Оптимизация приемов микроразмножения и сохранения лимона in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Самарина, Лидия Сергеевна

• Самарина, Лидия Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Самарина, Лидия Сергеевна

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ ЦИТРУСОВЫХ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ

1.1. Основные биологические особенности цитрусовых культур

1.2. Культура тканей, как основной инструмент биотехнологии цитрусовых

1.2.1. Проблема контаминации на этапе введения в культуру

1.2.2. Регенерация и микроразмножение эксплантов цитрусовых

1.2.3. Процедура сохранения гермоплазмы цитрусовых in vitro

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ СТЕРИЛЬНОЙ КУЛЬТУРЫ И ПРЯМОЙ ОРГАНОГЕНЕЗ ПОЧЕК ЛИМОНА

3.1. Эффективность стерилизации пазушных почек лимона

3.2. Особенности органогенеза лимона из пазушных почек и путем микропрививки

ГЛАВА 4. КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ ЛИМОНА

4.1. Влияние минеральной основы питательной среды и регуляторов роста на размножение побегов из почек лимона

4.2. Микропрививка как способ физиологического омоложения и размножения лимона

ГЛАВА 5. ОСОБЕННОСТИ СОХРАНЕНИЯ МИКРОПОБЕГОВ ЛИМОНА IN VITRO

5.1. Оптимизация режимов и условий хранения in vitro

5.2. ISSR-маркирование для определения генетической стабильности лимона в процессе хранения in vitro

ГЛАВА 6. УКОРЕНЕНИЕ И АДАПТАЦИЯ ПОБЕГОВ К НЕСТЕРИЛЬНЫМ УСЛОВИЯМ

Заключение

Рекомендации для практического применения

Выводы

Список литературы

ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация приемов микроразмножения и сохранения лимона in vitro»

ВВЕДЕНИЕ

Цитрусовые культуры занимают третье место в мире по распространению среди плодовых культур, и основными странами-производителями являются США, Япония, Испания, Италия и другие, с теплым влажным климатом (FAO, 2009). Кроме своей высокой пищевой ценности, они получили широкое применение в парфюмерной, косметологической, фармацевтической промышленностях, а также известны как высокодекоративные растения. Цитрусовое дерево является настоящим украшением интерьера: декоративные плоды и ароматные цветы появляются одновременно, круглый год в кроне из вечнозелёных кожистых листьев со специфическим запахом эфирных масел. В России наиболее популярна в озеленении комнатная культура лимона. Известными сортами являются Павловский лимон, Майкопский, Новоафонский и лимон Мейера. Лимон (Citrus limon (L.) Burm.) — один из наиболее ценных видов рода Citrus. О диетических и лечебных свойствах лимонов, было известно в арабских странах уже в 13 веке. Их с успехом применяли при лечении ран, легочных заболеваний, цинге и др. Из лепестков цветков, листьев и кожуры плодов добывают эфирное масло, используемое в кондитерском производстве, парфюмерии и медицине.

В благоприятных условиях растения лимона могут цвести круглый год и, благодаря высокой декоративности, с успехом используются для внутреннего озеленения и как комнатная культура.

Наилучшие места для произрастания цитрусовых - тропические и субтропические территории, расположенные на широте 40 градусов по обе стороны экватора, где температура преимущественно выше 0 °С. Среди субтропических районов земного шара особое место принадлежит субтропикам Краснодарского края, которые по своему географическому положению (43-44° с. ш.) являются самой северной зоной по выращиванию

цитрусовых. Опыт промышленного цитрусоводства первой половины XX века и экспериментальные посадки этих культур в 1980-1990-х годах показывают, что промышленная культура цитрусовых в субтропиках России может быть экономически рентабельной (Трубачев В.В., http://www.Hmon-citron.ru). В благоприятные по климатическим условиям годы местные хозяйства получали высокие урожаи мандаринов - от 200 до 350 ц/га. Сравнительно высокими были и урожаи лимонов.

В результате многолетних исследований по возделыванию и селекции цитрусовых на базе ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии создана коллекция, в которой собраны все виды рода Citrus, имеющие важнейшее экономическое значение - всего более 120 таксонов (Зорин, Лаврийчук, 1964; Фогель, 2008; Кулян, 2012). Следует отметить, что Черноморское побережье России является зоной рискованного цитрусоводства, так как периодически повторяющиеся холодные зимы представляют собой угрозу для промышленных посадок. В связи с этим, главными направлениями цитрусоводства в нашей стране является получение новых сортов, устойчивых к низким температурам и биотическим факторам.

Традиционные методы селекции цитрусовых малоэффективны в связи с биологическими особенностями этих культур: полиэмбриония, длительный ювенильный период, стерильность пыльцы и семяпочек. Современные методы биотехнологии позволяют преодолеть эти проблемы и открывают возможности для получения сортов нового поколения. Для осуществления этих приемов необходимы эффективные протоколы регенерации, микроразмножения и депонирования in vitro (Malaurie, 1998; Marin, Duran Villa, 1999; Negash et al., 2001 и др.).

Абсолютное большинство зарубежных протоколов микроразмножения и сохранения цитрусовых in vitro выполнены на сеянцах (Barlaas, Skene, 1982; Marin, Duran Villa, 1999; Chaturvedi et al., 2002; Avenido et al., 2004; Jajoo, 2009; Benabdesselam, 2011; Chen, 2012 и др.). При этом способе

сохранения сортовые особенности утрачиваются и растения зацветают через 5-10 и более лет. В этой связи актуальным является вопрос разработки и оптимизации надежных приемов сохранения взрослых (неювенильных) тканей, а также изучение органогенного потенциала различных типов эксплантов в условиях in vitro на примере С. limon для сохранения геноресурсов и использования их в селекционных целях.

Объекты исследований: Citrus limon (L.) Burm., сорта: Новоафонский, Ударник, Бесколючий; Citrus х meyeri лимон Мейера коллекции ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии.

Цель исследований: оптимизировать приемы микроразмножения и сохранения лимона in vitro для создания депонированной коллекции и дальнейшего использования ее в селекционной работе. Задачи исследований:

1. Определить эффективный способ стерилизации побегов. Выявить возможные пути прямого морфогенеза эксплантов лимона in vitro.

2. Оптимизировать минеральную основу питательной среды и гормональный состав для микроразмножения лимона.

3. Установить оптимальный режим хранения микропобегов лимона in vitro.

4. Оценить эффективность ISSR-праймеров для определения генетической стабильности сортов в процессе хранения лимона in vitro.

5. Разработать протокол поддержания депонированной коллекции лимона в культуре тканей.

Новизна исследований. Впервые установлена возможность использования техники микропрививки для повышения жизнеспособности и коэффициента размножения микропобегов. Модифицирована минеральная основа питательной среды для размножения. Определены оптимальные сроки и условия среднесрочной консервации микропобегов. Для определения жизнеспособности растений при хранении лимона in vitro впервые использован метод медленной индукции флуоресценции хлорофилла.

Впервые с помощью ISSR праймеров проведена оценка полиморфизма изученных сортов лимона.

Практическая значимость. Оптимизация приемов клонального микроразмножения цитрусовых позволит создать и поддерживать резервную коллекцию, сохранить на небольших производственных площадях накопленный генофонд для дальнейшего использования в селекционных и практических целях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Микропрививка - как способ омоложения эксплантов от взрослых растений лимона;

2. Условия культивирования и составы питательных сред на всех этапах — от введения in vitro до адаптации ex vitro;

3. Оптимизированы приемы клонального микроразмножения и среднесрочного хранения микропобегов лимона in vitro.

