Особенности формирования у взрослых гуморального иммунитета к вирусу Varizella zoster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат медицинских наук Казанова, Александра Сергеевна

• Казанова, Александра Сергеевна
• кандидат медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Казанова, Александра Сергеевна

Оглавление

Список сокращений

Введение

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

Научная новизна

Практическая значимость

Основные положения, выносимые на защиту

Часть 1. Обзор литературы

1.1 Характеристика вируса ветряной оспы и опоясывающего

герпеса

1.2. Ветряная оспа и ее осложнения

1.2.1 Ветряная оспа

1.2.2. Адаптивный иммунитет к VZV

1.2.3. Ветряная оспа у беременных

1.3 Вакцинопрофилактика ветряной оспы

1.4 Опоясывающий герпес (Herpes zoster)

1.4.1. Клиническая картина опоясывающего герпеса

1.4.2. Осложнения опоясывающего герпеса

1.5. Субклиническая форма VZV-инфекции

Часть 2. Экспериментальные исследования

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Характеристика обследованных пациентов

2.2. Вакцинный препарат

2.3 Иммуноферментный анализ

2.40ценка авидности VZV-специфичных IgG

2.5Выделение и культивирование мононуклеарных клеток периферической крови in vitro

2.60пределение жизнеспособности клеток

2.70ценка спонтанной и индуцированной продукции цитокинов в культуре МПК

2.8Выделение нуклеиновых кислот

2.9«Двойная» полимеразная цепная реакция

2.10 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

2.11 Определение ревматоидного фактора

2.12 Статистический анализ

Часть 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение

Глава 3. Лабораторная диагностика инфекции, развивающейся вследствие реактивации VZV

3.1. Серологическая диагностика

3.2. Эффективность двойной полимеразной цепной реакции (Double "nested" PCR)b диагностике VZV-инфекции

3.3. Оценка спонтанной продукции в культуре МПК анти-VZV IgG

Глава 4. Изучение особенностей VZV-специфического гуморального иммунитета на заражение VZV и вакцинацию

4.1. Изучение особенностей гуморального иммунитета к VZV у здоровых доноров

4.1.1. Наличие IgG-антител к VZV в сыворотке крови в разных возрастных группах

4.1.2.Авидность анти-VZV IgG в сыворотке крови в различных возрастных группах

4.2.Изучение специфического гуморального иммунного ответа на вакцинацию против ветряной оспы

4.2.1. Иммуногенность вакцины против ветряной оспы

4.2.1.1. Наличие гуморального иммунного ответа на введение вакцины

4.2.1.2 Тип поствакцинального гуморального иммунного ответа исходно серопозитивных по анти-VZV IgG лиц

4.2.1.3. Характер поствакцинального гуморального иммунного ответа серонегативных к VZV лиц

4.3 Эффективность вакцинации

4.4 Факторы восприимчивости военнослужащих к заражению VZV по результатам наблюдения в эпидемическом очаге ветряной оспы

4.5. Восприимчивость к заражению VZV беременных

Глава 5. Исследование гуморального иммунного ответа на типичную и субклиническую инфекцию вследствие реактивации VZV

5.1. Изучение иммунного ответа при манифестной форме инфекции вследствие реактивации VZV

5.1.1. Иммунореактивность к а-герпесвирусам больных манифестной формой инфекции вследствие реактивации VZV

5.3. Исследование субклинической формы инфекции вследствие реактивации VZV

5.3.1. Субклиническая реактивация VZV у здоровых

доноров

5.3.2. Субклиническая VZV-инфекция вследствие реактивации вируса у пациентов с поражениями ЦНС

5.3.2.1. Частота субклинической VZV-инфекции у пациентов с острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу

5.3.2.2. Субклиническая инфекция вследствие реактивации VZV у больных с психической патологией

5.4. Исследование гуморальных факторов, ассоциированных с реактивацией VZ V

5.4.1. Оценка продукция цитокинов в культуре МПК

5.4.2. Определение ревматоидного фактора (RF) в сыворотке крови

5.4.3. Определение кортизола в сыворотке крови

Заключение

Выводы

Список литературы

Список сокращений

БДА - белок диссоциирующий агент

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ВПГ — вирус простого герпеса

ДПК — длительно живущая плазматическая клетка

ИА - индекс авидности антител

ИЛ - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФТС - иммуноферментная тест система

ИФН - интерферон

МПК - мононуклеарные клетки периферической крови

МРТ - магнитно-резонансная томография

ОГ - опоясывающий герпес

ОНС - острый некроз сетчатки

ОП — оптическая плотность

ОРС — открытая рамка считывания

ПГН — постгерпетическая невралгия ПНС — прогрессирующий некроз сетчатки

ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

ФНО — фактор некроза опухоли

ФСБ — фосфатно-солевой буфер

ЦМВ — цитомегаловирус

ЦНС — центральная нервная система

ЭП - эндогенный психоз

CDC — Center for Disease Control and Prevention, Центр по контролю и профилактике заболеваний - орган санитарно-эпидемиологического надзора США

gE - гликопротеин Е

RF - ревматоидный фактор, аутоантитела преимущественно класса IgM к собственному гаммаглобулину.

vOka - аттенуированный вакцинный штамм вируса ветряной оспы и опоясывающего герпеса

VZV - вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса {Varicella Zoster Virus)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности формирования у взрослых гуморального иммунитета к вирусу Varizella zoster»

Введение

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Ряд патогенных вирусов вызывает хронические инфекции человека, (вирус иммунодефицита человека, вирусы семейства герпеса, вирусы гепатитов В и С, вирус папилломы человека), что требует от организма хозяина создания постоянного иммунного прессинга в отношении данного возбудителя [75, 116]. Специфичный иммунитет к данным возбудителям характеризуется пожизненной продолжающейся адаптацией к вирусу. Одним из таких патогенов является вирус герпеса человека третьего типа - вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса (Varicella Zoster Virus, VZV). Инфицированность населения данным возбудителем чрезвычайно велика, по данным Центра по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) она составляет 99,6% в группе лиц 40-49 лет [69]. Известно, что VZV достаточно консервативен, и в большинстве стран циркулирует один серотип вируса [70]. Так же не установлено специфических иммуносупрессивных характеристик VZV, что делает заболевания, вызываемые этим патогеном, оптимальным объектом изучения формирования гуморального иммунитета при хронических инфекциях. Поскольку возрастная динамика иммунитета к VZV будет в большей степени отражать изменения в иммунной системе при многократном контакте с вирусом, чем реакцию на быструю смену

антигенной структуры возбудителя в сочетании с иммуносупрессивным действием вируса (как например при ВИЧ-инфекции).

Первичная У2У-инфекция протекает в виде ветряной оспы -заболевания сопровождаемого лихорадкой и характерными везикулярными диссеминированными высыпаниями на коже и слизистой оболочке. В большинстве случаев ветряная оспа имеет благоприятный прогноз, однако, с учетом стабильно высокой заболеваемости (554,8 случаев на 100000 населения в РФ, 2011) и неврологических и офтальмологических осложнений её причисляют к опасным инфекционным заболеваниям [47]. Считается, что ведущую роль в защите от ветряной оспы играет гуморальный иммунитет [33, 91]. Включение в национальные иммунизационные программы ряда стран вакцинопрофилактики ветряной оспы привело к значительному снижению заболеваемости и смертности от этого заболевания [46, 103]. В России специфическая профилактика ветряной оспы на федеральном уровне до настоящего времени не проводится, она осуществляется регионально, например, включена в календарь профилактических прививок г. Москвы и предусматривает иммунизацию детей старше 2 лет, не болевших ветряной оспой (Приказ департамента здравоохранения г. Москвы №271 от 31 марта 2011 г.).

Исследования показали, что живой аттенуированный штамм УХУ уОка, входящий в состав всех современных вакцин для профилактики

ветряной оспы, после попадания в организм, также как и дикий вирус, проникает в ганглии вегетативной нервной системы, черепно-мозговых и спинномозговых нервов, где в течение всей жизни хозяина персистирует в латентном состоянии [31]. Таким образом, в странах, где прививки против ветряной оспы закреплены законодательно, первичное инфицирование диким штаммом, по сути, заменяется введением ослабленного вируса, в результате чего в организме развивается вакцинная инфекция полностью соответствующая всем стадиям У2У-инфекции, вызываемой диким штаммом вируса, и формируется в большинстве случаев прочный адаптивный иммунитет. Тем не менее, у некоторых переболевших или вакцинированных против ветряной оспы возникает повторное заболевание. При этом какие-либо определенные факторы специфичного гуморального иммунитета, ассоциированные с повышенным риском развития повторной ветряной оспы, не установлены, что дает основание для проведения глубокого анализа иммунного ответа на МХУ у реконвалесцентов и лиц, вакцинированных против ветряной оспы.

Необходимо отметить, что полноценный гуморальный иммунитет к вирусу ветряной оспы, сформировавшийся после перенесенной болезни или вакцинации, не даёт гарантии того, что дикий или вакцинный штамм вируса с течением времени не реактивирует и не вызовет самостоятельное, часто тяжелое, изнуряющее человека заболевание - опоясывающий герпес (ОГ). К

относительным факторам риска развития опоясывающего герпеса относят пол (болезнь чаще развивается и тяжелее протекает у женщин), стресс и иммунодепрессивные состояния [50]. Абсолютные факторы риска развития ОГ до сих пор не известны. Тяжесть течения ОГ обусловлена частыми (до 50%) осложнениями заболевания, в том числе невралгиями, парезами, VZV-васкулопатиями, офтальмогерпесом. Основным фактором риска развития заболевания ОГ является ослабление иммунитета к вирусу у лиц пожилого возраста, (средневозрастная заболеваемость ОГ составляет 3,2 на 1000, а среди лиц старше 70 лет достигает 10 на 1000 человек в год). Таким образом, изучение характера и особенностей адаптивной, в том числе гуморальной иммунореактивности у больных ОГ является актуальной задачей современной медицинской науки.

Известно, что иммунный ответ способен подавлять кожные проявления VZV-инфекции, вплоть до полного их исчезновения. Репликация возбудителя в нервной ткани при этом продолжается, и возникает особая форма заболевания - zoster без высыпаний {Zoster Sine Herpete) [41]. Постановка правильного диагноза болезни в этих условиях существенно затруднена, что является основанием для разработки новых диагностических приемов, необходимых для верификации атипичных случаев VZV-инфекции.

После реактивации WZV из мест латенции трансаксонально проникает к адвентиции сосудов головного мозга, а далее трансмурально - в интиму артерий, где происходит его репликация [86, 87, 105]. Данный процесс -У2У-васкулопатия - сопровождается развитием инсультов и формированием сосудистых мальформаций [81]. Примечательно, что в 37% случаев У2У-васкулопатия не сопровождается везикулярными высыпаниями, что актуализирует обследование лиц с поражениями ЦНС, подозрительных на атипичную форму У7У-инфекции [40]. Особый интерес представляют исследования пациентов с сосудистой патологией ЦНС и поражениями психотического типа, которые часто сопровождаются выраженной стрессовой реакцией. Результаты этих исследований помогут оптимизировать контроль за инфекциями, возникающими вследствие первичного и повторного заражения, а также реактивации УХУ', улучшить вакцинопрофилактику ветряной оспы, определить ассоциативные связи между манифестными, субклиническими формами заболевания и патологическими процессами в ЦНС.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью настоящего исследования явилось изучение особенностей формирования гуморального иммунного ответа при первичном заражении У2У, реактивации вируса и вакцинопрофилактике ветряной оспы.

В задачи исследования входит:

- разработка нового подхода к лабораторной диагностике острой VZV-инфекции, в том числе возникающей вследствие реактивации вируса, основанного на анализе продукции VZV-специфичных IgG в культуре мононуклеаров периферической крови (МПК) in vitro, и его сравнение с серологическим — ИФА и молекулярно-генетическим - ПЦР методами диагностики.

- оценка и сравнение авидности специфичных IgG-антител к VZV у здоровых добровольцев разных возрастных групп.

- анализ эффективности вакцинопрофилактики ветряной оспы у добровольцев, находящихся в эпидемическом очаге ветряной оспы, и оценка влияния исходного гуморального иммунитета к VZV на тип иммунного ответа на введение вакцину.

- изучение роли факторов, влияющих на противовирусный иммунитет, таких как у-интерферон, продуцируемый в культуре МПК, и кортизол в сыворотке крови, в развитии реактивации VZV.

- выявление у больных с признаками поражения ЦНС (пациенты с ишемическим инсультом и психически больные) маркеров активно текущей VZV-инфекции, анализ возможности и частоты возникновения субклинической реактивации вируса ветряной оспы у здоровых

испытуемых, больных с острым нарушением мозгового кровообращения и психической патологией.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

- Впервые дана оценка чувствительности и специфичности серологического метода диагностики У7У-инфекции в следствие реактивации вируса, основанного на одновременном определении в сыворотке крови маркеров -

к гликопротеину Е ^Е) УХУ и анти-У2У ^М. Оба маркера выявлялись с 59% частотой. С помощью двойной ПЦР впервые в РФ определена частота выявления ДНК УХУ в МПК больных ОГ, она составила 49%.

- Разработан высокочувствительный (97,4%) и специфичный (100%) подход к диагностике вирусной инфекции вследствие эндогенной реактивации УХУ, основанный на выявлении продукции специфичных антител в культуре мононуклеаров периферической крови (МПК).

- Впервые дана оценка гуморального иммунитета к УХУ в популяции здоровых добровольцев разных возрастных групп. Средний индекс авидности (ИА) анамнестических У2У-специфичных в сыворотке крови нарастает с 50% в юношеском возрасте (до 25 лет) до 68% у лиц старше 65 лет. Доля лиц с преобладанием в сыворотке крови высокоавидных анамнестических анти-УгУ (ИА более 35%) повышается с 83% до 100%, соответственно.

- Определен фактор, ассоциированный с повышенной восприимчивостью к повторному заболеванию ветряной оспой. Им оказался измененный гуморальный иммунный ответ на первичное заражение, проявляющийся циркуляцией анамнестических анти-У2У антител в сыворотке крови, превышающих в 3 и более раза титр анти-У2У с низким индексом авидности (ИА<35%).

- Выявлена зависимость типа иммунного ответа на введение вакцины против ветряной оспы от исходного индекса авидности VZV-cпeцифичныx в сыворотке крови вакцинируемых лиц. При исходном индексе авидности (ИА) специфических антител менее 50% ответ реализовался преимущественно по типу вторичного ^в-ответа, а при исходном ИА > 50% - по типу первичного иммунного ответа с продукцией УЕУ-специфичных ^М.

- Впервые установлено, что у лиц с сосудистыми нарушениями ЦНС (ишемический инсульт) и психической патологией субклиническая форма инфекции, возникающая вследствие реактивации УХУ, происходит достоверно чаще, чем у практически здоровых людей.

- Определены гуморальные факторы, ассоциированные с манифестной и субклинической формой заболевания, возникающего вследствие реактивации УХУ: повышенный уровень кортизола в сыворотке крови и сниженная продукция у-интерферона в культуре МПК, стимулированных митогеном (конканавалином А).

- Выявлена перекрестная реактивность в отношении вируса простого герпеса 1 и 2 типов антител, образующихся у взрослых в ответ на реактивацию VZV.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

- Разработан подход к лабораторной диагностике VZV-инфекции, основанный на анализе продукции анти-VZV IgG в культуре МПК in vitro. Данный подход оказался эффективным в диагностике инфекции, возникающей в результате эндогенной реактивации вируса, его чувствительность достигала 97,4% и при 100% специфичности. Применение метода позволит улучшить контроль как над манифестными, так и над субклиническими формами инфекции.

- Установлен серологический фактор, ассоциированный с восприимчивостью к повторному заражению вирусом ветряной оспы, и разработан научно-методологический подход к выявлению таких лиц. Этим фактором оказался постинфекционные анти-VZV IgM в сыворотке крови, превышающие по титру низкоавидные VZV-специфичные IgG-антитела.

