Трансмиссивность современных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Дубровина, Ирина Анатольевна

• Дубровина, Ирина Анатольевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Дубровина, Ирина Анатольевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика вируса гриппа

1.1.1. Структура вириона

1.1.2. Организация генома

1.1.3. Репликация вируса гриппа

1.2. Изменчивость вируса гриппа и адаптация к новым хозяевам

1.3. Патогенез вируса гриппа

1.3.1. Клиническая картина и гистопатологические изменения, вызываемые вирусами гриппа

1.3.2. Генетические факторы патогенности

1.4. Трансмиссивность вируса гриппа

1.4.1. Модели для изучения трансмиссивности

1.4.2. Возможные механизмы, лежащие в основе трансмиссивности

1.5. Специфическая профилактика гриппа

1.5.1. Инактивированные гриппозные вакцины

1.5.2. Живые гриппозные вакцины

1.5.3. Трансмиссивность вакцинных штаммов

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Вирусологические методы

2.2. Методы работы с лабораторными животными

2.3. Серологические методы

2.4. Молекулярно-биологические методы

2.5. Компьютерное обеспечение «Калькулятор фенотипов»

2.6. Статистическая обработка данных

Глава 3. МОРСКАЯ СВИНКА - МОДЕЛЬ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ

ТРАНСМИССИВНОСТИ ВИРУСА ГРИППА

3.1. Отработка условий интраназального заражения

3.2. Подбор оптимальной инфицирующей дозы

3.3. Заключение

Глава 4. ТРАНСМИССИВНОСТЬ ВИРУСОВ ГРИППА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

4.1. Трансмиссивность «диких» вирусов гриппа в экспериментах ш vivo

4.1.1. Контактная передача «диких» вирусов гриппа

4.1.2. Передача «диких» вирусов гриппа на ближней дистанции

4.1.3. Передача «диких» вирусов гриппа на дальней дистанции

4.2. Трансмиссивность холодоадаптированных вирусов гриппа

4.3. Взаимная передача вирусов гриппа от зараженных морских свинок свинкам, зараженным другими вирусами гриппа

4.4. Заключение

Глава 5. ФОРМИРОВАНИЕ РЕАССОРТАНТОВ ПРИ ИНТРАНАЗАЛЬНОМ 56 ЗАРАЖЕНИИ ЖИВОТНЫХ СМЕСЬЮ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА

5.1. Динамика выделения вируса гриппа из носовых смывов

5.2. Одномоментное заражение животных смесью вирусов гриппа

5.2.1. Заражение морских свинок смесью, содержащей вирус NIBRG-23

(H5N1) и донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)

5.2.2. Заражение морских свинок смесью двух «диких» вирусов

5.2.3. Заражение морских свинок смесью трех штаммов вируса гриппа

5.3. Разномоментное заражение животных смесью двух вирусов гриппа

5.4. Сравнительный анализ репродукции вирусов при смешанном заражении и моноинфекции

5.5. Трансмиссивноть реассортантов, полученных при принудительном скрещивании в морских свинках различных штаммов вируса гриппа.

5.6. Заключение

Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

75

84

85

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВДП верхние дыхательные пути

ЖГВ живая гриппозная вакцина

ИГВ инактивированная гриппозная вакцина

JI17 донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2)

РГА реакция гемагглютинации

РКЭ развивающиеся куриные эмбрионы

РТГА реакция торможения гемагглютинации

ХА холодоадаптированный

ЭИД50 50%-ная эмбриональная инфицирующая доза вируса

att аттенуация, аттенуирующий фенотип (attenuation)

са холодоадаптированность (cold-adaptation, са фенотип)

НА гемагглютинин

NA нейраминидаза

non-ts способность к репродукции при температуре выше оптимальной

PCR полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction)

PR8 «дикий» вирус A/PR/8/34 (H1N1)

RCT40(38) репродуктивная способность при различных температурах

(reproductive capacity at different temperatures) RDE receptor-destroying enzyme

ts температурочувствительность (temperature sensitivity)

NIBRG-23 (H5N1) реассортант, подготовленный на основе высокоурожайного вируса

A/PR/8/34 (H1N1) (PR8) и вирусов гриппа птиц А/индюк/Турция/1/2005 (H5N1) Indo/5 (H5N1) реассортант, подготовленный на основе высокоурожайного вируса

A/PR/8/34 (H1N1) (PR8) и вирусов гриппа птиц А/Индонезия/05/2005 (H5N1) VN1203 (H5N1) реассортант, подготовленный на основе высокоурожайного вируса

A/PR/8/34 (H1N1) (PR8) и вирусов гриппа птиц А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Трансмиссивность современных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Грипп - это тяжелая вирусная инфекция, которая поражает людей вне зависимости от возраста и национальности и остается серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Заболевания гриппом сопровождаются высокой смертностью, особенно у маленьких детей и пожилых людей [85]. Эпидемии гриппа происходят каждый год и охватывают до 15% населения Земли. Пандемии возникают каждые 10—40 лет. В 2009 году мир оказался на пороге первой пандемии 21-го века, вызванной вирусами, подобными А/Калифорния/7/2009 (НШ1).

Сегодня, наряду с уже повсеместно циркулирующим калифорнийским штаммом А (НШ1), потенциальную угрозу пандемии несут высоко патогенные вирусы гриппа птиц, которые уже преодолели видовой барьер, передаваясь от птиц к человеку [102]. В дальнейшем могут произойти новые генетические изменения, которые позволят птичьим вирусам передаваться непосредственно от человека к человеку.

Три основных свойства вируса гриппа определяют его пандемические потенции: новизна штамма для иммунной системы, вирулентность и способность передаваться от человека к человеку, то есть трансмиссивность. Именно степень трансмиссивности циркулирующих штаммов определяет тяжесть вызываемых ими пандемий или эпидемий [47]. Несмотря на бесспорно ключевую роль трансмиссивности вируса гриппа в распространении эпидемических и пандемических штаммов, природа и механизмы их контагиозности продолжают обсуждаться. Поэтому существует насущная необходимость глубокого понимания проблемы трансмиссивности вируса гриппа. Раскрытие механизмов, лежащих в ее основе, позволит более эффективно контролировать грипп и изыскивать новые пути и методы его профилактики.

