Организация липид-белковых структур на примере вирусного белка М1: электрохимический подход тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.05, кандидат физико-математических наук Князев, Денис Геннадьевич

• Князев, Денис Геннадьевич
• кандидат физико-математических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Князев, Денис Геннадьевич

Введение.

Обзор литературы.

§1. Вирус гриппа.

§2. Вирусное слияние и баддинг.

§3. Матриксный белок М1.

§4. БЛМ и мембранная электростатика.

Материалы и методы.

Результаты.

§1. Изучение адсорбции белка М1 на БЛМ

Компенсация внутримембранного поля.

§2. Изучение адсорбции белка М1 на липидном монослое на подложке

Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса.:.

§3. Изучение адсорбции белка М1 на липидном бислое на подложке

Атомная силовая микроскопия.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Организация липид-белковых структур на примере вирусного белка М1: электрохимический подход»

Вспышки гриппа — прогнозируемое явление для зимы в Северном и Южном полушариях. Грипп распространяется очень быстро. По статистике, ежегодно заболевает до 10% взрослого населения. Показателя заболеваемости и смертности остаются стабильно высокими с 20-х годов прошлого века, не имея тенденции к улучшению. Именно это является причиной того, что фундаментальные исследования вируса гриппа остаются востребованными по сей день.

Вирус гриппа является серьезным патогеном человека, который на протяжении XX столетия вызвал три пандемии с высоким уровнем смертности. Пандемический штамм вируса возникает намного реже эпидемических штаммов, в результате комбинирования генетического материала человеческого вируса гриппа типа А с материалом животного вируса гриппа, в результате чего образуется абсолютно новый штамм, против которого у человека нет естественного иммунитета. Это приводит к началу пандемии — эпидемии в мировом масштабе. При этом имеется достаточно высокая вероятность появления в ближайшем будущем новых высоко патогенных штаммов вируса. Именно высокий пандемический потенциал сделал вирус гриппа объектом углубленных исследований. Лучшее понимание жизненного цикла вируса гриппа, особенно стадий, приводящих к инфицированию клетки, крайне важно для создания новых превентивных и терапевтических стратегий. Данные, полученные на вирусе гриппа, могли бы создать подход и основу для изучения других особо опасных патогенов человека, таких как ВИЧ и вирус лихорадки Эбола.

Подобно многим другим оболочечным вирусам, вирус гриппа доставляет нуклеокапсид в цитоплазму клетки хозяина путем эндоцитоза, а затем слияния своей оболочки с мембраной эндосомы. Как проникновение вирусного генома внутрь клетки, так и морфогенез дочерних вирионов обеспечиваются тонко согласованным взаимодействием основных мембранных белков вируса, в том числе трансмембранного гликопротеина гемагглютинина (ГА) и матриксного белка М1.

Эти взаимодействия определяют всю архитектуру вириона. При низких значениях рН, вызывающих конформационную перестройку молекул ГА, а также изменение взаимодействия М1 с поверхностными гликопротеинами ГА и нейраминидазой (НА), происходит диссоциация слоя белка М1, что в конечном счете обеспечивает выход вирусного генома в клетку. Роль матриксного белка крайне важна на многих стадиях репликации вируса — от вхождения вируса в клетку и его «раздевания» до сборки и почкования дочерних вирионов.

Прогресс в понимании всего процесса молекулярных перестроек в вирионе вируса гриппа при низких значениях рН, определяющих инфицирование клетки, сдерживается отсутствием необходимой структурной информации о пространственной организации полноразмерного М1 белка при слиятельно активном (5) и нейтральном (7) рН in situ (т.е. в том же окружении, что и в составе вириона), его ориентации относительно вирусной мембраны и характере взаимодействий М1-М1, М1-липид и М1-рибонуклеопротеин. В данной работе исследуются межмолекулярные взаимодействия белка М1 на липидной поверхности, которые определяют диссоциацию и сборку белкового каркаса в вирионе. Эти взаимодействия в вирусах гриппа различных штаммов реализуются, по-видимому, одними и теми же молекулярными механизмами, поскольку а) белок М1 является высоко консервативным для разных штаммов вируса и б) вирус гриппа инфицирует преимущественно клетки эпителия верхних дыхательных путей, т.е. липидный состав оболочки, с которой взаимодействует белок, можно считать постоянным.

Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей формирования белок-липидных структур при адсорбции матриксного белка М1 на липидную поверхность. Для этого были выбраны такие модельные системы, как бислойная липидная мембрана (БЛМ), липидный моно- и бислои на твердой подложке. В проведенных экспериментах изучалась адсорбция белка М1 на бислойной липидной мембране и на липидном моно- и бислоях на подложке методами компенсации внутримембранного поля, спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса и атомной силовой микроскопии. В ходе работы были поставлены следующие задачи:

1) Изучить влияние рН на адсорбцию белка М1 в значимом для вируса гриппа диапазоне рН от 5 до 7;

2) Выяснить эффективность связывания белка М1 с липидом в различных условиях;

3) Оценить толщину слоя адсорбировавшегося белка и уточнить ориентацию молекулы М1 относительно липидного слоя.

