Персонализированный подход к выбору тактики лечения больных злокачественными новообразованиями челюстно-лицевой области и шеи на основе наиболее значимых клинических и молекулярных маркеров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.14, доктор наук Кутукова Светлана Игоревна

• Кутукова Светлана Игоревна
• доктор наук
• 2022

Оглавление диссертации доктор наук Кутукова Светлана Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Заболеваемость плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

и злокачественными новообразованиями слюнных желез

1.2 Ассоциация нормальной слизистой оболочки полости рта

с дезоксирибонуклеиновой кислотой вирусов

1.2.1 Цитомегаловирус

1.2.2 Вирус простого герпеса I и II типов

1.2.3 Вирус Эпштейна-Барр

1.2.4 Вирус папилломы человека

1.3 Прогностическая роль вирусной инфекции в течении плоскоклеточного рака

слизистой оболочки полости рта

1.4 Прогностическая роль показателей системного воспаления в течении

плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

и злокачественных новообразований слюнных желез

1.4.1 Роль факторов системного воспаления в течении плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

1.4.2 Роль факторов системного воспаления в течении злокачественных новообразований слюнных желез

1.5 Прогностическая роль микроокружения опухоли в течении

плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

1.6 Прогностическая роль экспрессии лиганда рецептора программируемой

клеточной гибели 1 типа в течение плоскоклеточного рака слизистой

оболочки полости рта и злокачественных новообразований слюнных желез

1.6.1 Роль экспрессии лиганда рецептора программируемой клеточной гибели

1 типа в течении плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

1.6.2 Роль экспрессии лиганда рецептора программируемой клеточной гибели

1 типа в течении злокачественных новообразований слюнных желез

1.7 Роль экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста 2 типа

в прогнозе течения злокачественных новообразований слюнных желез

1.8 Молекулярно-генетический профиль злокачественных новообразований

слюнных желез

1.8.1 Роль мутации в гене RET в течении злокачественных новообразований

слюнных желез

1.8.2 Роль мутации в генах семейства NTRK в течении злокачественных опухолей слюнных желез

1.8.3 Роль мутации в гене ALK в течении злокачественных новообразований слюнных желез

Глава 2 ОБЩИЕ МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Общая характеристика клинического материала

2.1.1 Характеристика общей когорты больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

2.1.2 Характеристика общей когорты больных доброкачественными

и злокачественными новообразованиями слюнных желез

2.1.3 Характеристика группы здоровых добровольцев

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методы оценки клинико-лабораторных показателей

2.2.2 Методика морфологического исследования

2.2.3 Методика проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени

с целью определения наличия дезоксирибонуклеиновой кислоты вирусов

2.2.4 Иммуногистохимическое исследование

2.2.5 Определение мутаций в генах RET, ALK, ROS-1, MET, NTRK1, 2,

в опухолях слюнных желез

2.2.6 Методика оценки эффективности лечения пациентов

2.2.7 Методика статистического анализа

2.3 Результаты анализа общей когорты больных плоскоклеточным раком

слизистой оболочки полости рта

2.3.1 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от демографических показателей больных и клинико-лабораторных характеристик плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

2.3.2 Результаты лечения общей когорты больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

Глава 3 ИССЛЕДОВАНИЕ АССОЦИАЦИИ ПЛОСКОКОЛЕТОЧНОГО РАКА

СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА С ВИРУСАМИ

3.1 Материал и методы

3.1.1 Общая характеристика больных

3.1.2 Результаты выявления дезоксирибонуклеиновой кислоты вирусов

путем проведения полимеразной цепной реакции

3.2 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком

слизистой оболочки полости рта

3.2.1 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от ассоциации с вирусной дезоксирибонуклеиновой кислотой

Глава 4 ИССЛЕДОВАНИЕ ФАКТОРОВ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛЕНИЯ И УРОВНЯ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ У БОЛЬНЫХ ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА

4.1 Материал и методы

4.1.1 Общая характеристика больных

4.1.2 Оценка факторов системного воспаления

4.2 Результаты исследования

4.2.1 Результаты анализа общих реакций организма пациентов

с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

4.2.2 Результаты оценки диагностической значимости факторов системного воспаления пациентов с плоскоклеточным раком

слизистой оболочки полости рта

4.3 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком

слизистой оболочки полости рта

4.3.1 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от факторов системного воспаления (результаты однофакторного анализа)

4.3.2 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от факторов системного воспаления (результаты многофакторного анализа)

Глава 5 ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА ОПУХОЛИ И ЕЕ МИКРООКРУЖЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ПЛОСКОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ

СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА

5.1 Материал и методы

5.1.1 Общая характеристика больных

5.1.2 Оценка иммунологического статуса опухоли и ее микроокружения

5.2 Результаты исследования

5.2.1 Результаты анализа иммунологического статуса опухоли ее микроокружения больных плоскоклеточным раком

слизистой оболочки полости рта

5.2.2 Результаты анализа экспрессии лиганда рецептора программируемой клеточной гибели 1 типа в опухоли и ее микроокружении больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

5.2.3 Результаты оценки диагностической значимости иммунологического статуса опухоли и ее микроокружения у больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

5.2.4 Результаты оценки диагностической значимости экспрессии лиганда рецептора программируемой клеточной гибели 1 типа у больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

5.3 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком

слизистой оболочки полости рта

5.3.1 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от иммунологического микроокружения опухоли и экспрессии лиганда рецептора программируемой клеточной гибели 1 типа

(результаты однофакторного анализа)

5.3.2 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от иммунологического микроокружения опухоли и экспрессии лиганда рецептора программируемой клеточной гибели 1 типа

(результаты многофакторного анализа)

Глава 6 ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ТЕЧЕНИЯ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОГО РАКА СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ПОЛОСТИ РТА, АССОЦИИРОВАННОГО С ВИРУСОМ ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА

6.1 Материал и методы

6.1.1 Общая характеристика больных

6.1.2 Оценка влияния экспрессии белка р16тк4а на течение плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

6.2 Результаты исследования

6.2.1 Клинико-морфологические характеристики больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

в зависимости от статуса р16ink4a в опухоли

6.2.2 Иммунологические характеристики плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта в зависимости от экспрессии

белка р16ink4a

6.2.3 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости

от экспрессии белка р16INK4a

Глава 7 ИЗУЧЕНИЕ КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ СЛЮННЫХ ЖЕЛЕЗ

7.1 Общая характеристика пациентов, включенных в исследование

7.2 Оценка факторов системного воспаления и уровня эндогенной интоксикации

у больных злокачественными новообразованиями слюнных желез

7.2.1 Результаты анализа факторов системного воспаления и уровня эндогенной интоксикации больных злокачественными

новообразованиями слюнных желез

7.2.2 Результаты оценки диагностической значимости факторов системного воспаления пациентов с плоскоклеточным раком

слизистой оболочки полости рта

7.2.3 Отдаленные результаты лечения больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от факторов системного воспаления (результаты однофакторного анализа)

7.2.4 Отдаленные результаты лечения больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от факторов системного воспаления (результаты многофакторного анализа)

7.3 Результаты морфологического и иммуногистохимического анализа

злокачественных новообразований слюнных желез

7.3.1 Оценка уровня экспрессии рецептора эпидермального фактора роста

2 типа в злокачественных новообразованиях слюнных желез

7.3.2 Оценка прогностической значимости экспрессии лиганда рецептора программируемой клеточной гибели 1 типа у больных

злокачественными новообразованиями слюнных желез

7.4 Молекулярно-генетический профиль злокачественных новообразований

слюнных желез

7.4.1 Встречаемость мутаций в злокачественных новообразованиях

слюнных желез

7.4.2 Характеристика больных злокачественными новообразованиями слюнных желез с наличием мутаций в структуре опухоли

7.4.3 Выживаемость больных злокачественными новообразованиями

слюнных желез в зависимости от мутационного статуса опухоли

Глава 8 РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ВЫБОРА ОПТИМАЛЬНОЙ ТАКТИКИ ПЕРВИЧНОГО ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ

8.1 Разработка алгоритма выбора оптимальной тактики первичного лечения

для больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

8.1.1 Общая характеристика больных

8.1.2 Общая характеристика клинико-лабораторных и морфологических факторов прогноза течения плоскоклеточного рака

слизистой оболочки полости рта

8.1.3 Результаты оценки диагностической значимости факторов неблагоприятного прогноза у больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

8.2 Разработка алгоритма выбора оптимальной тактики первичного лечения

для больных злокачественными новообразованиями слюнных желез

8.2.1 Общая характеристика клинико-лабораторных и морфологических факторов прогноза течения злокачественных новообразований слюнных желез