На сегодняшний день наиболее эффективным методом защиты от гриппа является вакцинопрофилактика. В последние годы живая гриппозная холодоадаптированная (ХА) реассортантная вакцина (ЖГВ) как средство защиты от гриппа заняла лидирующее положение в мире среди других профилактических противогриппозных препаратов. По мнению экспертов Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), использование живых противогриппозных вакцин является эффективным путем защиты восприимчивой популяции не только от сезонно возникающих эпидемий, но и глобальных пандемий гриппа.

Начиная с 1977 года регулярно публиковались результаты клинических исследований по выделению вакцинных штаммов ЖГВ от не привитых лиц, в которых [62,55,80, 57, 8,50], за единственным исключением [92,93], не была зарегистрирована их передача при тесном контакте привитых и не привитых лиц. Только в двух работах Уез1кап е1 а1 [92,93] описан

|

«1 Ч

единичный случай выделения вакцинного штамма американской вакцины Р1иМ1з1 от ребенка, получившего препарат плацебо. При этом у него не было отмечено никаких клинически выраженных симптомов, а полученный изолят не утратил Хь/са/аП свойства, присущие вакцинному вирусу. В отечественных публикациях [5,63] передача вакцинных штаммов отечественной ЖГВ при тесном контакте привитых и не привитых лиц зарегистрирована не была. Однако, в связи с изменением антигенной структуры циркулирующих вирусов, появлением новых потенциально опасных вирусов гриппа требуется проведение новых, углубленных исследований трансмиссивности вакцинных штаммов.

Периодически в научной литературе и средствах массовой информации поднимается вопрос о возможности распространения среди населения штаммов живой гриппозной вакцины с их последующей реассортацией с циркулирующими вирусами. По мнению авторов таких статей, вакцинный штамм может обменяться генами с сезонным вирусом, что в свою очередь может привести к формированию мутантного вируса с новыми, неизученными свойствами и повышенной вирулентностью.

Сегментированная природа генома, и, соответственно, способность к реассортации вируса гриппа является одной из основных причин возникновения пандемических вирусов и играет ключевую роль в адаптации к новому хозяину [84]. Известен ряд работ, касающихся изучения последствий реассортации для организма чувствительного хозяина двух «диких» вирусов. В частности, экспериментально показано, что скрещивание низко патогенного вируса гриппа птиц А(Н5Ш) и вируса гриппа А(НЗШ) человеческого происхождения может привести к формированию реассортантов с повышенной вирулентностью для мышей [41]. Обнаружение в дикой природе межвидовых реассортантных вирусов гриппа, несущих гены вирусов человеческого и иного происхождения [13] свидетельствует о возможности наступления событий такого рода. Высокая эффективность скрещивания после одномоментного заражения хорьков смесью вируса гриппа птиц А(Н5>Н) и человека А(НЗК2) с преобладанием реассортантов, несущих поверхностные антигены птичьего происхождения, делает реальной опасность такого рода встречи.

Что же касается экспериментального изучения реассортации «дикого» и ХА вакцинного штаммов, в доступной литературе имеется только одна работа, в которой продемонстрировано, что скрещивание «дикого» вируса А/Сидней/5/97 (НЗШ) с ХА вакцинных штаммом, подготовленным на его же основе, привело к созданию реассортантов, среди которых доминировали аттенуированные температурочувствительные варианты при этом ни один реассортант не приобрел вирулентность, превышающую таковую «дикого» родителя [60]. Таким образом, к моменту начала нашей работы систематических исследований подобного рода в мире не проводилось.

Все вышесказанное определяет важность изучения феномена трансмиссивное™ вируса гриппа, а доказательство необоснованности приведенных выше опасений позволит подтвердить безопасность применения ЖГВ не только в эпидемический, но и в пандемический по гриппу периоды.

Основной целью настоящей работы явилось изучение трансмиссивности различных штаммов вируса гриппа и особенностей реассортации in vivo вирусов гриппа, обладающих разным уровнем вирулентности для экспериментальных животных.

Для решения поставленной цели в задачи исследования входило:

1. Отработка модели трансмиссивности этих штаммов в экспериментах на морских свинках.

2. Изучение трансмиссивности пандемических, потенциально пандемических и сезонных штаммов вируса гриппа в экспериментах in vivo и сравнительная оценка степени их контагиозности для лабораторных животных.

3. Оценка возможности передачи ХА вирусов - доноров аттенуации и вакцинных штаммов ЖГВ - контактным животным.

4. Изучение особенностей реассортации сезонных и пандемически опасных вирусов гриппа с ХА штаммами в экспериментах in vivo.

Научная новизна исследования.

Впервые в России в экспериментах in vivo проведено систематическое изучение способности к трансмиссивности широкого спектра вирусов гриппа.

Показано, что разные штаммы вируса гриппа обладают способностью к передаче на расстоянии различной степени выраженности (от высокой до полного ее отсутствия). Наиболее трансмиссивными оказались вирус NIBRG-23 (H5N1), унаследовавший НА и NA от вируса гриппа птиц A/turkey/Turkey/1/2005, и выделенный от человека вирус гриппа свиней А/Индиана/10/2011 (H3N2)v. Вызвавший пандемию 2009 года вирус А/Калифорния/07/2009 (H1N1) проявлял меньшую контагиозность.

В экспериментах на лабораторных животных впервые продемонстрировано полное отсутствие трансмиссивности ХА штаммов вируса гриппа (доноров аттенуации и вакцинных штаммов ЖГВ).

Установлено, что смешанная инфекция in vivo «диких» и ХА вирусов не приводит к формированию реассортантов, превышающих по своей вирулентности «дикие» родительские вирусы.

Теоретическая и практическая значимость работы.

В результате моделирования смешанной инфекции in vivo обоснована несостоятельность опасений о возможности формирования при массовой вакцинации населения живой

гриппозной вакциной реассортантных вирусов, обладающих повышенным уровнем патогенности.

Показано, что реассортация ш vivo происходит менее эффективно, если один из участников скрещивания является ХА вирусом.

Установлен факт интерференции ХА вирусов с вирусами «дикого» типа, что открывает новые перспективы применения живой гриппозной аттенуированной вакцины в пандемической ситуации.

Подтверждена безопасность массового применения не только сезонной, но и пандемической живой гриппозной вакцины.

Положения, выносимые на защиту.

«Дикие» вирусы гриппа обладают разной степенью трансмиссивности для экспериментальных животных (морских свинок), которая далеко не всегда коррелирует с другими биологическими свойствами (уровнем репродукции в верхних дыхательных путях).