Обзор литературы

§1. Вирус гриппа.

Вирусы представляют собой самостоятельную неклеточную форму жизни. В самом примитивном варианте вирус состоит из некоторого количества генетического материала (РНК или ДНК), упакованного в плотную белковую оболочку. Поэтому размер вирусов мал, он редко превышает 100-200 нм. Некоторые вирусы (т.н. оболочечные) обладают также липидной оболочкой, представляющей собой липидный бислой с некоторым количеством белков, так или иначе способствующих попаданию вирусного генома внутрь клетки-хозяина. Цель вирусной частицы — доставить свой генетический материал в ядро инфицируемой клетки с тем чтобы, используя клеточные механизмы, обеспечить воспроизводство таких же вирусных частиц. Как правило, для того, чтобы вирусный геном попал по назначению, ему необходимо преодолеть только один барьер - клеточную мембрану. Поэтому некоторые вирусы внедряют свой геном внутрь клетки, формируя лишь пору в клеточной мембране, другие - проникают внутрь клетки путем эндоцитоза, а лишь затем высвобождают свой генетический материал. Для формирования пор в мембранах клеток вирусы обладают специальными белками слияния, которые могут находиться в двух состояниях - неактивном и слиятельно-активном, переход между которыми включается каким-либо внешним воздействием (триггером). Им может быть как простое взаимодействие белка слияния с рецепторами на клеточной мембране (ВИЧ), так и понижение рН внешней среды (вирус гриппа).

Вирус гриппа является оболочечным вирусом из семейства ортомиксовирусов. Для человека клинически значимыми являются вирусы гриппа типа А и В. В данной работе исследовался компонент вируса гриппа А. Схематическое изображение и электронная микрофотография вириона гриппа А приведены на рис. 1. Внешняя часть вириона представляет собой липидный бислой, сформированный из цитоплазматической мембраны инфицированной клетки. В липидную оболочку встроены вирусные трансмембранные белки: вирусный белок слияния гемагглютинин (ГА), фермент нейраминидаза (Н) и протонный канал М2. Гемагглютинин является трансмембранным гликопротеином, который посттрансляционно модифицируется добавлением КГ-связанных углеводородов к семи остаткам аспарагина каждого мономера и ковалентным соединением пальмитиновой кислоты к трем остаткам цистеина в области цитоплазматического конца. Функциональной единицей, экспонированной на мембране вируса, является тример гемагглютинина. Удаленный от мембраны домен гемагглютинина - т.н. ГА] — содержит сайты узнавания сиаловых рецепторов, находящихся на поверхности клетки-мишени и ответственен за сорбцию на клетке-мишени. 1М-концевой домен гемагглютинина - т.н. ГА2 — является рН-активируемым доменом, отвечающим за слияние с эндосомальной мембраной клетки-мишени [1,2]. Функция еще одного трансмембранного гликопротеина - нейраминидазы — заключается в десорбции вновь синтезированного вириона с поверхности клетки-хозяина. Вирусный протонный канал М2 представлен в вирионе в виде тетрамера и активируется низким значением рН [3,4].

Внутренний монослой вирусной липидной мембраны ассоциирован с белковым каркасом, образованным из вирусного матриксного белка М1 (более подробно он будет описан в следующем разделе), который формирует белковую оболочку вокруг содержимого вирусной частицы [5]. Эта сетка-каркас представляет собой монослой М1-белка толщиной около 60А, с размером ячейки около 40А [6]. Под белковой оболочкой располагается рибонуклеопротеин (РНП) — это комплекс РНК с нуклеопротеином и полимеразами, заключённый в липидную оболочку, сформированную из цитоплазматической мембраны инфицированной клетки-хозяина в процессе размножения вируса [7,8]. Геном вируса гриппа А представляет собой восемь отдельных сегментов одноцепочечной отрицательной РНК, кодирующей по меньшей мере 10 вирусных белков, три из которых функционируют в качестве полимераз. Вирусная РНК, нуклеопротеин и полимеразы чрезвычайно сильно ассоциированы в РНП [9,10].

Рис. 1. Схематическое изображение вириона гриппа [б] (слева) и электронная микрофотография вируса гриппа [11](справа). На схеме показаны вирусные белки ~ ГА, нейраминидаза, Ы1 и Ы2, а также липидная мембрана и РНП. На микрофотографии (X 350 ООО) хорошо видны "шипы " - внешние домены вирусных белков, окружающие вирусный капсид.