8.2.2 Результаты оценки диагностической значимости факторов неблагоприятного прогноза у больных злокачественными новообразованиями слюнных желез

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение А (справочное). Оценка факторов неблагоприятного прогноза

плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

Приложение Б (справочное). Оценка факторов неблагоприятного прогноза

злокачественных опухолей слюнных желез

Приложение В (справочное). Патент №

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Персонализированный подход к выбору тактики лечения больных злокачественными новообразованиями челюстно-лицевой области и шеи на основе наиболее значимых клинических и молекулярных маркеров»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Злокачественные новообразования слизистой оболочки полости рта и слюнных желез занимали семнадцатое место в структуре общей онкологической заболеваемости в России в 2019 году и седьмое - в структуре смертности от злокачественных новообразований (до 32,3% больных погибает в течение первого года, после установления диагноза) [4]. Несмотря на практически полную доступность опухолей данной локализации для визуального контроля как самим пациентом, там и любым специалистом, к которому он обращается за медицинской помощью, 62,8% больных попадают на прием к онкологу уже в ГГГ-ГУ стадиях заболевания, что значительно увеличивает риск неудач первичного лечения и вероятность наступления смерти от злокачественного новообразования. Но и у больных с ранними (Г, ГГ) стадиями заболевания общая 5-летняя выживаемость не превышает 89,6% [4].

Выбор тактики лечения основывается на действующих клинических рекомендациях и должен учитывать стадию опухолевого процесса как основного показателя для оценки возможности проведения хирургического лечения как наиболее радикального и предпочтительного метода противоопухолевого воздействия, с последующей оценкой неблагоприятных гистологических признаков (НГП), таких, как состояние края резекции, гистологического строения и степени дифференцировки опухоли, наличия периваскулярной, перилимфатической и перинеальной инвазии, а также морфологических признаков экстранодального распространения опухоли [2, 3]. Однако, сейчас уже очевидно, что прогноз течения заболевания и риск развития его прогрессирования определяют множество факторов, которым уделяется все больше и больше внимания в течение последних 10-15 лет.

Одним из первых факторов, которым стала отводиться значительная роль в этиологии и прогнозе злокачественных новообразований слизистой оболочки полости рта, стали онкогенные вирусы [18, 78]. Изначально, у нас не определено значение ассоциации нормальной слизистой оболочки полости рта с основными типами онкогенных вирусов, хотя их изучению посвящено немало работ [33, 51, 79, 112, 119, 140]. Но и ассоциация опухолевых процессов с ДНК основных типов онкогенных вирусов все еще не имеет однозначного трактования [57, 84, 167, 176]. Некоторые работы определяют факт наличия в структуре опухоли вирусной ДНК как фактор, ухудшающий прогноз заболевания [57, 185], ряд авторов, напротив, говорят о положительном влиянии ассоциации вируса и злокачественной опухоли полости рта [24, 81].

Но существуют и данные о полном отсутствии роли вирусной инфекции в возникновении и течении эпителиального опухолевого процесса [141, 176].

Еще одним важным фактором, влияющим на течение эпителиальных злокачественных новообразований, является уровень системного воспаления в целом, и некоторые его показатели, в частности [1]. Одни авторы рекомендуют оценивать отдельные показатели, характеризующие уровень системной воспалительной реакции организма больного [99, 138], другие - рассчитывать относительные индексы, свидетельствующие об уровне эндогенной интоксикации в целом [1, 8, 23, 43, 156], третьи - оценивать только серологические маркеры воспаления [9, 190]. К сожалению, данные о влиянии воспаления на прогноз эпителиальных опухолей слизистой оболочки полости рта и слюнных желез противоречивы и у нас нет однозначного маркера (или группы маркеров), которые можно использовать как реальный критерий оценки прогноза заболевания на этапе первичной диагностики с целью выбора оптимальной тактики лечения.

Опухолевое микроокружение также является тем фактором, который может оказывать значимое влияние на прогноз эпителиальных злокачественных новообразований различных локализаций. Наиболее значимыми компонентами микроокружения следует рассматривать CD8-Т-лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, а также нейтрофилы и эозинофилы, уровень которых в структуре самой опухоли и окружающей ее строме может оказать значимое влияние на течение заболевания [10, 35, 120, 170, 183, 184]. Большинство авторов говорят о значимом благоприятном влиянии высокого уровня экспрессии CD8-TILs на выживаемость больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта [46, 47, 155]. Однако, встречаются работы, свидетельствующие как о негативном [193] влиянии опухолевого микроокружения на прогноз заболевания, так и о полном отсутствии какого-либо влияния данного фактора на течение опухолевого процесса [38, 150, 192].

Роль экспрессии лиганда рецептора программируемой клеточной гибели 1 типа (PD-L1) в прогнозе злокачественных новообразований слизистой оболочки полости рта и слюнных желез также неоднозначна. Наличие экспрессии PD-L1, по мнению большинства авторов, является фактором неблагоприятного течения как плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта [25, 37, 165], так и аденогенного рака слюнных желез [145-147, 157, 160]. Кроме того, анализируя представленные на сегодняшний момент данные, мы встречаем и работы, свидетельствующие как о позитивном влиянии положительной экспрессии PD-L1 на течение эпителиального опухолевого процесса [41, 129], так и полном отсутствии этого влияния на прогноз заболевания [42, 161].

Многообразие морфологических форм злокачественных новообразований слюнных желез и их молекулярно-генетические особенности обращают на себя все больше и больше

внимания не только как прогностические, но и, в большей степени, как предиктивны факторы течения заболевания. Одним из первых маркеров, который изучался у больных аденогенным раком слюнных желез, стала экспрессия рецептора эпидермального фактора роста 2 типа (HER2/neu). На первых этапах оценивалась прогностическая ценность данного маркера в общей когорте больных злокачественными новообразованиями слюнных желез [21, 92]. C 2000-х годов авторы начинают выделять только отдельные подтипы аденогенного рака, имеющие на мембране опухолевых клеток рецепторы HER2/neu [80, 90], причем прогностическая ценность их неоднозначна [14, 94, 178]. Введение в клиническую практику все более широких возможностей диагностики дало нам представление о прогностической, и самое главное, предиктивной ценности мутаций отдельных генов, знание которых помогает нам в выборе терапии тем больным, которым уже не доступно хирургическое вмешательство [29, 121]. Наличие мутации в киназном домене гена RET [44, 123, 143], классического слияния генов семейства NTRK [5, 64, 121, 132] или транслокации в гене ALK [20, 29] также играют определенную роль как в прогнозе аденогенного рака слюнных желез, так и в формировании ответа распространенных форм опухоли на проводимую терапию.

Таким образом, выбор оптимальной тактики первичного лечения больным эпителиальными злокачественными новообразованиями слизистой оболочки полости рта и слюнных желез на основе определения значимых клинических, лабораторных и молекулярных маркеров является важной и не решенной проблемой современной онкостоматологии, что делает исследование, посвященное поиску наиболее информативных прогностических маркеров и оптимизации алгоритмов выбора тактики первичного лечения больных, актуальным и современным.

Цель исследования

Повышение эффективности лечения больных злокачественными новообразованиями органов головы и шеи за счет персонифицированного похода к выбору лечебной тактики с помощью оценки клинических и молекулярных маркеров прогноза течения заболевания.

Задачи исследования

1. Проанализировать структуру больных злокачественными новообразованиями челюстно-лицевой области и шеи, и изучить непосредственные и отдаленные результаты лечения при существующих протоколах выбора тактики лечения.

2. Определить частоту выявления ассоциации плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта и нормальной слизистой оболочки полости рта с различными типами

вирусов: CMV, EBV, HSV I,II типа, HPV 6,11 и 16, 18 типов с помощью ПЦР в реальном времени и иммуногистохимических методов для выявления их влияния на течение плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта.

3. Изучить гематологические маркеры системной воспалительной реакции (показатели периферической крови, а также их соотношения) и оценить их прогностическую значимость в течении эпителиальных злокачественных новообразований слизистой оболочки полости рта и слюнных желез.

4. Оценить иммунологическое микроокружение плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта (уровень инфильтрации опухоли и ее микроокружения нейтрофилами, эозинофилами и CD8-T-лимфоцитами) и определить его прогностическую ценность.

5. Определить уровень экспрессии лиганда рецептора программируемой клеточной гибели (PD-L1) в опухолевых и иммунных клетках эпителиальных злокачественных новообразований слизистой оболочки полости рта и слюнных желез, и оценить их прогностическую значимость.