- Получены новые данные о частоте субклинической VZV-реактивации у лиц с поражениями ЦНС, что позволит совершенствовать представление о патогенезе этих заболеваний, и может быть в дальнейшем использовано для коррекции терапии этих патологических состояний.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1) Разработан новый двухэтапный подход к диагностике манифестных и субклинических форм острой УгУ-инфекции, основанный на анализе спонтанной продукции У2У-специфичных ^в-антител в культуре мононуклеаров периферической крови, превосходящий по эффективности серологический (ИФА) и молекулярно-генетический (ПЦР) методы диагностики У2У-инфекции.

2) Преимущественный тип гуморального иммунного ответа у лиц, вакцинированных против ветряной оспы, зависит от исходной авидности анамнестических У2У-специфичных ^в-антител. Наличие антител с ИА менее 50% предполагает реализацию вторичного иммунного ответа, а ИА > 50% - ответа по первичному типу.

3) Фактором, ассоциированным с повышенной восприимчивостью к повторному заражению VZV, может быть изменение формирования гуморального иммунитета после первичного инфицирования, которое заключается в циркуляции в крови постинфекционных специфичных ^М превышающих по титру низкоавидные анти-У2У (ИА < 35%).

4) Повышение концентрации кортизола в сыворотке крови и снижение продукции у-ИФН в культуре МПК, ассоциировано с развитием

заболеваний а-герпесвирусной этиологии, включая манифестные и субклинические формы У2У-инфекции вследствие реактивации вируса.

5) Субклиническая форма УгУ-инфекции, вследствие реактивации вируса, достоверно чаще, чем у практически здоровых людей, происходит у лиц с сосудистыми нарушениями ЦНС и больных психической патологией

Апробация материалов диссертации и публикации

Основные положения и результаты диссертации доложены на IV Ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012), X съезде ВНПОЭМП "Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации" (Москва, 2012), Юбилейной всероссийской научной конференции "Отечественная эпидемиология в XXI веке" (Санкт-Петербург, 2012), XVII Всероссийской научно-практической конференции «Интеграция в лабораторной медицине» - 3 место в конкурсе работ молодых ученых (Москва, 2012), II Всероссийской научной конференции молодых ученых "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия" (Санкт-Петербург, 2012), научных конференциях молодых ученых ФГБУ «НИИВС им. И.И.Мечникова» РАМН (Москва, 2011, 2012), XVIII Всероссийской научно-практической конференции «Аналитическая надежность и диагностическая значимость лабораторной медицины» (Москва, 2013) - 2 место в конкурсе работ молодых ученых.

Публикации результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы посвященной материалам и методам исследования, трех глав, посвященных собственным исследованиям, обсуждения и выводов, списка использованной литературы. Диссертация изложена на 157 страницах, иллюстрирована 12 таблицами, 5 рисунками. Список литературы содержит 140 источников (4 отечественных и 136 зарубежных).

Часть 1. Обзор литературы

ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА ВЕТРЯНОЙ ОСПЫ И ОПОЯСЫВАЮЩЕГО ГЕРПЕСА.

Varicella Zoster Virus (VZV) наряду с вирусами простого герпеса 1 и 2 типов входит в семейство Herpesviridae, подсемейство — a-herpesvirinae, обладает строгой видовой специфичностью и паразитирует только в организме человека. Геном вируса представлен линейной двухцепочечной ДНК (124884 нуклеотидных пар), содержащей кодирующие последовательности 71 гена. Икосаэдрический нуклеокапсид вируса (162 капсомера) покрыт липидной оболочкой. Вирионы плейоморфны, их диаметр составляет 150-200 нм. Через 72 часа после заражения чувствительной культуры клеток, VZV вызывает цитопатический эффект, характеризующийся формированием большого количества многоядерных синцитиев без продукции стабильных вирионов. В процессе репликации VZV продуцируются 12 поверхностных белков, с преобладанием гликопротеина Е (gE), к которому вырабатываются основные нейтрализующие антитела GE ответственен за вирулентность вируса в патогенезе нервных поражений [140]. Кроме gE, продуцируются гликопротеины В, I и Н. В инициации клеточного иммунного ответа на VZV участвуют вирусные белки - продукты трансляции с открытых рамок считывания (ОРС) 4 и 63 [64]. Обычно при латенции вируса в нейронах выявляются транскрипты ОРС 4, 21, 29, 62, 63 и 66 [95]. Исследование латентно инфицированных ганглиев тройничного

нерва с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) также показало наличие транскриптов генов вируса, транслируемых с ОРС 11,41,43,57 и 68 [95].

Долгое время было известно лишь об одном серотипе [70].

Однако в 1998 году был выделен мутантный штамм вируса - К^Р-М^Р, у которого в §Е отсутствовал В-клеточный эпитоп, необходимый для реализации процессов комплемент зависимой нейтрализации и антителозависимой цитотоксичности [101]. Показано, что основной функцией анти-§Е антител является нейтрализация вируса, а их продукция осуществляется в ответ на У2У-инфекцию или вакцинацию препаратом, содержащим живой аттенуированный штамм вируса. Анти^В антитела, продуцируемые в результате иммунизации живой вакциной, также обладают вируснейтрализующими свойствами, однако после перенесённого заболевания определяются не всегда [52]. В 1999 году в Канаде у 75-летнего мужчины с клиникой опоясывающего герпеса был выделен штамм вируса со схожей мутацией в гене gE - У2У-ВС [122]. В 2006 году опубликованы данные о мутантных штаммах, принадлежащих к так называемым «ускользающим» мутантам, которые не вступали во взаимодействие с вируснейтрализующими моноклональными антиЛ^У, что существенно затрудняло серологическую диагностику УгУ-инфекции [134]. Как выяснилось, мутантные штаммы отличаются от обычных штаммов VZV и

фенотипически - они лучше размножаются как in vitro, так и in vivo [106]. Вероятно, мутантные штаммы могут вызывать более тяжелую форму VZV-инфекции у человека. Это подтверждается сообщением о иммунокомпетентном больном, у которого был зафиксирован случай тяжёлой диссеминированной формы гепатита с летальным исходом, вызванный мутантным по gE VZV [96].

1.2 ВЕТРЯНАЯ ОСПА И ЕЕ ОСЛОЖНЕНИЯ 1.2.1 Ветряная оспа

Первичная У2У-инфекция протекает в виде ветряной оспы -заболевания сопровождаемого лихорадкой и характерными везикулярными диссеминированными высыпаниями на коже и слизистой. В большинстве случаев болезнь имеет благоприятный прогноз.

Заражение происходит главным образом через слизистую

оболочку верхних дыхательных путей и носоглотки, возможно заражение через конъюнктиву глаз. Репликация вируса начинается в зонах первичной инокуляции в области головы и шеи. Уже через 4-5 дней вирус попадает в кровь и с её током распространяется по всему организму. Еще через неделю после репликации вируса в клетках ретикулоэндотелиальной системы, наблюдается вторичная, ассоциированная с Т-лимфоцитами виремия, приводящая к развитию экзантемы [93]. Инкубационный период ветряной оспы длится от 10 до 20 суток, но обычно составляет 14-15 дней [136]. Ветряная оспа чаще всего протекает как легкое, не требующее специфического лечения заболевание, сопровождаемое лихорадкой, недомоганием, головной болью и зудящей везикулярной сыпью. Однако, с учетом высокой заболеваемости (554,8 случаев на 100000 населения в РФ, на 2011 год) и неврологических и офтальмологических осложнений, её

причисляют к опасным инфекционным заболеваниям [47]. В большинстве случаев заражение УТЧ происходит весной. Пациенты становятся заразными для окружающих за 1-2 дня до появления сыпи, инфицируя контактных лиц при дыхании, и продолжают оставаться заразными в течение последующих 5-7 дней высыпаний, выделяя вирус с содержимым кожных везикул. Интересно, что именно в содержимом везикул можно обнаружить свободные, не ассоциированные с клетками вирионы У2У [30]. После покрытия высыпаний корочками больной утрачивает способность заражать окружающих.

Наиболее частым осложнением ветряной оспы является бактериальная суперинфекция поврежденной высыпаниями кожи, чаще стафилококковой или стрептококковой этиологии [9]. Реже ветряная оспа осложняется вирусной пневмонией, смертность от которой может достигать 10-3 0%, особенно среди взрослых [16, 94]. Самыми частыми неврологическими синдромами при первичной У2У-инфекции являются энцефалит, острая мозжечковая атаксия, миелит и менингит. Другие синдромы, например, демиелинизирующая радикулонейропатия, встречаются гораздо реже [54]. Достаточно часто диагностируется сочетание ветряночного энцефалита и синдрома Рейе, который, как правило, протекает тяжело и может окончиться летально. Большинство энцефалитов обычно проявляют себя через неделю после начала высыпаний, однако описаны

случаи и более позднего начала неврологической симптоматики. При этом важно отметить, что ветряночный энцефалит не всегда сопровождается высыпаниями, а его развитие может иметь как постепенное, так и внезапное начало. Клинически энцефалит проявляется лихорадкой, головной болью, рвотой, сонливостью, судорогами, менингизмом, иногда коматозным состоянием.

Острая мозжечковая атаксия — самое частое неврологическое осложнение ветряной оспы у детей без сопутствующей соматической патологии. Частота развития этого состояния составляет 1 на 4000 случаев ветряной оспы [47]. В редких случаях атаксия развивается до появления экзантемы, но чаще с 5 по 10 день от начала высыпаний [20]. Считается, что патогенетически это одна из форм аутоиммунного демиелинизирующего энцефаломиелита, хотя в ряде случаев к развитию атаксии может приводить и продуктивная У2У-инфекция. Очень редко У2У-инфекцию связывают с развитием миелопатии (парапарезом, аномалией сухожильных рефлексов, симптомом Бабинского и дисфункцией сфинктеров), в этих случаях неврологическая симптоматика сохраняется длительно [65]. Поражение мочеполовой системы при ветряной оспе обычно протекает по типу цистита с везикулезными высыпаниями на слизистой мочевого пузыря, сопровождаемого гематурией и лейкоцитурией, а также может проявляться в виде нейрогенного мочевого пузыря с задержкой мочеиспускания. Задержка

мочи и констипация возникают на фоне поражения вирусом крестцовых нервов [62].

1.2.2. Адаптивный иммунитет к VZV

После перенесенной первичной VZV-инфекции формируется пожизненный адаптивный иммунитет, гуморальное звено которого играет ведущую роль в предотвращении повторного заражения вирусом. Выявлена прямая корреляция между высоким уровнем антител к VZV в сыворотке крови пациентов и отсутствием клинически выраженной инфекции [91]. У людей пожилого возраста со сниженными показателями клеточного иммунитета, но с высокими титрами анти-VZV антител в сыворотке крови риск развития ветряной оспы, как правило, минимизирован. Установлено, что заболевание ветряной оспой вследствие контакта с источником VZV можно предотвратить путем пассивной иммунизации контактного лица анти-VZV иммуноглобулином [91]. Однако, в ряде случаев развивается повторное заражение вирусом, так Johnson J.A. et al. в 2011 году описан случай заболевания у 32-летней женщины, перенесшей ветряную оспу в возрасте 5 лет и имеющей подтвержденные анамнестические VZV IgG в сыворотке крови за два года до повторного развития ветряной оспы. Повторное инфицирование у нее развилось после контакта с больным опоясывающим герпесом в заразный период. Ряд авторов полагают, что ответственными за повторное заражение следует считать низкие титры VZV IgG или нарушение

созревания их аффинности [66, 79]. При этом необходимо отметить, что далеко не у всех переболевших ветряной оспой лиц, в сыворотке крови которых отмечалось преобладание низкоаффинных (с точки зрения методики измерения - низкоавидных) анти-УгУ 1§0-антител, развивалось повторное заболевание. Для оптимизации вакцинопрофилактики ветряной оспы необходимо разработать методологический подход для выявления контингента лиц, восприимчивых как к первичному, так и повторному к заражению Это потребует оценки таких факторов восприимчивости,

как отсутствие перенесенной ранее ветряной оспы, серонегативности по У2У-специфичным 1§0 после ветряной оспы и нарушения при первичном инфицировании созревания аффинности антител.

Несмотря на протективное с точки зрения заражения вирусом гуморальное звено иммунитета, необходимым условием выздоровления от ветряной оспы принято считать наличие у больного полноценного клеточного иммунитета. Наиболее тяжелые и даже летальные случаи ветряной оспы наблюдаются у лиц с отсутствием клеточных реакций или с существенным их снижением. Назначение при этом препаратов иммуноглобулинов в большинстве случаев неэффективно. Вероятно, это связано с тем, что распространение вируса в организме больного может осуществляться из клетки в клетку без его выхода в межклеточное пространство. Изучение иммунного ответа при первичной VZV-инфeкции

или при вакцинации против ветряной оспы во многом ограничено отсутствием адекватной модели ветряной оспы на животных, включающей все стадии У2У-инфекции, в том числе стадию реактивации вируса [17, 104].

1.2.3. Ветряная оспа у беременных.

Особенно тяжело ветряная оспа протекает у беременных, при этом часто происходит генерализация процесса, развивается вирусная пневмония, смертность от которой достигает 10-30% [16, 94]. Заболеваемость ветряной оспой беременных в Европе составляет 1 на 2000-3000 беременностей (с большей частотой у этнических меньшинств). При инфицировании беременной У2У на ранних сроках гестации повышается риск развития врожденных пороков у плода. Так, риск развития синдрома врожденной ветряной оспы при развитии первичной У2У-инфекции у беременной с 13-й по 20-ю неделю гестации составляет 2% [24]. Данный синдром характеризуется Рубцовыми поражениями кожи, гипоплазией конечностей и аномалиями глаз. Считается, что основные поражения при синдроме врожденной ветряной оспы происходят вследствие продолжающейся внутриутробно зостероподобной реактивации [56]. Около 30% детей, рожденных с синдромом врожденной ветряной оспы, погибают в первые несколько месяцев жизни. Даже при благоприятном течении ветряной оспы у матери и рождения ребенка без осложнений, вирус, по-видимому, инфицирует тропные ткани и персистирует в организме потомства [102].

Описан случай развития нейрогенного мочевого пузыря и пузырно-мочеточникого рефлюкса, приведшего к уремии и потребовавшего хирургического лечения у мальчика, родившегося от матери, перенесший во время беременности ветряную оспу. Урологическим симптомам предшествовала везикулярная сыпь в 2,5 месяца по ходу XI, XII грудного нерва, клинически соответствовавшая опоясывающему герпесу [42]. Ветряная оспа, возникшая у беременной женщины за 5 дней до или через 2-3 дня после родов, в 20% случаев приводит к заболеванию диссеминированной фульминантной ветряной оспой новорожденного. При этом смертность от инфекции может достигать 20 - 23%, и таким детям показано лечение ацикловиром в сочетании со специфической иммуноглобулинотерапией [110].

1.3. ВАКЦИНОПРОФИЛАКТИКА ВЕТРЯНОЙ ОСПЫ

Известно, что в настоящее время единственным эффективным методом профилактики ветряной оспы, в том числе среди взрослого населения, является вакцинация. Впервые вакцину против ветряной оспы разработал в 1974 году японский исследователь - профессор Мичиаки Такахаши, выделивший VZV у больного ветряной оспой трехлетнего мальчика по имени Ока. Вакцинный штамм вируса ветряной оспы получил впоследствии соответствующее название - vOka. В процессе аттенуации было последовательно проведено 11 пассажей вируса на эмбриональных клетках легочных фибробластов человека при 34°С, 12 пассажей на эмбриональных фибробластах морских свинок при 37°С и несколько пассажей на диплоидных клетках человека [118, 119]. В результате вирус был адаптирован к диплоидным клеткам человека MRC-5. Вероятно, ослабление вакцинного штамма вируса произошло вследствие 8 мутаций в ОРС 62 и 7 мутаций в ОРС 71, кодирующих продукцию предраннего белка IE62 -основного трансактиватора транскрипции остальных вирусных генов [44]. Выяснилось, что вакцинный вирус генетически гетерогенен и состоит из 13 подтипов VZV с различиями в последовательности ДНК. Так, подтип s7-01 вакцинного штамма Ока {vOka) отличается от дикого штамма Ока (parental -рОка) 8 заменами в гене, кодирующем предранний белок IE62, а подтип s7-13 только 5 заменами. Однако, несмотря на различия в репликативных

возможностях между подтипами вакцинного штамма Ока, все они реплицируются существенно хуже, чем дикий вирус Ока [139].