Апробация работы и публикация результатов исследований. Результаты исследований докладывались и обсуждались на ежегодных отчетных сессиях ГНУ ВНИИЦиСК Россельхозакадемии, Сочи, 2009 - 2012 гг., на конференции «Научное обеспечение АПК», Краснодар, 2011 г., на летней школе молодых ученых «AgroBioTech», Москва, 2012, на Всероссийской выставке «Золотая Осень», Москва, 2011 г., на конкурсе научно-исследовательских проектов молодых ученых «AllTech Young Scientist», 2012 г., конкурсе инновационных проектов молодых ученых «У.М.Н.И.К.», Краснодар, 2011 г. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них чытыре - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах печатного текста, состоит из введения, 6 глав, рекомендаций для практического применения, выводов и 6 приложений. Работа содержит 18 таблиц, 35 рисунков. Список литературы включает 218 источников, в том числе 185 на иностранных языках.

ГЛАВА 1. КУЛЬТУРА ТКАНЕЙ ЦИТРУСОВЫХ: ПРОБЛЕМЫ И

ПЕРСПЕКТИВЫ

1.1. Основные биологические особенности цитрусовых культур

Род Citrus L. принадлежит к семейству рутовых (Rutaceae), подсемейству померанцевых (Aurantioidae) и состоит в близком родстве с другими важными родами - Fortunella, Poncirus, Microcitrus, Eremocitrus (всего 140 родов и 1300 видов по всему миру) (Singh, Rajam, 2009). Цитрусовые культуры занимают третье место в мире по распространению среди плодовых культур и их ежегодное производство составляет более 200 миллионов тонн, а площадь под насаждениями более 7,2 млн га (FAO, 2009). Бразилия и США являются мировыми лидерами по производству плодов и обеспечивают 42 % всей мировой потребности. Другие крупнейшие цитрусопроизводящие страны это Испания, Италия, Египет, Мексика, Китай, Индия.

Центрами видового разнообразия цитрусовых являются Китай и юго-восточная Азия, где эти плодовые растения культивируются уже более 4000 лет. Цитрусовые культуры произрастают в более ста странах мира и предпочитают тропический и субтропический климат. Жизненная форма -вечнозеленые кустовидные деревья, очень чувствительные к изменению температуры, особенно в моменты активного роста и созревания плодов, критическими температурами являются -8-10 °С. В следующем ряду приведена морозоустойчивость от наименьшей до наибольшей: цитрон, лайм, лимон, грейпфрут, сладкий апельсин, танжерин (и его гибриды), кислый апельсин, кумкват (кинкан), понцирус трехлисточковый (и его гибриды) (Saunt, 1990; Singh, Rajam, 2009).

На Черноморском побережье России главным лимитирующим фактор возделывании цитрусовых являются отрицательные температуры. В связи с этим, основное направление агротехники цитрусовых в этой зоне -разработка систем укрытий и повышение морозостойкости растений.

Многолетние исследования, предпринятые с целью получения новых морозоустойчивых сортов, так и не привели к получению устойчивых генотипов ни у одного из видов цитрусовых (Mauk, Shea, 1994; Singh, Rajam, 2009, Febres et al., 2011).

Традиционная селекция цитрусовых в мире практикуется много десятилетий, и непреодолимыми препятствиями для нее являются высокая гетерозиготность, стерильность пыльцы/семяпочек, долгий ювенильный период (8-15 и более лет), нуцеллярная полиэмбриония и апомиксис (Koltunow, 1995). Далее более подробно рассмотрим эти особенности.

Все виды цитрусовых культур в генетическом отношении очень близки между собой и, как правило, имеют одинаковое (2п =18) число хромосом, что обусловливает легкое переопыление и возникновение межвидовых гибридов. Многовековое переопыление между этими гибридами способствовало появлению большого количества новых генотипов -организмов с определенными унаследованными качествами (http://gryadka.net/).

Высокая степень спонтанной гибридизации между различными таксонами, и, как следствие, высокая гетерозиготность семян цитрусовых создают проблемы для селекционеров. При этом в гибридах чаще всего проявляются отрицательные признаки родителей, которые носят доминантный характер наследования (Febres et al., 2011). Данная биологическая особенность послужила главной причиной того, что до сих пор нет общепринятой всеми неоспоримой таксономической системы цитрусовых, т.к. сложно определить происхождение многих таксонов. Еще одной причиной путаницы в их таксономической системе является высокая подверженность почковым мутациям, образование химер и соматических гибридов. Некоторые авторы предлагают интересное объяснение последнему, утверждая, что в результате прочного симбиоза растения с грибами, мицелий гриба, обитая в сосудистых тканях деревьев цитрусовых,

вырабатывает токсины, которые могут влиять на митотические деления в почках цитрусовых на молекулярном уровне, приводя к возникновению почковых мутаций (Керкадзе, Трапаидзе, 1982).

Другой характерной особенностью многих ценных промышленных видов цитрусовых является стерильность пыльцы и семяпочек. Высокая степень стерильности наряду с партенокарпией необходима для производства бессемянных плодов. Однако для получения гибридов эта особенность является нежелательным признаком и затрудняет селекцию.

Следующая особенность рода Citrus это полиэмбриония. Она подразделяется на 2 типа: гаметофитная и спорофитная. Гаметофитная полиэмбриония включает апогаметы и апоспоры, тогда как спорофитная заключается в образовании зародышей из тканей нуцеллуса, интегумента, делением зиготы или из эндосперма (Cameron, Gaber, 1968; Batygina, Vinogradova, 2007). За исключением последних двух, эти различные формы полиэмбрионии связаны с апомиксисом и определяются как неполовое размножение семенами (Savidan et al., 2003).

Нуцеллярная эмбриония является препятствием в селекции привоя. Когда берется материнское растение с этой чертой, селекционеру приходится затратить много материальных и трудовых ресурсов, чтобы получить популяцию, что связано с продолжительным ювенильным периодом, который может длиться от 5 до 15 лет в зависимости от вида. В то же время, нуцеллярная эмбриония рассматривается как важная характеристика для производства подвоев, поэтому селекционеры при подборе подвоев выбирают родителей, которые дают высокий процент нуцеллярных семян и мало половых зародышей.

Перечисленные здесь биологические особенности цитрусовых культур часто являются препятствиями для селекции. Преодолеть эти проблемы возможно биотехнологическими приемами, в основе которых лежит метод культуры тканей, позволяющий размножать и сохранять ценные генотипы in

vitro. Биотехнологические исследования на цитрусовых культурах ведутся в мире уже более 60 лет и за это время достигнуты высокие результаты: получены новые сорта методами генетической трансформации, соматической гибридизации, расшифрованы геномы некоторых видов, выделены целевые гены. Однако, до настоящего времени имеется масса нерешенных проблем не только в генетической трансформации, но и в области регенерации и культивирования тканей некоторых видов и сортов цитрусовых.