Содержание компонентов вируса гриппа В/Ног^ Коп^8/73 приведено в таблице 1 [6]. Полная масса вируса составляет около 190 МДа, из которых на долю липидов приходится около 20% (для вируса гриппа А 19-20% [12,13], для вируса гриппа В - 20% [14]) и 2.5% - на долю РНК (полный геном составляет 14639 пар нуклеотидов, что соответствует 4.5 МДа). Упомянутый в таблице белок ЫВ является, вероятно, аналогом М2-белка вируса гриппа А и, возможно, также формирует тетрамеры [15].

Строение вирусной частицы изучено довольно подробно с помощью электронной микроскопии и биохимических методов. Как было сказано выше, нуклеокапсид вируса заключен в бислойную липидную мембрану, несущую вирусные белки (на электронных микрофотографиях видны как "шипы", торчащие из оболочки вируса, длина которых обычно порядка 10-15 нм (рис. 1).

Вирионы гриппа А обычно полиморфны (т.е. форма вирионов неодинакова). Диаметр частиц, близких по форме к сферическим, по данным электронной микроскопии обычно порядка ОД - 0,15 мкм [16]. При этом в случае вируса гриппа А (в отличие от В) размер и форма вирионов в значительной степени варьируют, что было продемонстрировано криоэлектронной микроскопией вирусной суспензии [17]. Большие вирусные частицы содержат непропорционально мало генетического материала, т.е. выглядят почти пустыми изнутри.

Сегмент Кодируемый Мол. вес Кол-во коппй на Доля от 190

РНК белок белка, кДа вирион МДа, %

1 РВ2 86 8 0.36

2 РВ1 83 8 0.35

3 РА 80 8 0.34

4 НА 64 (70) 350-400 тримеров 38-44

5 NP 56 630 19

6 NA 51 (60) 50 тетрамеров 6

NB 12 15 мономеров 0.1

7 М1 27 1100 17

8 NS1 31 -

NS2 13 -

Таблица 1. Стехиометрия компонентов вируса гриппа В/Hong Kong/8/73 [б].

Так как вирусный геном сегментирован, нуклеокапсид также состоит из 8 частей, однако до сих пор не удалось выделить суперструктуру, которая включала бы в себя все 8 сегментов РНП. РНК составляет приблизительно 1012% от общей массы РНП [18,19], что означает, что каждый мономер нуклеопротеина связан с 20-26 нуклеотидами РНК. Нуклеопротеин связывается с сахаро-фосфатным остовом РНК неспецифично по отношению к нуклеотоидной последовательности и препятствует таким образом формированию вторичной структуры. Следовательно, нуклеотидные основания оказываются экспонированными наружу, что позволяет полимеразе транскрибировать вирусную РНК без диссоциации нуклеопротеина от РНК [20]. Каждый отдельный полимеразный комплекс связан с одим из концов отдельного РНП-стержня. Внутри РНП полимераза связана как с 3'-, так и с 5'-концами вирусной РНК и, скрепляя их, формирует кольцевую структуру РНК. Это кольцо затем суперспирализуется и превращается в стержневидную структуру [18,19].

Вирионы семейств арена-, альфа-, рабдо-, парамиксо-, ортомиксо- и ретровирусов получают свою липидную оболочку из плазматической мембраны [21,22]. Роль липидной мембраны вируса до недавнего времени казалась второстепенной, так как она заимствуется вирусом у клетки-хозяина в результате "почкования" - кооперативного процесса, приводящего к объединению матриксного белка, трансмембранных белков и нуклеокапсида -и содержит относительно немного липида (около 20% по массе - см. выше) (рис. 2).

Рис. 2. Последовательные этапы формирования вирионов вируса гриппа на поверхности инфицированной клетки (X350 ООО) [11].

Однако, липидный состав вирусных оболочек значительно отличается от липидного состава мембраны клетки-хозяина [23,24], от которой отщепилась вирусная частица. Это было показано для разных типов вирусов: вируса леса Семлики [25], вируса Синдбис [26], вируса везикулярного стоматита [27].

Подобные данные говорят в пользу предположения о том, что так называемые рафты ("гайв" - домены специфического состава, содержащиеся в мембране) клеточной мембраны избирательно встраиваются в вирусную мембрану в процессе отщепления вирусной частицы от клеточной мембраны. Например, в работе [28] был проанализирован липидный состав мембраны вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и цитоплазматической мембраны клеток, в которых созревал вирус. Было показано снижение уровня фосфатидилхолина и фосфатидилинозитола на 50 % и 80 % соответственно, увеличение содержания холестерина в 2,5 раза, фосфатидилсерина на 50-140 % и фосфатидной кислоты на 100 % относительно уровня клеточной мембраны. Оказалось, что высокий процент холестерина в мембране вириона критичен для инфекционности вируса. Например, экстракция около 50% холестирина из мембран вируса везикулярного стоматита снижает его ифекционность более чем на 85%, для ВИЧ снижение уровня холестерина в оболочке на 50-60 % редуцирует его инфекционность на 50 % [29]. Роль холестерина в процессе слияния, индуцируемого белками, не совсем ясна. По данным ЭПР-спектроскопии, наличие холестерина повышает параметр упорядоченности мембраны вириона. Процесс слияния вируса с мембраной-мишенью можно также ингибировать добавлением в среду экзогенных липидов типа лизофосфатидилхолина, либо ускорить добавлением липидов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты (олеиновая кислота, арахидоновая кислота).