6. Определить частоту встречаемости экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста 2 типа (HER-2/neu) и их прогностическую ценность в эпителиальных злокачественных опухолях слюнных желез.

7. Выявить редкие мутации в эпителиальных злокачественных опухолях слюнных желез, определить частоту их встречаемости и прогностическую ценность.

8. По результатам многофакторного анализа выделить независимые клинические, морфологические и молекулярно-генетические параметры, с помощью которых разработать алгоритм оптимального подхода к выбору первичной тактики лечения больных эпителиальными злокачественными новообразованиями слизистой оболочки полости рта и слюнных желез путем расширения показаний для введения в схемы лечения неоадъювантной/индукционной химиотерапии и послеоперационной дистанционной лучевой терапии.

Научная новизна исследования

1. Впервые на значительном клиническом материале произведена оценка частоты ассоциации плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта и нормальной слизистой оболочки полости рта у здоровых добровольцев с основными типами онкогенных вирусов: CMV, EBV, HSV I, II типа, HPV 6,11 и 16, 18 типов с помощью реакции ПЦР в реальном времени, и определена их клиническая ценность.

2. Впервые на значительном клиническом материале произведен сравнительный анализ частоты выявления ассоциации плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта с ВПЧ

16 типа путем ПЦР в реальном времени в нативной опухоли и ИГХ детекцией суррогатного маркера ассоциации - р16тк4а.

3. Впервые на значительном клиническом материале произведена оценка клинико-лабораторных показателей (уровень лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов, тромбоцитов, нейтрофильно-лимфоцитарное отношение, тромбоцитарно-лимфоцитарное отношение, лимфоцитарно-моноцитарное отношение) на этапе первичной постановки диагноза злокачественного новообразования и выявлены независимые значимые неблагоприятные факторы прогноза течения и прогрессирования заболевания.

4. Впервые на значительном клиническом материале произведена оценка иммунологического микроокружения (уровень инфильтрации нейтрофилами, эозинофилами, CD8-Т-лимфоцитами) плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта и определены независимые неблагоприятные факторы прогноза течения и прогрессирования заболевания.

5. Впервые на значительном клиническом материале произведена оценка уровней экспрессии лиганда рецептора программируемой клеточной гибели 1 типа (PD-L1) на опухолевых и иммунных клетках плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта и эпителиальных злокачественных новообразований слюнных желез, и выявлены независимые неблагоприятные факторы прогноза течения и прогрессирования заболевания.

6. Впервые на значительном клиническом материале произведена оценка уровня экспрессии рецептора эпидермального фактора роста 2 типа (HER-2/neu) в структуре эпителиальных злокачественных новообразований слюнных желез, и определена его клиническая ценность.

7. Впервые в опухолях слюнных желез выявлена частота встречаемости мутации в гене ALK, гене RET, генах семейства NTRK и определена их прогностическая ценность.

8. Впервые оптимизирован алгоритм выбора тактики лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта с наличием 4 и более факторов неблагоприятного прогноза с включением неоадъювантной (при проведении последующего хирургического вмешательства) или индукционной (при последующей радикальной ХЛТ) химиотерапии.

9. Впервые оптимизирован алгоритм выбора тактики лечения больных эпителиальными злокачественными новообразованиями слюнных желез с наличием 3 и более факторов неблагоприятного прогноза с включением послеоперационной дистанционной лучевой терапии после радикального хирургического вмешательства.

Теоретическая и практическая значимость работы

В работе получены данные, уточняющие клинико-морфологические и молекулярно-генетические факторы, оказывающие значимое влияние на течение и риск рецидивирования плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта и эпителиальных злокачественных новообразований слюнных желез. Так, ассоциация плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта с основными типами онкогенных вирусов в нативной опухолевой ткани, определенная методом ПЦР в реальном времени является фактором благоприятного прогноза течения заболевания, увеличивающая показатель общей и безрецидивной выживаемости больных. Уровень относительного числа моноцитов периферической крови >9,1% и уровень нейтрофильно-лимфоцитарного соотношения >2,30, совокупный уровень инфильтрации структуры опухоли и ее микроокружения нейтрофилами >39 клеток/мм , полное отсутствие эозинофильной инфильтрации опухоли или регистрация только 1 клетки/мм2, совокупный уровень инфильтрации опухоли и ее микроокружения CD8-Т-лимфоцитами <143 клетки/мм2, полное отсутствие экспрессии лиганда программируемой клеточной гибели 1 типа (PD-L1) на мембране опухолевых клеток или регистрация экспрессии не более, чем на 15% опухолевых клетках являются независимыми неблагоприятными факторами, увеличивающими риск смерти пациентов. А уровень лейкоцитов

<5,23х107л, уровень абсолютного числа лимфоцитов периферической крови <2,88х107л, уровень относительного числа моноцитов >6,96% и уровень абсолютного числа эозинофилов <0,09* 107л, уровень инфильтрации нейтрофилами непосредственного опухолевого микроокружения, >38 клеток/мм2, уровень инфильтрации опухоли CD8-Т-лимфоцитами <48 клеток/мм , уровень инфильтрации микроокружения CD8-T-лимфоцитами <87 клеток/мм являются независимыми неблагоприятными факторами, свидетельствующими о высоком риске прогрессирования заболевания.

Частота выявления гиперэкспрессии рецепторов HER-2/neu в структуре протоковых аденокарцином слюнных желез составила 8,33% и явилась фактором, увеличивающим риск смерти пациентов от данной патологии. Значение комбинированного показателя (CPS), характеризующего экспрессию PD-L1 на опухолевых и иммунных клетках >1, также явилось фактором неблагоприятного прогноза течения заболевания у пациентов с злокачественными новообразованиями слюнных желез. Частота выявления мутации в гене NTRK (классическую перестройку ETV6ex5;NTRK3ex15) в злокачественных новообразованиях слюнных желез составила 3,92%, частота выявления несбалансированной экспрессии ALK в злокачественных новообразованиях слюнных желез составила 3,92%. Наличие мутации ALK является фактором неблагоприятного прогноза, уменьшающий общую выживаемость больных на 92,0 месяца. Частота выявления мутации в гене RET в злокачественных новообразованиях слюнных желез

составила 27,08% и определяет тенденцию к значимому снижению риска рецидивирования злокачественных эпителиальных новообразований слюнных желез.

Полученные результаты позволили разработать алгоритм выбора тактики лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта и эпителиальными злокачественными новообразованиями слюнных желез на основании анализа изученных клинико-морфологических и молекулярно-генетических маркеров.

Методология и методы исследования

Настоящее исследование соответствует принципам Хельсинской декларации [197] и надлежащей клинической практики ICH-GCP [66], одобрено Локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России и является открытым проспективным нерандомизированным популяционным исследованием.

Теоретическая основа работы представлена систематизированным анализом литературы, представленной в базах данных PubMed, Elsevier, Google Schoolar, eLibrary по теме диссертационного исследования.

В практическую часть работы включены данные 428 больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта, 348 больных новообразованиями слюнных желез (из которых 60 пациентов с верифицированным аденогенным раком слюнных желез), которым проводились лечебные и диагностические процедуры в СПб ГБУЗ «Городской клинический онкологический диспансер» и онкологическом отделении № 8 (челюстно-лицевой хирургии) клиники челюстно-лицевой хирургии ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России в период с июня 2010 по июль 2019 гг., а также 50 здоровых добровольцев (без зарегистрированных новообразований любого характера), обратившихся за консультативной или хирургической помощью в клинику челюстно-лицевой хирургии ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России в период с 2012 по 2014 гг. Основными критериями оценки эффективности лечения больных были продолжительность жизни и время без прогрессирования. Общий период наблюдения за больными плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта составил 181,5 месяцев, за больными злокачественными новообразованиями слюнных желез -91,5 месяц, за группой здоровых добровольцев 84,0 месяцев. Расчет объема необходимой выборки производился помощью пакета программ PASS®11 (NCSS, ver. 11.07). Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета прикладных статистических программ STATISTICA® (StatSoft, ver. 12.0), с помощью пакета статистических программ MedCalc® (ver. 20.014) и с помощью программы Microsoft® Exel (ver. 16.16.12).

Положения, выносимые на защиту

1. Ассоциация плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта с основными типами онкогенных вирусов (CMV, EBV, HSV I,II типа, HPV 6,11 и 16, 18 типов), отдельные показатели системного воспаления и уровня эндогенной интоксикации больного, микроокружение опухоли и ее иммуногенность оказывают значимое влияние на прогноз течения и риск развития прогрессирования заболевания больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта.