1.2. Культура тканей, как основной инструмент биотехнологии

цитрусовых

Культура растительных тканей включает в себя набор приемов, методов и стратегий in vitro, которые входят в группу технологий под общим названием биотехнология растений. Культура тканей используется для микроразмножения и оздоровления посадочного материала, повышения разнообразия гермоплазмы, являясь инструментом в помощь селекционерам. В настоящее время протоколы культуры тканей разработаны для большинства сельскохозяйственных видов, хотя оптимизация их все еще требуется для многих видов, особенно древесных растений. Методы культивирования тканей в сочетании с молекулярными методами с успехом используются для получения растений с заданными признаками путем переноса целевых генов. Методы культуры протопластов, пыльников, микроспор, семяпочек и зародышей используются для создания новых генетических форм, как правило, путем получения гаплоидов. С помощью культуры клеток также получают сомаклональные и гаметоклональные вариации с высоким селекционным потенциалом. Культивирование единичных клеток и меристем применяют для устранения патогенов из растительного материала, тем самым значительно повышается урожайность имеющихся сортов (Brown et al., 1995).

Промышленные лаборатории культуры тканей за рубежом обеспечивают миллионами растений рынок декоративных и

сельскохозяйственных растений. Например, во Франции 94 % всей продукции цветочных культур получают этим методом. В США около 100 коммерческих предприятий получают посадочный материал декоративных, овощных, полевых, плодовых и лесных культур методом клонального микроразмножения (www.botanicblog.ru). В нашей стране намечается тенденция к расширению этого направления.

Применение биотехнологических приемов для размножения, селекции и сохранении цитрусовых за рубежом основывается на культуре тканей. Первые попытки культивирования цитрусовых in vitro в мире относятся к 1960-м годам (Murashige, Tucker, 1969). В нашей стране первые исследования в этой области были предприняты Р.Г. Бутенко и JI.H. Шенгелия в 1980-х годах (Шенгелия, Бутенко, 1983). До настоящего времени исследования по оптимизации условий микроразмножения цитрусовых не прекращаются, о чем свидетельствует множество зарубежных работ в разных странах, а более всего в Пакистане, Италии, Индии, Бразилии, США, Египте и других (Singh et al., 2003; Chiancone et al., 2006; Shibli et al., 2006; Aleza et al., 2010; Samanhudi et al., 2010; Benabdesselam et al., 2011; Kumar et al., 2012).

С появлением и развитием трансгенных техник стало возможным придавать новые характеристики растительному геному, однако для эффективности регенерации трансформированных растений важным является усовершенствование протоколов культивирования тканей, т.к. для древесных многолетних растений получить стерильную культуру и размножить микропобеги удается не всегда легко. Кроме того, если речь идет о сохранении коллекций ценных генотипов, важным вопросом является генетическая стабильность сохраняемых форм. В этом случае наиболее надежными эксплантами считаются вегетативные почки. Однако известно, что эти экспланты при введении в культуру характеризуются высоким процентом контаминации in vitro, медленной регенерацией и низкими

коэффициентами размножения (Citrus genetics..., 2008). В связи с этим, стерилизации эксплантов древесных растений уделяется большое внимание.

1.2.1. Проблема контаминации на этапе введения в культуру

Этап введения в стерильную культуру вегетативных почек древесных многолетних растений, в том числе цитрусовых, сопряжен с такими трудностями, как высокий процент контаминации in vitro, задержка регенерации и появление вторично-инфицированных микропобегов.

Контаминация in vitro — одна из главных серьезных проблем в производственных лабораториях за рубежом, особенно когда источником эксплантов являются растущие в условиях открытого грунта растения (Niedz, Bausher, 2002). Многие авторы, занимающиеся культивированием древесных растений in vitro, сталкивались с этой проблемой (Baruah, et al., 1996; Al-Khayri, Al-Bahrany, 2001; Rahman et al., 2004).

Существует несколько типов контаминантов - различные грибы, бактерии, вирусы и другие микроорганизмы. Среди них грибы являются наиболее распространенными контаминантами в культуре тканей, в том числе и у цитрусовых (Керкадзе, Трапаидзе, 1982; Niedz, Bausher, 2002).

Грибное заражение in vitro может быть эндогенным, неизвестного происхождения или эндофитным (Herman, 1990). Эндофитные заражения сложнее всего устранить. Известно, что множество эндофитов являются полезными для роста растений ex vitro, но они же являются и контаминантами в питательной среде. М. L. Heiander с коллегами (1996) сообщали, что мутуализм между эндофитом и растением-хозяином зависит, главным образом, от условий выращивания растений. В субтропическом климате, где и произрастают цитрусовые, грибная контаминация очень характерна по причине наличия высоких температур и влажности. Условия культивирования in vitro также способствуют распространению грибной инфекции.

Когда растение подвергается стрессу, мутуализм разрушается. Эндофитные грибы, в обычных условиях находящиеся в симбиозе с растением, могут быть токсичными для растения, когда оно подвергается стрессу, например, когда утончается клеточная стенка при неблагоприятных условиях культивирования in vitro (Darworth, 1996). Производимые грибами фитотоксины (оксалат, афлотоксин и др.) замедляют и останавливают морфогенез эксплантов in vitro. Для преодоления проблемы грибной контаминации используют фунгициды, такие как:

- Бепомил - фунгицид, действует как ингибитор размножения;

- Формальдегид - фунгицид широкого действия, убивает споры;

- Гипохлорит натрия и калымя — окисляющие агенты, убивают широкий спектр патогенов;

- Типол - детергент, помогает удалению загрязнений;

- Сулема - хлорид ртути — ядовитое вещество широкого спектра;

- Оксихлорид меди — фунгицид и стерилизатор;

- Нистатин, тетрациклин - антибиотики против грибов и дрожжей, нарушают синтез белка в микробной клетке (Mngomba et al., 2012).

В некоторых работах вместо гипохлорита натрия использовали 10 % Доместос для стерилизации эксплантов грецкого ореха (Payghamzadeh, 2011), и яблони (Duron, 1985) и др. Основное действующее вещество его -гипохлорит натрия, и преимуществом этого средства является наличие детергента, таким образом, не требуется добавлять его отдельно. Стерилизующие вещества часто используются в комбинациях для повышения эффективности стерилизации. Например, несколько капель детергента Твин 20 или Типол часто добавляют в стерилизующий раствор. Проникновение фунгицида также можно усилить полосканием и встряхиванием эксплантов в растворе (Mngomba et al., 2012).

Считается, что успех получения асептической культуры зависит от источника используемых маточных растений. Взрослые растения больше

заражены спорами и грибными патогенами, однако большая часть исследований проводится именно на взрослых, плодоносящих растениях. Для получения асептических культур от таких растений требуется прекультивирование их перед созданием маточной коллекции (Niedz, Bausher, 2002).

Многие авторы указывают на проблему контаминации при введении в культуру тканей различных видов растений (Geier et al., 1977; Altaf, 2006; Chen, Yeh, 2007; LaPatra et al., 2008). Так, например, W.L. Chen и D.M. Yeh (2007) сообщали о проблемах при введении в культуру тканей растений рода Aglaonema. Наилучший результат для введения в культуру Aglaonema и Philodendron отмечался при добавлении в среду 200 мг/л стрептомицина. По их данным предварительная обработка стрептомицином является более эффективной, чем добавление его в питательную среду. Они показали, что введение антибиотиков в стерильную дистиллированную воду, а не в питательную среду, ограничивает рост бактерий в большей степени, т.к. в среде есть питательные вещества, стимулирующие их рост.

Антибиотики играют важную роль в получении асептической культуры. Было установлено, что применение одних только фунгицидов приводит к пролиферации других микроорганизмов in vitro - дрожжей, бактерий, протей (www.phytotechlab.com). Обычно в культуре тканей применяют антибиотики широкого спектра действия. Например, применение тетрациклина и доксициклина было эффективно для преодоления контаминации эксплантов пазушных почек взрослых растений чая (Иддагода и др., 1990).