Теперь, когда были вкратце описаны сам вирус гриппа и его основные компоненты, целесообразно перейти к описанию вирусного слияния и баддинга. При этом основное внимание будет уделено роли матриксного белка в этих процессах.

Заключение диссертации по теме «Электрохимия», Князев, Денис Геннадьевич

Выводы

В работе исследовалась адсорбция белка М1 на бислойной липидной мембране и на липидном моно- и бислое на подложке методами компенсации внутримембранного поля, спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса и атомной силовой микроскопии. Была четко показана рН-зависимость адсорбции белка на липидных поверхностях. Изучалась зависимость адсорбции от ионной силы и липидного состава поверхности. Были предложены ориентация молекулы М1 относительно липидного бислоя, а также механизм диссоциации белкового каркаса в кислом рН.

На основе имеющейся рентгеновской структуры М1 [65] часто предполагают, что вирусный белковый каркас стабилизируется как гидрофобными, так и электростатическими взаимодействиями. По этой причине при нейтральном значении рН заряды молекул М1 оказываются частично скомпенсированными. Как известно, в процессе инфицирования М1-каркас внутри вириона разрушается при изменении рН внешней среды с 7 до 5 [49]. При этом известная из рентгеноструктурного анализа пространственная структура N- и М-доменов белка (а следовательно, и распределение на них гидрофобных участков) не меняется [61]. Однако, как обсуждалось выше, в этом случае существенно увеличивается общий положительный заряд белка.

Можно предположить, что именно изменение белок-белкового взаимодействия внутри каркаса (например, электростатическое отталкивание мономеров матриксного белка друг от друга в кислом рН) дестабилизирует вирусный белковый каркас.

Результаты, полученные разными методами, находятся в хорошем согласии друг с другом. Это позволило сделать следующие выводы об особенностях адсорбции матриксного белка на липидной поверхности. - Показана необратимость адсорбции белка М1 на липидных поверхностях. Таким образом, взаимодействия М1-липид достаточно для ассоциации белковых молекул на липидной оболочке вириона.

- Показано наличие зависимости потенциала адсорбции и сигнала поверхностного плазмонного резонанса от концентрации белка в растворе, что позволило предположить создание на липидной поверхности белковых сетей различной структуры.

- Оценен привносимый белком на БЛМ заряд. Проведенная оценка показала, что этот заряд положителен и зависит от значения рН среды.

- Показана зависимость адсорбции белка от липидного состава поверхности и от ионной силы раствора: при наличии отрицательно заряженных липидов и при низкой ионной силе раствора адсорбция происходит с большей эффективностью.

Изучение адсорбции М1 с помощью спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса проводилось под руководством профессора В.М. Мирского в Университете Регенсбурга, Германия.

Автор благодарит Н.В.Федорову и Л.А.Баратову за предоставленный матриксный белок, В.И.Золотаревского за помощь в проведении АСМ-экспериментов, О.В.Батищева за помощь и поддержку в ходе выполнения всей работы, Ю.А.Чизмаджева за предоставленную идею исследования и ценные обсуждения работы, В.С.Соколова за ответственное и участливое руководство и весь коллектив лаборатории биоэлектрохимии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Князев, Денис Геннадьевич, 2008 год

1. Wiley D.C., Skehel J.J.// The Structure and Function of the Hemagglutinin Membrane Glycoprotein of Influenza Virus.// Annual Review of Biochemistry.1987. V.56.P.365-394.

2. Lear J.D.//Proton conduction through the M2 protein of the influenza A virus; a quantitative, mechanistic analysis of experimental data.// Febs Letters. 2003. V.552.N l.P. 17-22.

3. Wu Y. J., Voth G.A.// Computational studies of proton transport through the M2 channel.//Febs Letters. 2003. V.552.N 1. P.23-27.

4. Schulze I.T.//The structure of influenza virus. II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 1972. V. 47. P. 181-196.

5. Ruigrok R.W.// Structure of Influenza A, B and C Viruses.//Textbook of Influenza./ /Ed. A.H.N.C.R.Webster. Blackwell Scientific Publications, 2007. P.

6. Henkel J.R., Popovich J.L., Gibson G.A., Watkins S.C., Weisz O.A.// Selective Perturbation of Early Endosome and/or trans-Golgi Network pH but Not Lysosome pH by Dose-dependent Expression of Influenza M2 Protein.// J.Biol.Chem. 1999. V.274.P.9854-9860.