Холодоадаптированные штаммы вируса гриппа, активно реплицируясь в ВДП экспериментальных животных, не способны к передаче от вакцинированных контактным особям.

Теоретическая вероятность реассортации высоковирулентных вирусов с ХА штаммами живой гриппозной вакцины не приведет к формированию реассортантов, обладающих непредсказуемо высоким уровнем вирулентности и трансмиссивности и потенциально способных вызвать новую эпидемию или даже пандемию, что подтверждает высокую безопасность применения ЖГВ.

Личный вклад автора в проведенные исследования заключается в его непосредственном участии в выполнении всех разделов данной работы.

Внедрение результатов исследования. Подготовлены два вакцинных штамма ЖГВ на эпидемический сезон 2012-2013 гг. и депонированы в Государственную коллекцию вирусов Российской Федерации на базе ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под номерами 2723, 2724, а также переданы в производственные институты. Разработанное компьютерное обеспечение «Калькулятор фенотипов» внедрено в практику работы лаборатории вакцинных штаммов отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева (ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН, Санкт-Петербург) и используется для обработки массива данных, оценки фенотипических свойств полученных реассортантных вирусов.

Апробация диссертации осуществлялась на протяжении всего периода работы. Основные положения диссертации были доложены на 19 международных и российских научных конференциях: на Международной научно-практической конференции, посвященной Всемирному дню здоровья (Киев, Украина, 7-8 апреля 2010 г.); на 14-й

Международной Пущннской школе-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 г.); на 17-м Международном конгрессе медицинских наук (ISCOMS) (Гронинген, Нидерланды, 8-11 июня 2010 г.); на VII Международном конгрессе по контролю за гриппом (Гонконг, Китай, 3-7 сентября 2010 г.); на Международном научно-практическом конгрессе студентов и молодых ученых «Актуальные проблемы современной медицины» (Киев, Украина, 3-^4 ноября 2010 г.); на Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (21-22 декабря 2010 г.); на Х-й Всероссийской молодежной конференции Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, республика Коми, 19-21 апреля 2011 г.); на 15-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2011 г.); на Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодежь - медицине будущего», посвященной 135-летию со дня рождения Н.Д.Стражеско (Одесса, Украина, 28-29 апреля 2011 г.); на Четвертой конференции Европейской научной рабочей группы по гриппу (ESWI) (Мальта, 11-14 сентября 2011 г.); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе», посвященной 80-летию кафедры эпидемиологии и доказательной медицины ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России (Москва, 13-14 октября 2011 г.); на Всероссийской молодежной конференции-школе «Нейробиология интегративных функций мозга» посвященной 120-летию создания физиологического отдела им. И.П.Павлова НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 21-25 ноября 2011 г.); на Международном конгрессе «Человеческий фактор риска» Союза управления рисками в профилактической медицине (URMPM) (Лондон, Великобритания, 8-9 сентября 2012 г.); на Второй Российско-Германской неделе молодого ученого «Общество и здоровье» (Екатеринбург, 16-21 сентября 2012 г.); на Научной конференции «Грипп: вирусология, эпидемиология, профилактика, лечение», посвященной 45-летию ФГБУ «НИИ гриппа» Минсоцздравразвития России (Санкт-Петербург, 24-25 октября 2012 г.); на П-й Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 12-14 ноября 2012 г.); на XVI Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина человек и его здоровье» (Россия, Санкт-Петербург, 20 апреля 2013 г.); на Международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Россия, Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013 г.); на VIII Международном конгрессе по контролю за гриппом (ЮАР, Кейптаун, 5-10

сентября 2013), а также регулярно заслушивались на заседаниях отдела вирусологии им. А.А.Смородинцева ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (2010-2012 гг.).

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус гриппа

В семейство 0гЖотухоу1пс1ае входит пять родов, три из которых представлены вирусами гриппа А В и С. Из остальных двух родов один представлен клещевым арбовирусом (род и еще один - вирусом инфекционной септецимии лосося (род /лш'гил).

Вирусы гриппа А поражают человека и некоторые виды животных (лошади, свиньи и др.) и птиц. Вирусы гриппа В и С патогенны только для людей [32].

Первый вирус гриппа человека был выделен от человека в 1933 г. В. Смитом, К. Эндрюсом и П. Лэйдоу путем заражения белых хорьков. Позже этот вирус был отнесен к типу А. В 1940 г. Т. Френсис и Т. Меджилл открыли вирус гриппа В, а в 1949 г. Р. Тэйлор - вирус гриппа С [74]. Основными признаками семейства Опкотухоутёае являются негативный, минус-нитевой сегментированный РНК-геном и спиральный нуклеокапсид, заключённый в липопротеидную оболочку. Вирионная РНК неинфекционна и комплементарна информационной РНК. Размножается в клеточном ядре и цитоплазме птиц, млекопитающих, созревает путём почкования на плазматической мембране клеток [32].

1.1.1. Структура вир иона

Вирион вируса гриппа А имеет форму шара диаметром около 100 нм. Встречаются и нитевидные формы диаметром 80-100 нм и длиной в сотни нанометров. Вирусы гриппа типов А и В морфологически неотличимы друг от друга при исследовании под электронным микроскопом. Вирусные частицы вируса гриппа А имеют в своем составе около 1% РНК, 70% белков, 20% липидов, 5-8% углеводов. Масса вириона составляет 250 МДа, плавучая

л д

плотность в сахарозе 1.19 г/см , в цезия хлориде - 1.34 г/см . Три вирусных белка (у вирусов гриппа В их четыре) пронизывают липидный слой и образуют внешнюю поверхность вириона. Два из них - вирусные гликопротеиды: гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (ИА). Они формируют поверхность вирусной частицы. Из 550-600 структурных элементов поверхности на долю КА приходится 50-100, остальные являются НА [56] Меньшее число матриксных (М2) ионных каналов пересекают липидную оболочку, Соотношение М2: НА порядка одного канала М2 на 101-102 молекул НА [103].

Функция гемагглютинина состоит в прикреплении вируса к поверхности клетки и в обеспечении слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной. Нейраминидаза - это

фермент, который отщепляет сиаловую кислоту, концевой сахарный остаток олигосахаридов, присутствующих в гликопротеидах гликолипидах клеток млекопитающих и птиц. Сиаловая кислота является рецептором для гемагглютинина вирусов гриппа А и В, ее устранение необходимо для успешного распространения вируса от клетки к клетке. Характер связи между сиаловой кислотой и галактозой определяет видовую и тканевую специфичность [52,16] клеточных рецепторов и ограничивает круг хозяев разных вариантов вируса гриппа А.