Водный стресс может ингибировать рост грибов в сосудистой ткани растений (Coleman et al., 1989). Маточные растения Aglaonema предварительно содержались без полива 2 месяца, в результате чего рост патогенной флоры снижался (Chen, Yeh, 2007). Авторы указывают две возможные причины: либо грибная инфекция не может размножаться при

водном стрессе, либо сосудистые ткани эксплантов после водного стресса абсорбируют стерилизующие растворы, которые проникают глубоко в ткани эксплантов, приводя к более эффективному уничтожению микроорганизмов.

В зарубежных работах для получения стерильной культуры обычно используют простую стерилизацию одним-двумя растворами. Так, для преодоления проблемы контаминации субтропического плодового растения гуавы {Psidium guajava L.) побеги обрабатывали 15 % щелочью 20 минут и культивировали на среде MC. В результате было получено 53,3 % стерильных эксплантов (Liu, Yang, 2011).

Пазушные почки Citrus jimos стерилизовали 1 % NaCIO 10-15 мин с добавлением 0,01 % Твин 20 1—30 мин, затем после промывки стерильной дистиллированной водой погружали в 70 '% этанол на 1 секунду и опять промывали (Oh et al, 1991).

В другой работе для получения стерильной культуры почек мандарина Kinnow, использовали раствор PPM (Plant Preservative Mixture), состоящий из двух биоцидов - изотиазолонов. Его добавляли в питательную среду в высоких концентрациях (более 20 мл/л). РРМ снижал заражение с 92 до 37 % (Altaf, 2006).

При введении в стерильную культуру пазушных почек 10-летнего лайма побеги стерилизовали 70 % этанолом 30 секунд, затем 15 минут в 1 % гипохлорите натрия (20 % Хлорокс) с 3 каплями детергента Твин 20 на 100 мл раствора. К сожалению, авторы не указывают в работе эффективность этой стерилизации (Al-Khayri, Al-Bahrany, 2001).

Побеги 10-летнего мандарина Кинноу (Kinnow) из открытого грунта, обрабатывали 1 % Сулемой (Хлорид ртути) 10 мин или 5 % гипохлоритом натрия 15 мин. В результате стерилизации сулемой было получено 19,5 % жизнеспособных почек и после стерилизации гипохлоритом натрия - 18 % (Altaf, 2006).

Другие исследователи для стерилизации почек мандарина из открытого грунта обрабатывали побеги 80 % этанолом 5 минут. Авторами сообщается, что такая стерилизация не подавляла дальнейшее развитие почек in vitro (Giladi et al., 1989).

Успех получения стерильной культуры зависит не только от способа стерилизации — не меньшее значение имеет источник эксплантов и возраст маточных растений. Известно, что пазушные почки взрослых растений цитрусовых отличаются значительно большей контаминацией in vitro, чем сеянцы. Проблема контаминации сеянцев цитрусовых легко преодолима, и коэффициенты размножения их гораздо выше, чем у пазушных почек от взрослых растений (Germana, 2003; Shailendra et al., 2005). Но, для сохранения и размножения сортов необходимо получить прямой морфогенез в культуре in vitro, и часто приходится иметь дело с эксплантами взрослых растений. Поэтому требуется оптимизация методик получения стабильной культуры неювенильных эксплантов.

Между тем, способ стерилизации эксплантов также влияет на последующую регенерацию, от которой, в свою очередь, зависит успех микроразмножения в целом.

1.2.2. Регенерация и микроразмножение эксплантов цитрусовых Культура сеянцев in vitro - влияние регуляторов роста. Известно, что решающую роль в культуре in vitro цитрусовых играют регуляторы роста. На каждом из этапов культивирования (введение в культуру, микроразмножение, укоренение) их содержание может быть различным. Наиболее распространенными регуляторами роста для цитрусовых культур являются бензиламинопурин (БАП) и нафтилуксусная кислота (НУК). И изучение оптимальных комбинаций фиторегуляторов чаще всего проводится на сеянцах.

Изучение различных фиторегуляторов (зеатин, БАЛ, кинетин, тидиазурон (ТДЗ), индолилуксусная кислота (ИУК), индолилмасляная кислота (ИМК) и ИУК) в среде МТ (Murashige, Tucker, 1969) показало, что наиболее оптимальным на этапе введения в культуру является БАЛ 1 мг/л, который индуцирует 100 % морфогенез сеянцев апельсина (Singh, Rajam, 2010).

S. Sharma с коллегами (2009) описывали регенерацию из каллуса грубокорого лимона (Rough lemon), мандарина Клеопатра (Cleopatra mandarín) и пектиниферы (Pectinifera). У этих видов на питательной среде МС с добавлением БАЛ 1,0 мг/л отмечалась регенерационная активность 76,7 - 90,0 %.

Другие исследователи отмечают эффективность аденина 40 — 80 мг/л в сочетании с БАЛ 4,44 цМ в среде МТ для регенерации эпикотилей лимона сорта Волькамер. По их данным НУК не оказывала положительного влияния на морфогенез (Thanh, Minh, 2010).

ТДЗ был отмечен малоэффективным для введения в культуру сеянцев помело (С. granáis (L.) Osbeck.). Английские биотехнологи К. Р. Paudial и N. Naq (2000) отмечают низкую пролиферацию спустя 6 недель культивирования на среде с ТДЗ.

Как правило, побеги, полученные на этапе введения в культуру, пересаживают на питательную среду для клонального микроразмножения. Среды для размножения могут содержать те же или иные комбинации регуляторов роста. Так, для размножения сеянцев грейпфрута, кислого апельсина, лимона максимальная продуктивность была получена в комбинации БАЛ 1,0 мг/л и НУК 10,0 мг/л в питательной среде (Marín, Duran-Villa, 1999). Однако в большинстве других работ цитокинины преобладают над ауксинами и, как правило, концентрация цитокининов не превышает 2 мг/л.

Например, размножение сеянцев лимона и мандарина осуществляли на среде МС с 1 мг/л БАЛ и получали коэффициент размножения 2,1 и 2,0 соответственно (Sharma et al., 2009), что является сравнительно небольшими величинами для сеянцев. У сеянцев апельсина коэффициент размножения составлял 8,24 побега на среде МТ с 1 мг/л БАЛ (Singh, Rajam, 2010).

Индонезийские исследователи также указывают на эффективность БАП на этапе микроразмножения. В их работе коэффициент размножения у цитруса Тавангмангу был наибольшим при добавлении 0,5 мг/л БАП и составил 3,93 (через 3 месяца культивирования); при повышении и понижении концентрации БАП этот показатель снижался (Samanhudi et al., 2010).

У сеянцев помело было получено 5,2 побега на эксплант на среде МС с добавлением 1,8 цМ БА (Paudial, Naq, 2000). Эти авторы также указывают на то, что НУК не влияла на коэффициент размножения. Но добавление 5,8 цМ ГК на втором пассаже значительно усиливало рост микропобегов. О положительном действии ГК на рост микропобегов сообщалось и в других работах. Добавление 1 рМ ГК усиливало рост микропобегов Poncirus trifoliata (Van Le et al., 1999). Согласно данным других исследователей для микроразмножения сеянцев лимона более эффективной была среда с 0,1 мг/л 2,4Д, чем с БАП (Benabdesselam et al., 2011).

Из перечисленных работ следует, что коэффициент размножения сеянцев существенно зависит от генотипа и колеблется от 2,0 до 8,2 побегов на эксплант. Хотя оптимальные концентрации регуляторов роста разнятся среди видов цитрусовых, наиболее распространенным цитокинином является БАП в концентрации 1 мг/л.

