанные с немедленным реагированием на стресс [Besnard и др., 2011; Gao и др., 2019; Kawahara и др., 2015; Li и др., 2003; Rosati и др., 2016] . Для того чтобы определить важность Elk1 для выживания клеток ГИСО мы провели инактивацию этого гена с помощью миРНА. Результаты представлены на Рисунке 19. Панели Б и В демонстрируют, что даже не полная инактивация экспрессии гена драматически уменьшает выживаемость клеток ГИСО.

С15Т-Т1

с15т-т1/829

Р-Е1к1

Е1Ы актин

- * --¿I

Е1к1 миРНК

НМ миЖК

У У # #

Е1к1

актин

Рисунок 19. Валидация роли транскрипционного фактора Elk1 в эффективности комбинации ИМ/ARQ751

A. Репрезентативный вестерн-блоттинг белковых лизатов полученных из клеточных линий GIST-T1 и GIST-T1/829, подвергнутых обработке комбинацией ИМ/ARQ751 в течение 20 часов; для ИМ-чувствительной клеточной линии GIST-Т1 эффекта ИМ достаточно, чтобы инактивировать Е1к1, в то время как для резистентной линии GIST-T1/829 необходима обработка комбинацией ИМ/ARQ751 для инактивации Е1к1. Б. Подавление экспрессии Е1к1 в клетках GIST-T1/829 вызывает почти полную гибель клеток спустя 72 часа после транс-фекции с миРНА, что показывает значимость этого гена для выживания ГИСО.

B. Иммуноблот валидация эффективности подавления экспрессии Е1к1, актин использован как контроль равномерной загрузки образцов в гель; НМ - миРНК, у которой нет мишени, отрицательный контроль.

Таким образом, мы подтвердили, что транскрипционный фактор Е1к1 важен в эффективности комбинации ИМ и АКТ ингибиторов на клетки ГИСО.

5.2 Роль проапоптотического фактора PDCD4

Как было сказано выше, в результате обработки клеток ГИСО комбинацией ингибиторов только по два общих белка было обнаружено между двумя клеточными линиями среди белков с увеличенной и уменьшенной экспрессией. Наше внимание привлек PDCD4, антиопухолевый фактор, активатор апоптоза и регулятор клеточного цикла. Литературные данные показывают, что ингибирование AKT может приводить к увеличению уровня PDCD4 в раковых клетках, что в свою очередь вызывает повышение таких факторов как p21 и p27 - ингибиторов клеточного цикла [Ozpolat и др., 2007; Wang и др., 2019; Wei и др., 2012].

На Рисунке 20 представлены результаты иммуноблоттинга: обработка клеток ГИСО в течение 20 часов ИМ в концентрациях, воспроизводящих условия про-теомного скрининга, приводит к увеличению уровня PDCD4.

Рисунок 20. Валидация увеличения PDCD4 при обработке клеток комбинацией

ИМ/ARQ751

Репрезентативный вестерн-блот-тинг белковых лизатов, полученных из клеточных линий GIST-T1, GIST-T1/829, GIST-430, подвергнутых обработке комбинацией ИМ/ARQ751 в течении 20 часов; повышение PDCD4 вызывается обработкой комбинацией ингибиторов в большей мере, чем каждым ингибитором в отдельности; уровень PDCD4 коррелирует с расщеплением PARP1 и увеличением p27; GAPDH использован как контроль равномерной загрузки образцов в гель.

GIST-T1

GI5T-T1/SZ9 IM, 1мкМ

GI5T43Q

IM, 40нМ IM, 1м кМ 1МЛ™М

ARQ 751, IZQHM ARO 751, ЗмнМ ARQ 7Ы. ЗмкМ

J?

/

р KIT (Туг719| KIT

р AKT |Ser473f АКТ

С1Ьг202/Туг204]

V&ü/ld

ji-Sfi [Ser235/236)

ъь

PLltLWl

тип

Фрагмент FftRPl p27 GAi'PH

Уровень PDCD4 значительно увеличивается в каждой из трех линий клеток при обработке одним из ингибиторов, но двойное ингибирование вызывает значительно более сильное увеличение уровня PDCD4. Увеличение уровня фрагментированного PARP1 указывает на активацию апоптоза. Ожидаемо, наиболее сильная активация апоптоза наблюдается в ИМ-чувствительной модели, но тенденция к увеличению фрагментированного PARP1 наблюдается и в ИМ-резистентных линиях. Кроме того, в двух линиях из трех увеличение PDCD4 сопровождалось с увеличением уровня p27; таким образом, можно заключить, что из двух ИМ-резистентных линий, модель GIST-T1/829 является наименее чувствительной на молекулярном уровне к лечению комбинацией ИМ/ARQ751. На основании результатов иммуноблоттинга для дальнейшей валидации эффекта фармакологического одновременного ингибирования KIT и AKT на динамику клеточного цикла клеток ГИСО были выбраны клеточные линии GIST-T1 и GIST-430. Для этого с помощью проточной цитометрии было измерено включение БДУ в ДНК клеток ГИСО и окрашивание их 7-ААД (Рисунок 21).

Рисунок 21. Индукция комбинацией ИМ/ARQ751 остановки клеточного цикла и апоптоза

Репрезентативные результаты проточной цитометрии и определения включения БДУ при 72-часовой обработке ингибиторами клеток GIST-T1 (ИМ 40нМ, ARQ751 120 нМ) и GIST-430 (ИМ 1мкМ, ARQ751 3 мкМ).

Для клеток GIST-T1 приведены репрезентативные результаты проточной цитомет-рии (А), и определения остаеновки клеточного цикла (В) и апоптотической sub-G1 популяции (Г). Статистически значимое уменьшение в S фазе и увеличение апоптоза было выявлено для сравнений между комбинацией ингибиторов по сравнению со всеми другими условиями (*** р < 0.00007) и остановка в фазе G1 (р < 0.009).

Для клеток GIST-T1/829 приведены репрезентативные результаты проточной ци-тометрии (Б), определения остаеновки клеточного цикла (Д) и апоптотической sub-G1 популяции (Е). Статистически значимое уменьшение в S фазе и увеличение апоптоза было выявлено для сравнений между комбинацией ингибиторов по сравнению со всеми другими условиями (*** р < 0.002).

5.3 Подтверждение наличия активации AKT в различных подтипах ГИСО

При проведении всех экспериментов были использованы модельные клетки и животные KIT-мутантного подтипа ГИСО, который составляет до 85% случаев этого вида онкологии. Однако существуют еще два вида ГИСО, обусловленных другими причинами — PDGFRa мутантный подтип и ГИСО «Дикого типа» (Wild type), когда опухоль не имеет мутаций в KIT или PDGFRa (но может иметь мутации в других генах). Для того, чтобы определить, может ли терапия AKT ингибиторами в перспективе помочь пациентам с такими видами опухоли, мы провели еще один протеомный скрининг с использованием образцов опухолей, полученных от пациентов с различными типами ГИСО. На Рисунке 22 приведена «тепловая карта» активности всех трех форм AKT в образцах нормальной ткани желудка, и трех подтипах ГИСО. Видно, что во всех типах ГИСО наблюдается активация AKT, что может свидетельствовать о потенциальной применимости новых ингибиторов для лечения этих видов онкологии.