НА и ИА являются трансмембранными белками. Их гидрофобные трансмембранные участки пронизывают липидный слой оболочки вируса, а короткий внутренний гидрофильный участок закрепляет их в составе оболочки вируса. Третий трансмембранный белок вирусной оболочки, обозначаемый у вируса гриппа А как М2, а у гриппа В как ВМ2, обеспечивает формирование ионных каналов. Это необходимо для эффективного проникновения вирусного генетического материала в цитоплазму инфицированной клетки. У вируса гриппа В существует дополнительный трансмембранный белок N8, также участвующий в ионном транспорте.

Внутренний листок оболочки вирусов гриппа образован белком М1. Внутренняя структура вирусной частицы - нуклеокапсид - представлен рибонуклеопротеидными тяжами, содержащими вирусную РНК и 4 вирусных белка. Главный из них, белок ИР, представлен в количестве 1000 молекул на вирион. Остальные три белка РВ1, РВ2, РА являются компонентами вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы [59].

1.1.2. Организация генома

Грипп это оболочечный вирус с геномом представленным одноцепочечной, сегментированной, антисмысловой РНК. Вирус гриппа А имеет восемь сегментов, которые кодируют 11 вирусных белков: гемагглютинин (НА), нейраминидаза (ИА), М1, М2, нуклеопротеин (№), не структурный белок 1 (КБР1) , не структурный белок 2 (N82, также известный как белок ядерного экспорта) и белки полимеразного комплекса РВ1, РВ1 -Р2, РВ2 и РА.

Самые большие геномные РНК-сегменты кодируют полимеразные белки РВ1 и РВ2. Во втором сегменте, кодирующем полимеразный белок РВ1, помимо рамки считывания РВ1 размером в 757 триплетов имеется дополнительная рамка, начиная с 120-го нуклеотида, длиной 87 триплетов. Она кодирует белок РВ1-Б2, имеющий сродство к митохондриям и играющий роль в гибели клеток в результате инфекции. Для вирусов гриппа В и С не было найдено аналогов РВ1-Б2 [91]. Первый сегмент, кодирующий белок РВ2, имеет лишь одну рамку считывания, как и третий сегмент, который кодирует белок РА. Гетеротример,

содержащий в одной молекуле РВ1, РВ2, РА, осуществляет транскрипцию и репликацию вирусного генома [10].

Четвертый сегмент кодирует гемагглютинин. НА играет решающую роль на ранней стадии вирусной инфекции, отвечая за связывание с рецепторами клетки хозяина, проникновения вируса в клетку, и слияние мембран. Молекула НА синтезируется как единая полипептидная цепь, которая в дальнейшем подвергается процессингу. Он включает в себя гликозилирование, сульфацирование, ацилирование, отщепление сигнального пептида и, наконец, протеолитическое расщепление на 2 субъединицы большую НА1 и малую НА2. Субъединицы в зрелой молекуле НА связаны дисульфидной связью. Для приобретения НА функции слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной, необходимо расщепление молекулы. Вирусная частица, содержащая нерасщепленный НА, не обладает инфекционностью. В молекуле НА есть три гидрофобных участка. Один из них, N-концевой сигнальный пептид, отщепляется в ходе процессинга. Трансмембранный якорный участок на С-конце НА2 закрепляет НА в липидном слое, а пептид слияния на N-конце НА2, возникающий после расщепления НА на 2 субъединицы, обеспечивает слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. В вирусной частице гемагглютинин присутствует в виде триммера, собранного из трех одинаковых молекул [76].

Белок NP кодируется пятым сегментом генома. Он является основным компонентом рибонуклепротеинового комплекса. NP не имеет кластеров основных аминокислот, но многие его регионы способны связываться с РНК. Играет важную роль в контроле ядерно-цитоплазматического транспорта РНК. [9].

Шестой сегмент кодирует белок нейраминидазу, длина сегмента, как и длина белка, сильно варьируют у разных штаммов вируса гриппа А. Белок гликозилирован, как и НА, но не подвергается протеолетическому расщеплению. В вирионе белок представлен тетрамером, содержащим две пары молекул NA. В каждой паре молекулы NA соединены дисульфидной связью. В дистальной части тетрамера расположен активный центр NA. В тоже время у вируса гриппа В шестой сегмент кодирует белок, как NA, так и с -1 альтернативной рамки считывания, белок NB матрицы, и соответствует белку М2 вируса гриппа А [25].

Седьмой сегмент вируса гриппа А содержит 1027 н.о. Он кодирует белки М1 и М2. Белок М1 кодируется полноразмерной коллинеарной мРНК, комплементарной всей кодирующей части седьмого сегмента. Матричная РНК для белка М2 получается в результате сплайсинга, при котором вырезаются 689 н.о. У вируса гриппа В эту функцию выполняет белок ВМ2, он синтезируется не при трансляции сплайсированной мРНК, а за счет +2 альтернативной рамки считывания. Белок М1 имеет несколько гидрофобных участков. В вирионе он образует внутренний листок оболочки, подстилая липидный слой. Белок М2

образует тетрамер, в котором центральная трансмембранная часть формирует канал, служащий для транспорта ионов Н+ внутрь вирусной частицы [95].

Восьмой сегмент кодирует белки NS1 и NS2. Белок NS1 образуется в результате трансляции полноразмерной мРНК, не подвергнутой сплайсингу. Те молекулы мРНК, которые подвергаются сплайсингу, транслируются с образованием белка NS2, функция которого состоит в транспорте новосинтезированных нуклеокапсидов из клеточного ядра в цитоплазму [39,22].

Все данные по функциям белков вируса гриппа представлены в таблице 1. Для большинства белков установлены их функции. Но вместе с тем в последнее время представляет значительный интерес идентификация и изучение новых белков вируса гриппа, и как следствие более глубокое понимание их функций. Так в работе Muramoto с соавторами было показано, что сегмент РА кодирует не один, а целых четыре белка РА, РА-Х, PAN 155, PA-N182 [54]. Ген РВ1 помимо полимеразной субъединицы может кодировать еще два белка, PB1-F2 и РВ1 N40. PB1-F2 виропорин который вызывает образование пор в митохондриях и индуцирует апоптоз, а функция РВ1 N40 еще не выяснена [65].