Клинические исследования вакцины показали её высокую эффективность даже у тех детей, которых вакцинировали через 2-3 дня после контакта с заразными больным ветряной оспой. Исследования долгосрочной эффективности вакцинации показали, что около 98% детей после иммунизации вырабатывали анти-VZV IgG антитела в высоких титрах. Впервые производство вакцины против ветряной оспы было налажено в Институте Бикен (Япония) в 1976 году. Однако препарат был лицензирован в Японии только в 1986 году, а в Южной Корее - в 1988 году. В дальнейшем, компании Glaxo Smith Kline, Merck и Pasteur использовали аттенуированный Такахаши вакцинный штамм Ока для производства собственных вакцин. В 1984 году получила лицензию вакцина Varilrix (GSK'), зарегистрированная во многих странах мира и используемая для вакцинации лиц из «групп риска», а также детей, начиная с 9-ти месячного возраста. В 1993 году на территории Франции у лиц с состоянием иммуносупрессии было одобрено применение вакцины компании Pasteur - Okavax. В 1980 году в США компания Merck приступила к 15-летним клиническим испытаниям собственной вакцины. В 1984 году в группе, состоящей из 956 детей в возрасте от 12 месяцев до 14 лет, было проведено двойное слепое плацебо контролируемое исследование вакцины Ока/Merck. Эффективность вакцины, определяемая по способности

ранее серонегативных к VZV детей в течение первого года после иммунизации вырабатывать анти-VZV антитела, составила 100%. У 94% из них сероконверсия зафиксирована в течение первых 8 недель после иммунизации. В исследованиях, проведенных в 1991 году, через 2 года после вакцинации, данный препарат также продемонстрировал высокую эффективность (98% серопозитивных), а через семь лет количество серопозитивных составляло 95%. Подобный уровень эффективности вакцины был продемонстрирован при введении высоких доз препарата (17,430 БОЕ). В дальнейшем испытуемым вводились значительно меньшие дозы вакцины. Так, показано, что после введения вакцины в дозе 950 БОЕ, 75-87% пациентов на протяжении 2-3-х лет сохраняли достаточно высокие уровни анти-VZV IgG-антител [73]. Исследование, проведенное с участием 3300 детей в возрасте от 12 месяцев до 17 лет, показало эффективность вакцины в дозах 1000, 1140, 1145, 1450 и 1625 БОЕ. До 96% вакцинированных лиц вырабатывали специфические антитела в высоких титрах. У 99% из них, антитела сохранялись в течение года. Только у 12% вакцинированных детей в результате контакта с больными ветряной оспой развивалось заболевание, из числа не иммунных контактных лиц ветрянкой заболело 87%. В другом исследовании вакцины, содержащей 2900-9000 БОЕ, эффективность по предотвращению заболевания в течение 3 лет после вакцинации составляла 93% [135]. В 1995 году вакцина с торговым названием Varivax (Merck) была одобрена FDA (Food and Drug Administration) для использования в США. В

2005 году для вакцинации детей в возрасте от 12 месяцев до 12 лет стала применяться тетравалентная вакцина против кори, краснухи, эпидемического паротита и ветряной оспы (ProQuad\ Merck) [31]. Совет по иммунизации США (ACIP) рекомендовал обязательную вакцинацию детей 12-18 месяцев, а также детей из «групп риска» с 19 месяцев до 12 лет. Детям старше 13 лет, не болевшим ветряной оспой, рекомендовалось двукратное введение вакцины с интервалом 4-8 недель. Начиная с 1999 года, в США ACIP предложил сделать вакцинацию против ветряной оспы необходимым условием при госпитализации детей и при их поступлении в начальную школу. В Германии Институт Роберта Коха с целью профилактики синдрома врожденной ветряной оспы рекомендовал проводить дополнительную вакцинацию детей в возрасте от 12 до 15 лет, ранее не болевших ветрянкой. После одобрения применения вакцины в США число вакцинированных детей 19-36 месячного возраста неуклонно росло, с 27% в 1997 до 89% в 2006 году. В 2006 году в США было зарегистрировано 612,768 случаев ветряной оспы (снижение по сравнению с довакцинальным периодом на 85%), 1276 госпитализаций (снижение на 88%). В 2004 году было зарегистрировано всего 19 смертей обусловленных тяжелым течением ветряной оспы и ее осложнениями, до вакцинации регистрировалось 105 случаев в год - снижение показателя смертности составило 82% [103]. Наиболее существенное снижение заболеваемости наблюдалось в группе детей от 1 до 9 лет, а самое значительное сокращение смертности наблюдали в возрастной группе до 4-х

лет. Введение вакцинации привело к смещению пика заболеваемости с 3-6 летнего возраста на 9-11 лет. Еще одним достоинством живой вакцины можно считать её эффективность при профилактике опоясывающего герпеса. Так, при исследовании у детей, больных лейкозами, пациенты в возрасте до 5 лет, вакцинированные против ветряной оспы, значительно реже заболевали инфекцией вследствие эндогенной реактивации вируса -опоясывающим герпесом, чем дети, переболевшие ветряной оспой. По всей видимости, вакцинный штамм, несмотря на развитие латенции в ганглиях, в силу аттенуации, реактивирует значительно реже, чем дикий штамм вируса ветряной оспы. Sharrar R.G. et al в 2009 году опубликовал данные о 205 случаях развития опоясывающего герпеса после вакцинации Varivax. Всего было введено 16,1 млн. доз вакцины, заболеваемость составила 1,3 на 100000, что существенно ниже заболеваемости опоясывающим герпесом после перенесенной первичной VZV-инфекции, составляющей 3,2 на 100000 населения в год. Из 205 зарегистрированных случаев опоясывающего герпеса, 143 случая были выявлены у детей до 5 лет. Из них 32 ребенка были обследованы с помощью ПЦР. У 22 детей обнаружили ДНК вакцинного* а у 10 - дикого штамма VZV [74]. Для сравнения, заболеваемость опоясывающим герпесом в группе детей до 5 лет, инфицированных диким штаммом VZV, составляла 20 случаев на 100000. Это еще раз подтверждает меньшую склонность к реактивации штамма Ока по сравнению с диким вирусом. Здоровые дети, вакцинированные живой аттенуированной

вакциной, рискуют заболеть опоясывающим герпесом в 4-12 раз меньше, чем дети, перенесшие ветряную оспу [15].

Несмотря на снижение показателей заболеваемости, болезненности и смертности, количество вновь выявляемых случаев ветряной оспы в США с 2003 по 2006 год оставалось стабильным. Даже в регионах с высоким охватом вакцинацией (96-100%) наблюдались множественные вспышки ветряной оспы. Было установлено, что однократное введение вакцины предотвращает развитие ветряной оспы лишь у 80-85% детей. Ретроспективный анализ 10-летнего периода вакцинопрофилактики показал, что риск развития ветряной оспы (через 42 дня после прививки) в группе детей, получивших 1 дозу вакцины, оказался в 3,3 раза выше, чем у двукратно иммунизированных детей. В 2006 году АС1Р рекомендовал двукратную вакцинацию детей до 12 лет с интервалом 3 месяца, ас 13-летнего возраста допускалась двукратная вакцинация с интервалом в 28 дней. К факторам риска неэффективности иммунизации и развития ветряной оспы, вызванной диким штаммом, относят: возраст на момент вакцинации менее 14 месяцев, давность однократной вакцинации более 5 лет и отягощенный аллергологический анамнез в виде атопической бронхиальной астмы или экземы [121]. Оказалось, что у пациентов страдающих бронхиальной астмой или респираторным аллергозом эффективность вакцинации в 7,1 раз ниже, чем у здоровых детей. Предполагается, что ветряная оспа у вакцинированных

может вызываться мутантным штаммом, устойчивым к действию антител к УгУ. Кроме того, заболевание ветряной оспой, вызванное диким штаммом вируса у однократно иммунизированных лиц, может быть отчасти связано с низким уровнем секреторных анти-У2У б^А в слизистых оболочках пациентов после подкожной иммунизации [121]. Актуальной проблемой является выявление факторов, ответственных за восприимчивость к повторному заражению VZV как вакцинированных против ветряной оспы, так и перенесших инфекцию, вызванную диким штаммом вируса.

В России специфическая профилактика ветряной оспы на федеральном уровне до настоящего времени не проводится, она осуществляется регионально, например, включена в календарь профилактических прививок г. Москвы и предусматривает иммунизацию детей старше 2 лет, не болевших ранее ветряной оспой (Приказ департамента здравоохранения г. Москвы №271 от 31 марта 2011 г.).

Исследования показали, что уОка - живой аттенуированный штамм входящий в состав современных вакцин, после попадания в организм, также как и дикий вирус, проникает в ганглии вегетативной нервной системы, черепно-мозговых и спинномозговых нервов, где в течение всей жизни хозяина персистирует в латентном состоянии [31]. При аутопсии у детей, вакцинированных против ветряной оспы, а затем умерших по различным, не связанным с вакцинацией причинам, в ганглиях

спинномозговых и черепно-мозговых нервов обнаруживался вакцинный штамм УЪУ [31]. У вакцинированных с низким уровнем в сыворотке крови анти-УгУ возможна реактивация вакцинного штамма вируса уОка [73]. Риск развития связанного с вакцинацией опоясывающего герпеса выше у детей, имевших ассоциированную с вакцинацией сыпь или перенесших ветряную оспу после вакцинации [49]. Поствакцинальное заболевание опоясывающим герпесом описано лишь у нескольких здоровых детей. В одном случае ребенок с клиникой опоясывающего лишая, вызванного вакцинным штаммом, инфицировал своего сибса, который в результате развил клинику легкой ветряной оспы.

Исходя из предположения о выраженной бустеризации иммунитета после контакта с заразным больным иммунных к УгУ лиц, ряд исследователей высказывали опасения, что снижение вследствие массовой вакцинации свободно циркулирующего У2У нивелирует данный бустерный эффект и, таким образом, приведет к росту заболеваемости опоясывающим герпесом. Однако в большинстве эпидемиологических исследований, проведенных в странах с принятыми программами вакцинопрофилактики ветряной оспы, эти предположения не нашли подтверждения [99]. После реализации программ вакцинации против ветряной оспы в США и Германии заболеваемость опоясывающем герпесом остается на прежнем уровне, что может быть связано с поддержанием популяционного иммунитета благодаря

субклинической реактивации и выделения дикого штамма вируса ветряной оспы [88, 108]. В настоящее время лишь в исследовании Patel M.S. et al. 2008 года в Австралии был обнаружен рост заболеваемости herpes zoster после реализации вакцинации против ветряной оспы и более чем 66% снижения заболеваемости ветряной оспой. В 2005 году в Австралии была принята программа массовой вакцинопрофилактики ветряной оспы, а в 2010 году появилось сообщение о росте заболеваемости herpes zoster. К 2007 году охват вакцинацией детей в возрасте до 2 лет в Австралии составил лишь 15,8%. Начиная с 2005 года, в различных возрастных группах на 1,6% в год увеличилось число госпитализаций по поводу опоясывающего герпеса и на 1,7-3% в год применение противовирусных препаратов для лечения herpes zoster. Однако достоверной причинно-следственной связи между заболеваемостью herpes zoster и реализацией кампании по вакцинопрофилактике в этой работе авторам установить не удалось.

1.4. ОПОЯСЫВАЮЩИЙ ГЕРПЕС.

Полноценный гуморальный иммунитет к вирусу ветряной оспы и опоясывающего герпеса после перенесенной болезни или вакцинации не даёт гарантии того, что дикий или вакцинный штамм вируса с течением времени не реактивирует и не вызовет самостоятельное, часто тяжелое, изнуряющее человека заболевание - опоясывающий герпес (ОГ). При первичной инфекции VZV гематогенно и трансаксонально попадает в чувствительные ганглии головного и спинного мозга, а также в ганглии вегетативной нервной системы, где пожизненно персистирует в латентном состоянии, сохраняя способность к реактивации. По различным данным у 63-100% населения после перенесенной ветряной оспы развивается латенция VZV в ганглиях [18, 58, 77]. Латенция в ганглии тройничного нерва развивается в 94% случаев [59]. В первую очередь в группе риска по реактивации вируса находятся люди старше 60 лет, пациенты, получающие иммуносупрессивную терапию, кортикостероиды, анти-ФНО терапию (препаратами моноклональных антител к фактору некроза опухоли-а), онкологические больные, больные СПИДом, пациенты после трансплантации органов и костного мозга. И сильный стресс, и травма относятся к факторам риска реактивации VZV. Семейная предрасположенность также учитывается как фактор риска реактивации вируса [55]. Ветряная оспа, перенесенная ребёнком в возрасте до одного года, является предпосылкой для ранней

манифестации опоясывающего герпеса. Заболеваемость опоясывающим герпесом, в отличие от ветряной оспы, не имеет сезонности. По данным Награг Я. у 30% людей, переболевших ветряной оспой, впоследствии может развиться опоясывающий герпес, заболеваемость которым в США составляет 3,2 случая на 1000 населения в год [50]. С возрастом опасность возникновения опоясывающего герпеса также увеличивается. В 60-69 лет заболеваемость составляет 6,9 на 1000, а у лиц старше 80 лет она уже достигает 10,9 на 1000 [60]. Опасность заболевания опоясывающим герпесом у пожилого человека с физиологически сниженным клеточным иммунитетом сохраняется, несмотря на высокие титры противовирусных антител в сыворотке крови [100].

Эффективность иммунизации пациента вакциной против опоясывающего лишая зависит, главным образом, от функциональной активности его иммунной системы [99]. Прямые и непрямые затраты на лечение заболеваний, возникающих в результате реактивации У2У, в разы превосходят затраты на лечение первичной инфекции - ветряной оспы. Так, в Германии затраты на лечение опоясывающего герпеса составляют 70 млн. евро в год, что в 4 раза превышает затраты на лечение ветряной оспы.

1.4.1. Клиническая картина опоясывающего герпеса.

Опоясывающий герпес, как правило, проявляется в виде унилатеральной зудящей, болезненной сыпи в пределах 1-3 дерматомов, преимущественно в грудном отделе. После разрешения высыпаний могут оставаться рубцовые изменения на коже. В 10-20% случаев опоясывающий герпес проявляется глазным герпесом {herpes zoster opticus), при котором поражается глазничная ветвь тройничного нерва. Эта форма заболевания чаще всего осложняется постгерпетической невралгией (ПГН). Кроме того, существует опасность возникновения склерита, острого эпителиального кератита, увеита, пареза глазодвигательных нервов, ретинита, неврита зрительного нерва, что чревато снижением зрения и даже развитием слепоты [78]. Опоясывающий герпес с поражением уха (herpes zoster oticus) -синдром Рамсея-Ханта (Ramsay-Hunt) - развивается вследствие поражения VZV коленчатого ганглия лицевого нерва и проявляется сильной болью в области уха, а также парезом лицевого нерва на стороне поражения, сочетающимся с герпетическими высыпаниями на коже наружного слухового прохода [109, 117]. Поражение VZV верхне- и нижнечелюстной ветви тройничного нерва может приводить к остеонекрозу челюсти и даже к спонтанному выпадению зубов [89, 132]. Обнаружение ДНК вируса в узлах чревного и нодозного сплетений вегетативной нервной системы, позволяет предполагать возможность поражения висцеральных органов при

реактивации VZV [36]. В ряде случаев, особенно у лиц с иммунодефицитными состояниями, реактивация VZV может вызывать такое генерализованное поражение как гранулематозный артериит, приводящий к развитию геморрагического инсульта, миелита, менингита и энцефалита [22, 40, 81].