На этапе укоренения размноженных микропобегов наиболее часто использовали НУК и ИМК. Так, наибольший ризогенез у сеянцев апельсина был получен при добавлении в среду МС 1,0 мг/л ИМК (Singh, Rajam, 2010). Для укоренения грубокорого лимона оптимальной питательной средой

являлась Уг МС с добавлением ИМК 10 мг/л (Sharma et al., 2009). У сеянцев помело НУК была более эффективна для индукции корнеобразования, чем ИМК: на среде с 2,7 цМ НУК было получено более 75 % укоренения (Paudial, Naq, 2000). Наибольший процент укоренения микропобегов апельсина и лайма также отмечался при добавлении в среду 1,5 мг/л НУК (Mukhtar et al., 2005). Укоренение микропобегов лиметты с частотой 78 % получали на среде МС с 2,46 цМ ИМК и 1,11 цМ БАЛ (Jahoo, 2010). Сеянцы лимона укореняли на среде И> МС без регуляторов роста (Tahn, Minh, 2010).

Все приведенные выше работы выполнены на сеянцах, которые характеризуются высокими показателями размножения in vitro и, как правило, используются в качестве подвоев и в исследованиях по трансформации.

Соматический эмбриогенез - это еще один эффективный способ массового получения растений in vitro. Для этого используют несколько типов эксплантов: tTCL (thin transverse cell layer - перенесение тонкого слоя клеток), семена и эмбриогенные каллусы.

Для получения каллуса и соматического эмбриогенеза используют различные регуляторы роста. Некоторые исследователи указывают на положительное влияние кокосового молока (10-20 %), солодового экстракта (250 - 800 мг/л) и экстракта казеина 1,0 - 3,0 г/л на рост и развитие цитрусовых in vitro (Глоба-Михайленко, 1980; Mukhtar et al., 2005). Например, для индукции каллуса апельсина и лайма в питательную среду МС добавляли 2,0 мг/л 2,4Д и 20 % кокосового молока (Mukhtar et al., 2005). При изучении влияния Сахаров, было выявлено, что раффиноза и лактоза в большей степени стимулировали органогенез из каллуса, чем сахароза (Глоба-Михайленко, 1980; Глоба-Михайленко, Хусайни, 1987).

Одним из источников регенерантов является органогенный каллус, полученный из тонкого слоя клеток (tTCL) пестиков на питательной среде МС с добавлением 0,5 г/л солодового экстракта и 13,3 |iM 6-БАП и 146 jiM

сахарозы. Соматические зародыши появлялись через 2-5 месяцев после введения в культуру, в зависимости от генотипа и положения tTCL: из рыльца - 0 - 5,2 %, из столбика 0 - 42,4 %, из завязи 0 - 9,3 %. Через 12 недель соматические зародыши регенерировали побеги с высокой частотой. Так были получены регенеранты шести различных видов цитрусовых: Citrus deliciosa Ten., С.limón (L.) Burm., C.madurensis Lour., C.medica L., C.tardiva Hort. Ex Tan., C.sinensis (L.) Osb. Наибольший процент регенерации отмечен у лимона (Carimi, De Pasquale, 1999).

В. Van Le с коллегами также культивировали tTCL из междоузлий Poncirus trifoliata. Регенерация побегов из tTCL с частотой 90 % была получена на среде 10 ¡j.M бензиладенина (БА) и 1 jjM ТДЗ, и продуктивность составила 37 почек на каждый tTCL. Авторы утверждают, что растения регенеранты, полученные ими из tTCL, не имели фенотипических отклонений от исходных растений вследствие того, что они развивались по пути прямого органогенеза без каллуса, что говорит об отсутствии сомаклональных вариаций (Van Le et al., 1999).

Для получения соматического эмбриогенеза цитрусовых, используют многозародышевые семена. Так, был разработан эффективный метод получения соматических зародышей из семян сладкого апельсина на питательной среде МТ, содержащей 500 мг/л солодового экстракта, 1 % мальтозу и 0,5 % сахарозу, 0,9 % агар (Моисеева и др., 2010). Еще один воспроизводимый метод получения адвентивных зародышей С. limonia был предложен индийским биологом A. Jajoo. На среде MC с 2,22 цМ БАЛ было получено 18,26 побегов/эксплант (Jajoo, 2010).

Семена - быстрый и продуктивный источник микропобегов in vitro. Сеянцы мандарина появляются через 7 дней с частотой 100 % на среде MC-BS с 1 мг/л БАЛ, тогда как в грунте семена прорастают на 33-й день с частотой 12 - 52 % (Niedz, 2006). При микрочеренковании сеянцев удается получить 30 — 40 микропобегов на среде MC с 2 мг/л ГК. Регенерация

происходит из органогенного каллуса, образующегося на базальном конце сегментов эпикотиля (Niedz, 2006).

В более ранней работе соматический эмбриогенез получали из тканей альбедо незрелых плодов помелло, на среде МС с 1 мг/л БАП и 1 мг/л 2,4-Д. Пересадка на среду без регуляторов роста приводила к дальнейшему вытяжению побегов. Органогенный каллус получали на средах В5, МС и BP с 0,5 мг/л 2,4-Д. Через 3 месяца из него получали регенеранты (Song et al., 1991).

Считается, что с помощью соматического эмбриогенеза можно оздоравливать сорта от вирусов, вироидов и других патогенов. Такие работы были проведены и на цитрусовых. Так, например, в Египте эмбриогенные культуры получали из незрелых семяпочек цитрусовых (8 недель после опыления) был получен 100 % эмбриогенез апельсина на среде МС без цитокининов (сорт Шамоути) и с 1,0 мг/л кинетина (сорт Вашигтон Навел). Результаты тестирования (ELISA и RT-PCR) на наличие вируса CTV в регенерантах оказались отрицательными. Эти авторы также применяли метод RAPD-PCR для определения сомаклональной изменчивости регенерантов. Результаты показали, что большинство растений идентичны материнским, значительных различий между ними не было обнаружено (El-Sawy et al., 2006).

Еще один путь оздоровления от вирусов указывают А. М. D'Onghia с коллегами, которые из стерильных бутонов выделяли пестики и рыльца и помещали вертикально на среду МС, содержащую 7 г/л агара, 146 цМ сахарозы, 0,5 г/л солодового экстракта и 13 цМ БАП. Полученные соматические зародыши 2-3 мм в диаметре изолировали из эмбриогенных каллусов и помещали на безгормонную среду. Регенеранты прививали на 6-месячные сеянцы кислого апельсина. Спустя 2 года был проведен анализ на CW и CTV вирусы, и их не было обнаружено. Таким образом, авторы

считают этот метод перспективным для оздоровления. Растения начали завязывать плоды на 3-й год после высадки (D'Onghia et al., 2002).

Несмотря на свою высокую эффективность, соматический эмбриогенез и морфогенез из ювенильных эксплантов имеют свои недостатки. Несмотря на то, что с путем соматического эмбриогенеза можно оздоровить растения от вирусов, риск возникновения генотипических отклонений достаточно высок (Perez-Molphe-Balch, Ochoa-Alejo, 1997; Garsia et al., 1999). К тому же, растения, полученные из семян, обычно имеют сильно выраженные ювенильные черты, и им необходим продолжительный период до вступления в плодоношение (Almeida et al., 2002). Поэтому, для сохранения коллекций ценных генотипов in vitro необходимо получить стерильную культуру неювенильных эксплантов.