Таблица 1. Белки, кодируемые отдельными сегментами генома вируса гриппа А

№ Сегмент генома Белок Функции белка Ссылка

1 РВ2 РВ2 Компонент полимеразного комплекса, связывание 5'-концеых кэпов мРНК и клеточных пре-мРНК, активация РА-зависимой эндонуклеазной активности. 59

2 РВ1 РВ1 Компонент транскриптазного комплекса, элонгация синтеза РНК, взаимодействие с РВ2 и РА. 10,15

РВ1-Р2 (виропорин) Виропорин - вызывает образование пор в митохондриях и индуцирует апоптоз. Фактор патогенности

3 РА РА Элонгация цепи, основной тип активности -эндонуклеазная, обладает также протеазной активностью. 59

4 НА НА Гемагглютинин. Распознавание и связывание с рецептором 103,52

5 ЫР ИР Нуклеопротеин. Основной компонент РНП, контроль ядерно-цитоплазматического транспорта РНК 59

6 ЫА ЫА Нейраминидаза. Отщепление остатков сиаловых кислот. 59

7 М М1 Образует внутренний листок оболочки, подстилая липидный слой, обеспечивает процессы самосборки вирусных частиц и их почкование. Оказывает влияние на морфологию вирионов 40

М2 Образует ионный канал - протонная помпа. Оказывает влияние на морфологию вирионов

8 N8 N81 Неструктурный белок, контролирует сплайсинг и полиаденилирование, ядерно-цитоплазматический транспорт, взаимодействие с клеточными белками 17,22,39

ЫЕР Контролирует ядерно-цитоплазматический транспорт мРНК.

1.1.3. Репликация вируса гриппа

Вирусы гриппа распознают И-ацетилнейраминовую кислоту на поверхности клетки-хозяина. Сиаловые кислоты - это девятиуглеродные кислые моносахариды, часто встречающиеся на концах многих гликоконъюгатов. Таким образом, они повсеместно присутствуют на многих типах клеток у многих видов животных. Второй углерод сиаловой кислоты может быть связан с углеродом в 3-й или 6-й позиции молекулы галактозы, образуя а-2-3 или а-2-6 связи, в результате формируется уникальная пространственная конфигурация сиаловой кислоты. Сиаловые кислоты распознаются и связываются шипами гемагтлютинина вируса гриппа, который специфически распознает либо а-2-3, либо а-2-6 связь. В человеческих эпителиальных клетках трахеи, преобладают а-2-6 связи, а а-2-3 связи более распространены в эпителии кишечника птиц. Следует отметить, что сиаловые кислоты с а-2-3 связью присутствуют и в клетках человеческого дыхательного эпителия, хотя и в меньшем количестве [16,52]. Следовательно, человек может быть заражен птичьим вирусом, хотя и с меньшей эффективностью, чем человеческим штаммом [20].

Инфекционный цикл начинается с контакта вирусной частицы с клеточной поверхностью. При этом рецепторсвязывающий карман НА связывает концевой остаток сиаловой кислоты в клеточном олигосахариде [76]. Вирусная частица, находящаяся на стенке эндосомы, подвергается воздействию кислой реакции среды, что приводит к структурной перестройке НА. Происходит слияние липидных слоев, и нуклеокапсид выходит в цитоплазму [29]. За время пребывания в эндосоме внутренняя среда вириона делается все более кислой, так как происходит перекачка ионов Н+ из эндосомы в вирион, осуществляемый через канал тетрамера М2. Закисление среды вызывает диссоциацию связи нуклеокапсида с белком М1 и позволяет нуклеокапсиду не только перейти в цитоплазму, но и транспортироваться в ядро клетки [61].

Каждый сегмент вирусной РНК оказывается в клеточном ядре, где вирусная РНК ассоциирована с белком ИР. Каждый рибонуклеопротеидный тяж содержит, по меньшей мере, один полимеразный комплекс, присоединенный к двум концам вирусной РНК. Элонгацию осуществляет белок РВ1 продвигаясь по нити геномной РНК от ее 3'- конца к 5'-концу.

Вирусспецифические мРНК транспортируются из ядра в цитоплазму. Некоторые мРНК подвергаются сплайсингу. В цитоплазме мРНК транслируются с образованием вирусных белков. Белок ОТ, белки полимеразного комплекса, N8, N82, частично белок М1 транспортируются в ядро. После достижения определенной концентрации в ядре белка ОТ, вирусный полимеразный комплекс приобретает способность синтезировать полноразмерные

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дубровина, Ирина Анатольевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Александрова Г. И., Климов А. И. Живая вакцина против гриппа //СанктПетербург: Наука. - 1994. - Т. 151. - С. 1.

2. Ахметов Л.З. Лабораторные и дикие грызуны. - Ташкент. - 1981.- 195 с.

3. Каверин Н. В., Смирнов Ю. А. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемий //Вопросы вирусологии. - 2003. - Т. 3. - С. 4-10.

4. Каркищенко H. Н., Грачева С. В. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях //М.: Профиль-2С. - 2010. -Т. 358.

5. Ларионова Н.В., и др. Живая гриппозная вакцина для детей и взрослых. Трансмиссивность вакцины в наблюдениях на детях 3-6 лет//Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы,- 2012. -№1.- С.25-29.

6. Bender С. et al. Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997-1998 //Virology. - 1999. - T. 254. - №. 1. - С. 115-123.

7. Bi Y. et al. Novel genetic reassortants in H9N2 influenza A viruses and their diverse pathogenicity to mice //Virol J. - 2011. - T. 8. - C. 505

8. Block S. L. et al. Shedding and immunogenicity of live attenuated influenza vaccine virus in subjects 5-49 years of age //Vaccine. - 2008. - T. 26. - №. 38. - C. 4940-4946.

9. Boulo S, Akarsu H, Ruigrok RW, Baudin F. Nuclear traffic of influenza virus proteins and ribonucleoprotein complexes//Virus Res. - 2007.-124(l-2).-P.12-21.

10. Chen W. et al. A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death //Nature medicine. - 2001. - T. 7. - №. 12. - C. 1306-1312.