1.4.2. Осложнения опоясывающего герпеса.

К наиболее частым осложнениям опоясывающего герпеса можно отнести резидуальные боли, персистирующие у пациентов более 6 недель с момента начала высыпаний - постгерпетическая невралгия (ПГН). Эти боли могут длиться несколько месяцев, а иногда остаются годами вследствие продолжающегося геморрагического некроза и фиброза в чувствительных ганглиях спинного мозга [133]. Чем старше пациент, тем вероятнее возникновение у него осложнения в виде ПГН, риск развития которого в среднем составляет 10-20% [29, 50]. У пациентов старше 60 лет опоясывающий герпес осложняется ПГН уже в 40% случаев. Существенным фактором, предрасполагающим к возникновению ПГН, служит выраженность болевого синдрома в период высыпаний опоясывающего герпеса [23]. Приблизительно в 5% случаев herpes zoster осложняется развитием парезов черепно-мозговых и периферических нервов [123]. Осложнение в виде миелита обычно проявляется слабостью и аномалией глубоких сухожильных рефлексов со стороны высыпаний и сегментарным

геми- или парапарезом [123]. При развитии миелита может наблюдаться дисфункция мочевого пузыря. Течение миелита у иммунокомпетентных лиц в большинстве случаев бывает монофазным, со спонтанным выздоровлением. Однако у лиц с иммунодефицитами, чаще всего у больных СПИДом, заболевание имеет демиелинизирующую природу, характеризуется прогрессирующим волнообразным течением и часто приводит к летальному исходу. Описаны случаи миелита после опоясывающего герпеса не только у иммунодефицитных пациентов, но и у лиц с нормальным иммунным статусом [34].

У1У-васкулопатия. Вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса способен реплицироваться в стенках мозговых артерий человека. Это подтверждается обнаружением в стенках артерий головного мозга многоядерных гигантских клеток, включений в виде телец Каудри типа А и вирионов герпеса, вирусных антигенов и ДНК вируса [38]. Предположительно такое избирательное поражение сосудов именно ЦНС связано с отсутствием в их стенке наружной эластической мембраны, что упрощает трансмуральное распространение вируса от адвентиции к интиме сосуда [39, 87]. Наличие по данным МРТ-исследования мультифокальных поражений головного мозга на стыке белого и серого вещества у человека при У^У-васкулопатии предполагает наряду с трансаксональным и гематогенный механизм распространения вируса. В опытах на животных

показано, что распространение VZV происходит путем аксонального антероградного транспорта из тройничного ганглия, коленчатого узла в передние и средние мозговые артерии, а из С1-СЗ спинномозговых ганглиев шейного отдела спинного мозга в задние мозговые артерии [37, 87, 105]. Вирусная инфекция в стенках артерий приводит к воспалению, тромбозу и окклюзии сосудов. Большинство неврологических состояний при реактивации VZV связаны с моно- или мультифокальными инфарктами вследствие развития васкулопатий при репродукции вируса в стенках больших и малых мозговых артерий [40]. Вследствие вирусиндуцированного поражения сосудов возможно образование аневризм мозговых артерий. Точную частоту VZV-васкулопатий и ишемических инсультов на фоне реактивации вируса ветряной оспы у взрослых установить достаточно сложно, так как многие подобные случаи протекают без характерных высыпаний и остаются не диагностированными. Чаще всего васкулопатии выявляются у лиц с состоянием иммуносупрессии. По данным аутопсии больных СПИДом от 1,5% до 4,4% инфекций ЦНС у данных пациентов вызываются VZV [43]. У 25% (у 2-х из 8) больных церебральной васкулопатией инфекционной этиологии была диагностирована VZV-инфекция [67]. Недавнее популяционное исследование, проведенное на о. Тайвань показало, что заболевание опоясывающим герпесом с поражением глазничной ветви тройничного нерва более чем в 4,5 раза повышает риск развития инсульта в течение последующего года [80]. В группе больных с

глазным вариантом herpes zoster в течение года инсульт развивался у 8,1% больных, а в группе сравнения только у 1,7% человек. Однако данное исследование носило ретроспективный характер и верификации активной VZV-инфекции в момент инсульта не проводилось. От 7% до 31% диагностированных ишемических инсультов у детей были вызваны активной формой VZV-васкулопатии, а у 44% детей транзиторным ишемическим атакам предшествовала ветряная оспа [6, 10, 12]. В детском возрасте 1 из 15000 случаев ветряной оспы осложняется инсультом [10].

Некроз сетчатки. Клинически VZV-индуцированный некроз сетчатки проявляется в виде острого или прогрессирующего некроза сетчатки. Острый некроз сетчатки (ОНС) встречается как у иммунокомпетентных больных, так и у пациентов с нарушениями иммунного статуса. У пациентов с ОНС наблюдаются периорбитальные боли, помутнение стекловидного тела и снижение периферического зрения. Некроз пронизывает сетчатку на всю толщину и характеризуется очаговыми четко ограниченными участками сетчатой оболочки, локализующимися за височными сосудистыми аркадами. Главным диагностическим признаком этой окклюзионной ангиопатии является выраженное воспаление передней камеры глаза и стекловидного тела [57]. Кроме VZV, ОНС могут вызывать вирус простого герпеса 1 и 2 типов [111, 120, 124]. Прогрессирующий некроз сетчатки (ПНС) вызывается почти исключительно VZV. В Северной Америке

У2У-ассоциированный ПНС занимает после цитомегаловирусной инфекции второе место среди оппортунистических инфекций с поражением сетчатки у больных СПИДом [26]. ПНС чаще встречается у больных СПИДом и другими иммуносупрессивными состояниями, у которых количество CD4+ лимфоцитов составляет менее 10 в 1 мм3 крови [48, 76]. Предшественниками ПНС могут быть ретробульбарный неврит зрительного нерва, асептический менингит и окклюзия центральной артерии сетчатки [27, 90]. Множественные отдельные нечеткие повреждения сетчатки начинаются в периферическом отделе её внешнего слоя, и только на поздних стадиях вовлекаются глубокие слои сетчатки.

1.5. СУБКЛИНИЧЕСКАЯ ФОРМА VZV-ИНФЕКЦИИ.

В последние десятилетия появились сообщения о развитии абортивных, с точки зрения клинических проявлений, форм инфекции вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего герпеса. Клеточный иммунный ответ снижает выраженность кожных проявлений при реактивации вируса, но не останавливает репликацию вируса в нервной ткани. Таким образом, практически любое неврологическое проявление реактивации VZV может протекать без характерных высыпаний. Клиницисты должны всегда помнить о реальной возможности развития опоясывающего герпеса без везикулярной сыпи {zoster sine herpete).

Обследования пациентов из групп риска по реактивации VZV, находящихся в состоянии стресса - во время космического полета -продемонстрировали возможность развития субклинической формы болезни (без каких-либо клинических проявлений), сопровождающейся выделением вируса со слюной [88]. В исследованиях Schuneman'a было показано, что у 3 из 120 обследованных иммуннокомпетентных пациентов старше 50 лет без клиники опоясывающего герпеса в лимфоцитах периферической крови определялась ДНК VZV [108]. Известно, что фактором риска ранней манифестации опоясывающего герпеса служит перенесенная внутриутробно или в возрасте до 1 года первичная VZV-инфекция. При обследовании в динамике 6 детей без кожных высыпаний, перенесших в течение первого

года жизни ветряную оспу, у половины из них (3 ребенка) в парных сыворотках определялась более чем 4-х кратное нарастание титра вирус специфичных IgG-антител. У 4 из 6 детей вирус специфический клеточный иммунитет становился положительным, что также указывает на активацию иммунной системы вирусом и субклиническое течение yZV-инфекции. При исследовании Birlea М. et al., 2011 из 186 больных СПИДом у 16% пациентов определялись признаки субклинической инфекции ЦНС, вызванной вирусом ветряной оспы. Диагноз у них был подтвержден при ИФА исследовании парных образцов спинномозговой жидкости. Подобный субклинический вариант VZV-инфекции удалось подтвердить и в экспериментах in vivo с использованием родственного вируса ветряной оспы обезьян - SVV {Simian Varicella Virus). Лишь у 1 из 5 обезьян с индуцированной радиационной терапией иммуносупрессией была обнаружена манифестная инфекция, а у 4 заболевание протекало без клинических проявлений [84]. По-видимому, субклиническая форма заболевания при реактивации VZV встречается существенно чаще, чем манифестная форма. Однако точная частота возникновения субклинической форм болезни при реактивации VZV как в группе здоровых доноров, так и у пациентов с поражениями ЦНС на сегодняшний день не известна.

Часть 2. Экспериментальные исследования Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1 ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ

Клиническое обследование больных и здоровых добровольцев проводили на базе Лаборатории диагностики вирусных инфекций НИИВС им И.И.Мечникова РАМН, в 9 отделении КИБ №1 г. Москвы, 17-м неврологическом отделении ГКБ №4 г. Москвы, в 4 отделении клиники Научного Центра Психического Здоровья РАМН г Москвы, в медицинском центре «МИАЛ-Олимп» г. Москва и в Медицинской службе МВД РФ.

В исследовании принимали участие:

1) 72 больных опоясывающим герпесом в среднем на 6 день болезни, находящихся на стационарном лечении. 33 пациента обследовались однократно только серологически, у 39 пациентов серологическое обследование сочеталось с оценкой продукции специфических антител культурой МПК и генетически-молекулярным исследованием.

2) 65 однократно обследованных здоровых донора.

3) 68 военнослужащих, проходящих срочную службу во внутренних войсках МВД России. Группа была разделена на лиц получающих однократную вакцинацию против ветряной оспы препаратом

«Окавакс» (АуепЙБ-РазШег, Франция), обследованных серологически в динамике (в день вакцинации и в среднем через 62 дня после введения вакцины) и подгруппу сравнения, включающую 32 человека, обследованных однократно. Клиническое наблюдение за развитием симптомов ветряной оспы проводилось в течение 6 месяцев.

4) 91 здоровая женщина в среднем на 7 неделе беременности, подтвержденной УЗ-исследованием, серологически обследовались однократно.

5) 48 пациентов с острой ишемией головного мозга, из них 18 человек с подтвержденным МРТ-исследованием диагнозом ишемического инсульта серологически обследовались в динамике: в первые 3 суток от ишемической атаки, через месяц стационирования и через 3 месяца амбулаторно. Еще 14 пациентов с ишемическим инсультом и 16 с транзиторной ишемической атакой в первые 24 часа от начала ишемической атаки, без нейровизуализации ишемического очага были обследованы однократно серологически, и с учетом продукции специфичных антител в культуре МПК.

6) 38 пациентов с психической патологией однократно обследовали серологически в сочетании с оценкой продукции специфичных антител в культуре МПК и генетически-молекулярным исследованием.

2.2 ВАКЦИННЫЙ ПРЕПАРАТ

36 из 68 военнослужащим, прибывающим на комплектование во внутренние войска РФ в часть с продолжающейся вспышкой ветряной оспы, однократно проведена вакцинопрофилактика ветряной оспы препаратом на основе живого аттенуированного штамма - «Окавакс» Biken Institute, Япония (Дистрибьютор Aventis-Pastuer, Франция).

2.3 ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

Концентрацию анти-VZV IgG, IgM и IgG к gE VZV в сыворотке и плазме крови, а также в супернатанте культуры МПК определяли с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Использовали лицензированные коммерческие иммуноферментные тест-системы (ИФТС) производства ЗАО «Векторбест» (РФ) - «Векто VZV - IgG», «Векто VZV - IgM» и «Векто gE-VZV - IgG», а также ИФТС производства «Эколаб» (РФ) - «ИФА-Ветряная оспа-IgG» и «ИФА-Ветряная оспа-IgM». При проведении ИФА следовали методическим рекомендациям производителей тест-систем. Величину оптической плотности измеряли при длине волны Х,=450 нм на спектрофотометре Е1х800 (BioTek, США). Данные, полученные на ИФТС «Векторбест», выражали в единицах оптической плотности (ед. ОП), а на ИФТС производства «Эколаб» в ед. ОП и титрах, определённых по калибровочному графику ИФТС.

С помощью ИФА определяли специфичные к цитомегаловирусу (ЦМВ) ^в-антитела в супернатанте культуры МПК с использованием ИФТС «ЦМВ-Скрин» производства ЗАО «Биосервис» (г. Москва).

Тев-антитела к вирусу простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ-1 и-2) и индекс их авидности в сыворотке крови и надосадочной жидкости культуры МПК испытуемых определяли с помощью ИФТС «ВПГ1 -диагност», «ВПГ2-диагност» («Биосервис», Москва). При проведении ИФА следовали методическим рекомендациями производителя ИФТС. Результат выражали в единицах оптической плотности (ед. ОП).

Специфичные к ВПГ-1 и ВПГ-2 ТцМ-антитела выявляли с помощью лабораторного варианта ИФТС, включающего ВПГ-1 и ВПГ-2 иммуносорбент (ЗАО «Биосервис») и конъюгат меченных пероксидазой хрена мышиных антител к человеческому 1§М (ЗАО «Эколаб»).

Концентрацию кортизола в сыворотке крови определяли с помощью одностадийного конкурентного варианта твердофазного ИФА с использованием ИФТС «ИммуноФА-КОРТИЗОЛ» (НВО «Иммунотех», Москва). Концентрацию определяли по калибровочному графику, построенному по величинам оптической плотности внутренних образцов ИФТС с известной концентрацией кортизола. Результаты выражали в нмоль/л. Концентрацию кортизола, превышающую 638 нмоль/л, считали повышенной.

Оценивали уровень у-интерферона и интерлейкина-4 в надосадочной жидкости культуры МПК сэндвич вариантом твердофазного ИФА с использованием тест-систем «ProCon IF gamma», «ProCon IL4» (Протеиновый контур, Санкт-Петербург). При проведении ИФА следовали методическим рекомендациям производителя ИФТС. Благодаря калибровочным референтным образцам ИФТС строили кривую зависимости оптической плотности измеренной при >.=450 нм на спектрофотометре Е1х800 и концентрации цитокинов (в пг/мл). По графику определяли концентрацию цитокинов в исследуемом образце.

2.4 ОЦЕНКА АВИДНОСТИ VZV-СПЕЦИФИЧНЫХ IgG В

СЫВОРОТКЕ КРОВИ.

Оценку авидности антител к VZV осуществляли с помощью метода, модифицированного Kneitz R. и соавторами, сущность которого заключается в параллельной постановке ИФА одного образца сыворотки крови в двух лунках полистиролового планшета ИФТС [72]. После внесения и инкубации в соответствии с рекомендациями производителя тест-системы разведенного в 100 раз образца сыворотки крови в две лунки планшета, сорбированных вирусом ветряной оспы, производили однократную отмывку в течение 3 минут одной лунки диссоциирующим раствором (4M раствор гидроперита -мочевины пероксида), под воздействием которого часть антител с меньшим сродством к антигенам VZV диссоциировала из образовавшегося на этапе

инкубации комплекса антиген-антитело. Во вторую лунку вносили раствор сравнения - фосфатно-солевой буфер (ФСБ). Индекс авидности (ИА) анти-VZV IgG определяли как отношение величины оптической плотности среды с добавлением гидроперита измеренной при А,=450 нм к величине ОП с добавлением ФСБ и выражали в %. Авидность считалась низкой при ИА антител менее 35%, переходной при 36-65%, свыше 66% - высокой.

2.5 ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ IN

VITRO.

Для выделения мононуклеаров периферической крови (МПК) кровь путем венепункции получали натощак, для предотвращения коагуляции гепаринизировали из расчета 20 единиц натрия гепарина на 1 мл цельной крови. Клетки выделяли с помощью одноступенчатого градиента плотности Фиколл-Верографина (р=1,077). Отбирали лимфоцитарное кольцо, клетки трижды отмывали раствором Хенкса при 4°С. МПК доводили до концентрации 1 х 106 кл/мл и культивировали в стерильных стеклянных пробирках при 37 °С в полной питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коров, 4 мМ L-глутамина и гентамицин. Через 48 часов МПК осаждали центрифугированием при 250 g в течение 15 минут, а полученную надосадочную культуральную жидкость разливали в пластиковые микропробирки типа эппендорф по 350 мкл и хранили до проведения ИФА при -18 °С.