2. Индукционная (неоадъювантная) химиотерапия снижает риск смерти, обусловленной плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта, в группе больных, у которых выявлено 4 и более дополнительных факторов неблагоприятного прогноза.

3. Уровень эндогенной интоксикации и отдельные показатели системного воспаления, микроокружение опухоли и ее иммуногенность оказывают значимое влияние на течение и риск развития прогрессирования больных эпителиальными злокачественными новообразованиями слюнных желез.

4. Послеоперационная дистанционная лучевая терапия и химиолучевая терапия снижают риск смерти, обусловленную злокачественными новообразованиями слюнных желез, в группе больных, у которых выявлено 2 и более дополнительных факторов неблагоприятного прогноза.

5. Молекулярно-генетический профиль эпителиальных злокачественных новообразований слюнных желез является важным критерием, определяющим прогноз течения заболевания.

Степень значимости и апробации результатов

Значимость полученных результатов определяется большим объемом и репрезентативностью выборки, длительным периодом наблюдением за пациентами, применением современных высокотехнологичных методов диагностики и лечения, обработкой полученных результатов современными методами математической статистики Полученные результаты полностью решают поставленные задачи и логически вытекают из материала и методов исследования. На основании полученных результатов доказаны основные положения и сформулированы выводы. Практические рекомендации полностью обоснованы проведенным исследованием и могут служить руководством к выбору первичной тактики лечения больных эпителиальными злокачественными новообразованиями челюстно-лицевой области и шеи в клинической практике.

Результаты работы доложены на Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2021); Конгрессе с международным участием Российского общества специалистов по опухолям головы и шеи (2014, 2015, 2016, 2017, 2018, 2020); VIII съезде онкологов и радиологов стран СНГ и Евразии (Казань, 2014); 4th International Conference on Innovative Approaches in Head and Neck Oncology (Barcelona, Spain, 2013); The European Cancer Congress (ECCO17 - ESMO38 - ESTRO32), (Amsterdam, Nederland, 2013); 41 Annual congress of European Society of Medical Oncology (ESMO - 2016) (Copenhagen, Denmark, 2016); 42nd Annual congress of European Society of Medical Oncology (ESMO), 08.09.2017-12.09.2017 (Madrid, Spain, 2017).

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследования используются в лечебной работе онкологического отделения № 8 (челюстно-лицевой хирургии) клиники челюстно-лицевой хирургии ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России, в лечебной работе СПб ГБУЗ «Городской клинический онкологический диспансер», в учебной и научной работе кафедры стоматологии хирургической и челюстно-лицевой хирургии и кафедры онкологии ФПО ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 60 печатных работ, в том числе 12 статей в рецензируемых журналах, входящих в перечень журналов, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Минобрнауки России для публикации основных научных результатов диссертаций, 2 из них в рецензируемых научных периодических изданиях, входящих в реферативную базу данных и систему цитирования "Scopus"; получен 1 патент РФ на полезную модель; выполнено 2 государственных задания с формированием итоговых отчетов (Рег. № НИОКР 115091630010; Рег. № НИОКТР АААА-А18-118122590034-0).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертационная работа соответствует пункту 3 паспорта научной специальности 14.01.14 Стоматология и пункту 2 паспорта научной специальности 14.01.12 Онкология, медицинской отрасли науки.

Личный вклад автора

Автор лично принимала участие на всех этапах планирования и выполнения работы. Автором самостоятельно изучена и проанализирована отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все пациенты, которые были включены в исследование, наблюдались лично от момента постановки диагноза. Автор непосредственно принимала участие в проведении морфологического исследования операционного материала. Вирусологическое исследование проведено совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной диагностики ФГБОУ ВО «ПСПбГМУ им. И.П. Павлова» Минздрава России. Иммуногистохимическое исследование выполнено совместно с сотрудниками лаборатории иммуногистохимии ФГБУ «РНЦРХТ им. ак. А.М. Гранова» Минздрава России (руководитель лаборатории - д.м.н. Григорий Александрович Раскин). Молекулярно-генетическое исследование с определением экспрессии выполнено совместно с сотрудниками научной лаборатории молекулярной онкологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России (руководитель лаборатории - член корр. РАН, профессор Евгений Наумович Имянитов). Автором самостоятельно разработан протокол исследования, составлена электронная база данных, проведена статистическая обработка материала, обобщены, систематизированы и проанализированы результаты. В соответствии с полученными данными автором сформулированы выводы, практические рекомендации и оформлена диссертация.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 390 страницах компьютерного текста и состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 96 таблицами и 171 рисунком. Список литературы содержит 198 источников (из них отечественных - 12, иностранных - 186).

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Заболеваемость плоскоклеточным раком слизистой оболочки полсти рта и злокачественными новообразованиями слюнных желез

В последнее десятилетие в России мы наблюдаем, к сожалению, неуклонный рост заболеваемости, а самое главное - смертности, от злокачественных новообразований слизистой оболочки полости рта и слюнных желез. В 2019 году было зарегистрировано уже 9 510 новых случаев заболевания. К сожалению, в 2019 году только у 36,3% больных заболевание было выявлено на I или II стадии, в III стадии заболевание удалось выявить году только у 28,4%, а у 34,4% больных злокачественное поражение полости рта или слюнных железы диагностировано уже в IV стадии. Подобная статистика свидетельствует не только о поздней диагностике заболевания, но и, как следствие, о значимом ухудшении показателей выживаемости больных, диагноз злокачественного заболевания у которых установлен на поздних стадиях. Данный факт подтверждается и общими показателями летальности: в 2019 году доля умерших от злокачественных новообразований слизистой оболочки полости рта и слюнных желез составила 32,3% [4].

В Санкт-Петербурге только за 2019 год было выявлено 425 новых случаев злокачественных новообразований слизистой оболочки полости рта и слюнных желез. Причем, в I и II стадиях заболевания было выявлено всего 40,1% (10,% и 20,5% соответственно), пациенты с III стадией заболевания составили 35,5%, а с IV - 31,3%. Летальность в течение года после установления диагноза злокачественного новообразования составила 30,7% [4].

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Кутукова Светлана Игоревна, 2022 год

о- - 1.

ê

1

ô,

о— .....-4- -+Ч-Ч--

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 CPS

— ¿11

Месяцы - - - >11

Рисунок 152 - Время без прогрессирования больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от комбинированного показателя CPS (порог отсечения=11)

Медиана ВБП больных, у которых значение комбинированного показателя CPS соответствовало значению 11, было меньше порогового уровня или негативным (0), составила 168,0 месяцев (95% ДИ 72,0-168,0), что на 149,0 превышало медиану ВБП больных, значение CPS у которых превышало 11: медиана ВБП 19,0 (95% ДИ 6,0-31,0). Полученные различи были статистически значимыми: р=0,0343, 0Р=0,27 (95% ДИ 0,8-0,91).

Таким образом, на основании результатов проведенного однофакторного анализа, в многофакторную модель оценки влияния рассматриваемых факторов на ПЖ и ВБП больных злокачественными новообразованиями слюнных желез целесообразно включить уровень экспрессии PD-L1 на иммунных клетка, инфильтрирующих опухоль и ее микроокружение, а также комбинированный показатель CPS, совокупный уровень экспрессии PD-L1 в клетках самой опухоли и в иммунных клетках.

Результаты многофакторного анализа влияния экспрессии PD-L1 на показатели

выживаемости больных злокачественными новообразованиями слюнных желез

С целью оценки истинной прогностической значимости рассматриваемых факторов уровней экспрессии PD-L1 на показатели продолжительности жизни и времени без прогрессирования больных злокачественными новообразованиями слюнных желез, все параметры, определенные как значимые в результате однофакторного анализа, были включены в многофакторную модель пропорциональных рисков Кокса.

В модель, оценивающую влияние рассматриваемых факторов на показатель продолжительности жизни больных, были включены уровень экспрессии PD-L1 в иммунных клетках и комбинированный показатель CPS.

В целом, построенная модель обладала статистической значимостью: р=0,0012, а качество построенной модели было хорошим: AUC=0,741±0,080 (95% ДИ 0,593-0,858).

Результаты многофакторного анализа влияния уровней экспрессии PD-L1 на продолжительность жизни больных, проведенного путем построения модели пропорциональных рисков Кокса представлена в таблице 85.