11.Claas E. C. J. et al. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus //The Lancet. - 1998. - T. 351. - №. 9101. - C. 472-477

12. Cline T. D. et al. Increased pathogenicity of a reassortant 2009 pandemic H1N1 influenza virus containing an H5N1 hemagglutinin //Journal of virology. - 2011. - T. 85. - №. 23. - C. 12262-12270.

13. Cong Y. et al. Reassortant between human-Like H3N2 and avian H5 subtype influenza A viruses in pigs: a potential public health risk //PloS one. - 2010. - T. 5. - №. 9. - C. el2591.

14. Conenello G. M. et al. A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence //PLoS pathogens. - 2007. - T. 3. - №. 10. - C. el41.

15. Conenello G. M. et al. A single N66S mutation in the PB1-F2 protein of influenza A virus increases virulence by inhibiting the early interferon response in vivo //Journal of virology. -2011. - T. 85. -№. 2. - C. 652-662.

16. Couceiro J., Paulson J. C., Baum L. G. Influenza virus strains selectively recognize sialyloligosaccharides on human respiratory epithelium; the role of the host cell in selection of hemagglutinin receptor specificity //Virus research. - 1993. - T. 29. - №. 2. - C. 155-165.]

17. Dauber B., Heins G., Wolff T. The influenza B virus nonstructural NS1 protein is essential for efficient viral growth and antagonizes beta interferon induction //Journal of virology. -2004. - T. 78. - №. 4. - C. 1865-1872.

18. Donaldson L.J., Rutter P.D., Ellis B.M. et al. Mortality from pandemic A/H1N1 2009 influenza in England: public health surveillance study.// BMJ. - 2009. -V. 339. - №. - P. b5213.

19. Francis T., Stuart-Harris C. H. Studies on the nasal histology of epidemic influenza virus infection in the ferret iii. Histological and serological observations on ferrets receiving repeated inoculations of epidemic infuenza virus //The Journal of experimental medicine. -1938. - T. 68. - №. 6. - C. 813-830.

20. Gambotto A. et al. Human infection with highly pathogenic H5N1 influenza virus //The Lancet. - 2008. - T. 371. - №. 9622. - C. 1464-1475.

21. Gao Y. et al. Identification of amino acids in HA and PB2 critical for the transmission of H5N1 avian influenza viruses in a mammalian host //PLoS pathogens. - 2009. - T. 5. - №. 12.-C.e 1000709.

22. García-Sastre A. Inhibition of interferon-mediated antiviral responses by influenza A viruses and other negative-strand RNA viruses //Virology. - 2001. - T. 279. - №. 2. - C. 375-384.

23.Gustin K. M. et al. Influenza virus aerosol exposure and analytical system for ferrets //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2011. - T. 108. - №. 20. - C. 84328437.

24. Hatta M. et al. Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses //Science. - 2001. - T. 293. - №. 5536. - C. 1840-1842.

25. Hatta M., Kawaoka Y. The NB protein of influenza B virus is not necessary for virus replication in vitro //Journal of virology. - 2003. - T. 77. - №. 10. - C. 6050-6054.

26. Hay A. et al. Influenza activity-United States and worldwide, 1999-2000 season, and composition of the 2000-01 influenza vaccine //Morbidity and Mortality Weekly Report. -2000. - T. 49. -№. 17. - C. 375-381.

27. Holmes E. C. et al. Comment on" Large-Scale Sequence Analysis of Avian Influenza Isolates" //Science. - 2006. - T. 313. -№. 5793. - C. 1573-1573.

28. Horimoto T., Kawaoka Y. Pandemic threat posed by avian influenza A viruses //Clinical microbiology reviews. - 2001. - T. 14. - №. 1. - C. 129-149.

29. Huang Q. et al. Early steps of the conformational change of influenza virus hemagglutinin to a fusion active state: stability and energetics of the hemagglutinin //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. - 2003. - T. 1614. - №. 1. - C. 3-13.

30. Imai M. et al. Experimental adaptation of an influenza H5 HA confers respiratory droplet transmission to a reassortant H5 HA/H1N1 virus in ferrets //Nature. - 2012. - T. 486. - №. 7403.-C. 420-428.

31. Imai M. et al. Transmission of influenza A/H5N1 viruses in mammals //Virus research. -2013. http://dx.doi.Org/10.1016/i.virusres.2013.07.017

32. Krug, R. M., and R. A. Lamb. "Orthomyxoviridae: the viruses and their replication." Fields Virology (2001): 1487-1503.

33. Kandun I. N. et al. Three Indonesian clusters of H5N1 virus infection in 2005 //New England Journal of Medicine. - 2006. - T. 355. - №. 21. - C. 2186-2194.

34. Kilbourne E. D. The influenza viruses and influenza-an introduction //Kilbourne (ed.), The influenza viruses and influenza. Academic Press, Inc., New York. - 1975. - C. 1-13.

35. Kim J. K. et al. Ducks: the "Trojan horses" of H5N1 influenza //Influenza and other respiratory viruses. - 2009. - T. 3. - №. 4. - C. 121-128.

36. Kiseleva I. et al. Cell-based assay for the determination of temperature sensitive and cold adapted phenotypes of influenza viruses //Journal of virological methods. - 2004. - T. 116.-№. l.-C. 71-78.

37. Klimov A. I. et al. Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A/Leningrad/134/57 (H2N2) virus //Virology. - 1992. - T. 186. - №. 2. - C. 795-797.

38. Klimov A. I. et al. Genes coding for polymerase proteins are essential for attenuation of the cold-adapted A/Leningrad. - 2001

39. Kochs G, Garcia-Sastre A, Martinez-Sobrido L. Multiple anti-interferon actions of the influenza A virus NS1 protein. J Virol. 2007 Jul; 81(13):7011-21.

40. Lamb R. A., Lai C. J., Choppin P. W. Sequences of mRNAs derived from genome RNA segment 7 of influenza virus: colinear and interrupted mRNAs code for overlapping proteins //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1981. - T. 78. - №. 7. - C. 4170-4174.

41. Li C. et al. Reassortment between avian H5N1 and human H3N2 influenza viruses creates hybrid viruses with substantial virulence //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2010. - T. 107. - №. 10. - C. 4687-4692.

42. Li Z. et al. Molecular basis of replication of duck H5N1 influenza viruses in a mammalian mouse model //Journal of virology. - 2005. - T. 79. - №. 18. - C. 12058-12064.