A

Б

пими/Киы*и А*Т1 АКТ2 лет»

Ыолп*124 отп ■0.22769 1.0619

Н«м1К

Иолп»126 -0 41504 1 3364)

Молл*127 А2К11 1 12658

Когт*128 03145« -0.95736 042469

0.7$$ 77 0158)37

N«1714110 0 1Ы61 1 394514

Иогт»М1 0.77 У79С

N<»<71*142 «07512 •11234)! 204692

кггм оси«* 0868687, 1.220)3

киот 0 157044 0 30 3 342 0689747

ЮТ11 «.1504 1-0)2806 1.6)5522 1 497229

КПП 0 178874 01)8814

ЮТ 20 01М12) 1.051024

К(Т21 0.05739 1.196607;. 2 228049

[кГТ22 0479782 1 249142 19568

КПП 0151628 0.90766 1 226508

ют» -0.42*57 0.577246

К1Т34 0 321928, 1 337996 2 501)12

ЮТ к 0116)65 085758) 0.967906

ЮШ 0587845 I 271426 1 833092

ЮТИ «ОИ !.)5162» 1.614474

кгти 0558758 0.689747

ЮТ 40 -1.24*11 0.325)86 0769772

«ГТОЗ 0 075875 0312665 1405448

«Л 04 009895« -0.0)505 1 202808

*уто5 0 302173 0067639 0 722466

*Т06 0.41664 -0.17951 1.25882

0146655 0 47300« 1 882447

WT12 0 09051 ОЛ 45)51 1 528071

УУТМ «гтм 1246712 1 776525 2 244887 1 388465

0181421 ■0.51457

[>ГХ,(ЙД01 0 238787 0 716333 1 4823)2

ЮЫНАС1 0.30)542 1.180148 2.0755))

ЮЫМ07 гобним -01156 0 386259 1 211635

0880184 0 454176 0.4792)1

РОМ ВАН 0 0*67*4 07)0203 0938098

Г004КА17 0 1150)3 0.226509 0.24245

РОСГЯАН ГООШЛ.1) -042082 0250962 0 509949 0.996)89 1 22)423 1 16092

РОС.ТЙД» ■0 14561 0 3242)5 2 038М5

гошин О 115« 0.58111 0.7)8984

Образец Подтип ГИСО мутацж

грынн

Нопв» 124 _

ноппасй - —

и

мпггпз127 _ _

Мргтл129 _ _

Моггт1п129 -Г _

Могта130 _

—

МоптаИ2 - _

ттоа К1ГПЧЛЙ™ КГГэас«11оУа155(Иа

КИМ К1Гти1й1К КГГэт». 11:0.^1550^

К1Т китийш кггмх 11-

К1Т 13 китнип! КГГяоон 11. ол^БМРю

К1Т 20 ютгтьт КГГ-Х».

ЮТ КГТ КГГэоо, 11 о^ЫЯЙгэ

кггпхт КГГлионИ: р.Тц>И7А-ч

К1Т 31 КГГгтиЛэгХ К1Т ^.-к« 11: р

КЗТЗЗ ЮГ (НАЛ К!Т .1 >: и1я?5&7е1у

К1Т34 КГГгшЮЩ ОТмиНихМЯСИ»

К]Т35 КГГтим КГГэо». IV оУа1ЫИАа

К1Т $7 КП пиЛТл! КГГ-жюн 11:п.Т|ц55ТУв1559б5(™РГн

К1Т35 КГГтЛзгЦ КЗТэпанН «И

К1Т39 КГГпкЛдгХ ЮТзкхЩА р.ГгрН7 УаТМ9еЫ(1аСуз

К |Т 40 юг пщьу* К1Т ааон 11: р Рта67Э С1иЬвЗ<Гир

К1Т,РСС1™ «Й

ЮТРОЗРНА мЙ Не обнаружь

'ЛТ05 КПЛЧКИНА Л1Й Не обнаружен

ИГГОб ЮТ^РСЙГКАниИ Не обнар^й^о

10 К1Т.РОССНЛ ЗОНА зккн 14: о.-МЗ^ЭРти: ^ Р.Уа!б5711е

■.VI 12 ЮТ.РСЙРКА «и жю«7: р.ТТ>2731очп Ю р.С1у453£га

КГГЛ>о&ПА»м

ИТ 16 к1т№3™ л1и Не обнар/т»«

росрчл си РСКЗРЧАтиил* РОСРИА зчкн 14. р АзибЙТут; аюп 18 ГуПМЭСуа

РОСРР№ 02 РСКЗРРЙгтиЛа* ЯОйР»1 ЗЙ* рлк>154^я1

роаеяА о? РМЗРРАттвч! №ЖА жэон 16 р.А5р542Уг>1

рооп^л 14 РСКЗРКАгщЛу* РОСРЯА йоон !Й: рА4рб4211е

РОСРНА 15 РСКЗРРУлттаШ РОСРГЫъън 12 О.Мв1&б1А№

роориа 17 РКЬРРЙгтЛат РООРЯЛ 115- рА5р642Уг>1

РОСРР{Л 19 РСЮРРИ гтцлак ЯСС.™ ааон 16:

РОСРЧА 23 Р[5СРР(А гтиЛаШ Н)£Нг4э№1г

ройрна 32 рсйряа 16 рмзрра пилат РОСРЙА ти1йл( РООРЯА эоон 16: рЛар64№1 акт жюн 16. р

Рисунок 22. Подтверждение активации AKT в образцах опухолей разных подтипов ГИСО методом киномного профилирования

А. Тепловая карта относительной активности трех форм АКТ среди трех основных подтипов ГИСО и в нормальной ткани желудка. Б. Информация о мутационном статусе использованных образцов.

ГЛАВА 6. АКТИВНОСТЬ НОВЫХ АКТ ИНГИБИТОРОВ IN VIVO В МОДЕЛЯХ ГИСО С РАЗЛИЧНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ИМ

В ходе выполнения работы была разработана новая ксенографтная модель ГИСО, полученная из человеческой опухоли. Новая модель получила название PDX9.1. Она обладает первичной устойчивостью к лечению ИМ за счет мутации А502_503 дупликации в 9 экзоне гена KIT. Модель разрабатывалась в соответствии с протоколом, приведенным в разделе Методы, при этом свежий образец ткани был приживлен лабораторным животным и серийно перевивался по мере достижения опухолью размера, составляющего около 10% от размера мыши. При каждом следующем пассаже контролировалось сохранение генетических и морфологических свойств опухоли (схема получения и гистологическая картина новой модели представлены на Рисунке 23). Модель использовали для in vivo тестирования новых AKT ингибиторов в качестве модели первичной резистентности к ИМ, которой опухоль обладает благодаря мутации экзона 9 гена KIT.

гэ

C-KJl

ruco

IM4HÍH<¿

гиоо FOK»,l

Кпшрть

- v %т\

■Л rf-*"*

■ : ! i : ■ i ■ t 1 ! i ■ i fu ллЛл A/i/WW\MI

м to л1

ki/toiwJ

<-K|t, ЭКЮ« 9. ^ппин.щия

Рисунок 23. Схематическое представление разработки PDX9.1 ксенографтной модели.

Образец опухоли, содержащей мутацию в 9 экзоне гена KIT, последовательно прививался под кожу лабораторным мышам по мере достижения размера около 10% от размера тела мыши. При каждой пересадке контролировалось сохранение опухолями характерной гистологической картины (окрашивание гематоксилином и эозином), экспрессии гена KIT (иммуногистохимическое окрашивание на высококонсервативный маркер гастроинтестинальных стромальных опухолей KIT) и характерной мутации в экзоне 9 гена KIT. A. Сравнение гистохимических характеристик опухоли от пациента и PDX9.1 модели, использованной для тестирования новых ингибиторов. Б. Сравнение результатов секвенирования характеристик опухоли от пациента и PDX9.1 модели, использованной для тестирования новых ингибиторов. В. Схема разработки новой модели PDX9.1.

Для доклинического тестирования новых ингибиторов были подготовлены мыши линий SCID и NSG. Мышам линии SCID подкожно вводили клетки ГИСО линий GIST-T1 и GIST430 в соответствии с протоколом, описанным в разделе Методы. Опухолевые клетки модели PDX9.1 вводили подкожно мышам линии NSG. Когда опухоли приобрели размер, оптимальный для надежных измерений, мышам стали пе-рорально вводить ингибиторы в дозировке представленной на Таблице 3. Предварительные эксперименты показали, что для новых ингибиторов наблюдается эффект накопления, поэтому они вводились не ежедневно, как показано в Таблице 4. В

используемой дозировке у мышей не наблюдалось побочных эффектов и потери веса в ходе лечения.