Таблица 85 - Результаты многофакторного регрессионного анализа Кокса для оценки риска смерти у больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от уровней экспрессии PD-L1

Показатель Отношение риска (HR) 95% ДИ p-value (Cox)

PD-L1 на иммунных клетках >1% 6,53 1,81-23,55 0,0042

Комбинированный показатель (CPS) >1

Проведенный многофакторный анализ позволил установить, что единственным независимым показателям, имеющими статистически значимое влияние на продолжительности жизни больных злокачественными новообразованиями слюнных желез, является уровень экспрессии PD-L1 на иммунных клетках, инфильтрирующих опухоль и ее микроокружение.

Влияние уровня экспрессии PD-L1 на иммунных клетках представлено на рисунке 153.

Регистрация уровня экспрессии PD-L1 на иммунных клетках, инфильтрирующих опухоль и ее микроокружение, более 1% увеличивало риск смерти пациента в 6,53 раз (р=0,0042; ОР=6,53: 95% ДИ 1,81-23,55).

80 70 60

»?

£ 50 л

I

8 40

э &

£ 30 20 10 о

о 50 100 150 200 250

Месяцы

Рисунок 153 - Модель относительного риска наступления смерти у больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от уровня PD-L1 на иммунных клетках

В модель, оценивающую влияние рассматриваемых факторов на показатель времени без прогрессирования больных, были включены уровень экспрессии PD-L1 в иммунных клетках и комбинированный показатель CPS.

В целом, построенная модель обладала статистической значимостью: р=0,0408, хотя качество построенной модели было средним: АиС=0,619±0,091 (95% ДИ 0,454-0,766).

Результаты многофакторного анализа влияния уровней экспрессии PD-L1 на время без прогрессирования больных, проведенного путем построения модели пропорциональных рисков Кокса представлена в таблице 86.

Таблица 86 - Результаты многофакторного регрессионного анализа Кокса для оценки риска прогрессирования у больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от уровней экспрессии PD-L1

Показатель Отношение риска (БК) 95% ДИ p-value (Cox)

PD-L1 на иммунных клетках >1% 2,82 1,04-7,62 0,0407

Комбинированный показатель (CPS) >11

Проведенный многофакторный анализ позволил установить, что единственным независимым показателям, имеющими статистически значимое влияние на время без

прогрессирования больных злокачественными новообразованиями слюнных желез, является уровень экспрессии PD-L1 на иммунных клетках, инфильтрирующих опухоль и ее микроокружение.

Влияние уровня экспрессии PD-L1 на иммунных клетках представлено на рисунке 154.

Рисунок 154 - Модель относительного риска наступления прогрессирования у больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от уровня PD-L1

на иммунных клетках

Регистрация уровня экспрессии PD-L1 на иммунных клетках, инфильтрирующих опухоль и ее микроокружение, более 1% увеличивало риск прогрессирования опухолевого процесса в 2,82 раз (р=0,0407; ОР=2,82: 95% ДИ 1,04-7,62).

7.4 Молекулярно-генетический профиль злокачественных новообразований слюнных желез

7.4.1 Встречаемость мутаций в злокачественных новообразованиях слюнных желез

С целью характеристики молекулярно-генетического профиля злокачественных новообразований слюнных желез нами, с помощью ПЦР, произведена оценка экспрессии микроРНК следующих генов в структуре злокачественных новообразований слюнных желез:

RET, ALK, ROS-1, MET, NTRK1, NTRK2, NTRK3. Из всех проанализированных 59 образцов злокачественных новообразований слюнных железе ПЦР удалось провести только для 51, для 8 образцов исследование выполнить не удалось из-за низкого качества выделенной РНК. Частота встречаемости рассматриваемых мутаций в структуре злокачественных новообразований слюнных желез представлена на рисунке 155.

RET 13 (25,49%)

■ Нет мутации ■ ETV6ex5_ NTRKex15 ■ ALK unbal RET

Рисунок 155 - Частота встречаемости мутаций генов RET, ALK, NTRK3

Проведенный молекулярно-генетический анализ позволил выявить в структуре злокачественных новообразований слюнных желез следующие мутации. У большинства больных - 66,67% (34/51) - никаких драйверных мутаций выявлено не было (р=0,0107). У 25,49% (13/51) больных в структуре злокачественных новообразований слюнных железы была выявлена экспрессия микроРНК киназного домена 12-14 экзонов гена RET и это была наиболее часто регистрируемая мутация в рассматриваемой когорте больных (р=0,0021). С помощью ПЦР в 3,92% (2/51) была выявлена несбалансированная экспрессия ALK, однако, без проведения секвенирования нового поколения вариант перестройки установить не удалось. Еще в 2 случаях - 3,92% (2/51) - была обнаружена транслокация в гене NTRK3: в обоих случаях это была классическая перестройка ETV6ex5; NTRK3ex15. Мутаций в генах ROS1, MET, NTRK1, NTRK2 ни в одном случае обнаружено не было. Следует отдельно отметить, что в каждом опухолевом образце была обнаружена экспрессия только 1 типа мутированного гена, сочетаний нескольких мутаций выявлено не было.

7.4.2 Характеристика больных злокачественными новообразованиями слюнных желез

с наличием мутаций в структуре опухоли

Общая характеристика больных злокачественными новообразованиями слюнных желез, у которых была выявлена какая-либо из оцениваемых мутаций в структуре опухоли, представлена в таблице 87.

Таблица 87 - Общая характеристика пациентов, в структуре опухоли которых были выявлены мутации

Признак RET ALK NTRK3

абс., (%) абс., (%) абс., (%)

Общее количество больных 13/51 (24,48%) 2/51 (3,92%) 2/51 (3,92%)

Пол:

мужчины женщины 5 (38,46%) 8 (61,54%) 1 (50,0%) 1 (50,0%) 2 (100%)

Локализация первичного очага: околоушная слюнная железа 10 (76,93%) 2 (100%)

подчелюстная слюнная железа верхняя губа 1 (7,69%) 1 (7,69%) 1 (50,0%)

крыло-челюстная складка 1 (7,69%)

спинка языка 0 1 (50,0%)

Стадия опухолевого процесса (клиническая) I (сТШОМО) II (сТ2ШМ0) III (сТ3ШМ0, сТЗШМО) IVA (сТ2ШМ0, сТ3ШМ0, сТ4аШ-2М0) 2 (15,39%) 5 (38,46%) 5 (38,46%) 1 (7,69%) 2 (100%) 1 (50,0%) 1 (50,0%)

Морфологическая структура протоковая аденокарцинома аденокистозный рак 6 (46,15%) 2 (15,39%) 2 (100%)

светлоклеточная аденокарцинома 2 (15,39%)

миоэпителиальный рак 1 (7,69%)

мукоэпидермоидная карцинома рак из плеоморфной аденомы 1 (7,69%) 1 (7,69%) 2 (100%)

В подгруппе пациентов, в структуре опухоли которых была выявлена мутация в гене RET, было 5 (38,46%) мужчин и 8 (61,54%) женщин; возраст больных варьировал от 44 до 76 лет, средний возраст составил 57,0±10,54 лет (95% ДИ 49,92-64,08). Среди больных с наличием экспрессии гена ALK в структуре опухоли была 1 женщина и 1 мужчина, в возрасте 76 и 57 лет соответственно, а среди больных с наличием в структуре опухоли транслокации в гене NTRK3 обе пациентки были женского пола в возрасте 52 и 49 лет.

У большинства больных первичный опухолевый очаг локализовался в области околоушной слюнной железы: у 76,93% (10/13) в подгруппе больных с мутацией в гене RET (р=0,0070) и у 2 (100%) больных с экспрессией ALK. В подгруппе больных с транслокацией NTRK3 первично были поражены только малые слюнные железы слизистой оболочки верхней губы и спинки языка. Подчелюстная слюнная железа была поражена только в одном случае (7,79%) у больного с мутацией в гене RET. У всех больных с транслокацией NTRK3 первичный опухолевый очаг локализовался в области малых слюнных железы: в 1 случае в области слизистой оболочки верхней губы и в одном случае - на спинке языка. В 2 случаях с наличием мутации в гене RET первично также были поражены малые слюнные железы слизистой оболочки верхней губы (7,69%) и крыло-челюстной складки (7,69%).

У обоих больных с экспрессией ALK опухолевый процесс имел агрессивное и быстрое течения (исходя из анамнестических данных) и первичная постановка диагноза уже была произведена в IVA-стадии заболевания. У больных с транслокацией NTRK3, в одном случае была определена I, а в другом случае - II стадии заболевания. В подгруппе больных с выявленной мутацией в гене RET у 76,92% была определена II (38,46%) и III (38,46%) стадии заболевания, у 15,39% - I и у 7,69% - IVA стадии опухолевого процесса.