2.6 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК

Для определения жизнеспособности клеток использовали 0,1% раствор трипанового синего (Serva, США) на культуральной среде. Окрашивание МПК красителем осуществляли согласно стандартному протоколу. Подсчет клеток проводили с помощью камеры Горяева — приемлемым для дальнейшего культивирования считали уровень жизнеспособных клеток > 95%.

2.7 ОЦЕНКА СПОНТАННОЙ И ИНДУЦИРОВАННОЙ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ В КУЛЬТУРЕ МПК.

МПК выделяли и отмывали, как описано выше. Культивировали в концентрации 1 млн./мл в стерильных стеклянных пробирках в течение 48 часов при 37 С0 в полной питательной среде RPMI-1640, а также в аналогичной среде с добавлением конканавалина А в концентрации 0,5 мг/л. Через 48 часов клетки осаждали центрифугированием, полученный супернатант разливали по 300 мкл алликвотам и хранили до проведения дальнейшего анализа при - 18С. В дальнейшем оценка уровня цитокинов в надосадочной жидкости проводилась методом ИФА.

2.8 ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ.

Для выделения тотальной клеточной ДНК к клеточному осадку добавляли 270 мкл буфера NET (100 ммоль NaCl, 10 ммоль ЭДТА (рН 8,0), 40 ммоль

Tris-HCl (pH 7,5)), 30 мкл 10%-ного раствора SDS и протеиназу К (изготовитель ЗАО «Синтол») до конечной концентрации 0,02 - 0,04 мг/мл. Инкубацию проводили при 54-56°С 1-1,5 ч, периодически встряхивая смесь. Тотальную клеточную ДНК экстрагировали трижды: фенолом, смесью фенола и хлороформа (1:1), смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1) [3]. Осаждали ДНК с помощью 96% этанола, отмывали еще раз 70% этанолом и растворяли в буфере Tris-HCl (pH 8,0). Пробы ДНК для немедленного использования хранили при +4°С, а для длительного хранения замораживали при -20°С. Также использовали набор для выделения нуклеиновых кислот DIAtom Prep 100 (Izogen, Москва).

2.9 «ДВОЙНАЯ» ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ.

Амплификация маркерного фрагмента с помощью «двойной» ПЦР ( nested double PCR). В качестве маркера на присутствие ДНК VZV в образце использовали фрагмент гена гликопротеина I (gl) длиной 447 пар нуклеотид (п.н.). В качестве положительного контроля использованы вакцинные штаммы Varicella zoster выращенные на базе лаборатории гибридных клеточных культур ИВС РАМН: штамм Oka (4 пассаж, клетки MRC-5; 4 пассаж, ВСЖ; 4 пассажа на клетках MRC-5 и 4 пассажа на клетках Vero) и Варилрикс (1-й и 2-й пассажи, клетки MRC-5). Для получения указанного фрагмента последовательно использовали две пары праймеров [61]. Первый продукт длиной 677 п.н. синтезировали с использованием праймеров:

gl-Fl: 5'-CCG TAT ATG AGC CTT-3' gl-Rl: 5'-GAG TTC АТС AAA CAG TGT GCT CGT G-3' После первой ПЦР проводили очистку ПЦР-продукта с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Второй ПЦР-продукт длиной 447 п.н. синтезировали с использованием праймеров:

gI-F2: 5'-TAT GGC САС GTA ARG ATT ATG ATG G-3' gIR2: 5'-CCA CGT CTT GAA AGC ATG TTG TAT G-3'. Смесь для ПЦР содержала десятикратный буфер для амплификации (ЗАО «Синтол», Москва) с концентрацией MgCl2 1,5 шМ; по 200 нмоль каждого из 4 дезоксирибонуклеотидов; по 1 мкмоль из 2 праймеров; 100-200 нг тотальной клеточной ДНК и 0,5 ед. Taq-полимеразы (ЗАО «Синтол», Москва). Объем реакционной смеси составлял 25 мкл.

Программа амплификации включала этап первоначальной денатурации ДНК: +94°С — 10 мин; 30 циклов синтеза фрагмента: +90°С— 1 минута, +60°С — 2 минуты, 72°С — 2 минуты; заключительный этап достройки концов: +72°С — 5 минут [61]. Полученный после первой ПЦР продукт в объеме 5 мкл брали для второй реакции при общем объеме смеси 25 мкл.

Наличие ПЦР-продукта выявляли с помощью электрофореза аликвоты амплификата (10 мкл) в 1,6%-ном агарозном геле. С целью последующей визуализации продукта в ультрафиолете (À,=312 нм) в гель добавляли бромистый этидий (10 мг/мл) до конечной концентрации 0,2 мкг/мл.

2.10 ПОЛИМЕРАНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Для подтверждения моноэтиологической роли VZV в развитии опоясывающего герпеса проводили исследование ДНК, выделенной из МПК и плазмы крови больных опоясывающим герпесом с использованием набора «ВПГ-ГЕН. Комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК вируса простого герпеса человека 1, 2 типа в режиме реального времени» (НПО ДНК-Технология, Москва). Реакцию проводили согласно рекомендациям фирмы производителя в детектирующем термоциклере ДТ-96 (НПО ДНК-Технология).

2.11 ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕВМАТОИДНОГО ФАКТОРА (RF)

Для исключения ложноположительных результатов все образцы сывороток крови положительные на IgM исследовали на наличие ревматоидного фактора с помощью прямого теста агглютинации латексных частиц (RF-Direct Latex reagent test, VedaLab, Франция). Ревматоидный фактор -аутоантитела преимущественно класса М к IgG человека, образуется при ряде аутоиммунных (ревматоидный артрит) и некоторых инфекционных заболеваниях (инфекционный мононуклеоз). Латексный реагент представляет собой суспензию латексных частиц, сенсибилизированных человеческим гаммаглобулином. При смешивании реагента с образцом

сыворотки крови, содержащей ревматоидный фактор, происходит реакция агглютинации, которая легко регистрируется визуально. Таким образом, наличие или отсутствие агглютинации указывает на наличие или отсутствие RF в исследуемом образце. Минимальная чувствительность данного теста составляет 8 МЕ/мл. Что позволяет при использовании различных разведений сыворотки крови также оценить количество RF в исследуемом образце.

2.12 СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Statistica 8.0 (StatSoft). Определялись средние значения со стандартным отклонением (М ±а), 95% доверительный интервал, доли и их ошибки (% ± т%). Сравнение межгрупповых различий проводили с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрических критериев (Манн-Уитни, Колмогорова-Смирнова). Сравнение частот проводили с помощью точного критерия Фишера и х2- Для определения корреляционных связей показателей с нормальным распределением использовали коэффициент корреляции Пирсона (г), корреляцию непараметрических распределенных данных проводили по Спирману (R). Порогом статистической значимости считали альфа-уровень = 0,05 [2].

Часть 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение

Глава 3. Лабораторная диагностика инфекции, развивающейся вследствие реактивации VZV,

До недавнего времени бытовало представление, что VZV-инфекция исключительно манифестна, то есть и первичное экзогенное инфицирование, и вторичная эндогенная реактивация, протекающая с наиболее тяжелой неврологической симптоматикой, обязательно сопровождается характерными везикулярными высыпаниями [1]. Основным и достаточным диагностическим методом, таким образом, был клинический. Если же требовалась верификация инфекционного агента, то при манифестной форме реактивации VZV в виде опоясывающего герпеса (ОГ) генетически-молекулярное исследование содержимого везикул на ДНК вируса было наиболее показательным методом диагностики. Так, было опубликовано исследование, где удалось диагностировать эндогенную реактивацию VZV по единичному пузырьку [128]. Однако, было показано, что в ряде случаев иммунный ответ способен снизить кожные проявления VZV-инфекции, не предотвращая репликацию вируса в нервной ткани - так называемый зостер без высыпаний - Zoster Sine Herpete [41]. Более того, показано, что из тройничного узла, а также из чувствительных ганглиев первых шейных спинномозговых нервов вирус после реактивации способен распространяться к адвентиции сосудов головного мозга и далее трансмурально проникать и

реплицироваться в интиме артерий [85, 86, 105]. Подобное вирусное поражение сосудов головного мозга - У2У-васкулопатия - может приводить к развитию инсультов и формированию сосудистых мальформаций [40]. В 37% случаев VZV-вacкyлoпaтия не сопровождается характерными везикулярными высыпаниями. Особый интерес представляет разработка подхода к выявлению атипичной инфекции вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего герпеса. Поскольку именно такая форма инфекции наиболее трудна с точки зрения серологической диагностики из-за невозможности дифференцировать анамнестические антитела от инфекционных. В свете перечисленного выше, лабораторная диагностика У2У-инфекции при реактивации вируса приобретает особую актуальность. Для решения этой проблемы нами был разработан собственный двухэтапный диагностический подход, состоящий из этапа выделения и культивирования в питательной среде без стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови (МПК), а также этапа учета продукции специфических антител в надосадочной жидкости культуры МПК с помощью твердофазного варианта ИФА. Также мы сравнили специфичность и чувствительность разработанного нами подхода с существующими методами диагностики острой У2У-инфекции.

На этом этапе в исследование были включены 65 добровольцев. Они были разделены на две группы. Первая - опытная группа - состояла из 39

больных ОГ в период активных везикулярных высыпаний. Средний возраст больных составлял 63,7±18,1 лет. Забор крови проводился в среднем на 7 ± 3,7 день с момента появления неврологической симптоматики, предшествующей в большинстве случаев появлению высыпаний на коже. Вторая - группа контроля - состояла из 26 практически здоровых доноров без везикулярных высыпаний на коже и слизистых. Все добровольцы контрольной группы были серопозитивных по 1§С к то есть были

латентно инфицированы вирусом. Участники группы контроля перенесли первичную У2У-инфекцию - ветряную оспу (26 человек) более чем за 1 год до исследования, причем 5 человек контрольной группы кроме первичной инфекции также переболели ОГ. Три человека контрольной группы находились в контакте с больными ОГ в заразный период - работники отделения КИБ №1. Средний возраст доноров составлял 49,4 ± 15,4 года. Тендерный состав групп достоверно не различался.

Таблица 1.

Характеристика групп, участвовавших в исследовании эффективности лабораторных методов диагностики острой Varicella zoster вирусной инфекции

Признак Больные опоясывающим герпесом Здоровые доноры

Количество, человек 39 26

Возраст, лет (М±а) 63,7±18,1 49,4 ± 15,4

Тендерный состав (б1:?) (29:71)% (25 :75)%

Давность VZV-инфекции 7 дней (3 - 22 дня) более 1 года назад

Доля лиц серопозитивных по анти-VZV IgG 100% 100%

IgG к VZV в сыворотке крови, ед.ОП (М±а) 3,43±1,05 2,47 ± 1,43*

Максимальный уровень анти-VZV IgG в сыворотке крови, ед.ОП 4,365 4,047

Примечание: *- достоверность различий между больными опоясывающим герпесом и здоровыми донорами, р<0,05 по ^критерию Стьюдента.

3.1. СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА.

Мы оценили эффективность серологической диагностики в выявлении острой \^У-инфекции. Диагностика включала определение в сыворотке

крови больных ОГ маркеров острой УгУ-инфекции - ^в-антител к поверхностному гликопротеину Е вируса (£Е) а также анти-У2У ^М.

Диагностику проводили с использованием ИФТС «Векто — и

«Векто УТУ - ^М». Также все сыворотки были исследованы методом ИФА на наличие к У2У с использованием ИФТС «Векто - ^в».

Пороговым значением, выше которого образец признавали положительным, считали в соответствии с методическими рекомендациями производителя ИФТС сумму величины отрицательного контроля для ИФТС (в нашем случае 0,067 ед. ОП) и 0,3 ед. ОП. Все пациенты с ОГ были серопозитивны к вирусу ветряной оспы, образцы сывороток были положительными на наличие анти-УгУ Для участников контрольной группы критерием включения в исследования была серопозитивность по к У2У. Максимальные значения к V2У в сыворотках крови больных ОГ и доноров контрольной группы были сопоставимы - 4,365 и 4,047 ед. ОП, соответственно. Средний же уровень к У2У в сыворотке крови, выявленный по результатам иммуноферментного анализа, в группе ОГ составил 3,43 ± 1,05 ед. ОП, а в группе контроля средний уровень антител к УХУ был достоверно ниже, он составил 2,47 ± 1,53 ед. ОП (р<0,05). Однако, так как в нашем исследовании максимальные значения у пациентов из обеих групп были сопоставимы, уровень ^в-антител к VZV в сыворотке

крови, выраженный в ед. ОП, не может служить диагностическим маркером острой инфекции, развившейся вследствие реактивации VZV.

Таблица 2.

Частота выявления серологических маркеров острой Varicella zoster вирусной инфекции у больных опоясывающим герпесом и здоровых

доноров

Маркеры острой уху-инфекции Больные опоясывающим герпесом (%±ш) Здоровые доноры (%±т)

Анти-УгУ ^М 67±7,6* 3,8±3,8

Анти^Е уху да 67±7,6* 7,7±5,3

Анти-У2У ^М или анти^Е уху да 74±7,1* 11,5±6,4

Анти-угу ^м одновременно с анти-§Е уху да 59±7,9* 0

Отсутствие обоих маркеров 26±7,1 89,5±6,4*

Примечание: * - достоверные различия частот между группой больных опоясывающим герпесом и здоровыми донорами, р<0,001.

В группе больных ОГ у 13 из 39 человек (33,3%) методом ИФА не детектировались в сыворотке крови анти-У2У ^М. Также у 13 человек не удалось обнаружить в сыворотке крови антител к §Е УХМ. В группе контроля, без признаков острой У7У-инфекции, IgM к УХУ и анти-^Е УХУ в сыворотке крови были выявлены у 1 и 2 человек, соответственно. При этом ни у одного человека из группы контроля одновременно не было выявлено

антиЛ^У ^М и к gE в сыворотке крови, что обеспечивало 100% специфичность. Для исключения ложноположительных результатов при выявлении острой повторной У2У-инфекции следует рекомендовать одновременное определение обоих маркеров в сыворотке крови. В группе больных ОГ оба маркера в сыворотке крови одномоментно детектировались у 23 пациентов (59%).

Таким образом, определение к ^ VZV и оши-УТЧ ^М как маркеров острой УгУ-инфекции показало диагностическую значимость -59%. Однако, у 10 из 39 больных ОГ (26%) в сыворотке крови не определялось ни одного из вышеперечисленных маркеров. Определение к §Е \7У и анти-У2У ^М в сыворотке крови может служить скрининговым методом диагностики острой У2У-инфекции, но следует учитывать, что их детекция даже в комбинации не эффективна более чем в четверти случаев УгУ-инфекции, развившейся вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего герпеса.

Чувствительность серологической диагностики в нашем исследовании, таким образом, составила 59 ± 8% при 100% специфичности.

3.2. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ДВОЙНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ДИАГНОСТИКЕ УгУ-ИНФЕКЦИИ.

Из МПК 35 больных ОГ была выделена тотальная ДНК, которая была исследована на наличие ДНК с помощью двух последовательных

амплификаций с двумя парами праймеров к гену гликопротеина I ^1) У2У [61]. ДНК вируса ветряной оспы и опоясывающего герпеса была обнаружена в образцах 17 больных ОГ. Чувствительность ПЦР-диагностики составила 49±8,6% (95% С1: 31,2-66,0%). ДНК УгУ выявлялась с первых дней болезни по 11 день включительно, что соответствует данным литературы о целесообразности использования ПЦР-диагностики лишь в первые 2 недели заболевания ОГ [61].