Ксенографтная модель, полученная введением клеток GIST-T1, служила моделью с высокой чувствительностью к ИМ; модель с клетками GIST430 имела вторичную (приобретенную) устойчивость к ИМ (полученную в ходе лечения ИМ за счет появления дополнительной мутации в гене KIT, см. раздел Методы). Новая модель PDX9.1 служила примером первичной резистентности к ИМ. Таким образом, в данной работе мы сравнили эффективность использования первого и второго поколения AKT ингибиторов по уменьшению размеров опухолей у модельных животных в условиях разнообразия чувствительностей к терапии, каковое наблюдается среди реальных пациентов.

Результаты in vivo эксперимента представлены в виде графиков зависимости размера опухолей от времени, прошедшего с начала лечения (Рисунок 24). Синяя линия на всех частях рисунка означает использование комбинации ингибиторов; статистически значимый эффект при сравнении комбинаторного лечения со стандартной терапией ИМ был получен только для ИМ-чувствительной модели GIST-T1 (p < 0.0006), в то время как в обеих ИМ-резистентных моделях петлеобразная форма кривой хоть и имеет зрительное отличие в сторону стабилизации размера опухолей, но не позволяет считать отличие статистически значимым. При этом, ARQ751 использовали в значительно меньшей дозировке, чем ARQ092 (см. Методы). В модели ИМ-чувствительной ГИСО (GIST-T1) комбинация ИМ/ARQ751 продемонстрировала уменьшение размера опухолей, в то время как ИМ и комбинация ИМ/ARQ092 продемонстрировала только стабилизацию размера (статистически значимую). ARQ751 монотерапия GIST-T1 так же продемонстрировала стабилизацию сравнимую с эффектом ИМ (нет статистической разницы с ИМ). Кроме того, в модели с пониженной чувствительности к ИМ (первичная резистентность), PDX9.1, наблюдается стабилизация размера опухолей под воздействием лечения комбинацией ингибиторов, в то

время как в модели вторичной чувствительности, GIST-430, после короткого периода стабилизации наблюдался рост опухолей даже при двойном ингибировании сигнальных киназ.

GíST-Tl

GIST-430

- Контроль

- им

- АЯ0 751

-1Ш№ Т51

S

£

PDX9.1

- KOHTpOfls

- ИМ

«ДЙ0 751 -ИМ/АОД751

Ш т т Ш EHF-I F,1:Hч 14ЛЧЛЛЛ Л П hHLUI Jlllbll

GIST-T1

1Í Я » <t Sí liPlMKt №|ЛЧАЛДЛ1Ч1|НИЯ.£||ЕЙ

GIST-43C

s = <

bl

■ Контроль

p им

-ARQ09¡ -HM/ARQMl

I íl

Si

i

Wt МЛ i НЛЧАЛДЛИЕН

PDX9.1

— Коктроль -— ИМ -— AflQ 092 -ИМ/ARQ »2

ni lM.'H НЛЧЛЛЛ ль ЧН HílH Jlh>! II

ЦП! МЛ f ЦДЧМЛ Л1 Ч( НЦЯ. Л*| И

m л л lú

НГНРЛЧС НАЧАЛА ЛНЧШИЧ,ДН[Й

Рисунок 24. Кривые выживания мышей с привитыми опухолями, обладающими различными типами чувствительности к ИМ: чувствительные к ИМ GIST-T1 (A и Г), Б. Первично резистентные PDX9.1 (Б и Д), вторично резистентные GIST430 (В и Е). В каждой группе мыши были случайным образом разбиты на подгруппы и получали лечение ингибиторами: контроль (плацебо), ИМ, один из AKT ингибиторов - ARQ751 (A, Б, В) или ARQ092 (Г, Д, Е), и комбинация ИМ и соответствующего AKT ингибитора. Дозировки зависели от типа лабораторных животных и приведены в Таблице 3. Статистическая значимость отличий между кривыми рассчитывали по критерию Манна-Уитни. Сравнение между комбинацией ингибиторов ИМ/ARQ75 против стандартной терапии с ИМ выявила статистически значимую разницу (p < 0.0006) в модели GIST-T1, в то время как для комбинации ИМ/ARQ092 в этой модели, а так же для обоих AKT-ингибиторов в моделях GIST430 и PDX9.1 статистически значимой разницы не было, что объясняется петлеобразной формой кривой, однако, тренд к большей эффективности отмечается во всех экспериментальных моделях.

Уровень уменьшения активации pS6 и увеличения экспрессии PDCD4 в опухолях был подтвержден иммуногистохимическим окрашиванием (Рисунок 25). В силу долгой продолжительности in vivo эксперимента опухоли обычно накапливают кло-нальное разнообразие, поэтому далеко не все сравнения имеют статистическую значимость: значимые изменения задетектированы в ИМ-чувствительной модели GIST-T1. В модели с пониженной чувствительностью к ИМ PDX9.1 прослеживается тренд к уменьшению активности pS6 и активации PDCD4 под действием ингибиторов. В модели сильной вторичной устойчивости к ИМ (GIST-430) тренда не наблюдалось, что коррелирует с худшими результатами динамики опухолевого роста.

Рисунок 25. Количественный анализ иммуногистохимического подтверждения инактивации S6 и увеличения экспрессии PDCD4 в результате лечения ингибиторами in vivo. Результаты иммуногистохимического окрашивания образцов опухолей, полученных у мышей в ходе in vivo эксперимента для всех трех линий на PDCD4 (A, Б, В) и S6 (Г, Д, Е). Статистическая значимость отличий между кривыми рассчитывали по критерию Манна-Уитни.

ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

В течение последних двадцати лет ИМ оставался препаратом первой линии для лечения большинства случаев ГИСО. За это время три дополнительных ингибитора рецепторной тирозинкиназы (сунитиниб, регорафениб, рипретиниб) были одобрены в качестве второй, третьей и четвертой линий терапии для ИМ-резистентных ГИСО опухолей. Как только все одобренные четыре линии терапии становятся неэффективными, за счет развития резистентности, пациенты с прогрессирующим ГИСО остаются без дальнейших вариантов лечения. Следует отметить, что выживаемость пациентов без прогрессирования для всех этих препаратов измеряется месяцами, в то время как препарат первой линии ИМ стабилизирует рост опухоли в среднем на два года. Следовательно, профилактика или отсрочивание развития приобретенной устойчивости к ИМ может иметь потенциальную клиническую пользу. Было показано, что активация пути PI3K/AKT способствует устойчивости к ИМ в ГИСО как само по себе (компенсаторная активация "обходных" сигнальных путей), так и при появлении вторичных мутаций в гене KIT или активации дополнительный киназных рецепторов [Bauer и др., 2007; Li и др., 2015; Quattrone и др., 2014; Zook и др., 2017]. В нескольких доклинических исследованиях сообщалось о значительной эффективности ИМ в комбинации с ингибиторами PI3K в ИМ-чувствительных моделях GIST, однако результаты эффективности этой комбинации в различных ИМ-устойчивых моделях были не так однозначны [Bosbach и др., 2017; Floris и др., 2013; Garcia-Valverde и др., 2020; Looy Van и др., 2014]. Предыдущее исследование показало, что лечение ИМ в сочетании с ингибитором AKT первого поколения, MK-2206, имеет повышенную эффективность в ИМ-чувствительных и устойчивых клеточных линиях ГИСО, а также более длительную стабилизацию заболевания и улучшение выживаемости в ИМ-чувствительной ксенотрансплантантной модели по сравнению с одним лечением ИМ [Zook и др., 2017]. Кроме того, было показано, что обработка ГИСО

комбинацией АКТ ингибитора и ИМ ассоциирована с увеличением экспрессии гена Bex1, который в литературе ассоциирован с активацией апоптоза [Karakoula и др., 2014; Kazi, Kabir, Rönnstrand, 2015; Xiao и др., 2014; Zhang, 2008; Zook и др., 2017]. В этом исследовании мы стремились глубже изучить, может ли ингибирование AKT в сочетании с ИМ быть эффективным в менее чувствительных к ИМ моделях. Для этого исследования была разработана новая модель ГИСО, названная PDX9.1. Эта модель обладает мутацией экзона 9 гена KIT, второй по частоте причиной развития ГИСО у пациентов, вызывающей пониженную чувствительность к ИМ или резистентность.