Экспрессия гена ALK определялась только в мукоэпидермоидных карциномах слюнных желез, а NTRK3-транслокация - только в протоковых аденокарцниомах. Экспрессия микроРНК киназного домена 12-14 экзонов гена RET в большинстве случаев также была зарегистрирована в структуре протоковой аденокарциномы слюнной железы - 46,15% (6/13; р=0,0893). По два случая выявления приходились на аденокистозный рак (15,39%) и светлоклеточную аденокарциному (15,39%) и по 1 (7,69%) случаю RET-мутация выявлена в структурах миоэпителиального рака, мукоэпидермоидной карциномы и рака из плеоморфной аденомы.

7.4.3 Выживаемость больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от мутационного статуса опухоли

В рамках радикального лечения всем больным, в структуре опухоли которых были выявлены изучаемые мутации, было проведено адекватное хирургическое вмешательство с последующим проведением послеоперационной лучевой терапией (по показаниям у больных с III и IVA стадиями заболевания, согласно действующим клиническим рекомендациям).

Безусловно, особый интерес представляет прогностическая роль обнаруженных нами мутаций в структуре злокачественных новообразований слюнных желез. В связи с чем,

на следующем этапе исследования мы оценили влияние выявленных мутаций на показатели выживаемости больных.

Результаты влияния наличия в структуре злокачественных новообразований слюнных желез экспрессии ALK, транслокации в гене NTRK3 и экспрессии микроРНК киназного домена 12-14 экзонов гена RET на продолжительность жизни больных представлены в таблице 88.

Таблица 88 - Влияние выявленных мутаций на продолжительность жизни больных злокачественными новообразованиями слюнных желез (результаты однофакторного анализа)

Показатель Медиана (мес.) (95% ДИ) Отношение риска (HR) (95% ДИ) p-value (log-rank тест)

Экспрессия ALK: нет есть 105,0 (95% ДИ 105,0-105,0) 13,0 (95% ДИ 13,0-32,0) 0,003 (95% ДИ 0,00007-0,10) 0,0015

Транслокация NTRK3: нет есть 105,0 (95% ДИ 105,0-105,0) 78,0±0,0 (95% ДИ 78,0-78,0) - 0,5757

Экспрессия RET: нет есть 105,0 (95% ДИ 105,0-105,0) 74,0±9,5 (95% ДИ 55,5-92,5) 1,15 (95% ДИ 0,27-4,85) 0,8514

Проведенный однофакторный анализ позволил выявить значимое негативное влияние наличия в структуре опухоли несбалансированной экспрессии гена ALK на прогноз течения заболевания (рисунок 156).

Продолжительность жизни (Kaplan.Meier]

о Complete t Censored

100% 90% 80% 70% 60%

I

5 50%

С <8

40% 30% 20% 10% 0% -10%

0 50 100 150 200 250 300 Экспрессия AI.K

—

Меслць -- - есть

p=0.0015

Jk______

Рисунок 156 - Продолжительность жизни больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от наличия АЕК-экспрессии

Медиана ПЖ больных, в структуре опухоли которых отсутствовала несбалансированная экспрессия ALK составила 105,0 месяцев (95% ДИ 105,0-105,0) и значимо, на 92 месяца, превысила медиану ПЖ больных, в опухоли которых экспрессия ALK была обнаружена (р=0,0015; ОР 0,003: 95% ДИ 0,00007-0,10).

Наличие в структуре злокачественных новообразований слюнных желез транслокации в гене NTRK3 значимого влияния на ПЖ больных не оказывала (рисунок 157).

Продолжительность жизни |Kaplan-Meief)

о Complete + Censored

100%

90%

80%

70%

3 60%

X

л

| 50% ^

40% 30% 20% 10% 0%

\ р=0,5757

ч

50

100 150 Месяцы

200 250 300 NTWO-TpaHcnoicauHS

— пет

-- ГС Т>.

Рисунок 157 - Продолжительность жизни больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от наличия NTRK3-транслокации

Медиана ПЖ больных без наличия мутации в гене NTRK3 составила 105,0 месяцев (95% ДИ 105,0-105,0) и несмотря на то, что в группе больных с выявленной транслокацией NTRK3 медиана ПЖ достигнута не была, средняя продолжительность в этой подгруппе больных составила 78,0±0,0 месяцев (95% ДИ 78,0-78,0) (р=0,5757).

Наличие в структуре злокачественных новообразований слюнных желез экспрессии микроРНК киназного домена 12-14 экзонов гена RET также значимого влияния на показатель ПЖ больных злокачественными новообразованиями слюнных желез не оказало (рисунок 158).

Медиана ПЖ больных, в структуре опухоли которых не была обнаружена экспрессия микроРНК киназного домена 12-14 экзонов гена RET составила 105,0 месяцев (95% ДИ 105,0105,0), а медиана ПЖ у больных с выявленной мутацией в гене RET достигнута на момент среза данных достигнута не была, а средняя ПЖ составила 74,0±9,5 (95% ДИ 55,5-92,5); значимых различий в рассматриваемых подгруппах получено не было - р=0,8514, ОР 1,15: 95% ДИ 0,27-4,85).

Продолжительность жизни | К ар la п.Meier |

о Complete + Censored

100%

90%

80%

70%

5 60% X

I S0%

40% 30% 20% 10% 0%

0 50 100 150 200 250 300 Экспрессия нет

— нет

Месяцы - есть

Рисунок 158 - Продолжительность жизни больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от наличия RET-мутации

Таким образом, проведенный однофакторный анализ показал, что единственным молекулярно-генетическим фактором, оказывающим значимое (к сожалению, негативное) влияние на показатель ПЖ больных злокачественными новообразованиями слюнных желез явилось наличие в структуре опухоли несбалансированной экспрессии гена ALK.

Результаты влияния наличия в структуре злокачественных новообразований слюнных желез экспрессии ALK, транслокации в гене NTRK3 и экспрессии микроРНК киназного домена 12-14 экзонов гена RET на время без прогрессирования заболевания представлены в таблице 89.

Таблица 89 - Влияние выявленных мутаций на время без прогрессирования больных злокачественными новообразованиями слюнных желез (результаты однофакторного анализа)

Показатель Медиана (мес.) (95% ДИ) Отношение риска (HR) (95% ДИ) p-value (log-rank тест)

Экспрессия ALK: нет есть 63,1±5,6 (95% ДИ 52,2-74,1) 16,0 (95% ДИ 16,0-16,0) 0,04 (95% ДИ 0,0007-2,33) 0,1213

Транслокация NTRK3: нет есть 61,2±5,7 (95% ДИ 50,1-72,3) 78,0±0,0 (95% ДИ 78,0-78,0) - 0,4351

Экспрессия RET: нет есть 60,1±6,0 (95% ДИ 48,4-71,9) 79,9±8,5 (95% ДИ 63,1-96,6) 2,55 (95% ДИ 0,79-8,18) 0,1168

р=0,8514

Яг*":

о- - - -

Риск развития прогрессирования заболевания значимо не увеличивала ни одна из рассматриваемых молекулярно-генетических поломок, однако, влияние отдельных мутаций следует рассматривать как наличие уверенной тенденции к оказанию значимого влияния показателя.

Сравнение кривых времени без прогрессирования больных в зависимости от наличия экспрессии ALK представлено на рисунке 159.

Время без прогрессирования (Kaplan-Meier)

о Complete + Censored

100%

90% 80% 70% $0%

1

л 50%

О

Ю

йг 40% 30% 20% 10% 0% -10%

0 20 40 $0 80 100 120 140 160 180 200 Экспрессия AUi

— нет

Месяцы — есть

Рисунок 159 - Время без прогрессирования больных злокачественными новообразованиями

слюнных желез в зависимости от наличия ALK-экспрессии

Медиана ВБП больных без наличия в структуре опухоли несбалансированной экспрессии ALK на момент окончательной оценки достигнута еще не была, а среднее ВБП составило в этой группе больных 63,21±5,6 месяца (95% ДИ 52,2-74,1) и имело тенденцию к значимому превышению медианы ВБП ALK-позитивных больных: 16,0 месяцев (95% ДИ 16,016,0) (р=0,1213; ОР 0,04: 95% ДИ 0,0007-2,33).

Результаты анализа ВБП в подгруппах больных с наличием и отсутствием транслокации в гене NTRK3 представлены на рисунке 160.