Культивирование неювенильных тканей. Экспланты, полученные от взрослых растений, не часто культивируют in vitro, главным образом, из-за высокого уровня их контаминации, низкой морфогенетической способности и низкой способности к укоренению микропобегов (Citrus genetics..., 2008). Тем не менее, было описано несколько методик микроразмножения микропобегов от взрослых (плодоносящих) растений цитрусовых культур. Одна из первых таких работ принадлежит М. Barlaas и K.G.M. Skene, которые получали морфогенез из узловых сегментов взрослых растений мандарина, цитранжа, лайма и сладкого апельсина (Barlass, Skene, 1982). Р.Г. Бутенко с коллегами также предпринимали попытки размножения лимона Мейера и Новоафонского пазушными почками сеянцев и 4-5-летних растений на среде MC и наилучшие результаты показала среда с добавлением БАП 1,0 мг/л. По данным этих авторов все попытки сохранить и размножить микропобеги, полученные от взрослых растений, не увенчались успехом, микропобеги постепенно сбрасывали листья и погибали (Бутенко, Шенгелия, 1986).

Исследователи из Саудовской Аравии изучали регенерацию и микроразмножение побегов от 10-летних растений лайма. Наилучшие результаты по микроразмножению побегов (8 побегов/эксплант) были получены на среде MC с 1,0 мг/л БАЛ и 0,5 мг/л кинетина. ИМК была малоэффективна для микроразмножения. Удлинение побегов наблюдали на среде с 0,25 мг/л БАЛ в сочетании с 1,0 мг/л кинетина. Максимальный процент укоренения (56 %) был получен на среде с 1,0 мг/л ИУК (Al-Khari et al., 2001). Высокий коэффициент размножения, полученный этими авторами, — это скорее исключение, чем правило, ведь часто даже ювенильные экспланты не бывают столь продуктивны.

N. Altaf (2006) вводил в культуру вегетативные почки от растущих в открытом грунте 10-летних растений мандарина Кинноу. Полученные микропобеги он высаживал на среду MC с добавлением 2 мг/л БА, 1 мг/л ГК, и 5 мг/л пролина. О коэффициенте размножения в данной работе не сказано. Микропобеги укоренялись на среде Vi MC + ИМК 2 мг/л. Укорененные побеги прививали на молодые сеянцы лимона.

J.S. Rathore с коллегами размножали in vitro побеги из апексов взрослых растений Citrus limon сорта Ассам, получая коэффициент размножения 5-6 побегов (Rathore et al., 2007). Pe'rez-Tornero с коллегами изучали регенерацию побегов лимона от 10-летних растений в культуре in vitro, укоренение и адаптацию микропобегов. На питательной среде DKW, содержащей 2 мг/л БА и 2 мг/л ГК, максимальный коэффициент размножения составлял 2,78. При этом отмечался хлороз листьев, и листовые пластинки были узкими. Наибольший процент укоренения ими был получен на среде, содержащей 3 мг/л ИМК (Pe'rez-Tornero et al., 2008).

Таким образом, публикации по культуре in vitro вегетативных почек от взрослых рестений немногочисленны. Другим способом вегетативного размножения сортов in vitro является морфогенез из меристем, в том числе и микропрививка.

Мнкропрививка. Для многих сельскохозяйственных видов растений разработаны эффективные протоколы морфогенеза из меристем. Этот способ позволяет оздоровить и сохранить ценные сорта in vitro без потери генетической стабильности. Тем не менее, многочисленные попытки применить его на цитрусовых культурах оказались безрезультатны, и до настоящего времени не удалось получить цитрусовые растения в культуре меристем (Citrus genetics..., 2008). Альтернативным способом оздоровления от вирусов является микропрививка. Кроме того, что этот способ не приводит к генотипическим отклонениям, он позволяет размножить и укоренить трудноразмножаемые генотипы цитрусовых. К тому же, микропиривитые цитрусовые растения зацветают на 2-й год. Первые сообщения по микропрививке цитрусовых относятся к 1870-м годам. Т. Murashige с коллегами (1972) прививали апикальные меристемы от зараженных вирусами растений на сеянцы, растущие in vitro. Некоторые из полученных растений были свободны от вирусов и вироидов и не имели ювенильных признаков. С тех пор техника микропрививки усовершенствовалась и до настоящего времени эта методика оптимизируется во многих лабораториях по всему миру.

Большой вклад в развитие техники микропрививки цитрусовых внес испанский биотехнолог L. Navarro (1978). Разработанная им методика прививки в перевернутый Т-разрез легла в основу всех дальнейших работ. Согласно этой методике микропривитые сеянцы следует культивировать на фильтровальных мостиках в жидкой MC среде (Citrus genetic..., 2008). Дальнейшие работы являются различными модификациями этого метода.

Одна из последних работ в данной области принадлежит пакистанским исследователям, которые для оздоровления от вирусов проводили микропрививку мандарина и апельсина на 2-х недельные сеянцы грубокорого лимона. Изучали два способа микропрививки: прививка в перевернутый Т-разрез и прямое положение меристемы на срезанную поверхность подвоя. В

первом случае было получено 34,7 % привитых растений, во втором - 26,7 %. Также были отмечены генотипические особенности: мандарин приживался лучше, чем апельсин. Наибольший процент (33 %) успешно привитых почек оказался на питательной среде с 5 % сахарозой (Naz et al., 2007).

Для усиления эффекта оздоровления мандарина индийские исследователи применяли обработку антибиотиками. Микропривитые растения культивировали на среде МС + 1 мг/л 2-ip и 800 мг/л солодового экстракта с различными концентрациями (5 - 25 мг/л) антибиотиков ацилогуанозина, азидотимидина, рибавирина и 2-тиоурацила. Наибольшее количество безвирусных растений (37 %) было получено в варианте с рибавирином 25 мг/л (Sharma et al., 2007).

Хорватские биотехнологи оздоравливали мандарин С. unshiu с помощью микропрививки в L-образный разрез на цитранж Троер. Маточные растения привоя перед этим подвергали термотерапии. Было получено 40% микропривитых растений на среде МС с 6 мг/л агара. После тестирования методом ELIZA у привитых растений вирусов не было обнаружено (Hancevic et al., 2009). Несмотря на многолетние исследования, посвященные усовершенствованию техники микропрививки, этот метод все еще трудоемок и процент успешных микропрививок в разных работах колеблется от 30 до 75

Таким образом, в качестве эксплантов для введения в культуру in vitro у цитрусовых могут служить секции побегов, кусочки корней, части листа, междоузлия, семена, пестики и другие. Большинство исследований, предпринятых с целью разработки протоколов культивирования цитрусовых in vitro, опираются на стандартные методики, разработанные для других культур - минеральная основа МС, DKW и другие с добавлением регуляторов роста БАП и НУК (Репа et al., 1995; Carimi, De Pasquale, 1999; Al-Khari, Al-Bahrany, 2001; Niedz, 2006; Altaf, 2006; Naz et al., 2007; Sharma et al., 2007; Pe'rez-Tornero et al., 2008 и др.). Большинство этих работ проводили

на сеянцах и ргенерантах из каллуса, которые характеризуются высокой продуктивностью in vitro. Однако и из вегетативных почек взрослых (10-летних) растений была получена регенерация, в частности и у лимона. В целом, методики регенерации и микроразмножения продолжают совершенствоваться для разных видов цитрусовых. В дальнейшем эти методики находят свое применение в таких направлениях биотехнологии цитрусовых культур, как размножение подвоев, оздоровление ценных генотипов, микроразмножение, сохранение в коллекциях in vitro, соматическая гибридизация, генетическая трансформация. В связи с целью данного исследования считаем необходимым остановиться более подробно на вопросе сохранения гермоплазмы цитрусовых in vitro.