Еще одним новшеством данной работы является выбор AKT ингибиторов. Поскольку было показано, что аллостерические ингибиторы AKT более эффективно вызывают гибель клеток в клеточных линиях AKT дикого типа по сравнению с АТФ-конкурентными ингибиторами, мы выбрали два новых аллостерических пан-AKT ингибитора, ARQ 092 (так же известный как мирансертиб) и его модифицированную улучшенную версию ARQ 751 [Kostaras и др., 2020; Yu и др., 2015].

Целью данной работы было исследование эффективности комбинации обоих вышеописанных новых стерических ингибиторов пан-AKT, в комбинации с ИМ, стандартным лекарственным средством, одобренным для лечения гастроинтестиналь-ной стромальной опухоли (ГИСО). Кроме того, целью работы так же было установление молекулярного механизма действия этой комбинации.

Выбранные нами ингибиторы ARQ 092 и ARQ 751 являются перорально биодоступными, селективными и мощными АТФ-независимыми аллостерическими ингибиторами АКТ первого и второго поколения, соответственно [Yu и др., 2015]. Оба они ингибируют первый поворотный этап в активации AKT (транслокация AKT в плазматической мембране).

АКТ (протеинкиназа B) представляет собой серин/треонинкиназу, которая принадлежит к семейству киназ AGC (от названия трех основных представителей -

протеинкиназы A, протеинкиназы G и протеинкиназы C; семейство из 63 эволюци-онно близких киназ). AKT у человека кодируется тремя генами AKT1, 2 и 3. ARQ 092 (Мирансертиб) связывается с неактивным нефосфорилированным участком AKT1 с очень высоким сродством (Kd = 0,28 нМ, измеренным поверхностным плазмонным резонансом) и ингибирует активность AKT1, 2 и 3 со значениями IC50 5.0, 4.5 и 16 нМ соответственно, тогда как значения IC50 для ARQ 751 составляют 0.55, 0.81 и 1.3 нМ соответственно (Таблица 6). Для сравнения, более старый ингибитор АКТ, использованный в упомянутом выше исследовании, МК-2206 имеет более низкую активность (40.5, 29.5 и 36.4 нМ) против всех трех AKT [Yu и др., 2015]. АТФ-конку-рентный GDC-0068 демонстрирует эквивалентную активность по отношению к ARQ 092 против AKT1, однако, как было сказано выше, на практике такой тип ингибиторов не так эффективен против немутантных ("дикого типа") AKT, а как было подробно описано во вводной части, активация АКТ в ГИСО происходит не из-за мутаций в AKT [Corless, Barnett, Heinrich, 2011; Kostaras и др., 2020]. Профилирование селективности по панели из 303 киназ для ARQ092 представлено в Таблице 7. Было показано, что только шесть киназ (MARK1, 3 и 4, DYRK2, IRAK1 и Haspin) ингибировались более чем на 50% при концентрации ARQ 092 5 мкМ. Значения IC50 ARQ 092 для этих шести киназ составляли 129, 173 180, 386, 806 и 1160 нМ соответственно (Таблица 7). ARQ 092 демонстрировал кинетику ингибирования в отношении AKT1, на которую не влияли концентрации АТФ до 1000 М. Наконец, было показано, что ARQ 092 обладает хорошими фармацевтическими свойствами и был переведен в доклинические и клинические исследования.

Таблица 6. Сравнение IC50 для существующих AKT ингибиторов [Yu и др., 2015]

Тип ингибитора AKT1 AKT2 AKT3

ARQ092 Аллостерический 5.0 4.5 16.0

ARQ751 Аллостерический 0.54 0.81 1.3

MK-2206 Аллостерический 40.5 29.5 36.4

GDC-0068 АТФ 2.0 27.0 6.3

ARQ751 является АКТ ингибитором второго поколения. Процент ингибирова-ния киназ с помощью ARQ 751 был определен при концентрации 5 мкМ против панели из 245 киназ. Примечательно, что ARQ 751 не ингибировал ни одну киназу, кроме полноразмерного AKT1, более чем на 50% при концентрации 5 мкМ, поскольку для анализа селективности полноразмерные AKT2 и AKT3 не были доступны (Таблица 9). Полноразмерные AKT 2 и AKT 3 использовались в биохимических анализах, приведенных в Таблице 8. Они показывают, что ARQ751 ингибирует все три формы. Таким образом, ARQ751 является более селективным и сильным ингибитором AKT, но он изучен меньше, и пока еще только проходит клинические испытания первой фазы (подробнее во введении).

Поскольку аллостерические ингибиторы (такие как ARQ 092 и ARQ 751) связываются как с активными, так и с неактивными формами AKT, они, по-видимому, не только подавляют активацию AKT активной формы (как это делают ATФ-конкурент-ные ингибиторы), но также подавляют активацию неактивной формы AKT путем нарушения транслокации в мембрану[№Ш^си и др., 2016a; Yu и др., 2015].

Таблица 7. Киназная селективность новых ингибиторов [Yu и др., 2015]

ARQ751 ARQ092

Киназа % ингибирования при концентрации 5uM Киназа IC50 (nM)

Blk(h) 40 MAPK4 129

Tie2 33 MAPK3 173

Haspin 30 MAPK1 180

Met 28 DYRK2 386

SGK3(119-end) 28 IRAK1 806

PASK <26 Haspin 1160

Прочие 238 ки-наз <25 Остальные 297 киназ <50% ингибирования при концентрации 5uM

Мы обнраужили сильный синергизм между ARQ 092, ARQ 751 и ИМ при соотношении 3:1 как в ИМ-чувствительной, так и в устойчивых клеточных линиях, хотя IC50 не были достигнуты ни для одной из устойчивых линий из-за исходной устойчивости к ИМ. Чтобы получить представление о молекулярных механизмах, ответственных за превосходную эффективность этой комбинации, мы выполнили несколько протеомных скринингов с использованием изогенных ИМ-чувствительной и устойчивой клеточных линий ГИСО (GIST-T1, GIST-T1/829).

Ранее было показано, что экспрессия гена Bex1 при обработке клеток ингибитором AKT MK2206 и ИМ воспроизводимо увеличивалась [Zook и др., 2017]. С использованием новых АКТ-ингибиторов тенденция сохранялась. Проведенный про-теомный скриниг по методу BioID позволил выявить взаимодействие Bex1 с Bcl-XL. Однако, повышение Bex1 проявлялось только на уровне мРНК во всех модельных линиях клеток: эндогенного белка Bex1 в клетках ГИСО обнаружить не удалось. Подавление экспрессии гена Bex1 уменьшало выживаемость клеток, но не затрагивало реакцию на обработку ингибиторами. Выявленное взаимодействие

сверхэкспрессированого белка Bexl с анти-апоптотическим белком Bcl-XL, может указывать на роль Bexl в регуляции апоптоза через секвестрацию Bcl-XL в ядре клетки. Такое взаимодействие не релевантно для ГИСО, но может быть полезным в контексте лечения глиом с помощью ИМ, поскольку основное место экспрессии Bexl — ткани головного мозга.