3.3. ОЦЕНКА СПОНТАННОЙ ПРОДУКЦИИ В КУЛЬТУРЕ МПК УгУ-СПЕЦИФИЧНЫХ ^-АНТИТЕЛ

Нами была предложена собственная модификация метода диагностики острой инфекции, развившейся вследствие эндогенной реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего герпеса, основанная на анализе продукции специфических антител в 48-часовой культуре МПК.

На первом этапе необходимо было подтвердить синтез, а не занос в культуру МПК У2У-специфичных антител. Для этого мы культивировали МПК двух больных ОГ в течение 30 минут при 37 °С в полной питательной среде ИРМ1-1640, содержащей 20 мкг/мл ингибитора синтеза белка циклогексимида (СаИэюсИет, США), как описано 1.-Р. Уепс1ге11 с соавт. [131]. Инкубация МПК этих больных в течение 30 минут в полной питательной среде ЯРМ1-1640 без добавления циклогексимида служила контролем. Затем мононуклеарные клетки трижды отмывали раствором солей Хенкса,

тестировали их жизнеспособность (приемлемым для исследования считался уровень витальности > 95%), доводили до концентрации 1 х 106 кл/мл и культивировали, как описано нами в разделе «материалы и методы».

I. Выделение МПК

II. Культивирование

Венозная кровь+ 20

ед. Na гепарина

На градиенте плотности

(Р= 1,077)

Отмывка (хЗ)

III. Определение в надосадочной жидкости методом

ИФА:

1) IgG-антитела к VZV

2) IgM-антитела к VZV

48 ЧАСОВ

106 кл/мл

RPMI-1640

10%СГГК,

Глутами,

гентамицип

МПК 2 больных

1) 30 мин инкубации в р-ре циклогексимида

2) 30 минут инкубации в питательной среде

Рисунок 1. Схема эксперимента для определения продукции ^С к \Ъ\ в культуре МПК больных ОГ и добровольцев контрольной группы.

При обработке МПК данных двух больных циклогексимидом (ингибитором синтеза белка) продукция к WZV резко снижалась - с 0,6 ед. ОП до 0,229

ед. ОП у одного больного и с 1,767 ед. ОП до 0,263 ед. ОП - у другого. Полученные в эксперименте с обработкой МПК циклогесимидом данные указывают на синтез, а не занос специфичных противовирусных антител в культуру МПК, который блокировался в наших опытах с помощью данного препарата.

При культивировании МПК пациентов in vitro у 38-ми из 39-ти больных ОГ (97,4%) начиная с третьего дня болезни определялась спонтанная продукция анти-VZV IgG. Концентрация VZV-специфичных антител в образцах неразведенной культуральной жидкости была, как правило, значительной, ее уровень превышал 4,0 ед. ОП, минимальная концентрация VZV-специфичных IgG, которая была выявлена у одного из пациентов с типичной клиникой опоясывающего герпеса, составляла 0,6 ед.ОП. При разведении культуральной жидкости в пять и десять раз перед внесением в лунки ИФТС фосфатно-солевым буфером с целью определения концентрации IgG к VZV, анти-VZV IgG детектировался лишь у 28-ми и 24-х больных ОГ, что составило соответственно 72% и 62%. Исходя из полученных в эксперименте с разведением культуральной жидкости данных, для диагностики острой повторной VZV-инфекции мы рекомендуем использовать в ИФА цельную надосадочную жидкость культуры МПК.

Необходимо отметить, что в культуре МПК одной из пациенток с ОГ (2,6%) на 3-й день болезни выявить достоверно определяемую продукцию

IgM и/или IgG к VZV не удалось, что, возможно, было следствием недостаточного количества источников антителопродуцентов в выделенной популяции мононуклеаров периферической крови - на этом этапе мы культивировали 2,4 млн. клеток в концентрации 1 млн/мл. Действительно, по данным проточной цитометрии в исходной культуре МПК больных ОГ клетки, относящиеся к В-лимфоцитам (CD45+, CD 19+), составляли 6,5-8% -156-192 тыс. клеток. Данный факт мы учитывали при выборе оптимального количества клеток в культуре для диагностики атипичных случаев VZV реактивации. И в дальнейшем минимальным количеством нами был выбрано 3,5 млн. клеток в культуре МПК.

В отличие от активной продукции в культуре МПК IgG к VZV у подавляющего числа больных ОГ in vitro достоверно определяемое образование IgM-антител к VZV было зафиксировано лишь у четырех из 39 пациентов (10,3%). Это, по всей видимости, указывает на то, что в культуре МПК больных ОГ преимущественное участие в антителообразовании принимают В-клетки памяти, а не новые клоны В-лимфоцитов. При этом средний уровень продукции IgM к VZV в культуре МПК всех четырех больных был низким - 0,47 ±0,1 ед. ОП. Исходя из полученных нами данных, можно сделать вывод, что лабораторная диагностика острой инфекции, возникающей вследствие реактивации VZV, основанная на

анализе спонтанной продукции анти-У2У 1§М в культуре МПК больных ОГ, на практике не может быть успешно реализована.

При исследовании продукции антител в культуре МПК здоровых доноров ни в одном образце культуральной жидкости анти-У2У и IgM обнаружено не было, ОП образцов не превышала величину отрицательного контроля для данных ИФТС (0,067 и 0,089 ОП соответственно). Важно отметить, что спонтанная продукция специфичных антител к У2У отсутствовала, в том числе в культуре МПК испытуемых из контрольной группы, находившихся в контакте с больными У2У-инфекцией в заразный период - трех терапевтов, проводивших наблюдение за больными ОГ. Таким образом, в результате наших экспериментов, было выявлено, что продукция специфических антител в культуре МПК детектируется только при развитии инфекционного процесса, контакт с заразными больными, вероятно, не приводил к активации В-клеточной памяти.

Кроме того, все образцы надосадочной жидкости, полученные из культуры мононуклеарных клеток крови, как доноров, так и больных ОГ, не содержали к ЦМВ, что также указывает на специфичность процесса антителообразования.

В результате проведенного исследования нами было продемонстрировано, что чувствительность метода лабораторной диагностики острой У2У-инфекции, возникающей вследствие эндогенной

I

I

реактивации вируса, в основе которого лежит анализ спонтанной продукции VZV-специфичных IgG антител мононуклеарами периферической крови больных in vitro, оказалась очень высокой (97,4%), а специфичность метода с учетом полного отсутствия ложноположительных результатов составила 100%.

Таким образом, впервые были получены данные, указывающие на то, что при повторной вирусной инфекции, в нашем исследовании это была инфекция, возникающая вследствие эндогенной реактивации VZV, в культуре мононуклеаров периферической крови синтезируются специфичные антитела. У больных опоясывающим герпесом ex vivo в культуре МПК спонтанно синтезировались специфичные к VZV IgG-антитела, что подтверждается их обнаружением в культуральной жидкости с помощью ИФА. Синтез специфических антител в культуре МПК больных ОГ, вероятнее всего, является следствием предшествующей активации клеток VZV in vivo.

В культуре клеток испытуемых из контрольной группы, ранее инфицированных VZV (переболевших ветряной оспой), признаков продукции IgG к VZV обнаружено не было, что, по-видимому, указывает на латентное состояние вируса, персистирующего в организме. Занос в культуру клеток больных ОГ анти-VZV из сыворотки крови путем абсорбции на поверхности МПК представляется маловероятным. Во-первых, на это

указывает отсутствие выявления IgG к VZV в культуре МПК доноров, в сыворотке крови которых уровни антител класса G к VZV были сопоставимы с максимальными значениями анти-VZV IgG в сыворотке крови больных ОГ. Во-вторых, на факт синтеза иммуноглобулинов указывают данные эксперимента с ингибитором синтеза белка - циклогексимидом, после обработки клеток которым, уровень IgG к VZV в надосадочной культуральной жидкости больных ОГ резко снижался.

J.P. Vendrell et al. (1991) предложил использовать метод анализа спонтанной продукции специфичных антител в культуре МПК для диагностики первичной инфекции, вызванной Toxoplasma gondii (токсоплазмоз) и цитомегаловирусом (мононуклеоз). В своих экспериментах он подтвердил возможность получения ложноположительных результатов продукции антител за счет абсорбции на МПК антител сыворотки крови, что могло быть следствием избыточно высокой концентрации клеток (5 х 106 кл/мл) при культивировании [129-131]. В наших опытах при исследовании продукции антител в культуре МПК здоровых доноров ложноположительные IgG к VZV не определялись.

Продуцируемые клетками больных ОГ антитела были специфичны по отношению к изучаемому инфекционному агенту - VZV. Образования анти-ЦМВ IgG выявлено не было.

Чувствительность метода оценки спонтанной продукции к У^У в

культуре МПК составила 97,4±2,6%.

Так как исследованные нами на выборке больных ОГ с привлечением контрольной группы традиционные методы и предложенная нами модификация диагностического подхода показали разную эффективность, нам было интересно сравнить их диагностическую значимость в выявлении У2У-инфекции, развившейся вследствие реактивации вируса. Сравнение эффективности различных методов диагностики представлено на Рисунке 2.

110% 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

■ т 5

■ 1 I

I

1) ПЦР

2) Серология

(\г\ ^м + 8Е да)

3) ПЦР + Серология

4) Продукция \Z\

ДО МПК * р<0,05

Среднее П Ошибка среднего 195% интервал 12 3 4

Диагностическая значимость лабораторных методов

Рисунок 2

диагностики острой манифестной VZV-инфeкции вследствие реактивации вируса.

В наших экспериментах достоверных различий эффективности серологического метода и «двойной» ПЦР диагностики острой ^/ZV-инфекции выявлено не было. Даже при комплексном, включающем ПЦР и серологическую диагностику, обследовании лабораторное подтверждение получали лишь 77% случаев опоясывающего герпеса. Метод, основанный на анализе спонтанной продукции специфических антител в культуре МПК, был достоверно эффективнее двух последних самих по себе и вместе взятых (р<0,001).

Важно отметить, что для каждого метода диагностики \^У-инфекции существуют, по-видимому, оптимальные временные рамки действия. Представления о них были суммированы на основе данных литературы и собственных экспериментальных данных, полученных при исследовании образцов сыворотки крови, культуральной жидкости и МПК больных ОГ различной давности заболевании, а также в ходе динамического наблюдения за испытуемыми с субклинической инфекцией вследствие реактивации У2У, выявленной нами при дальнейшем исследовании (см. 5.З.). Так, серологические маркеры (1§в к gE УХУ и ^М к У2У) циркулируют в сыворотке крови дольше всего - до 6 месяцев с момента реактивации вируса, однако их выявление в первую неделю болезни наименее эффективно. В то же время, ПЦР диагностика эффективна только в первые 2 недели болезни, в наших экспериментах после 11 дня болезни ДНК уху в крови больных ОГ

выявить не удавалось [61]. Начало действия разработанного нами нового подхода, по всей видимости, совпадает с ПЦР диагностикой - уже с 3 дня болезни удавалось зафиксировать продукцию специфичных антител в культуре МПК больных ОГ, однако, по-видимому, детектируемая циркуляции источников антителопродуцентов продолжается меньше, чем действие серологического метода диагностики. В нашем исследовании при динамическом наблюдении за 3 пациентами с субклинической инфекцией, развившейся вследствие реактивации вируса, действие серологического метода диагностики по времени превышало выявление продукции специфичных антител в культуре МПК на 2-2,5 месяца. Представление о временных рамках и эффективности действия методов представляется нам чрезвычайно важным, так как по полученным результатам при комплексном обследовании позволяет таймировать инфекционный процесс.

Таким образом, на первом этапе исследования нами была предложена модификация диагностического подхода, основанная на анализе спонтанной продукции специфических антител в культуре МПК, которая, несмотря на свою относительную трудоёмкость, по сравнению с традиционными методами диагностики имела, на наш взгляд, преимущество, так как показала наибольшую эффективность в выявлении У2У-инфекции (97,4%). Традиционные же методы диагностики: ПРЦ и серологический метод,

основанный на одновременном выявлении в сыворотке крови таких маркеров острой У2У-инфекции как ^О к и к показали достоверно

меньшую эффективность. Она оказалась на уровне 49-59%. Даже при комплексном обследовании, включающем оба традиционных метода, эффективность лабораторной диагностики инфекции вследствие реактивации VZV не превышала 77%.

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Казанова, Александра Сергеевна

выводы

1) Разработан новый двухэтапный подход к диагностике манифестных и субклинических форм острой VZV-инфекции, основанный на анализе спонтанной продукции VZV-специфичных IgG-антител в культуре мононуклеаров периферической крови, превосходящий по эффективности серологический (ИФА) и молекулярно-генетический (ПЦР) методы диагностики VZV-инфекции.

2) Доля лиц с индексом авидности (ИА) анамнестических анти-VZV IgG более 35% в группе здоровых добровольцев до 25 лет составляет 83%, в группе 26-40 лет - 85%, в группе 41-65 лет - 90%, старше 65 лет -100%. Установлен средний ИА VZV-специфичных IgG-антител в данных возрастных группах, он нарастает с 50% у лиц моложе 25 лет до 68% у лиц старше 65 лет.

3) Преимущественный тип иммунного ответа на введение вакцины для профилактики ветряной оспы зависит от исходной авидности VZV-специфичных IgG-антител в сыворотке крови: преимущественно первичный иммунный ответ развивается у лиц с исходным ИА более 50%, вторичный ответ - при ИА менее 50%.

4) Одним из факторов развития риска повторного заражения VZV является гуморальный иммунный ответ на первичное инфицирование, включающий изменение смены изотипа и созревание аффинности УгУ-специфичных антител (циркуляция в крови анамнестических анти-У2У ^М в сочетание с низкими титрами низкоавидных УгУ-специфичных 1§0-антител).

5) Продемонстрирована перекрестная реактивность, развивающаяся при иммунном ответе на реактивацию УгУ: вырабатываемые у 19 и 27% больных опоясывающим герпесом ^в-антитела перекрестно реагируют с вирусом простого герпеса 1 и 2 типов.

6) Субклиническая реактивация происходит с большей частотой у лиц с сосудистыми нарушениями ЦНС (15,6%) и у больных психической патологией (13,2%), чем у здоровых доноров (1,9%).

7) Повышение концентрации кортизола в сыворотке крови и снижение продукции у-ИФН в культуре МПК, ассоциировано с развитием заболеваний а-герпесвирусной этиологии, включая манифестные и субклинические формы УгУ-инфекции вследствие реактивации вируса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инфекция, вызываемая вирусом ветряной оспы и опоясывающего герпеса (Varicella Zoster Virus, VZV) поражает большую часть населения планеты. Практически каждый человек старше 40 лет инфицирован этим вирусом [69]. Устойчивое представление о том, что VZV-инфекция исключительно манифестна, то есть и первичное экзогенное инфицирование и вторичная эндогенная реактивация обязательно сопровождается характерными везикулярными высыпаниями, было нарушено исследованиями зарубежных ученых [41]. В этих работах было показано, что в ряде случаев иммунный ответ способен снизить кожные проявления VZV-инфекции, что однако не влияет на репликацию вируса в нервной ткани, так называемый зостер без высыпаний - Zoster Sine Herpete [41]. Более того, показано, что из ганглия тройничного нерва, а также из чувствительных ганглиев первых шейных дерматомов вирус после реактивации способен распространяться к адвентиции сосудов головного мозга и далее трансмурально проникать и реплицироваться в интиме артерий [86, 87, 105]. Подобное вирусное поражение сосудов головного мозга - VZV васкулопатия, может приводить к развитию инсультов и формированию сосудистых мальформаций. В 37% случаев VZV васкулопатия не сопровождает характерными везикулярными высыпаниями. В свете перечисленного выше, лабораторная диагностика VZV-инфекции при реактивации вируса приобретает особую актуальность. Однако, следует учитывать, что после первичного инфицирования VZV в большинстве случаев остается пожизненный адаптивный гуморальный иммунитет, что затрудняет диагностику инфекции вследствие реактивации вируса ветряной оспы и опоясывающего герпеса из-за невозможности дифференцировать анамнестические от инфекционных антител. Для решения этой проблемы нами был разработан собственный двухэтапный подход, состоящий из этапа выделения и культивирования в питательной среде без стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови, а также этапа учета продукции специфических антител в надосадочной жидкости культуры МПК с помощью твердофазного варианта ИФА, который оказался достоверно эффективнее традиционных методов диагностики (серологические маркеры и ПЦР)(3.3.).