7. Portela A., Digard P.// The influenza virus nucleoprotein: a multifunctional RNA-binding protein pivotal to vims replication.// Journal of General Virology. , 2002. V.83.P.723-734.

8. Lamb R.A., Choppin P.W.// The Gene Structure and Replication of Influenza-Virus.//Annual Review of Biochemistry. 1983. V.52.P.467-506.

9. Murti K.G., Webster R.G., Jones I.M.//Localization of RNA polymerases on influenza viral ribonucleoproteins by immunogold labeling.// Virology. 1988. V.164.N 2. P.562-566.

10. Жданов В.МУ/ Атлас вирусной цитопатологии . Москва Медицина, 1975

11. Blough Н.А., Merlie J.P.// The lipids of incomplete influenza virus.// Virology. 1970. V.40.N 3. P.685-692.

12. Klenk H.D., Rott R., Becht H.// On the structure of the influenza virus envelope.//Virology. 1972. V.47.N 3. P.579-591.

13. RuigrokR.W.H.//PhD thesis State University of Leiden, 1985.

14. Brassard D.L., Leser G.P., Lamb R.A.//Influenza В virus NB glycoprotein is a component of the virion.// Virology. 1996. V.220.N 2. P.350-360.

15. Fujiyoshi Y., Kume N.P., Sakata K., Sato S.В .//Fine-Structure of Influenza-A Virus Observed by Electron Cryomicroscopy.// Embo Journal. 1994. V.13.N 2. P.318-326.

16. Booy F.P., Ruigrok R.W.H., van Bruggen E.F.J.//// J.Mol.Biol. 1985. V.184.N 4. P.667-676.

17. Compans R.W., Content J., Duesberg P.H.// Structure of the Ribonucleoprotein of Influenza Virus.// J.Virol. 1972. V.10.P.795-800.

18. Jennings P.A., Finch J.T., Winter G., Robertson J.S.//Does the higher order structure of the influenza virus ribonucleoprotein guide sequence rearrangements in influenza viral RNA?// Cell. 1983. V.34.N 2. P.619-627.

19. Baudin F., Bach C., Cusack S., Ruigrok R.W.H.// Structure of Influenza-Virus Rnp .1. Influenza-Virus Nucleoprotein Melts Secondary Structure in Panhandle Rna and Exposes the Bases to the Solvent.// Embo Journal. 1994. V.13.N 13. P.3158-3165.

20. Scheiffele P., Roth M.G., Simons K.// Interaction of influenza virus haemagglutinin with sphingolipid-cholesterol membrane domains via its transmembrane domain.// Embo Journal. 1997. V.16.N 18. P.5501-5508.

21. Zhang J., Pekosz A., Lamb R.A.//Influenza virus assembly and lipid raft microdomains: a role for the cytoplasmic tails of the spike glycoproteins.// Journal of Virology. 2000. V.74.N 10. P.4634-4644.

22. Simons K., Ikonen E.// Functional rafts in cell membranes.// Nature. 1997. V.387.N 6633. P.569-572.

23. Simons K., van Meer G.//Lipid sorting in epithelial cells.// Biochemistry. 1988. V.27.P.6197-6202.

24. Renkonen O., Kaarainen L., Simons K., Gahmberg C.J//The lipid class composition of Semliki Forest virus and of plasma membranes of the host cells.// Virology. 1971. V.46.N2. P.318-326.

25. Klenk H.D., Choppin P. W.//Lipids of plasma membranes of monkey and hamster kidney cells and of parainfluenza virions grown in these cells.// Virology. 1969. V.38.N2. P.255-268.

26. McSharry J.J., Wagner R.R.// Lipid Composition of Purified Vesicular Stomatitis Viruses.//J.Virol. 1971. V.7.N 1. P.59-70.

27. Aloia R.C., Tian Hv Jensen F.C// Lipid composition and fluidity of the human immunodeficiency virus envelope and host cell plasma membranes.// P.N.A.S. 1993. V.90.N 11. P.5181-5185.

28. Sarin P.S., Gallo R.C.//Effects of a novel compound (AL 721) on HTLV-III infectivity in vitro.//N.Engl,J. 1985. V.313.N 20. P.1289-1290.

29. Garoff H., Hewson R., Opstelten D.J.E.//Virus maturation by budding.// Microbiology and Molecular Biology Reviews. 1998. V.62.N 4. P.l 171-+.

30. Gaedigk-Nitschko K., Schlesinger M.J.// Site-directed mutations in sindbis virus E2 glycoprotein's cytoplasmic domain and the 6K protein lead to similar defects in virus assembly and budding.// Virology. 2008. V.183.N 1. P.206-214.

31. Hunter E.//Macromolecular Interactions in the Assembly of Hiv and Other Retroviruses.// Seminars in Virology. 1994. V.5.N 1. P.71-83.