Второй протеомный скрининг был проведен для детекции дифференциально экспрессированных белков в изогенных ИМ-чувствительной и устойчивой клеточных линях ГИСО (GIST-Tl, GIST-T1/829) в контроле и после инкубации с комбинацией ИМ и АКТ ингибитора. Анализ на функциональное обогащение выявил обогащение белками, экспрессия которых регулируется транскрипционным фактором Elkl. Среди этих белков были киназа BMP2K, элементы каскада NfkB (CHUK) и регуляторы деградации самого рецептора KIT (Cbl). Несмотря, на то, что все эти данные выглядят очень интригующе в контексте молекулярной биологии ГИСО, а кроме того, инактивация Elkl с помощью микроРНК имела заметный цитотоксический эфеект на клетки ГИСО - литературные данные свидетельствуют о том, что это не может быть основным механизмом действия комбинации ИМ и ингибитора AKT. Во-первых, инактивация Elkl уже была описана ранее, как один из эффектов фармакологических веществ в отношении клеток ГИСО [Ochs и др., 2009; Yen и др., 20l9]. Elkl регулирует экспрессию генов мгновенной реакции на стресс (immediate early genes), и было показано, что его инактивация при лечении ИМ проходит в течение 24 - 48 часов [Bébien и др., 2003; Besnard и др., 20ll; Kochan и др., 20l4; Ochs и др., 2009]. Таким образом, в долгосрочном эффекте комбинации ИМ/ARQ751 эффект от Elkl не может играть значительной роли. Кроме того, судя по нашим данным, инактивация Elkl при лечении комбинацией HN/ARQ751 подавляется значительно сильнее по сравнению с ИМ в ИМ-резистентной модели (GIST-Tl/829), в то время как в ИМ-чувствительной модели разницы в степени подавления функции Elkl между ИМ и комбинацией не наблюдалось. Это наблюдение совершенно не коррелирует с тем фактом, что

эффективность комбинации ингибиторов в ИМ-чувствительной модели значительно превышает таковую в ИМ-резистетной (как in vitro, так и in vivo).

^рининг на изменения, вызванные обработкой ИМ и ингибиторами АКТ, в тотальном протеоме ИМ-чувствительных и ИМ-резистентных клеток, позволил сфокусировать наше внимание на факторе программируемой гибели клетки белке (Programmed Cell Death 4, PDCD4), экспрессия которого была значительно повышена в присутствии комбинации в ИМ-чувствительных и устойчивых клеточных линиях по сравнению с обоими ингибиторами по отдельности.

PDCD4 известен своей ролью супрессора опухолей и активатора апоптоза [Matsuhashi и др., 2019; Wang, Yang, 2018; Wei и др., 2012]. Потеря PDCD4 была связана с трансформацией опухоли и плохим прогнозом при различных формах рака [Matsuhashi и др., 2019]. Интересно, что в одном из исследований потеря или понижение экспрессии PDCD4 наблюдалась в 68% образцов ГИСО и была связана с прогрес-сированием опухоли [Ding и др., 2012]. Было показано, что pS6 фосфорилирует PDCD4, что приводит к его деградации через убиквитиновый путь [Matsuhashi и др., 2014; Schmid и др., 2008]. Как в предыдущем исследовании, так и в этой работе комбинация ингибирования KIT и AKT приводила к снижению фосфорилирования S6 по сравнению c обоими ингибиторами в отдельности [Zook и др., 2017]. Предыдущие исследования лейкоза, рака эндометрия и яичников показали, что ингибирование PI3K/AKT пути приводила к последующей активации PDCD4 (через уменьшение его деградации) и сопутствующей активации ингибитора клеточного цикла p27 [Ozpolat и др., 2007; Wang и др., 2019; Wei и др., 2012]. Комбинированное лечение в нашей панели ИМ-чувствительных и устойчивых клеточных линий ГИСО подтвердило повышенную экспрессию PDCD4, p27 и увеличение фрагментированного PARP. p27 является ингибитором клеточного цикла, а повышение количества фрагментированного PARP1 является стандартным показателем активации апоптоза. Кроме того, данные масс-спектрометрии показали подавление белка ODC1 как в IM-чувствительных, так

и в устойчивых изогенных клеточных линиях. ODC1 участвует в синтезе ДНК, достигает пика экспресии дважды в течение клеточного цикла, в переходах между фазами G1/S и G2/M, поэтому пониженный уровень ODC1 подтверждает арест клеточного цикла и уменьшение клеток в фазе S/M при обработке IM/ARQ 751 [Pegg, 2006; Pyronnet, Pradayrol, Sonenberg, 2000; Ye и др., 2019]. Проточно-цитометрический анализ включения БДУ при синтезе ДНК показал, что обработка комбинацией ингибиторов как в ИМ-чувствительных, так и в устойчивых клеточных линиях индуцировала остановку клеточного цикла как в G1-, так и в G2-фазе и ожидаемое значительное уменьшение количества клеток в S-фазе, а также увеличивало популяцию sub-G1 клеток (апоптотических клеток) по сравнению с любым ингибитором по отдельности е. Вместе эти результаты демонстрируют, что двойное ингибирование KIT и AKT как в ИМ-чувствительных, так и в устойчивых клетках ГИСО приводит к снижению активации pS6, ассоциированной с уменьшением деградации PDCD4, накоплению этого белка, остановке клеточного цикла за счет увеличения уровня белка p27 и усилению апоптоза. Модель, описывающая молекулярные изменения, происходящие в клетках ГИСО при двойном ингибировании KIT и AKT обобщены на схеме, приведенной на Рисунке 26.

Рисунок 26. Схема молекулярного механизма действия одновременного ингибирования AKT и KIT

Комбинация ИМ и ARQ-751 вызывает снижение активации ре-гуляторной киназы S6, что предотвращает деградацию PDCD4, что угнетает пролиферацию и активирует апоптоз.

ARq

751

ГЛАВА 8. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты наших исследований in vitro позволили обосновать целесообразность проверки активности новых AKT ингибиторов in vivo, чтобы определить, будет их комбинирование с ИМ улучшать эффективность самого ИМ, увеличивать время до появления резистентности в чувствительной модели и/или потенциально помогать в преодолении резистентности в ИМ-резистентных моделях. По сравнению со стандартным препаратом первой линии ИМ, комбинирование с AKT ингибитором показало значительно большую стабилизацию размера опухолей и, в некоторых случаях, уменьшение размера опухолей, в ксенотрансплантатной IM-чувствительной модели (GIST-T1). Однако в моделях, устойчивых к ИМ, GIST430 и PDX9.1, статистически значимых различий не наблюдалось, хотя тенденция, свидетельствующая о лучшем эффекте комбинации в модели первичной резистентности (PDX9.1) ясно прослеживалась для обоих протестированных AKT ингибиторов. Эффективность обоих вышеописанных новых стерических ингибиторов пан-AKT (ARQ092 и ARQ751) в комбинации с ИМ оказалась сопоставима, при этом используемая концентрация ARQ751 была ниже, чем у ARQ092. Кроме того, только ARQ751 (в комбинации с ИМ) в ИМ-чувствительной модели привел к уменьшению размера опухолей, в то время как ARQ092 вызывал только стабильную стабилизацию размера опухолей. Тенденция к ингибированию роста опухолей в ИМ-резистентной модели GIST-430 так же выглядит сильнее для комбинации ИМ/ARQ751, чем для ИМ/ARQ092, хотя корректное сравнение тут провести невозможно. В пользу предпочтительного дальнейшего исследования ARQ751 говорит и его большая селективность в отношении подвидов AKT.

Следует отметить, что в то время, как наши исследования новых комбинаций ИМ и AKT-ингибиторов in vitro показали значительные синергические значения КИ в

линиях клеток ГИСО, устойчивых к ИМ, эксперименты in vivo вместо этого продемонстрировали лишь тенденцию к более высокой эффективности на животных моделях устойчивых к ИМ, которые, однако, не были статистически значимыми.

При анализе цитотоксичности исследованных ингибиторов на ИМ-резистент-ных клеточных линиях, протеомных скринингах и исследовании включения БДУ в ДНК мы использовали высокие концентрации как ИМ, так и АКТ ингибиторов, для того чтобы компенсировать низкую чувствительность исследованных клеток к ИМ. Для in vivo исследований в моделях на животных используемую дозу ограничивала токсичность препаратов для животных, поэтому использовать более высокие дозы было невозможно. На момент проведения этого исследования новый ингибитор KIT, рипретиниб, еще не был одобрен.