43. Lipatov A. S. et al. Pathogenesis of Hong Kong H5N1 influenza virus NS gene reassortants in mice: the role of cytokines and B-and T-cell responses //Journal of general virology. - 2005. -T. 86. - №. 4. - C. 1121-1130.

44. Liu J. et al. Highly pathogenic H5N1 influenza virus infection in migratory birds //Science. -2005. - T. 309. - №. 5738. - C. 1206-1206.

45. Louie J.K., Acosta M., Winter K. et al. Factors associated with death or hospitalization due to pandemic 2009 influenza A(H1N1) infection in California.// JAMA. - 2009. -V. 302. - № 17.-P. 1896-1902.

46. Lowen A. C. et al. The guinea pig as a transmission model for human influenza viruses //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2006. - T. 103. - №. 26. - C. 99889992.

47. Lowen, A.C. et al. Blocking inter-host transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model//J. Virol.-2009-83.-P.2803-2818.

48. Lowen A. C. et al. Blocking inter-host transmission of influenza virus by vaccination in the guinea pig model //J Virol. - T. 19153237. - C. 39. 2803-2818.

49. Maines T. R. et al. Lack of transmission of H5N1 avian-human reassortant influenza viruses in a ferret model //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2006. - T. 103. - №. 32.-C. 12121-12126.

50. Mallory R. M., Yi T., Ambrose C. S. Shedding of Ann Arbor strain live attenuated influenza vaccine virus in children 6-59 months of age //Vaccine. - 2011. - T. 29. - №. 26. - C. 43224327.

51. Matrosovich M., Gao P., Kawaoka Y. Molecular mechanisms of serum resistance of human influenza H3N2 virus and their involvement in virus adaptation in a new host //Journal of virology. - 1998. - T. 72. - №. 8. - C. 6373-6380.

52. Matrosovich M. N. et al. Human and avian influenza viruses target different cell types in cultures of human airway epithelium //Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2004. - T. 101. - №. 13. - C. 4620-4624.

53. Mehle A., Doudna J. A. Adaptive strategies of the influenza virus polymerase for replication in humans //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - T. 106. - №. 50. -C. 21312-21316.

54. Muramoto Y, Noda T, Kawakami E, Akkina R, Kawaoka Y. Identification of novel influenza A virus proteins translated from PA mRNA//J Virol.-2013.- 87(5).-P.2455-2462.

55. Murphy B. R. Use of live attenuated cold-adapted influenza A reassortant virus vaccines in infants, children, young adults, and elderly adults //Infectious Diseases in Clinical Practice. -1993.-T. 2. -№. 3. - C. 174-181.

56. Nayak D. P. et al. Influenza virus morphogenesis and budding //Virus research. - 2009. - T. 143.-№. 2.-C. 147-161.

57. Nichol K. L., Treanor J. J. Vaccines for seasonal and pandemic influenza //Journal of Infectious Diseases. - 2006. - T. 194. - №. Supplement 2. - C. SI 11-S118.

58. Nicholls J. M. et al. Tropism of avian influenza A (H5N1) in the upper and lower respiratory tract //Nature medicine. - 2007. - T. 13. - №. 2. - C. 147-149.

59. Palese, P.; Shaw, ML. Orthomyxoviridae: The Viruses and their Replication. In: Knipe, DM. Howley, PM., editors. Fields Virology. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins; 2007.

60. Parks C. L. et al. Phenotypic properties resulting from directed gene segment reassortment between wild-type A/Sydney/5/97 influenza virus and the live attenuated vaccine strain //Virology. - 2007. - T. 367. - №. 2. - C. 275-287.

61. Pinto L. H., Lamb R. A. The M2 proton channels of influenza A and B viruses //Journal of Biological Chemistry. - 2006. - T. 281. - №. 14. - C. 8997-9000.

62. Rudenko L. G. et al. The inoculation properties of live recombinant influenza vaccine types A and B used separately and jointly in children 3 to 14] //Voprosy virusologii. - 1991. - T. 36. -№. 6.-C. 472.

63. Rudenko L. G. et al. Clinical and epidemiological evaluation of a live, cold-adapted influenza vaccine for 3-14-year-olds //Bulletin of the World Health Organization. - 1996. - T. 74. - №. l.-C. 77.

64. Scholtissek C. Stability of infectious influenza A viruses to treatment at low pH and heating //Archives of virology. - 1985. - T. 85. - №. 1-2. - C. 1-11.

65. Schrauwen E. J. A., M. de Graaf, S. Herfst, G. F. Rimmelzwaan, A. D. M. E. Osterhaus, R. A. M. Fouchier Determinants of virulence of influenza A virus// Eur J Clin Microbiol Infect Dis.-2013.

66. Schulman J. L., Kilbourne E. D. Airborne transmission of influenza virus infection in mice.-1962.-P.1129-1130.

67. Schulman J. L., Kilbourne E. D. Experimental transmission of influenza virus infection in mice I. The period of transmissibility //The Journal of Experimental Medicine. - 1963. - T. 118.-№. 2.-C. 257-266.

68. Schulman J. L., Kilbourne E. D. Experimental transmission of influenza virus infection in mice ii. Some factors affecting the incidence of transmitted infection //The Journal of experimental medicine. - 1963. - T. 118. - №. 2. - C. 267-275.

69. Schulman J. L. Experimental transmission of influenza virus infection in mice iv. Relationship of transmissibility of different strains of virus and recovery of airborne virus in the environment of infector mice IIThe Journal of experimental medicine. - 1967. - T. 125. -№. 3. - C. 479-488.

70. Schulman J. L. Experimental transmission of influenza virus infection in mice iii. Differing effects of immunity induced by infection and by inactivated influenza virus vaccine on transmission on infection //The Journal of experimental medicine. - 1967. - T. 125. - №. 3. -C. 467-478.

71. Schulman J. L. The use of an animal model to study transmission of influenza virus infection //American Journal of Public Health and the Nations Health. - 1968. - T. 58. - №. 11. - C. 2092-2096.

72. Schulman J. L. Effects of immunity on transmission of influenza: experimental studies //Progress in medical virology. Fortschritte der medizinischen Virusforschung. Progres en virologie medicale. - 1969. - T. 12. - C. 128-160.

73. Shinya K. et al. Avian flu: influenza virus receptors in the human airway //Nature. - 2006. -T. 440. - №. 7083. - C. 435-436.