32. Mebatsion T., Konig M., Conzelmann K.K.//Budding of rabies virus particles in the absence of the spike glycoprotein.// Cell. 1996. V.84.N 6. P.941-951.

33. Nayak D.P.//A look at assembly and morphogenesis of orthomyxo- and paramyxoviruses.// Asm News. 1996. V.62.N 8. P.411-414.

34. Sanderson C.M., Wu H.H., Nayak D.P.// Sendai Virus-M Protein Binds Independently to Either the F-Glycoprotein Or the Hn-Glycoprotein In-Vivo.// Journal of Virology. 1994. V.68.N 1. P.69-76.

35. Schnell M.J., Buonocore L., Boritz E., Ghosh H.P., Chernish R, Rose J.K.// Requirement for a non-specific glycoprotein cytoplasmic domain sequence to drive efficient budding of vesicular stomatitis virus.// Embo Journal. 1998. V.17.N 5. P.1289-1296.

36. Suomalainen M., Liljestrom P., Garoff H.// Spike Protein-Nucleocapsid Interactions Drive the Budding of Alphaviruses.// Journal of Virology. 1992. V.66.N 8. P.4737-4747.

37. Solon J., Gareil O., Bassereau P., Gaudin Y.//Membrane deformations induced by the matrix protein of vesicular stomatitis virus in a minimal system.// Journal of General Virology. 2005. V.86.P.3357-3363.

38. Shnyrova A., Ayllon J., Villar E., Zimmerberg J., Frolov V.A.//Reconstruction of membrane budding by viral matrix protein.// Biophysical Journal. 2007. P.427A-428A.

39. Gomez-Puertas P., Albo C., Perez-Pastrana E., Vivo A., Portela A.//Influenza Virus Matrix Protein Is the Major Driving Force in Virus Budding.// J.Virol. 2000. V.74.N 24. P. 11538-11547.

40. Jayakar H.R., Murti K.GV Whitt M.A.//Mutations in the PPPY motif of vesicular stomatitis virus matrix protein reduce virus budding by inhibiting a late step in virion release.// Journal of Virology. 2000. V.74.N 21. P.9818-9827.

41. Chen B.J., Leser G.P., Morita Ev Lamb R.A.//Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly and budding of plasmid-derived virus-like particles.// Journal of Virology. 2007. V.81.N 13. P.7111-7123.

42. Bourmakina S.V., Garcia-Sastre AM Reverse genetics studies on the filamentous morphology of influenza A virus.// Journal of General Virology. 2003. V.84.P.517-527.

43. Elleman C.J., Barclay W.S.//The Ml matrix protein controls the filamentous phenotype of influenza A virus.//Virology. 2004. V.321.N 1. P. 144-153.

44. Bourmakina S.V., Garcia-Sastre A.//The morphology and composition of influenza A virus particles are not affected by low levels of Ml and M2 proteins in infected cells.// Journal of Virology. 2005. V.79.N 12. P.7926-7932.

45. Jin H., Leser G.P., Zhang J., Lamb R.A.//Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase cytoplasmic tails control particle shape.// Embo Journal. 1997. V.16.N 6. P.1236-1247.

46. Ruigrok R.W.H., Barge A., Durrer P., Brunner J., Ma Kv Whittaker G.R.// Membrane interaction of influenza virus Ml protein.// Virology. 2000. V.267.N 2. P.289-298.

47. Zhirnov O.P.// Solubilization of Matrix Protein Ml/M from Virions Occurs at Different Ph for Orthomyxoviruses and Paramyxoviruses.// Virology. 1990. V.176.N 1. P.274-279.

48. Roberts P.C., Lamb R.A., Compans R.W.//The Ml and M2 proteins of influenza A virus are important determinants in filamentous particle formation.// Virology. 1998. V.240.N 1. P. 127-137.

49. Antonny B // Membrane deformation by protein coats.// Current Opinion in Cell Biology. 2006. V.18.N 4. P.386-394.

50. Kretzschmar E., Bui M., Rose J.K.//Membrane association of influenza virus matrix protein does not require specific hydrophobic domains or the viral glycoproteins.//Virology. 1996. V.220.N 1. P.37-45.

51. Yasuda J., Nakada S., Kato A., Toyoda T., Ishihama A.//Molecular Assembly of Influenza-Virus Association of the Ns2 Protein with Virion Matrix.// Virology. 1993. V.196.N 1. P.249-255.

52. Ye Z., Baylor N.W., Wagner R.R.//Transcription-inhibition and RNA-binding domains of influenza A virus matrix protein mapped with anti-idiotypic antibodies and synthetic peptides.// J.Virol. 1989. V.63.P.3586-3594.

53. Ye Z.P., Pal R., Fox J.W., Wagner R.R.// Functional and antigenic domains of the matrix (Ml) protein of influenza A virus.// J.Virol. 1987. V.61.N 2. P.239-246.