Резюмируя это исследование, можно рекомендовать в будущих исследованиях, оценивающих ингибирование PI3K/AKT пути в условиях первичной или вторичной резистентности к ИМ, изучить комбинацию АКТ ингибирования с ингибиторами ре-цепторных тирозин-киназ с альтернативными механизмами действия, такими как ри-претиниб (ингибитор активационной петли KIT) или авапритиниба (ингибитор KIT и PDGFRa), которые должны иметь большую эффективность в качестве отдельных ингибиторов по сравнению с ИМ. Авапритиниб является ингибитором широкого спектра, и недавно был одобрен для лечения PDGFRa-мутантного вида ГИСО. Для того, чтобы обосновать использование AKT ингибиторов в этом виде ГИСО, а также проверить обоснованность их использования в ГИСО "дикого типа" мы провели профай-линг кинома и обнаружили значительное повышение уровня активных AKT киназ во всех видах ГИСО, особенно AKT3 и AKT2, по сравнению с контрольными образцами нормальных тканей желудка.

Помимо комбинирования ингибиторов AKT с ингибиторами KIT, потенциально могут быть и другие терапевтические комбинации. Недавно сообщалось о том,

что ингибирование AKT усиливает цитотоксичность ингибиторов топоизомеразы II в ГИСО [Boichuk и др., 2020].

В заключение стоит отметить, что полученные молекулярно-биологические данные дают обоснование для более глубокого изучения процессов апоптоза и ареста клеточного цикла, вызванных терапией ГИСО, и в последствии могут предоставить источник новых терапевтических мишеней для лечения ГИСО и других опухолевых заболеваний с похожим молекулярным генезом. Ингибирование AKT в сочетании с ИМ продемонстрировало значительную, длительную эффективность в ИМ-чувстви-тельном ГИСО, что указывает на обоснованность разработки будущих клинических испытаний, оценивающих эту комбинацию в первичных ГИСО опухолях, чувствительных к ИМ. Однако, в условиях резистентности необходимо будет протестировать альтернативные препараты в сочетании с ингибированием AKT.

8.1 Основные выводы

1. Оба ингибитора AKT (ARQ092 и ARQ751) эффективно ингибируют звенья патогенетически активированного сигнального каскада PI3K/AKT/MAPK в клетках ГИСО in vitro в терапевтических концентрациях (3мкМ). Ингибирующий эффект особенно высок при использовании комбинации ингибиторов, и это позволяет преодолеть резистентность к ИМ in vitro. Цитотоксическая активность обоих новых ингибиторов АКТ (ARQ092 и ARQ751) в виде монотерапии практически не превышает эффективности ИМ in vitro в четырех различных линиях клеток ГИСО с разной чувствительностью к ИМ, но в комбинации с ИМ оба ингибитора усиливают антипроли-феративный эффект ИМ. В соотношении 1:3 комбинация K^AKT ингибитор демонстрирует наибольший синергизм в сравнении с монотерапией одним ингибитором в ИМ-чувствительном и в двух ИМ-резистентных линиях ГИСО.

2. Разработана новая ксенографтная модель ГИСО с первичной резистентностью к лечению ИМ; модель была получена приживлением образца опухоли от пациента мышам реципиентам и может ьыть испорльзована для многократных пассажей новым мышам; опухоль имеет мутацию экзона 9 рецептора KIT, подобные мутации встречаются у 15% пациентов с ГИСО.

3. Эффективность комбинаций ингибиторов AKT (ARQ092 и ARQ751) и ИМ протестирована на моделях с разными типами чувствительности к ИМ (первичная чувствительность, приобретенная резистентность и новая модель с первичной резистентностью). Ингибиторы не оказывают видимого побочного действия на модельных животных. Максимальная переносимая доза и эффективная доза ARQ751 (ингибитор второго поколения) была ниже, чем у ARQ092. При этом ARQ751 ингибитор в комбинации с ИМ на ИМ-чувствительной модели ГИСО вызывал уменьшение размера опухолей, тогда как ARQ092 только стабилизировал их размер. Комбинация АКТ ингибиторов с ИМ в моделях вторичной и первичной устойчивости к ИМ не дала статистически значимого снижения размера опухоли сравнению с монотерапией ИМ. Однако, при ее использовании наблюдалась тенденция к стабилизации размера опухоли.

4. Экспрессии гена Bexl при обработке клеток ингибиторами AKT и ИМ воспроизводимо увеличивалась, однако, это проявлялось только на уровне мРНК во всех модельных линиях клеток. Белка эндогенного Bexl в клетках не обнаружено. Подавление экспрессии гена Bexl уменьшало выживаемость клеток, но не затрагивало реакцию на обработку ингибиторами. Выявленное взаимодействие сверхэкс-прессированого белка Bexl с антиапоптотическим белком Bcl-XL, может быть интересно в контексте лечения глиом ИМ, поскольку основное место экспрессии Bexl — ткани головного мозга.

5. Скрининг на изменения, вызванные обработкой ИМ и ингибиторами АКТ, в тотальном протеоме ИМ-чувствительных и ИМ-резистентных клеток,

позволил выявить увеличение уровня белка PDCD4, который активирует ингибитор клеточного цикла p27 и активирует апоптоз. Активация PDCD4 была ассоциирована с лучшим эффектом терапии комбинации ИМ/АКТ ингибитором. Эти же данные выявили инактивацию транскрипционного фактора Elkl и падения уровня экспрессии его мишеней, среди которых есть киназы (BMP2K), элементы каскада NfkB (CHUK) и регуляторы деградации самого рецептора КИТ (Cbl). Эти изменения могут представлять интерес для исследования терапии ГИСО, но явно не являются определяющими для эффекта исследованных ингибиторов.

6. Данные киномного профилирования показывают активацию AKT не только в KIT-мутантных, но и в других типах ГИСО: "дикого типа" и PDGFRa - мутантных. Эти данные могут служить обоснованием для клинических испытаний AKT ингибиторов в терапии всех видов ГИСО. Комбинация AKT ингибитора с ИМ не позволяет преодолеть резистентность к ИМ, обусловленную стерической мутацией KIT рецептора.

8.2 Научно-практические рекомендации

Поскольку новые ингибиторы AKT продемонстрировали эффективность в виде монотерапии in vitro и in vivo, представленная научно-исследовальская работа дает основания для новых исследований, посвященный комбинированию ингибиторов AKT с другими терапевтическими средствами в ГИСО. Так, на основании полученных в данном доклиническом исследовании данных было получено разрешение на проведение клинических испытаний AKT ингибитора ARQ092 в комбинации с иммунотерапией PD1 ингибитором у больных с ГИСО.

Оба исследованных AKT ингибитора продемонстрировали синергизм in vitro в отношении выживаемости клеток ГИСО. Использование комбинации продемонстрировало тренд к лучшей стабилизации размера опухолей во всех использованных

моделях, однако статистическая значимость при сравнении комбинации и стандартной терапии ИМ была достигнута только в ИМ-чувствительной модели. Стоит подчеркнуть активность комбинации и положительную динамику у животных с первично ИМ-резистентными KIT-мутантными опухолями, которые представляют особую сложность в клинической практике. Низкая эффективность комбинации новых АКТ-ингибиторов и ИМ в моделях, резистентных к ИМ не является удивительной, однако полученная положительная динамика дает обоснования для доклинического (и клинического) исследования АКТ-ингибиторов в сочетании с новыми ингибиторами ре-цепторных тирозинкиназ, такими как рипретиниб и авапритиниб. Рипретиниб не был одобрен на момент проведения нашего исследования, однако, сейчас показана его высокая ингибирующая эффективность в отношении мутантных форм KIT, нечувствительных к ИМ. Второй новый тирозинкиназный ингибитор авапритиниб так же должен быть исследован в комбинации с АКТ ингибиторами. в PDGFRa-мутантных ГИСО, поскольку наши данные показывают заметную сверхактивацию AKT в этом виде ГИСО. Кроме того, киномное профилирование и масс спектрометрия указывают на возможность и обоснованность использования AKT ингибиторов не только в PDG-FRa мутантных формах ГИСО, но и в ГИСО "дикого типа" в виде монотерапии. Это особенно важно, если учесть, что поскольку в этрм типе ГИСО нет мутаций в рецеп-торных тирозин-киназах, то до сих нет и успешной терапевтической стратегии.