1.2.3. Процедура сохранения гермоплазмы цитрусовых in vitro

Термин «гермоплазма» широко используется в зарубежных работах, когда речь идет о сохранении генетических ресурсов, и обозначает живую ткань, из которой можно регенерировать целое растение (Citrus genetics..., 2008). В широком смысле слова «гермоплазма» (или зародышевая плазма) -это потенциальный наследственный материал в пределах вида или таксона. Таким образом, растительная гермоплазма является исходным материалом для получения новых форм растений с помощью традиционной селекции и биотехнологии. Гермоплазма цитрусовых - это пыльца, семена, почки, и в некоторых случаях листья и другие вегетативные органы растений цитрусовых и близких родов.

Сохранение гермоплазмы в коллекциях ex situ осуществляется тремя способами: в полевых коллекциях, свободных от патогенов защищенных коллекциях и с помощью in vitro сохранения (в криоколлекциях и с помощью замедления роста). Преимуществами последнего способа является высокая степень надежности, низкие трудозатраты и экономия площадей, возможность оздоровления от вирусов и других патогенов, возможность

быстрого размножения и получения генетически однородного материала. Такие коллекции являются базовыми для экспериментов по генетической трансформации и получения новых сортов другими современными селекционными методами. Недостатками сохранения в медленнорастущих коллекциях in vitro являются: возможность появления сомаклональных вариаций, сложность регенерации эксплантов (пазушных почек) от взрослых древесных растений, видо- и сортоспецифичность в подборе условий культивирования.

В мире существует несколько крупных in situ и ex situ коллекций гермоплазмы цитрусовых. В Китае (Бейбей, провинция Сычуань) в 1960-х гг. было основано национальное хранилище гермоплазмы цитрусовых. Это огромная коллекция, представленная более 1000 экземплярами, из которых 296 - местной селекции и 116 - спонтанной селекции. Университет сельского хозяйства в Хуазхонге поддерживает коллекцию из 280 экземпляров in vivo и 110 in vitro (Deng, 2007). В Индии ex situ консервация гермоплазмы цитрусовых началась.в 1950-х гг., и сейчас в разных регионах этой страны имеется 6 коллекций общим количеством около 600 генотипов. В Таиланде имеется 3 коллекции, содержащие около 500 генотипов. В Индонезии — 3 коллекции, всего около 500 образцов, также имеются коллекции во Вьетнаме, на Филлипинах (Citrus genetics..., 2008).

В центрах происхождения видов цитрусовых коллекции в основном представлены дикими и редкими видами. Вне этих центров коллекции состоят главным образом из новых элитных сортов и промышленных видов. Самые большие такие коллекции цитрусовых ex situ созданы в Аргентине, Австралии, Бразилии, Корсике (Франции), Марокко, Новой Зеландии, Южной Африке, Испании, Турции и США. Самая большая коллекция в Азии за пределами центров происхождения цитрусовых, описанных выше, находится в Японии, общее количество образцов в 1996 году превышало 1200 экземпляров. Большая коллекция также находится в США (National

Clonal Germplasm Repository for Citrus and Dates - NCGRCD) при Калифорнийском университете (Риверсайд) - около 1000 экземпляров; а также в Банк цитрусовой гермоплазмы в Испании, Валенсия (Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias - IVIA) (Citrus genetics..., 2008).

Консервация геноресурсов цитрусовых состоит из 6 основных этапов:

1. Приобретение новых экземпляров в коллекцию,

2. Введение в культуру,

3. Поддержание в культуре,

4. Описание и оценка,

5. Документация и создание базы данных,

6. Практическое использование.

Взаимосвязи между этими этапами показаны на рисунке 1.

In situ ресурсы

и S X 0> frai а о о s р. С

ai S X

0>

I в со

О)

s

X

a.

I

о С

01 s

X я в о

п л

ч

о с

и

Изучение растений

ex situ

Селекционные программы

1

Освобождение от патогенов и/или карантин

Крио-, ¡n vitro или другое хранение

Свободные от патогенов защищенные коллекции

Полевые коллекции

характеристика, с>иенка

Конечные потребители (селекционеры, исследователи, садоводы и др.)

Рис. 1. Схема консервации геноресурсов цитрусовых культур.

Развитие биотехнологии привело к появлению новой категории гермоплазмы - это клоны элитных генотипов, клеточные линии со специфическими свойствами и генетически трансформированный материал (Engelmann, 1991). Эта новая гермоплазма зачастую дорогосточщая и сложна в получении. Развитие эффективных технологий для обеспечения ее надежного сохранения - задача первостепенной важности.

Методы культивирования тканей представляют большой интерес для накопления, размножения и поддержания растительной гермоплазмы (Engelmann, 1991). Системы культивирования тканей позволяют размножать растительный материал с высокой продуктивностью в асептических условиях. Оздоровление от вирусов растений путем получения через культуру меристем и микропрививку в сочетании с термотерапией, гарантирует получение оздоровленных подвоев и упрощает процедуры карантина в процессе международного обмена гермоплазмой. Миниатюрность эксплантов позволяет сократить площади хранения и снизить затраты на содержание коллекций гермоплазмы.

Методы in vitro консервации растительной гермоплазмы по продолжительности сохранения объектов в коллекции подразделяются на 3 вида:

1. Краткосрочная консервация - хранение в условиях нормального роста (используется для временного сохранения коллекций гермоплазмы и обмена с другими коллекциями);

2. Среднесрочная консервация (хранение до 12 месяцев без субкультивирования) — представляет собой активный генобанк in vitro;

3. Долговременная консервация (хранение более 12 месяцев без субкультивирования) — рассматривается как резервный генобанк in vitro (Engelmann, 1998).

Остановимся подробно на методе среднесрочной консервации, которая является целью данного исследования. Для среднесрочной консервации

медленнорастущих видов используются стандартные культуральные условия. Однако в большинстве случаев условия среды и культуральные условия можно изменить для замедления роста. Замедление роста микропобегов позволяет сохранять их in vitro в течение 1-15 лет (в зависимости от вида) в условиях культуры тканей при периодических субкультивированиях (Kameswara, 2004).

Среднесрочная консервация путем замедления роста обеспечивается следующими способами:

1) подбор оптимального физиологического состояния побега,

2) добавление осмотических агентов и ростовых веществ,

3) пониженние температуры культивирования,

4) снижение концентрации солей и сахарозы,

5) снижение содержания кислорода в атмосфере,

6) инкапсуляция в альгинате (Withers, Engels, 1990; Charrier et al., 1991; Engelmann, 1991; Malaurie, 1998).

Использование осмотиков. Осмотические агенты - это вещества, которые уменьшают водный потенциал клеток. Добавление осмотика в среду эффективно замедляет рост и увеличивает продолжительность сохранения разных тканей многих видов растений in vitro (Wilson et al., 2000; Shibli et al., 2006). В соответствии с предположением о росте клеток за счет тургора (Zimmermann, Steudle, 1978) высокая концентрация осмотического агента в среде действует против создания критического тургорного давления, которое предшествует растяжению клетки. Этот стрессовый фактор ингибирует и рост каллуса и формирование побега (Brown et al., 1979).