54. Gregoriades A.// Interaction of influenza M protein with viral lipid and phosphatidylcholine vesicles.//J.Virol. 1980. V.36.P.470-479.

55. Gregoriades A., Frangione BJ/ Insertion of influenza M protein into the viral lipid bilayer and localization of site of insertion.// J.Virol. 1981. V.40.P.323-328.

56. Chong L.D., Rose J.K./7 Membrane Association of Functional Vesicular Stomatitis-Virus Matrix Protein Invivo.// Journal of Virology. 1993. V.67.N 1. P.407-414.

57. Chong L.D., Rose J.K.//Interactions of Normal and Mutant Vesicular Stomatitis-Virus Matrix Proteins with the Plasma-Membrane and Nucleocapsids.// Journal of Virology. 1994. V.68.N 1. P.441-447.

58. Sha B.D., Luo M J/ Structure of a Afunctional membrane-RNA binding protein, influenza virus matrix protein Ml.// Nature Structural Biology. 1997. V.4.N 3. P.239-244.

59. Baudin F., Petit I., Weissenhorn W., Ruigrok R.W.// In vitro dissection of the membrane and RNP binding activities of influenza virus Ml protein.// Virology. 2001. V.281.N 1. P.102-108.

60. Scianimanico S., Schoehn G., Timmins J., Ruigrok R.H.W., Klenk H.D., Weissenhorn W//Membrane association induces a conformational change in the Ebola virus matrix protein.// Embo Journal. 2000. V.19.N 24. P.6732-6741.

61. Harris A., Forouhar F., Qiu S.H., Sha B.D., Luo M.//The crystal structure of the influenza matrix protein Ml at neutral pH: Ml-Ml protein interfaces can rotate in the oligomeric structures of Ml.// Virology. 2001. V.289.N 1. P.34-44.

62. Epand R.M.//Proteins and cholesterol-rich domains.// Biochim.Biophys.Acta. 2008. V.1778.N 7-8. P.1576-1582.

63. Shnyrova A.V., Ayllon J., Mikhalyov I.I., Villar E., Zimmerberg J., Frolov

64. V. A J/ Vesicle formation by self-assembly of membrane-bound matrix proteins into a fluidlike budding domain.// Journal of Cell Biology. 2007. V.179.N 4. P.627-633.

65. Saijo S., Kishishita S., Yokoyama S.// Crystal structure of Matrix protein 1 from influenza A virus A/crow/Kyoto/Tl/2004(H5Nl). 2008. RCSB PDB-bank,

66. Ermakov Y.A., Cherny V.V., Sokolov V.S.//Adsorption of beryllium on neutral and charged lipid-membranes.// Biologicheskie Membrany. 1992. V.9.N 2. P.201-213.

67. Ermakov Yu.A., Sokolov V.S.//Boundary potentials of bilayer lipid membranes: methods and interpretations/ZPlanar Lipid Bilayers (BLMs) and their applications./ /Ed. H.T.Tien, A.Ottova-Leitmannova. Elsevier, 2003. P.109-141

68. Соколов B.C., Соколенко E.A., Филинский Д.В., Ермаков Ю.А., Лопина О.Д., Апель Х.-Ю.// Электрические потенциалы, возникающие при адсорбции фрагментов мембран с №,К,АТР-азой на липидных бислоях.// Биол.мембраны. 2007. V.24.N 4. Р.333-347.

69. Sokolov V.S., Sokolenko Е.А., Filinsky D.V., Ermakov Yu.A., Lopina O.D., Apell H.-J.// Electrostatic potentials created by membrane fragments with Na,K-ATPase adsorbed on lipid membranes.// Eur.Biophys.J. 2007. V.36.N Supplement 1. P.S88-S88.

70. Zhirnov O.P.// Isolation of Matrix Protein-Mi from Influenza-Viruses by Acid-Dependent Extraction with Nonionic Detergent.// Virology. 1992. V. 186.N 1. P.324-330.

71. Соколов B.C., Кузьмин В. Г .//Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока.// Биофизика. 1980. V.25.N 1. Р. 170-172.

72. Mueller P., Rudin D.O., Tien Н.Т., Wescott W. С. //Reconstitution of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system.// Nature. 1962. V.194.P.979-980.

73. Tien H. 77/Bilayer Lipid membranes (BLM): Theory and Practice . New York Marcel Dekker, Inc., 1974

74. Nikolelis D.P., Siontorou C.G.// Ammonium ion minisensors form self-assembled bilayer lipid membranes using gramicidin as an ionophore. Modulation of ammonium selectivity by platelet-activating factor.// Anal.Chem.1996. V.68.N 10. P.1735-1741.

75. Cornell B.A., Braach-Maksvytis V.L., King L.G., Osman P.D., Raguse B., Wieczorek L., Pace R.J.// A biosensor that uses ion-channel switches.// Nature.1997. V.387.N 6633. P.580-583.