74. Shope R. E. Swine influenza III. Filtration experiments and etiology //The Journal of experimental medicine. - 1931. - T. 54. - №. 3. - C. 373-385.

75. Simonsen L. The global impact of influenza on morbidity and mortality //Vaccine. - 1999. -T. 17.-C. S3-S10.

76. Skehel J. J., Wiley D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin //Annual review of biochemistry. - 2000. - T. 69. - №. 1. - C. 531-569.

77. Steel J. et al. Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N //PLoS pathogens. - 2009. - T. 5. - №. 1. - C. e 1000252.

78. Steinhauer D. A. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus //Virology. - 1999. - T. 258. - №. 1. - C. 1-20

79. Subbarao E. K., London W., Murphy B. R. A single amino acid in the PB2 gene of influenza A virus is a determinant of host range //Journal of virology. - 1993. - T. 67. - №. 4. - C. 1761-1764.

80. Talbot T. R. et al. Duration of virus shedding after trivalent intranasal live attenuated influenza vaccination in adults //Infection control and hospital epidemiology. - 2005. - T. 26. -№. 5.-C. 494-500.

81. Taubenberger J. K., Layne S. P. Diagnosis of influenza virus: coming to grips with the molecular era //Molecular diagnosis. - 2001. - T. 6. - №. 4. - C. 291-305.

82. Taubenberger J. K., Morens D. M. 1918 Influenza: the mother of all pandemics //Rev Biomed. - 2006. - T. 17. - C. 69-79.

83. Taubenberger J. K., Morens D. M. The pathology of influenza virus infections //Annual review of pathology. - 2008. - T. 3. - C. 499.

84. Taubenberger J. K., Morens D. M. Pandemic influenza-including a risk assessment of H5N1 //Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics). - 2009. - T. 28. - №. 1.

- C. 187.

85. Thompson W. W. et al. Mortality associated with influenza and respiratory syncytial virus in the United States //JAMA: the journal of the American Medical Association. - 2003. - T. 289.-№. 2.-C. 179-186.

86. Travis W. D. Non-neoplastic disorders of the lower respiratory tract. - Amer Registry of Pathology, 2002. - T. 2.

87. Ungchusak K. et al. Probable person-to-person transmission of avian influenza A (H5N1) //New England Journal of Medicine. - 2005. - T. 352. - №. 4. - C. 333-340.

88. Van Hoeven N. et al. Human HA and polymerase subunit PB2 proteins confer transmission of an avian influenza virus through the air //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - T. 106. - №. 9. - C. 3366-3371.

89. Van Kerkhove M. D. et al. Highly Pathogenic Avian Influenza (H5N1): Pathways of Exposure at the Animal-Human Interface, a Systematic Review //PLoS One. - 2011. - T. 6. -№. l.-C.e 14582.

90. Van Riel D. et al. H5N1 virus attachment to lower respiratory tract //Science. - 2006. - T. 312. -№. 5772. - C. 399-399.

91.Varga Z. T. et al. The influenza virus protein PB1-F2 inhibits the induction of type I interferon at the level of the MAVS adaptor protein //PLoS pathogens. - 2011. - T. 7. - №. 6.

- C. e1002067.

92. Vesikari T. et al. A randomized, double-blind study of the safety, transmissibility and phenotypic and genotypic stability of cold-adapted influenza virus vaccine //The Pediatric infectious disease journal. - 2006. - T. 25. - №. 7. - C. 590-595.

93. Vesikari T. et al. Safety and tolerability of cold-adapted influenza vaccine, trivalent, in infants younger than 6 months of age //Pediatrics. - 2008. - T. 121. - №. 3. - C. e568-e573.

94. Wang H. et al. Probable limited person-to-person transmission of highly pathogenic avian influenza A (H5N1) virus in China IIThe Lancet. - 2008. - T. 371. - №. 9622. - C. 14271434.

95. Webster R. G. et al. Evolution and ecology of influenza A viruses //Microbiological reviews. - 1992. - T. 56. - №. 1. - C. 152-179.

96. World Health Organization (WHO) URL http://www.who.int/influenza/vaccines/en/ (28.10.2013).

97. WHO. Global alert and response (GAR). Confirmed Human Cases of Avian Influenza A(H5N1) URL http://www.who.int/topics/avian influenza/en/ (28.10.2013).

98. World Health Organization et al. Cumulative number of confirmed human cases of avian influenza A/(H5N1) reported to WHO. - 2008.

99. Wright, PF.; Neumann, G.; Kawaoka, Y. Orthomyxoviruses. In: Knipe, DM.; Howley, PM., editors. Fields Virology. Williams & Wilkins; Philadelphia, Lippincott: 2007. p. 1691-1740.

100. Yamada S. et al. Biological and structural characterization of a host-adapting amino acid in influenza virus //PLoS pathogens. - 2010. - T. 6. - №. 8. - C. el001034.

101. Ye J., Sorrell E.M., Cai Y. et al. Variations in the hemagglutinin of the 2009 H1N1 pandemic virus: potential for strains with altered virulence phenotype? // PLoS Pathog. -2010. -V. 6. - № 10. - P. elOOl 145.

102. Zitzow L. A. et al. Pathogenesis of avian influenza A (H5N1) viruses in ferrets //Journal of virology. - 2002. - T. 76. - №. 9. - C. 4420-4429.

103. Zebedee S. L., Lamb R. A. Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions //Journal of virology. - 1988. - T. 62. -№. 8. - C. 2762-2772.

104. Zhang Y. et al. H5N1 hybrid viruses bearing 2009/H1N1 virus genes transmit in guinea pigs by respiratory droplet //Science. - 2013. - T. 340. - №. 6139. - C. 1459-1463.

105. Zhou N. N. et al. Genetic reassortment of avian, swine, and human influenza A viruses in American pigs //Journal of virology. - 1999. - T. 73. - №. 10. - C. 8851-8856.

106. Tumpey Т. M. et al. A two-amino acid change in the hemagglutinin of the 1918 influenza virus abolishes transmission //Science. - 2007. - T. 315. - №. 5812. - C. 655-659.

107. O'Hagan D. T. et al. MF59 adjuvant: the best insurance against influenza strain diversity //Expert review of vaccines. - 2011. - T. 10. - №. 4. - C. 447-462.

108. Reed L. J., Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints //American Journal of Epidemiology. - 1938. - T. 27. - №. 3. - C. 493-497.