Кроме того, полученные данные показали, что Bex1 достаточно мало экспрес-сируется в ГИСО, однако играет роль в поддержании клеточной жизнеспособности. Данные не подтвердили предположения о роли Bexl в ответе на комбинацию AKT ингибитора, однако выявили его взаимодействие и, возможно, секвестрацию анти-апоптотического фактора Bcl-XL. Это оказалось не основным механизмом действия новых ингибиторов, однако эти данные могут оказаться критически важными для изучения лейкозов и глиом, а также других онкологических заболеваний головного мозга, где Bex1 экспрессируется на высоком уровне. Посколькую использование

иматиниба при лечении опухолей головного мозга активно изучаемаая тема, данные о влиянии иматиниба на экспрессию проапоптотического фактора Bexl становятся особенно важными, потому что открывают новыевозмодности для комбинирования ИМ с другими апоптоз-активирующими агентами для лечения этой группы заболеваний.

Значительную роль в действии комбинации АКТ-ингибитора и ИМ по результатам представленной работы играет PDCD4, этот белок вовлечен в регуляцию клеточного цикла и апоптоза. Эти данные указывают на целесообразность исследований ингибиторов АКТ в комбинации с химиотерапевтическими препаратами, регулирующими эти процессы. Кроме того, надавние исследования выявили значительную эффективность ингибирования белка Weel, регулирующего клеточный цикл, в терапии ГИСО [Ye и др., 2021]. Оба эти исследования служат обоснованием для комбинирования ингибиторов Weel и AKT в различных типах ГИСО, с целью лучшего подавления клеточного цикла, независимо от устойчивости основного мутантного рецептора к таргетной терапии.

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

7-AAD - 7-аминоактиномицином

AGC - автоматический контроль усиления (automatic gain control) AKT - протеиназа B

BioID - метод биотиновой идентификации белковых взаимодействий (biotin identification)

BSA - бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin) CI (КИ) - комбинационный индекс (combination index) DTT - дитиотреитол (Dithiothreitol)

EDTA - этилендиаминтетрауксусной кислоты (ethylenediaminetetraacetic acid)

FDA - Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (US Food and Drug Administration)

FDR - частота ложного обнаружения (false discovery rate)

HCD - энергия диссоциации столкновением (higher-energy collisional dissociation)

HEPES - 2- [4- (2-гидроксиэтил) пиперазин-1-ил] этансульфоновая кислота (2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1 -yl]ethanesulfonic acid)

IAA - йодацетамид (iodoacetamide)

KIT - рецептор фактора стволовых клеток (SCF, CD117)

MIB/MS - метод анализа кинома с использованием гранул, конъюгированных c множеством киназных ингибиторов, и последующей масс-спектрометрии (multiplexed kinase inhibitor beads and mass spectrometry)

PBS - натрий-фосфатный буффер (phosphate buffered saline)

PDCD4 - programmed cell death protein 4

PDGFRa - рецептор фактора роста тромбоцитов типа альфа (platelet derived growth factor receptor alpha)

SD - страндартное отклонение (standart deviation)

TCEP - tрис(2-карбоксиэтил)фосфин (tris(2 carboxyethyl)phosphine)

АТФ - аденозинтрифосфат

БДУ - бромдезоксиуридин

БКА - бикарбонат аммония

БХК - бицинхониновая кислота

ВЭЖХ-МС/МС - высокоэффективная жидкостная хроматография и тандемная масс-спектрометрия

ГИСО - гастроинтестинальная стромальная опухоль

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислома

ИГХ - иммуногистохимический анализ

ИМ - иматиниба мезилат

кДНК - кодирующая ДНК

кПЦР - количественная ПЦР

миРНК - микроРНК

ПНР - приоритетное направление развития ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиноваякислота

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Орлова Р., Кащенко В., Глузман М. Гастроинтестинальная стромальная опухоль: патогенез, диагностика и лечение. : Издательство Санкт-Петербургского университета., 2019. С. 3-44.

2. Abbaspour Babaei M. и др. Receptor tyrosine kinase (c-Kit) inhibitors: a potential therapeutic target in cancer cells // Drug Des. Devel. Ther. 2016. Т. 10. С. 2443-2459.

3. Aggarwal B. B., Ichikawa H. Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives // Cell Cycle. 2005. Т. 4. № 9. С. 1201-1215.

4. Ashwell M. A. и др. Discovery and optimization of a series of 3-(3-phenyl-3H-imidazo[4,5-b] pyridin-2-yl)pyridin-2-amines: Orally bioavailable, selective, and potent ATP-independent Akt inhibitors // J. Med. Chem. 2012. Т. 55. № 11. С. 5291-5310.

5. Bauer S. и др. KIT oncogenic signaling mechanisms in imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumor: PI3-kinase/AKT is a crucial survival pathway // Oncogene. 2007. Т. 26. № 54. С. 7560-7568.

6. Bebien M. и др. Immediate-early gene induction by the stresses anisomycin and arsenite in human osteosarcoma cells involves MAPK cascade signaling to Elk-1, CREB and SRF // Oncogene. 2003. Т. 22. № 12. С. 1836-1847.

7. Becher R. и др. Phase II Trial of Orally Administered Miltefosine in Advanced Colorectal Cancer // Oncol. Res. Treat. 1993. Т. 16. № 1. С. 11-15.

8. Belinsky M. G., Rink L., Mehren M. von. Succinate dehydrogenase deficiency in pediatric and adult gastrointestinal stromal tumors // Front. Oncol. 2013. Т. 3 MAY.

9. Besnard A. и др. Elk-1 a Transcription Factor with Multiple Facets in the Brain // Front. Neurosci. 2011. Т. 5. № MAR. С. 35.

10. Bhatia R. Chapter 67 - Chronic Myeloid Leukemia // Hematology (Seventh Edition) / nog peg. R. Hoffman h gp. : Elsevier, 2018. C. 1055-1070.

11. Bhullar K. S. h gp. Kinase-targeted cancer therapies: progress, challenges and future directions // Mol. Cancer. 2018. T. 17. № 1. C. 48.

12. Bilodeau M. T. h gp. Allosteric inhibitors of Akt1 and Akt2: A naphthyridinone with efficacy in an A2780 tumor xenograft model // Bioorganic Med. Chem. Lett. 2008. T. 18. № 11. C. 3178-3182.

13. Blanke C. D. h gp. Long-term results from a randomized phase II trial of standard- versus higher-dose imatinib mesylate for patients with unresectable or metastatic gastrointestinal stromal tumors expressing KIT // J. Clin. Oncol. 2008. T. 26. № 4. C. 620-625.

14. Blay J. Y. h gp. Ripretinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumours (INVICTUS): a double-blind, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial // Lancet Oncol. 2020. T. 21. № 7. C. 923-934.

15. Blitterswijk W. J. Van, Verheij M. Anticancer mechanisms and clinical application of alkylphospholipids // Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Biol. Lipids. 2013. T. 1831. № 3. C. 663-674.

16. Boichuk S. h gp. Inhibition of akt-signaling sensitizes soft tissue sarcomas (STS) and gastrointestinal stromal tumors (GIST) to doxorubicin via targeting of homologymediated DNA repair // Int. J. Mol. Sci. 2020. T. 21. № 22. C. 1-21.

17. Bosbach B. h gp. Direct engagement of the PI3K pathway by mutant KIT dominates oncogenic signaling in gastrointestinal stromal tumor // Proc. Natl. Acad. Sci. 2017. T. 114. № 40. C. E8448-E8457.

18. Brown A. L., Kay G. F. Bex1, a gene with increased expression in parthenogenetic embryos, is a member of a novel gene family on the mouse X chromosome. // Hum. Mol. Genet. 1999. T. 8. № 4. C. 611-9.

19. Casali P. G. h gp. Gastrointestinal stromal tumours: ESMO-EURACAN Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up // Ann. Oncol. 2018. T. 29. № Supplement_4. C. 68-78.