76. Ivnitski D., Wilkins E., Tien H.T., Otto va A.//Electrochemical biosensor based on supported planar lipid bilayers for fast detection of pathogenic bacteria.// Electrochemistry Communications. 2000. V.2.N 7. P.457-460.

77. Mirsky V.M., Riepl M., Wolfbeis O.S.// Capacitive monitoring of protein immobilization and antigen-antibody reactions on monomolecular alkylthiol films on gold electrodes.// Biosensors & Bioelectronics. 1997. V.12.N 9-10. P.977-989.

78. Mirsky V.M., Hirsch T., Piletsky S.A., Wolfbeis O.S.//A spreader-bar approach to molecular architecture: formation of stable artificial chemoreceptors.// Angew.Chem., Int.Ed. 1999. V.38.N 8. P. 1108-1110.

79. Hirsch T., Zharnikov M., Shaporenko A., Stahl J., Weiss D., Wolfbeis O.S., Mirsky V.M.// Size-controlled electrochemical synthesis of metal nanoparticles on monomolecular templates.// Angew.Chem.Int.Ed Engl. 2005. V.44.N 41.1. P.6775-6778.

80. Boxer S.GJ/Molecular transport and organization in supported lipid membranes.// Current Opinion in Chemical Biology. 2000. V.4.N 6. P.704-709.

81. Welford К.// Surface-Plasmon Polaritons and Their Uses.// Optical and Quantum Electronics. 1991. V.23.N 1. P. 1-27.

82. Jung L.S., Campbell C.T., Chinowsky T.M., Mar M.N., Sinclair S.Y.// Quantitative Interpretation of the Response of Surface Plasmon Resonance Sensors to Adsorbed Films.// Langmuir. 1998. V.14.N 5636. P.5648.

83. Butt H.J,, Cappella В., Kappl M//Force measurements with the atomic force microscope: Technique, interpretation and applications.// Surface Science Reports. 2005. V.59.N 1-6. P. 1-152.

84. Egawa H., Furusawa К.// Liposome adhesion on mica surface studied by atomic force microscopy.// Langmuir. 1999. V.15.N 5. P.1660-1666.

85. Ермаков Ю.А., Февралева И.С., Атуллаханов Р.И.//Влияние поликатионов на граничные потенциалы бислойных липидных мембран.// Биол.мембраны. 1985. V.2.N 11. Р.1094-1100.I

86. Финогенова О.А., Филинский Д.В., Ермаков Ю.А.//Электростатические эффекты при адсорбции и десорбции полилизинов на поверхности липидных мембран разного состава.// Биол.мембраны. 2008. V.25.N 3. Р.230-238.

87. Gouy МУ/ Sur la constitution de la charge electrique a la surface d'un electrolyte.//J.Phys.(Paris). 1910. V.9.P.457-468.

88. Chapman D.LJ/A contribution to the theory of electrocapillarity.// Philos.Mag. 1913. V.25.P.475-481.

89. Stern ОУ/The theory of the electrolytic double-layer.// Z.Elektrochem. 1924. V.30.P.508-516.

90. Соколов B.C., Черный B.B., Абидор И.Г.//Измерение поверхностного заряда бислойных липидных мембран.// Доклады АН СССР. 1980. V.251.P.236-239.

91. Stryer Z./У Biochemistry /Ed. Freeman. NY Freeman, 1988 1089 P.

92. Wrigley N.G.// Electron microscopy of influenza virus.// Br.Med.Bull. 1979. V.35.N 1. P.35-38.

93. Voros J.//The density and refractive index of adsorbing protein layers.// Biophys.J. 2004. V.87.N 1. P.553-561.

94. Егоров A.M., Осипов А.П.// Теория и практика иммуноферментного анализа . Москва Высшая школа, 1991

95. Choi E.J., Dimitriadis Е.КУ/Cytochrome с adsorption to supported, anionic lipid bilayers studied via atomic force microscopy.// Biophys.J. 2004. V.87.N 5. P.3234-3241.

96. Mueller H., Butt H.J., Bamberg E.//Force Measurements on Myelin Basic Protein Adsorbed to Mica and Lipid Bilayer Surfaces Done with the Atomic Force Microscope.//Biophys.J. 1999. V.76.P. 1072-1079.

97. Mueller H., Butt H.J., Bamberg E.//Adsorption of membrane-associated proteins to lipid bilayers studied with an atomic force microscope: Myelin basic protein and cytochrome с.// Journal of Physical Chemistry B. 2000. V.104.N 18. P.4552-4559.

98. Князев Д.Г., Радюхин В.А., Соколов B.C.//Изучение межмолекулярных взаимодействий белков Ml вируса гриппа на поверхности модельной липидной мембраны методом компенсации внутримембранного поля.// Биол.мембраны. 2008. V.25.N 6. Р.491-500.