Медианы ВБП больных с наличием и отсутствием в структуре опухоли транслокации в гене NTRK3 на момент окончательной оценки достигнуты не были. Среднее ВБП в группе без транслокации NTRK3 составило 61,2±5,7 месяцев (95% ДИ 50,1-72,3) и значимо не отличалось (р=0,4352) от среднего ВБП в группе с выявленной NTRK3-транслокацией, где она составила 78,0±0,0 месяцев (95% ДИ 78,0-78,0).

ч р=0,1213

1

3 \

Ъ— ч

Время без прогресс ировании (Kaplan-Meier)

о Complete + Censored

100%

80%

60%

# 40%

20%

0%

Р-0 ,4351

О 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 НТОКЗ-траисгажщкя

-— нет

Месяцы — «то

Рисунок 160 - Время без прогрессирования больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от наличия NTRЮ-транслокации

А вот наличие в структуре опухоли экспрессии микроРНК киназного домена 12-14 экзонов гена RET также имело тенденцию к оказанию значимого, положительного, влияния на показатель времени без прогрессирования больных злокачественными новообразованиями слюнных желез (рисунок 161).

Время без прогрессирования (Kaplan-Meier)

с Complete + Censored

100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% -10%

ч р=0,1163

1

? 1-1

Ч

V-

20 40 60 80 100 120 140 160 Месяцы

180 200 Экслоессля RET

— не?

— etTfr

Рисунок 161 - Время без прогрессирования больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от наличия RET-мутации

Медианы ВБП в данных подгруппах больных также не были достигнуты не были. Среднее значение ВБП больных с наличием мутации в гене RET составило 79,9±8,5 месяцев

(95% 63,1-96,6) и имело тенденцию к значимому превышению среднего ВБП в подгруппе больных, в структуре опухолевой ткани которых отсутствовала мутация в гене RET, где среднее ВБП составило 60,1±6,0 месяц (95% ДИ 48,4-71,9) (р=0,1168; ОР 2,55: 95% ДИ 0,79-8,18).

Таким образом, на основании результатов проведенного однофакторного анализа, в многофакторную модель оценки влияния рассматриваемых факторов на ПЖ больных злокачественными новообразованиями слюнных желез целесообразно включить только наличие несбалансированной экспрессии гена ALK, а в модель, оценивающую влияние рассматриваемых факторов на ВПБ - наличие несбалансированной экспрессии гена ALK и гена RET.

Попытка построения модели пропорциональных рисков Кокса для оценки влияния рассматриваемых молекулярно-генетических факторов на время без прогрессирования больных злокачественными новообразованиями слюнных желез не выявило значимого влияния ни одного из изучаемых факторов.

Значимостью обладала только модель, оценивающая влияние данных показателей на ПЖ больных: р=0,0487, хотя качество построенной модели было недостаточным: AUC=0,581±0,075 (95% ДИ 0,509-0,652) (рисунок 162).

Рисунок 162 - Модель относительного риска наступления смерти у больных злокачественными новообразованиями слюнных желез в зависимости от наличия несбалансированной экспрессии гена ALK

Наличие в структуре злокачественного новообразования слюнной железы несбалансированной экспрессии гена ALK увеличивало риск смерти больного в 6,97 раз (р=0,0182; ОР=6,97: 95% ДИ 1,39-34,94).

332 Глава 8

РАЗРАБОТКА АЛГОРИТМА ВЫБОРА ОПТИМАЛЬНОЙ ТАКТИКИ ПЕРВИЧНОГО ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ

8.1 Разработка алгоритма выбора оптимальной тактики первичного лечения для больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

8.1.1 Общая характеристика больных

С целью определения алгоритма выбора тактики лечения больных эпителиальными злокачественными новообразованиями челюстно-лицевой области и шеи, на основании полученных нами данных о влиянии изучаемых факторов на прогноз течения заболевания и риск развития его прогрессирования, нами проведен окончательный анализ, в который были включены 98 пациентов с верифицированным диагнозом «Рак слизистой оболочки полости рта, получавших лечение и наблюдение в СПб ГБУЗ «Городской клинический онкологический диспансер» в период с июня 2010 по июль 2019 гг., у которых были проанализированы все изучаемые прогностические маркеры.

В исследуемой когорте пациентов с верифицированным плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта было 65 мужчин (66,33%) и 33 женщины (33,67%). Возраст пациентов варьировал от 25 до 84 лет, средний возраст составил 60,34±10,86 лет (95% ДИ 58,16-62,51). Общая характеристика пациентов, включенных в окончательный анализ представлены в таблице 90.

Таблица 90 - Общая характеристика пациентов с плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта, включенных в окончательный анализ

Признак Абс., (%)

Общее количество больных 98

Пол:

мужчины 65 (66,33%)

женщины 33 (33,67%)

Возраст, средний возраст 60,34±10,86

(годы) (23-85)

Признак Абс., (%)

Стадия опухолевого процесса

I (T1N0M0) 8 8,16%)

II (T2N0M0) 18 18,37%)

III (T1N1M0, T2N1M0, T3N0M0, T3N1M0) 14 14,29%)

IVA (T1N2M0, T2N2M0, T3N2M0, T4aN0-2M0) 50 51,02%)

IVB (Любая TN3M0, T4b Любая N M0) 8 8,16%)

Локализация первичного очага:

язык (передняя и средняя треть) 47 (47,96%)

дно полости рта 25 25,51%)

альвеолярная часть нижней челюсти 8 8,16%)

щека 6 6,12%)

верхнечелюстная пазуха 4 4,09%)

ретромолярная область 3 (3,06%)

крыло-челюстная складка 2 (2,04%)

альвеолярный отросток верхней челюсти 2 (2,04%)

твердое небо 1 1,02%)

Степень дифференцировки:

высокая 41 41,84%)

умеренная 32 32,65%)

низкая 6 6,12%)

не определена 19 19,39%)

Ороговение:

с ороговением 43 43,88%)

без ороговения 26 26,53%)

с частичным ороговением 6 6,12%)

не определено 23 23,47%)

Проведенное лечение:

НАХТ + хирургия +/- ДЛТ 35 35,72%)

хирургия +/- ДЛТ 14 14,29%)

ИХТ + ДЛТ(ХЛТ) 35 35,72%)

ДЛТ(ХЛТ) 14 14,29%)

Большинству пациентов (51,02%) при первичном обращении была диагностирована IVA стадия заболевания, у 14,29% пациентов - III стадия. Локализованные стадии заболевания (I и II) были диагностированы у 26,53% пациентов (8,16% и 18,37% соответственно). У 8,16% пациентов первичная опухоль была признана неоперабельной или поражение регионарных лимфатических узлов превышало 6 см (N3) - IVB стадия. Пациенты с зарегистрированными отдаленными метастазами (М1) в исследование включены не были.

У большинства больных - 47,96% - первичный опухолевый очаг локализовался в области передней и средней третей языка. У 25,51% больных локализацией первичного опухолевого очага была слизистая оболочка дна полости рта. У 8,16% больных первично была поражена слизистая оболочка альвеолярной части нижней челюсти. Слизистая оболочка щеки

первично была поражена у 6,12% больных. Слизистая оболочка верхнечелюстной пазухи первично поражалась у 4,09% больных, ретро-молярной области - у 3,06% больных. Слизистая оболочка крыло-челюстной складки и альвеолярного отростка верхней челюсти первично была поражена у 2,04% больных. И, в 1,02% случаев, первичный опухолевый очаг располагался в области слизистой оболочки твердого неба.

При морфологическом исследовании у большинства больных была выявлена высокая (41,84%) и умеренная (32,65%) степень дифференцировки плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта. В 6,12% случаев степень дифференцировки была низкой. А у 20,10% пациентов степень дифференцировки определена не была.

Наличие ороговения было выявлено в 43,88% случаев, у 26,53% больных ороговения в опухоли выявлено не было, в 6,12% ороговение было определено как частичное, и в 23,47% данный показатель не был оценен вообще.

С целью оптимизации выбора тактики первичного лечения на первом этапе все больные были разделены на следующие группы: группа больных, которым планировалось радикальное лечение с включением хирургического этапа как основного компонента лечения -49 пациентов, и группа пациентов, которым планировалось проведение радикального лечения но основе ДЛТ как основного метода терапии (без хирургического компонента) - 49 больных. В каждой группе, путем рандомизации простым методом с использованием таблицы случайных чисел, генерация которых производилась с помощью пакета прикладных статистических программ STATISTICA® (StatSoft, ver. 12.0), выделены следующие погруппы: 35 (35,72%) пациентов каждой группы получали неоадъювантную или индукционную химиотерапию, 14 (14,29%) пациентов получали лечения согласно действующим клиническим протоколам [7].