С учетом полученных данных о диагностической значимости серологической диагностики, ПЦР и собственного диагностического подхода мы обследовали здоровых доноров, а также лиц с поражениями ЦНС сосудистого генеза и больных с психопатологией без клинических проявлений УгУ-инфекции (5.3.). Нами было выявлено 11 случаев субклинической инфекции вследствие реактивации УгУ. Один случай у здоровой женщины-донора 53 лет, 5 случаев у пациентов с острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу и 5 случаев у больных с психической патологией. Таким образом, впервые в РФ были прижизненно описаны случаи субклинической формы инфекции вследствие реактивации УгУ, более того, показано, что у лиц с ишемическим поражением ЦНС и психическими нарушениями реактивации вируса ветряной оспы происходит достоверно чаще, чем у здоровых доноров. Данные о большей частоте по сравнению со здоровыми донорами субклинической инфекции вследствие реактивации УгУ у пациентов с поражениями ЦНС помогут в дальнейшем уточнить патогенез этих заболеваний и как следствие оптимизировать их терапию.

Нам представляется целесообразным использование полученных в исследовании новые данные о диагностической значимости и временных рамках действия различных методов диагностики острой УгУ-инфекции, представление об особенностях формирования гуморального иммунного ответа на заражение УТЧ и вакцинопрофилактику ветряной оспы для улучшения эпидемиологического контроля над УгУ-инфекциями и оптимизации их вакцинопрофилактики. Обнаруженная нами перекрестная реактивность антител, продуцируемых в ответ на У7У-инфекцию, в отношении вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, а также методологический подход для ее выявления может быть использован для изучения формирования индуцируемых инфекционными заболеваниями аутоиммунных реакций.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Казанова, Александра Сергеевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Лавров В.Ф., Казанова А.С., Кузин С.Н., и др. Ветряная оспа и опоясывающий лишай: особенности заболеваемости и клинических проявлений. // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. 2011. № 3. С. 54-57.

2. Лакин Г.Ф. Биометрия. — М.: Высшая школа. 1990.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. — М.: Мир. 1984.

4. Эбралидзе Л.К., Ведунова С.Л., Мальцева Н.Н. Выявление низкоавидных IgG-антител - перспективный подход в диагностике первичной герпетической инфекции. // Вопросы вирусологии 2004. Т49 №2 с46-48.

5. AdelmannM, Linington С. Molecular mimicry and the autoimmune response to the peripheral nerve myelin P0 glycoprotein. Neurochem Res. 1992 Sep;17(9):887-91

6. Amlie-Lefond C, Jubelt B. Neurologic manifestations of varicella zoster virus infections. Curr Neurol Neurosci Rep. 2009 Nov;9(6):430-4.

7. Ampofo K, Saiman L, LaRussa P, Steinberg S, Annunziato P, Gershon A. Persistence of immunity to live attenuated varicella vaccine in healthy adults.Clin Infect Dis. 2002 Mar 15;34(6):774-9.

8. Arduino PG, Porter SR. Herpes Simplex Virus Type 1 infection: overview on relevant clinico-pathological features. //J Oral Pathol Med. 2008, 37(2), p. 107-121.

9. Arvin AM. Varicella-zoster virus: overview and clinical manifestations. Semin Dermatol. 1996 Jun;15(2 Suppl l):4-7.

Ю. Askalan R, Laughlin S, Mayank S. Chickenpox and stroke in childhood: a study of frequency and causation. Stroke. 2001 Jun;32(6): 1257-62.

11. Banz K, Wagenpfeil S, Neiss A. The burden of varicella in Germany. Potential risks and economic impact. Eur J Health Econ. 2004 Feb;5(l):46-53.

12. Braun KP, Bulder MM, Chabrier S. The course and outcome of unilateral intracranial arteriopathy in 79 children with ischaemic stroke. Brain. 2009 Feb;132(Pt 2):544-57.

13. Brisson M, Edmunds WJ. Varicella vaccination in England and Wales: cost-utility analysis Arch Dis Child. 2003 Oct;88(10):862-9.

14. Brok HP, Boven L, van Meurs M, The human CMV-UL86 peptide 9811003 shares a crossreactive T-cell epitope with the encephalitogenic MOG peptide 34-56, but lacks the capacity to induce EAE in rhesus monkeys. J Neuroimmunol. 2007 Jan;182(l-2):135-52.

15. Civen R, Chaves SS, Jumaan A et al. The incidence and clinical characteristics of herpes zoster among children and adolescents after implementation of varicella vaccination.Pediatr Infect Dis J. 2009 Nov;28(ll):954-9.

16. Chiner E, Ballester I, Betlloch I. Varicella-zoster virus pneumonia in an adult population: has mortality decreased? Scand J Infect Dis. 2010 Mar;42(3):215-21.

17. Cohen JI, Moskal T, Shapiro M, Purcell RH. Varicella in chimpanzees. J Med Virol 1996; 50: 289-92

18. Cohrs RJ, Mehta SK, Schmid DS et al. Asymptomatic reactivation and shed of infectious varicella zoster virus in astronauts. //J. Med. Virol. 2008. № 80(6). P. 1116-1122.

19. Cohrs RJ, Randall J, Smith J. Analysis of individual human trigeminal ganglia for latent herpes simplex virus type 1 and varicella-zoster virus nucleic acids using real-time PCR. J Virol 2000; 74: 11464-71

20. Dangond F, Engle E, Yessayan L. Pre-eruptive varicella cerebellitis confirmed by PCR. Pediatr Neurol. 1993 Nov-Dec;9(6):491-3.

21. Desmond CP, Gaudieri S, James IR.Viral adaptation to host_immune_responses occurs in_chronic_hepatitis B virus (HBV)_infection, and adaptation is greatest in HBV e antigen-negative disease. J Virol. 2012 Jan;86(2):l 181-92.

22. Devinsky O, Cho ES, Petito CK. Herpes zoster myelitis. Brain. 1991 Jun;114 ( Pt 3):1181-96

23. Drolet M, Brisson M, Schmader K. Predictors of postherpetic neuralgia among patients with herpes zoster: a prospective study. J Pain. 2010 Nov;l 1(11):1211-21.

24. Enders G, Miller E, Cradock-Watson J. Consequences of varicella and herpes zoster in pregnancy: prospective study of 1739 cases. Lancet. 1994 Jun 18;343(8912): 1548-51.

25. Engelmann M, Ludwig M. The activity of the hypothalamo-neurohypophysial system in response to acute stressor exposure: neuroendocrine and electrophysiological observations. Stress 7(2):91-6 (2004).

26. Engstrom RE Jr, Holland GN, Margolis TP. The progressive outer retinal necrosis syndrome. A variant of necrotizing herpetic retinopathy in patients with AIDS. Ophthalmology. 1994 Sep;101(9):1488-502.

27. Franco-Paredes C, Bellehemeur T, Merchant A. Aseptic meningitis and optic neuritis preceding varicella-zoster progressive outer retinal necrosis in a patient with AIDS. AIDS. 2002 May 3; 16(7): 1045-9.

28. Fung LW, Lao TT, Suen SS, Chan OK, Lau TK, Ngai KL, Chan PK, Leung TY. Seroprevalence of varicella zoster virus among pregnant women in Hong Kong: comparison with self-reported history. Vaccine. 2011 Oct 26;29(46):8186-8188.

29. Gauthier A, Breuer J, Carrington D. Epidemiology and cost of herpes zoster and post-herpetic neuralgia in the United Kingdom. Epidemiol Infect. 2009 Jan;137(l):38-47.

30. Gershon AA, Chen J, Gershon MD. A model of lytic, latent, and reactivating varicella-zoster virus infections in isolated enteric neurons. J Infect Dis. 2008 Mar 1; 197 Suppl 2:S61-5.

31. Gershon AA, Chen J, Davis L, Latency of Varicella Zoster Virus in Dorsal Root, Cranial, and Enteric Ganglia in Vaccinated Children Trans Am Clin Climatol Assoc. 2012; 123: 17-35

32. Gershon AA. The current status of live attenuated varicella vaccine. Arch Virol Suppl. 2001;(17):l-6.

33. Gershon AA. Varicella-zoster virus infections Pediatr Rev. 2008 Jan;29(l):5-10

34. Gilden DH, Beinlich BR, Rubinstien EM. Varicella-zoster virus myelitis: an expanding spectrum. Neurology. 1994 0ct;44(10): 1818-23.

35. Gilden DH, Cohrs RJ, Mahalingam R et al. Neurological disease produced by varicella zoster virus reactivation without rash. //Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2010. № 342. P. 243-253.

36. Gilden DH, Gesser R, Smith J. Presence of VZV and HSV-1 DNA in human nodose and celiac ganglia. Virus Genes. 2001 ;23(2): 145-7.

37. Gilden DH, Kleinschmidt-DeMasters BK, LaGuardia JJ. Neurologic complications of the reactivation of varicella-zoster virus. N Engl J Med. 2000 Mar 2;342(9):635-45

38. Gilden DH, Kleinschmidt-DeMasters BK, Wellish M. Varicella zoster virus, a cause of waxing and waning vasculitis: the New England Journal of Medicine case 5-1995 revisited. Neurology. 1996 Dec;47(6): 1441-6

39. Gilden D, Mahalingam R, Nagel MA Review: The neurobiology of varicella zoster virus infection. Neuropathol Appl Neurobiol. 2011 Feb 23. doi: 0.1111/j.1365-2990.2011.01167.x.

40. Gilden DH. Varicella zoster virus vasculopathy and disseminated encephalomyelitis. J Neurol Sei. 2002 Mar 30;195(2):99-101.

41. Gilden DH, Wright RR, Schneck SA. Zoster sine herpete, a clinical variant. Ann Neurol. 1994 May;35(5):530-3. Review.

42. Gold I, Azizi E, Eshel G. Neurogenic bladder due to herpes zoster infection in an infant. Eur J Pediatr. 1989 Feb;148(5):468-9.

43. Gray F, Belec L, Lescs MC. Varicella-zoster virus infection of the central nervous system in the acquired immune deficiency syndrome. Brain. 1994 Oct;l 17 ( Pt 5):987-99.

44. Grinfeld E, Ross A, Forster T et al. Genome-wide reduction in transcriptomal profiles of varicella-zoster virus vaccine strains compared with parental Oka strain using long oligonucleotide microarrays. Virus Genes. 2009 Feb;38(l): 19-29. Epub 2008 Nov 27.

45. Grohmann U, Fallarino F, Bianchi R et al. Tryptophan catabolism in nonobese diabetic mice. Adv Exp Med Biol. 2003;527:47-54.

46. Grose C. Varicella vaccination of children in the United States: assessment after the first decade 1995-2005.J Clin Virol. 2005 Jun;33(2):89-95

47. Guess HA, Broughton DD, Melton LJ 3rd. Population-based studies of varicella complications. Pediatrics. 1986 Oct;78(4 Pt 2):723-7.

48. Guex-Crosier Y, Rochat C, Herbort CP. Necrotizing herpetic retinopathies. A spectrum of herpes virus-induced diseases determined by the immune state of the host. Ocul Immunol Inflamm. 1997 Dec;5(4):259-65.

49. Hardy I, Gershon AA, Steinberg SP, LaRussa P. The incidence of zoster after immunization with live attenuated varicella vaccine. A study in children with leukemia. Varicella Vaccine Collaborative Study Group.N Engl J Med. 1991 Nov 28;325(22): 1545-50.

50. Harpaz R, Ortega-Sanchez IR, Seward JF; Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Prevention of herpes zoster: recommendations of the Advisory

Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 2008 Jun 6;57(RR-5):l-30;

51. Hata A, Asanuma H, Rinki M, Sharp M, Wong RM, Blume K, Arvin AM. Use of an inactivated varicella vaccine in recipients of hematopoietic-cell transplants.N Engl J Med. 2002 Jul 4;347(l):26-34.

52. Haumont M, Jurdan M, Kangro H, Jacquet A, Massaer M, Deleersnyder V, Garcia L, Bosseloir A, Bruck C, Bollen A, Jacobs P. Neutralizing antibody responses induced by varicella-zoster virus gE and gB glycoproteins following infection, reactivation or immunization. J Med Virol. 1997 Sep;53(l):63-8.

53. Hayward AR, Buda K, Levin MJ. Immune response to secondary immunization with live or inactivated VZV vaccine in elderly adults.Viral Immunol. 1994;7(1):31-6.

54. Heininger U, Seward JF. Varicella. Lancet. 2006 Oct 14;368(9544):1365-76. Review

55. Hicks LD, Cook-Norris RH, Mendoza N. Family history as a risk factor for herpes zoster: a case-control study. Arch Dermatol. 2008 May;144(5):603-8.

56. Higa K, Dan K, Manabe H. Varicella-zoster virus infections during pregnancy: hypothesis concerning the mechanisms of congenital malformations. Obstet Gynecol. 1987 Feb;69(2):214-22. Review

57. Holland GN.The progressive outer retinal necrosis syndrome. Int Ophthalmol. 1994;18(3):163-5.

58. Hufner K, Derfuss T, Herberger S. Latency of alpha-herpes viruses is accompanied by a chronic inflammation in human trigeminal ganglia but not in dorsal root ganglia. J Neuropathol Exp Neurol 2006; 65: 1022-30

59. Inoue H, Motani-Saitoh H, Sakurada K. Detection of varicella-zoster virus DNA in 414 human trigeminal ganglia from cadavers by the polymerase chain reaction: a comparison of the detection rate of varicella-zoster virus and herpes simplex virus type 1. J Med Virol 2010; 82: 345-9

60. Insinga RP, Itzler RF, Pellissier JM. The incidence of herpes zoster in a United States administrative database. J Gen Intern Med. 2005 Aug;20(8):748-53.

61. Ito M., Nishihara H., Mizutani K. et al.. Detection of varicella-zoster virus (VZV) DNA in throat swabs and peripheral blood mononuclear cells of immunocompromised patients with herpes zoster by polymerase chain reaction // Clinical and Diagnostic Virology. 1995. № 4. P. 105-112.

62. Jellinek EH, Tulloch WS. Herpes zoster with dysfunction of bladder and anus. Lancet. 1976 Dec 4;2(7997): 1219-22.

63. Jones L, Black AP, Malavige GN, Ogg GS. Persistent high frequencies of varicella-zoster virus ORF4 protein-specific CD4+ T cells after primary infection. J Virol. 2006 Oct;80(19):9772-8.

64. Jones L, Black AP, Malavige GN, Ogg GS. Phenotypic analysis of human CD4+ T cells specific for immediate-early 63 protein of varicella-zoster virus. Eur J Immunol. 2007 Dec;37(12):3393-403.

65. Johnson R, Milbourn PE. Central nervous system manifestations of chickenpox. Can Med Assoc J. 1970 Apr 25;102(8):831-4.

66. Junker AK, Tilley P. Varicella-zoster virus antibody avidity and IgG-subclass patterns in children with recurrent chickenpox. J Med Virol. 1994 Jun;43(2):l 19-24.

67. Katchanov J, Siebert E, Klingebiel R. Infectious vasculopathy of intracranial large- and medium-sized vessels in neurological intensive care unit: a clinico-radiological study. Neurocrit Care. 2010 Jun;12(3):369-74.

68. Kennedy PG, Grinfeld E, Bontems S, Sadzot-Delvaux C. Varicella-zoster virus gene expression in latently infected rat dorsal root ganglia. Virology 2001; 289: 218-23

69. Kilgore PE, Kruszon-Moran D, Seward JF. Varicella in Americans from NHANES III: implications for control through routine immunization. J Med Virol. 2003;70 Suppl 1 :S111-8.