20. Cassier P. A. h gp. Outcome of patients with platelet-derived growth factor receptor alpha-mutated gastrointestinal stromal tumors in the tyrosine kinase inhibitor era // Clin. Cancer Res. 2012. T. 18. № 16. C. 4458-4464.

21. Chang T. T., Chou T. C. Rational approach to the clinical protocol design for drug combinations: a review. // Acta Paediatr. Taiwan. 2000. T. 41. № 6. C. 294-302.

22. Chao W. R. h gp. Computer-aided rational drug design: A novel agent (SR13668) designed to mimic the unique anticancer mechanisms of dietary indole-3-carbinol to block Akt signaling // J. Med. Chem. 2007. T. 50. № 15. C. 3412-3415.

23. Charville G. W., Longacre T. A. Surgical Pathology of Gastrointestinal Stromal Tumors: Practical Implications of Morphologic and Molecular Heterogeneity for Precision Medicine // Adv. Anat. Pathol. 2017. T. 24. № 6. C. 336-353.

24. Chetty R., Serra S. Molecular and morphological correlation in gastrointestinal stromal tumours (GISTs): an update and primer // J. Clin. Pathol. 2016. T. 69. № 9. C. 754-760.

25. Chinni SR and Sarkar FH. Akt inactivation is a key event in indole-3-carbinol-induced apoptosis in PC-3 cells | Request PDF // Ckinical Cancer Res. 2002. T. 8. № 4. C. 12281236.

26. Chou A. h gp. Succinate dehydrogenase-deficient GISTs are characterized by IGF1R overexpression // Mod. Pathol. 2012. T. 25. № 9. C. 1307-1313.

27. Chou T., Biosoft M. H.-C. (England): A., 1996 undefined. CalcuSyn: Windows software for dose effect analysis.

28. Clive S., Gardiner J., Leonard R. C. F. Miltefosine as a topical treatment for cutaneous

metastases in breast carcinoma // Cancer Chemotherapy and Pharmacology. : Springer, 1999. C. S29-S30.

29. Coe T. M., Sicklick J. K. Epidemiology of GIST // Gastrointestinal Stromal Tumors: Bench to Bedside / nog peg. C. R. Scoggins, C. P. Raut, J. T. Mullen. Cham: Springer International Publishing, 2017. C. 7-15.

30. Cohen M. H. h gp. Approval Summary for Imatinib Mesylate Capsules in the Treatment of Chronic Myelogenous Leukemia // Clin. Cancer Res. 2002. T. 8. № 5. C. 935-942.

31. Corless C. L., Barnett C. M., Heinrich M. C. Gastrointestinal stromal tumours: origin and molecular oncology // Nat. Rev. Cancer. 2011. T. 11. № 12. C. 865-878.

32. Cox J. h gp. Accurate Proteome-wide Label-free Quantification by Delayed Normalization and Maximal Peptide Ratio Extraction, Termed MaxLFQ // Mol. Cell. Proteomics. 2014. T. 13. № 9. C. 2513-2526.

33. Croom K. F., Perry C. M. Imatinib mesylate: In the treatment of gastrointestinal stromal tumours // Drugs. 2003. T. 63. № 5. C. 513-522.

34. Cruzalegui F. H., Cano E., Treisman R. ERK activation induces phosphorylation of Elk-1 at multiple S/T-P motifs to high stoichiometry // Oncogene. 1999. T. 18. № 56. C. 79487957.

35. DeMatteo R. P. h gp. Two Hundred Gastrointestinal Stromal Tumors // Ann. Surg. 2000. T. 231. № 1. C. 51.

36. DeMatteo R. P. h gp. Placebo-Controlled Randomized Trial of Adjuvant Imatinib Mesylate Following the Resection of Localized, Primary Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST) // Lancet. 2009. T. 373. № 9669. C. 1097-1104.

37. Demetri G. D. h gp. NCCN Task Force Report: Optimal Management of Patients with Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST)—Update of the NCCN Clinical Practice Guidelines

C. 40.

38. Demetri G. D. h gp. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors // N. Engl. J. Med. 2002. T. 347. № 7. C. 472-480.

39. Demetri G. D. h gp. Efficacy and safety of sunitinib in patients with advanced gastrointestinal stromal tumour after failure of imatinib: a randomised controlled trial // Lancet. 2006. T. 368. № 9544. C. 1329-1338.

40. Demetri G. D. h gp. Efficacy and safety of regorafenib for advanced gastrointestinal stromal tumours after failure of imatinib and sunitinib (GRID): an international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase 3 trial // Lancet (London, England). 2013. T. 381. №2 9863. C. 295-302.

41. Dhillon S. Avapritinib: First Approval // Drugs. 2020. T. 80. № 4. C. 433-439.

42. Ding L. h gp. An essential role of PDCD4 in progression and malignant proliferation of gastrointestinal stromal tumors // Med. Oncol. 2012. T. 29. № 3. C. 1758-1764.

43. Do K. h gp. Biomarker-driven phase 2 study of MK-2206 and selumetinib (AZD6244, ARRY-142886) in patients with colorectal cancer // Invest. New Drugs. 2015. T. 33. № 3. C. 720-728.

44. Dorlo T. P. C. h gp. Miltefosine: A review of its pharmacology and therapeutic efficacy in the treatment of leishmaniasis // J. Antimicrob. Chemother. 2012. T. 67. № 11. C. 25762597.

45. Eisenberg B. L., Trent J. C. Adjuvant and neoadjuvant imatinib therapy: Current role in the management of gastrointestinal stromal tumors // Int. J. Cancer. 2011. T. 129. № 11. C. 2533-2542.

46. Emile J. F. h gp. Frequencies of KIT and PDGFRA mutations in the MolecGIST prospective population-based study differ from those of advanced GISTs // Med. Oncol.

2012. T. 29. № 3. C. 1765-1772.

47. Estrada A. C. h gp. Tirucallic acids are novel pleckstrin homology domain-dependent akt inhibitors inducing apoptosis in prostate cancer cells // Mol. Pharmacol. 2010. T. 77. № 3. C. 378-387.

48. Falkenhorst J., Hamacher R., Bauer S. New therapeutic agents in gastrointestinal stromal tumours // Curr. Opin. Oncol. 2019. T. 31. № 4. C. 322-328.

49. Fang Z. h gp. Discovery of inter-domain stabilizers-a novel assay system for allosteric Akt inhibitors // ACS Chem. Biol. 2015. T. 10. № 1. C. 279-288.

50. FDA. HIGHLIGHTS OF PRESCRIBING INFORMATION: QINLOCK. , 2020.

51. Ferraro D., Zalcberg J. Regorafenib in gastrointestinal stromal tumors: Clinical evidence and place in therapy // Ther. Adv. Med. Oncol. 2014. T. 6. № 5. C. 222-228.

52. Filonenko D. A., Medvedeva B. M., Meshcheryakov A. A. Avapritinib: a new tyrosine kinase inhibitor for treatment of advanced gastrointestinal stromal tumors. The literature review and clinical case // J. Mod. Oncol. 2021. T. 22. № 4. C. 96-100.

53. Floris G. h gp. A potent combination of the novel PI3K inhibitor, GDC-0941, with imatinib in gastrointestinal stromal tumor xenografts: Long-lasting responses after treatment withdrawal // Clin. Cancer Res. 2013. T. 19. № 3. C. 620-630.

54. Fruman D. A., Rommel C. PI3K and cancer: Lessons, challenges and opportunities // Nat. Rev. Drug Discov. 2014. T. 13. № 2. C. 140-156.

55. Gao Y. h gp. Mechanical strain promotes skin fibrosis through LRG-1 induction mediated by ELK1 and ERK signalling // Commun. Biol. 2019. T. 2. № 1.

56. Garcia-Valverde A. h gp. Preclinical activity of PI3K inhibitor copanlisib in gastrointestinal stromal tumor // Mol. Cancer Ther. 2020. T. 19. № 6. C. 1289-1297.

57. George S. h gp. Avapritinib in Patients With Advanced Gastrointestinal Stromal Tumors

Following at Least Three Prior Lines of Therapy // Oncologist. 2021. C. onco.13674.