8.1.2 Общая характеристика клинико-лабораторных и морфологических факторов прогноза течения плоскоклеточного рак слизистой оболочки полости рта

С целью проведения окончательного анализа в анализируемую когорту были включены только пациенты, у которых был хотя бы один неблагоприятный фактор (НФ), выявленный по результатам подгруппового анализа. Перечень неблагоприятных факторов и пороговое значение каждого из них, свидетельствующие о неблагоприятном течение заболевания или высоком риске прогрессирования опухолевого процесса, представлено в таблице 91.

Таблица 91 - Факторы неблагоприятного прогноза течения и раннего прогрессирования плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта

№ п/п Фактор Пороговое значение

1 Стадия опухолевого процесса > II

2 Ассоциация с вирусом папилломы человека (тип 6,11; 16; 18) есть

Показатели периферической крови (визит исходной оценки)

3 Относительное число моноцитов >6,96%

4 Нейтрофильно-лимфоцитарный индекс (НЛИ) >2,30

5 Абсолютное число лейкоцитов <5,23x10%

6 Абсолютное число лимфоцитов <2,88х109/л

7 Абсолютное число эозинофилов <0,09x10%

Факторы, характеризующие иммунологическое микроокружение опухоли

8 Нейтрофильная инфильтрация, общая >39 клеток/мм2

9 Нейтрофильная инфильтрация микроокружения >38 клеток/мм

10 Эозинофильная инфильтрация опухоли <1 клетки/мм2

11 Инфильтрация CD8-Т-лимфоцитами, общая <143 клеток/мм

12 Инфильтрация CD8-Т-лимфоцитами опухоли <48 клеток/мм

13 Инфильтрация CD8-Т-лимфоцитами микроокружения <87 клеток/мм

Уровень экспрессии PD-L1

14 PD-L1 на иммунных клетках <7%

15 PD-L1 на опухолевых клетках <15%

В результате финального анализа было установлено, что количество неблагоприятных факторов прогноза течения заболевания и высокого риска прогрессирования в рассматриваемой когорте больных с диагнозом «Плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта» варьировало от 1 до 12; медиана количества неблагоприятных факторов составила 4 [3-7] фактора.

8.1.3 Результаты оценки диагностической значимости факторов неблагоприятного прогноза у больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

На следующем этапе нашего исследования мы провели ROC-анализ с целью определения прогностической значимости и пороговых значений (cut-off), определяемых как количество значимых факторов неблагоприятного прогноза течения заболевания у больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта.

8.1.3.1 Анализ влияния факторов неблагоприятного прогноза на продолжительность жизни и время без прогрессирования больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта

Оценка влияния выявленных факторов неблагоприятного прогноза на продолжительность жизни и время без прогрессирования больных представлена в таблице 92.

Таблица 92 - Оценка влияния факторов неблагоприятного прогноза на продолжительность жизни и время без прогрессирования больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта (результаты ROC-анализа)

Показатель Площадь под кривой (AUC) (95% ДИ) p-value Порог отсечения (cut-off: количество неблагоприятных факторов) Чувствительность Специфичность

Продолжительность жизни 0,793±0,057 (0,699-0,868) <0,0001 >3 90,28 61,54

Время без прогрессирования 0,731±0,056 (0,632-0,816) <0,0001 >5 60,87 72,42

Площадь под ROC-кривой, характеризующая влияние значимых неблагоприятных факторов на продолжительность жизни больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта, составила 0,793±0,057 (95% ДИ 0,699-0,868). Данная модель была статистически значима (р<0,0001), а качество модели было хорошим (рисунок 163).

Оптимальное пороговое значение количества факторов неблагоприятного прогноза в точке cut-off составило 3: наличие более 3 факторов неблагоприятного прогноза на момент первичной оценки негативно влияло на продолжительность жизни больных. Чувствительность данного теста составила 90,28%, что позволяет использовать его как скрининговый, а специфичность составила 61,54%, что не исключает возможности использовать данный тест как подтверждающий (конфирматорный).

Рисунок 163 - Результаты ROC-анализа зависимости Продолжительности жизни от количества факторов неблагоприятного прогноза

Площадь под ROC-кривой, характеризующая влияние значимых неблагоприятных факторов на время без прогрессирования больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта, составила 0,731±0,056 (95% ДИ 0,632-0,816). Данная модель была статистически значима (р<0,0001), а качество модели также было хорошим (рисунок 164).

Рисунок 164 - Результаты ROC-анализа зависимости Времени без прогрессирования от количества факторов неблагоприятного прогноза

Оптимальное пороговое значение количества факторов неблагоприятного прогноза в точке cut-off составило 5: наличие более 5 факторов неблагоприятного прогноза на момент первичной оценки увеличивало риск развития прогрессирования заболевания. Чувствительность данного теста составила 60,87%, что позволяет использовать его как скрининговый, а специфичность составила 72,41%, что не исключает возможности использовать данный тест как подтверждающий (конфирматорный).

Учитывая тот факт, что основной целью лечения онкологического больного является снижение риска его смерти, целесообразно выбрать в качестве порогового значения количества выявленных неблагоприятных факторов, то значение, которое оказывает непосредственное влияние на показатель продолжительности жизни больных.

Таким образом, оптимальным пороговым значением числа факторов неблагоприятного прогноза определено значение, равное 3: наличие 4 и более неблагоприятных факторов значимо ухудшает прогноз течения заболевания.

8.1.3.2 Отдаленные результаты лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от факторов неблагоприятного прогноза

С целью создания оптимального алгоритма выбора тактики первичного лечения больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от выявленных факторов неблагоприятного прогноза, нами построена модель пропорциональных рисков Кокса, куда включены следующие показатели:

- стадия опухолевого процесса;

- количество неблагоприятных факторов прогноза течения заболевания;

- наличие хирургического этапа в рамках первичного лечения;

- проведение лимфаденэктомии в рамках хирургического вмешательства;

- проведение неоадъювантной (индукционной) химиотерапии;

- проведение послеоперационного курса лучевой терапии.

В результате проведенного многофакторного регрессионного анализа влияния рассматриваемых факторов на продолжительность жизни больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости в модель вошли стадия опухолевого процесса, количество неблагоприятных факторов, наличие хирургического этапа в рамках комплексного или комбинированного лечения и проведение неоадъювантной (индукционной) химиотерапии. Проведение послеоперационной лучевой терапии и лимфаденэктомия были исключены из модели, в связи с отсутствием какого-либо влияния на продолжительность жизни больных.

В целом, модель оказалась статистически значимой (р<0,0001), качество модели было хорошим (Нагге1^ С-Мех=0,790; 95% ДИ 0,724-0,855) Результаты проведенного анализа с построением регрессии Кокса, представлены в таблице 93.

Таблица 93 - Результаты многофакторного регрессионного анализа Кокса для оценки риска смерти у больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от наличия выявленных неблагоприятных факторов и выбранной тактики лечения

Показатель Отношение рисков (ж) 95% ДИ р-уа1ие (Сох)

Стадия опухолевого процесса >11 1,34 0,87-2,04 0,1805

Количество неблагоприятных факторов >3 1,21 1,05-1,40 0,0096

Хирургическое лечение проводилось 0,13 0,05-0,33 <0,0001

Неоадъювантная (индукционная) ХТ проводилась 0,33 0,13-0,86 0,0231

Из всех факторов, включенных в модель, только стадия опухолевого процесса не оказывала значимого влияния на ПЖ больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта: р=0,1805; ОР 1,34: 95% ДИ 0,87-2,04. Все остальные факторы оказывали значимое влияние на прогноз течения заболевания. Влияние количества неблагоприятных факторов на течение заболевания представлены на рисунке 165.

100

80 70

-О

5 60

0 ю

§ 50 3 о. (и

1 40 £

30 20 10 0

0 20 40 60 80 100

Месяцы

Рисунок 165 - Модель относительного риска наступления смерти больных плоскоклеточным раком слизистой оболочки полости рта в зависимости от наличия неблагоприятных факторов прогноза течения заболевания и их количества

Наличие у больного >3 факторов неблагоприятного прогноза течения заболевания увеличивало риск смерти пациента на 79%: р=0,0096; ОР=1,21, 95% ДИ 1,05-1,40.

Влияние проведения хирургического этапа в рамках комплексного или комбинированного лечения больных плоскосеточным раком слизистой оболочки полости рта представлена на рисунке 166.

100

80

*

л

5 60

с:

0 ю

1

Э

6

£ 40

20 □

0 20 40 60 80 МО

Мещцы