70. Kinchington PR, Turse SE. Molecular basis for a geographic variation of varicella-zoster virus recognized by a peptide antibody. Neurology. 1995 Dec;45(12 Suppl 8):S13-4.

71. Kitamura K, Namazue J, Campo-Vera H et al. Induction of neutralizing antibody against varicella-zoster virus (VZV) by VZV gp3 and cross-reactivity between VZV gp3 and herpes simplex viruses gB. //Virology. 1986 Feb; 149(1), p 74-82.

72. Kneitz RH, Schubert J, Tollmann F A new method for determination of varicella-zoster virus immunoglobulin G avidity in serum and cerebrospinal fluid. BMC Infect Dis. 2004 Sep 8;4:33

73. Krause PR, Klinman DM. Varicella vaccination: evidence for frequent reactivation of the vaccine strain in healthy children.Nat Med. 2000 Apr;6(4):451-4.

74. LaRussa P, Steinberg SP, Shapiro E, Vazquez M, Gershon AA. Varicella vaccine revisited.Nat Med. 2000 Dec; 6(12): 1299-300.

75. Lauer G. Immune Responses to Hepatitis C Virus (HCV) Infection and the Prospects for an Effective HCV Vaccine or Immunotherapies J Infect Dis. (2013) 207 (suppl 1):S7-S12.

76. Lewis JM, Nagae Y, Tano Y. Progressive outer retinal necrosis after bone marrow transplantation. Am J Ophthalmol. 1996 Dec;122(6):892-5.

77. Liedtke W, Opalka B, Zimmermann CW. Age distribution of latent herpes simplex virus 1 and varicella-zoster virus genome in human nervous tissue. J Neurol Sci 1993; 116: 6-11

78. Liesegang TJ. Herpes zoster ophthalmicus natural history, risk factors, clinical presentation, and morbidity. Ophthalmology. 2008 Feb; 115(2 Suppl):S3-12. Review

79. L'Huillier AG, Ferry T, Courvoisier DS Impaired antibody memory to varicella zoster virus in HIV-infected children: low antibody levels and avidity*.HIV Med. 2012 Jan;13(l):54-61

80. Lin HC, Chien CW, Ho JD. Herpes zoster ophthalmicus and the risk of stroke: a population-based follow-up study. Neurology. 2010 Mar 9;74(10):792-7.

81. Linnemann CC Jr, Alvira MM. Pathogenesis of varicella-zoster angiitis in the CNS. Arch Neurol. 1980 Apr;37(4):239-40.

82. Ludwig B, Kraus FB, Allwinn R, Keim S, Doerr HW, Buxbaum S Loss of varicella zoster virus antibodies despite detectable cell mediated immunity after vaccination. Infection. 2006 Aug;34(4):222-6.

83. Macaladad N, Marcano T, Guzman M, Moya J, Jurado F, Thompson M, Meechan C, Li D, Schlienger K, Chan I, Sadoff J, Schodel F, Silber JL. Safety and immunogenicity of a zoster vaccine in varicella-zoster virus seronegative and low-seropositive healthy adults. Vaccine. 2007 Mar 1;25(11):2139-44.

84. Mahalingam R, Traina-Dorge V, Wellish M et al. Simian varicella virus reactivation in cynomolgus monkeys. //Virology. 2007. Vol. 10. № 368(1). P.50-59.

85. Mandelbrot L. Fetal varicella - diagnosis, management, and outcome. Prenat Diagn. 2012 Jun;32(6):511-8

86. Mayberg MR, Langer RS, Zervas NT. Perivascular meningeal projections from cat trigeminal ganglia: possible pathway for vascular headaches in man. Science. 1981 Jul 10;213(4504):228-30.

87. Mayberg MR, Zervas NT, Moscowitz MA. Trigeminal projections to supratentorial pial and dural blood vessels in cats demonstrated by horseradish peroxidase histochemistry. J Comp Neurol 1984; 223: 46-56

88. Mehta SK, Cohrs RJ, Forghani B. Stress-induced subclinical reactivation of varicella zoster virus in astronauts. J Med Virol. 2004 Jan;72(l): 174-9.

89. Mendieta C, Miranda J, Brunei LI. Alveolar bone necrosis and tooth exfoliation following herpes zoster infection: a review of the literature and case report. J Periodontol. 2005 Jan;76(l): 148-53. Review

90. Menerath JM, Gerard M, Laurichesse H. Bilateral acute retinal necrosis in a patient with acquired immunodeficiency syndrome. J Fr Ophthalmol. 1995;18:625-33.

91. Michalik DE, Steinberg SP, Larussa PS, Edwards KM, Wright PF, Arvin AM, Gans HA, Gershon AA. Primary vaccine failure after 1 dose of varicella vaccine in healthy children. J Infect Dis. 2008 Apr l;197(7):944-9.

92. Minarovits J, Gonczol E, Valyi-Nagy T. Latency Strategies of Herpesviruses. Springier, NewYork, 2007 - 300 p.

93. Moffat JF, Stein MD, Kaneshima H, Arvin AM. Tropism of varicella-zoster virus for human CD4+ and CD8+ T lymphocytes and epidermal cells in SCID-hu mice. J Virol 1995; 69: 5236-42

94. Mohsen AH, McKendrick M. Varicella pneumonia in adults. Eur Respir J. 2003 May;21(5):886-91. Review

95. Nagel MA, Choe A, Traktinskiy I, Cordery-Cotter R, Gilden D, Cohrs RJ.Varicella-zoster virus transcriptome in latently infected human ganglia. J Virol. 2011 Mar;85(5):2276-87. Epub 2010 Dec 22.

96. Natoli S, Ciotti M, Paba P, Testore GP, Palmieri G, Orlandi A, Sabato AF, Leonardis F. A novel mutation of varicella-zoster virus associated to fatal hepatitis. J Clin Virol. 2006 Sep;37(l):72-4.

97. Ogunjimi B, Smits E, Hens N, Hens A, Lenders K, Ieven M, Van Tendeloo V, Van Damme P, Beutels P. Exploring the impact of exposure to primary varicella in children on varicella-zoster virus_immunity_of parents. Viral Immunol. 2011 Apr;24(2):151-7.

98. Ou D, Mitchell LA, Metzger DL, Gillam S, Tingle AJ Cross-reactive rubella virus and glutamic acid decarboxylase (65 and 67) protein determinants

recognised by T cells of patients with type I diabetes mellitus. Diabetologia. 2000 Jun;43(6):750-62

99. Oxman MN, Levin MJ, Johnson GR. Shingles Prevention Study Group. A vaccine to prevent herpes zoster and postherpetic neuralgia in older adults. N Engl J Med. 2005 Jun 2;352(22):2271-84

100. Patterson-Bartlett J, Levin MJ, Lang N. Phenotypic and functional characterization of ex vivo T cell responses to the live attenuated herpes zoster vaccine. Vaccine 2007; 25: 7087-93

101. Richard A. Santos, Padilla J.A., Hatfield C., Grose C. Antigenic variation of varicella zoster virus Fc receptor gE: loss of a major B cell epitope in the ectodomain. Virology. 1998 Sep 15;249(1):21-31

102. Rodriguez-Fanjul X, Noguera A, Vicente A. Herpes zoster in healthy infants and toddlers after perinatal exposure to varicella-zoster virus: a case series and review of the literature. Pediatr Infect Dis J. 2010 Jun ; 29(6):574-6.

103.Roush SW, Murphy TV; Vaccine-Preventable Disease Table Working Group. Historical comparisons of morbidity and mortality for vaccine-preventable diseases in the United States. JAMA. 2007 Nov 14;298(18):2155-63.

104. Sadzot-Delvaux C, Merville-Louis MP, Delree P, Marc P, Piette J, Moonen G, Rentier B. An in vivo model of varicella-zoster virus latent infection of dorsal root ganglia. JNeurosci Res 1990; 26: 83-9

105. Saito K, Moskowitz MA. Contributions from the upper cervical dorsal roots and trigeminal ganglia to the feline circle of Willis. Stroke. 1989 Apr; 20(4):524-526.

106. Santos RA, Hatfield CC, Cole NL, Padilla JA, Moffat JF, Arvin AM, Ruyechan WT, Hay J, Grose C. Varicella-zoster virus gE escape mutant VZV-MSP exhibits an accelerated cell-to-cell spread phenotype in both infected cell cultures and SCID-hu mice Virology. 2000 Sep 30;275(2):306-17.

107. Schwarcz R, Rassoulpour A, Wu HQ, Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biol Psychiatry. 2001 Oct 1;50(7):521-30

108. Schimemann S, Mainka C, Wolff MH. Subclinical reactivation of varicella-zoster virus in immunocompromised and immunocompetent individuals. //Intervirology. 1998. № 41(2-3). P. 98-102.

109. Shim HJ, Jung H, Park DC. Ramsay Hunt syndrome with multicranial nerve involvement. Acta Otolaryngol. 2011 Feb;131(2):210-5.

no. Smith CK, Arvin AM. Varicella in the fetus and newborn. Semin Fetal Neonatal Med. 2009 Aug;14(4):209-17.

in. Soushi S, Ozawa H, Matsuhashi M. Demonstration of varicella-zoster virus antigens in the vitreous aspirates of patients with acute retinal necrosis syndrome. Ophthalmology. 1988 0ct;95(10): 1394-8.

112. Sperber SJ, Smith BV, Hayden FG. Serologic response and reactogenicity to booster immunization of healthy seropositive adults with live or inactivated varicella vaccine.Antiviral Res. 1992 Mar; 17(3):213-22.

113. Strangfeld A, Listing J, Herzer P Risk of herpes zoster in patients with rheumatoid arthritis treated with anti-TNF-alpha agents. JAMA. 2009 Feb 18;301(7):737-44.

114. Sugita S, Takase H, Kawaguchi T Cross-reaction between tyrosinase peptides and cytomegalovirus antigen by T cells from patients with Vogt-Koyanagi-Harada disease. Int Ophthalmol. 2007 Apr-Jun;27(2-3):87-95.

115. Sutradhar SC, Wang WW, Schlienger K, Stek JE, Xu J, Chan IS, Silber JL. Comparison of the levels of immunogenicity and safety of Zostavax in adults 50 to 59 years old and in adults 60 years old or older.Clin Vaccine Immunol. 2009 May; 16(5):646-52.

116. Swami M 2011 HIV-1 adaptation to NK-cell-mediated immune pressure Nature Medicine 1059 (2011)

117. Taguchi T, Ueda S, Kudo T. Ramsay-Hunt syndrome.J Infect. 2010 Dec 23.

118. Takahashi M, Asano Y, Kamiya H, Baba K, Ozaki T, Otsuka T, Yamanishi K. Development of varicella vaccine J Infect Dis. 2008 Mar 1;197 Suppl 2:S41-44.

119. Takahashi M, Otsuka T, Okuno Y, Asano Y, Yazaki T. Live vaccine used to prevent the spread of varicella in children in hospital. Lancet. 1974 Nov 30;2(7892): 1288-90.

no. Tan JCH, Byles D, Stanford MR. Acute retinal necrosis in children caused by herpes simplex virus. Retina. 2001;21(4):344-347.

121.Terada K, Niizuma T, Yagi Y, Miyashima H, Kataoka N, Sadahiro T.Low induction of varicella-zoster virus-specific secretory IgA antibody after vaccination. J Med Virol. 2000 Sep;62(l):46-51.

122. Tipples G A., Gwen M. Stephens, Chris Sherlock, Margrit Bowler, Benny Hoy, Darrel Cook, and Charles Grose New Variant of Varicella-Zoster Virus Emerg Infect Dis. 2002 December; 8(12): 1504-1505.

123. Thomas JE, Howard FM Jr. Segmental zoster paresis—a disease profile. Neurology. 1972 May;22(5):459-66.

124. Thompson WS, Culbertson WW, Smiddy WE,. Acute retinal necrosis caused by reactivation of herpes simplex virus type 2. Am J Ophthalmol. 1994 Aug 15;118(2):205-11.

125. Tsolia M, Gershon AA, Steinberg SP, Gelb L. Live attenuated varicella vaccine: evidence that the virus is attenuated and the importance of skin lesions in transmission of varicella-zoster virus. National Institute of Allergy and Infectious Diseases Varicella Vaccine Collaborative Study Group. J Pediatr. 1990 Feb; 116(2): 184-9.

126.Uchakin PN, Parish DC, Dane FC Fatigue in medical residents leads to reactivation of herpes virus latency. Interdiscip Perspect Infect Dis. 2011;2011:571340

127. Vafai A, Wroblewska Z, Graf L. Antigenic cross-reaction between a varicella-zoster virus nucleocapsidprotein encoded by gene 40 and a herpes simplex virus nucleocapsid protein. //Virus Research 1990, Vol. 15, N 2, p. 163— 174.

128. Vena GA, Apruzzi D, Vestita M, Calvario A, Foti C, Cassano N. Zoster ... "almost" ... sine herpete: diagnostic utility of real time-polymerase chain reaction. New Microbiol. 2010 0ct;33(4):409-10.

129.Vendrell JP, Pratlong F, Decoster A, Boulot P, Conge AM, Darcy F, Segondy M, Huguet MF, Serre A. Secretion of Toxoplasma gondii-specific antibody in vitro by peripheral blood mononuclear cells as a new marker of acute toxoplasmosis. Clin Exp Immunol. 1992 Jul;89(l): 126-30.

130.Vendrell JP, Segondy M, Fournier AM, Huguet MF, Reynes J, Ducos J, Serre A. Spontaneous in vitro secretion of antibody to cytomegalovirus (CMV) by human peripheral blood mononuclear cells: a new approach to studying the CMV-immune system interaction. J Infect Dis. 1991 Jul;164(l):l-7.

131. Vendrell JP, Segondy M, Ducos J, Reynes J, Huguet MF, Nicolas JC, Serre A. Clin Exp Immunol. 1991 Feb;83(2): 197-202. Analysis of the spontaneous in vitro anti-HIV-1 antibody secretion by peripheral blood mononuclear cells in HIV-1 infection.

132. Volvoikar P, Patil S, Dinkar A.Tooth exfoliation, osteonecrosis and neuralgia following herpes zoster of trigeminal nerve. Indian J Dent Res. 2002 Jan-Mar; 13(1): 11 -4. Review.

133. Watson CP, Deck JH, Morshead C. Post-herpetic neuralgia: further postmortem studies of cases with and without pain.Pain. 1991 Feb;44(2):105-17.

134. Wirgart BZ, Estrada V, Jackson W, Linde A, Grose C. A novel varicella-zoster virus gE mutation discovered in two Swedish isolates. J Clin Virol. 2006 Oct;37(2):134-6.

135. White CJ, Kuter BJ, Hildebrand CS, Isganitis KL, Matthews H, Miller WJ, Provost PJ, Ellis RW, Gerety RJ, Calandra GB. Varicella vaccine (VARIVAX) in healthy children and adolescents: results from clinical trials, 1987 to 1989. Pediatrics. 1991 May;87(5):604-10.

136. Whitley RJ. Therapeutic approaches to varicella-zoster virus infections. J Infect Dis. 1992 Aug;166 Suppl l:S51-7. Review.

137. Wroblewska Z, Valyi-Nagy T, Otte J, Dillner A, Jackson A, Sole DP, Fraser NW. A mouse model for varicella-zoster virus latency. Microb Pathog 1993; 15: 141-51

138. Xu F, Sternberg MR, Kottiri BJ, et al. Trends in herpes simplex virus type 1 and type 2 seroprevalence in the United States. //JAMA 2006; N 296 (8), p:964-973.

139. Yamanishi K. Molecular analysis of the Oka vaccine strain of varicella-zoster virus. J Infect Dis. 2008 Mar 1;197 Suppl 2:S45-8.

140.Zerboni L Berarducci B, Rajamani J et al. Varicella-zoster virus glycoprotein E is a critical determinant of virulence in the SCID mouse-human model of neuropathogenesis. // J. Virol. 2011. Jan;85(l):98-111.