Маннитол, сахароза, сорбитол (Shibli et al., 1992), трибутил-2,4-дихлоробензилфосфониум хлорид (Фосфон Д), яблочнокислый гидразид, сукцинокислый 2,2-диметил гидразид, хлорхолинхлорид и анцимидол являются осмотиками и увеличивают время между субкультивированиями в процессе хранения живых тканей растений in vitro (Dodds, Roberts, 1985).

Главным компонентом в большинстве культуральных сред выступает сахароза. Она является источником энергии и осмотическим агентом одновременно (Shibli et al., 1992; Shibli at al., 2000). Некоторые ее концентрации можно использовать для замедления роста растений in vitro (Orlikowska , 1992; Moges et al., 2003). Рост побегов in vitro картофеля (Sarkar, Naik, 1998) и дикого персика (Tahtamouni, Shibli, 1999) замедляли путем повышения концентрации сахарозы. Для культивирования каллуса табака добавление 30 г/л сахарозы снижало способность побегообразования в культуре, а 150 г/л полностью ингибировало его (Brown et al., 1979).

Маннитол может также использоваться как осмотический агент (Lipavska, Vreugdenhil, 1996). Это углеводный спирт, который образуется как первичный продукт фотосинтеза у некоторых растений (Tahtamouni, Shibli, 1999; Moges et al., 2003). У табака маннитол не задерживал рост (Shibli et al., 1999), но замедлял рост побегов в культуре тканей хризантемы (Moges et al., 2003) и горького миндаля (Ballester et al., 1997). Некоторые авторы сообщали, что повышение сахарозы, сорбитола и маннитола у горького миндаля значительно замедляли рост побегов и продлевали субкультивирование на 4 месяца при комнатной температуре (Shibli et al., 1999).

Хранение в условиях низкой температуры — один из главных способов сохранения геноресурсов (Moges et al., 2003). Устранение заболеваний, снижение генетических модификаций, а также уменьшение трудоемкости и занимаемой площади хранения - это главные плюсы данного способа консервации растительного материала (Hopkins, 1995; Reed et al., 1998). В условиях понижения температуры аккумуляция ненасыщенных липидов на клеточной мембране вызывает ее утолщение и задержку деления и растяжения клетки (Engelmann, 1997).

Хранение в холоде опирается на экологические и географические условия происхождения растений, но обычно температура варьирует в пределах 0 - 5 °С для холодостойких видов (Ashmore, 1997). Тропические и

субтропические растения менее устойчивы к низким температурам, чем растения умеренного пояса (Ford-Lloyd, Jackson, 1986). Например, гермоплазму кофе хранят при +20 °С тогда как ткани яблони сохраняют при +1-4 °С (Orlikowska, 1992). Малина (Reed, 1993) и мята (Reed, 1999) сохраняются in vitro при +4 °С с 12 часовым фотопериодом. Персик обычно сохраняют при +4-10 °С (Dereuddre et al., 1990), хотя побеги его можно хранить при +1-4 °С в течение 1 - 5 лет в зависимости от генотипа (Reed et al., 1998). Апексы абрикоса хранили при +3 °С 24 недели (Perez-Tornero et al., 1999), в то время как ткани картофеля - при +10 °С (Kwaitkowski et al., 1988). Культивирование меристем некоторых корневищных видов и апексов банана проходило при +18 °С в течение 18 месяцев (Wang, Charles, 1991).

Разные виды растений различаются в своей потребности продолжительности светового дня при их хранении в коллекции. Обычно хранение в условиях низких температур происходит совместно со снижением интенсивности света или в полной темноте (Wang, Charles, 1991; Zandvoort et al., 1994), но некоторые виды сохраняются при обычном световом режиме (Hvoslef-Eide, 1992). In vitro культуры кофе (Bertrand-Desbrunais et al., 1992), цитрусовых (Marín, Duran-Villa, 1991) и картофеля (Sarkar, 1998) успешно сохраняют при полном освещении, тогда как подвои яблони (Orlikowska, 1992), апексы абрикоса (Perez-Tornero et al., 1999) лучше хранятся в темноте.

За последнее десятилетие в развитии техник консервации растительной гермоплазмы in vitro достигнут большой прогресс. Несмотря на то, что основная инфраструктура для этого уже существует, в большинстве случаев пока еще не всегда доступна и возможна комплексная консервация, описанная в литературе. Одним из спорных вопросов в этой области является вопрос о генетической стабильности видов при хранении in vitro (Drew, 1997).

Существуют данные, что культивирование in vitro, базирующееся на регенерации путем прямого органогенеза или соматического эмбриогенеза,

может приводить к генетической нестабильности и сомаклональным вариациям. Генетическая стабильность является важным фактором при среднесрочном хранении с использованием методов замедления роста. Некоторые виды являются более склонными к появлению генетических отклонений в процессе хранения in vitro, например Musa spp. (банан) и Ananas comosus (ананас) (Smith, Drew, 1990). При использовании низких концентраций БАП у этих видов обозначенная проблема сводится к минимуму, но не устраняется (Drew, 1997).

В большинстве случаев сомаклональных вариаций изменения происходят только в одном гене. Исследователи в области молекулярной биологии уже разработали ряд генетических методов (например, антисмысловой, рибозимный, метод инсерционной инактивации, CRE-LOX системы), с помощью которых можно преодолеть проблему изменения единичных генов. Кроме того, с помощью более эффективных технологий в будущев возможно будет выделять нужные гены из консервированных in vitro видов и переносить их в геном других видов. Поэтому повреждения в единичных генах у доноров не является важной проблемой. Тем не менее, приоритет должен быть отдан эксплантам, которые дают прямую регенерацию в растущих коллекциях in vitro и не приводят к отклонениям (Drew, 1997).

Таким образом, обсуждение проблемы генетической изменчивости в процессе длительного хранения видов in vitro можно рассматривать с двух сторон: с одной стороны в сочетании с направленным давлением отбора — сомаклональные вариации могут быть полезны для получения новых форм (например, отбор холодоустойчивых форм при культивировании растений при низких положительных температурах); с другой стороны - сохранение видов (или сортов), пусть даже путем получения генетических отклонений, предпочтительнее, чем безвозвратная потеря этих видов и сортов (Drew, 1997). Создание коллекции цитрусовых in vitro может легко решить

проблемы сохранения геноресурсов и позволяет консервировать гермоплазму в любой стране. Для некоторых видов цитрусовых культура тканей может играть огромную роль как единственно возможный способ сохранения. Для повышения эффективности этого способа требуются оптимизированные методики регенерации и культивирования растений in vitro (Carimi, De Pasquale, 2001).

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Самарина, Лидия Сергеевна

Выводы

1. Установлен эффективный режим стерилизации побегов взрослых растений лимона - обработка 0,3% раствором Велтолен 25 мин и добавление антибиотика тетрациклина 400 мг/л в питательную среду.

2. Оптимизирован минеральный и гормональный состав питательной среды для микроразмножения лимона - КМО + БАП 2,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л.

3. Установлено, что после трех циклов микропрививки в почках происходит активизация ростовых процессов, и коэффициент размножения лимона повышается в 2 раза, что является критерием физиологического омоложения. Микропрививка является наиболее перспективным способом микроразмножения и сохранения лимона in vitro.

4. Выявлены оптимальные условия, позволяющие сохранять микропобеги лимона in vitro 10-12 месяцев на среде Уг МС + БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л, при температуре + 10 ± 2 °С, освещении 1 000 люкс, фотопериоде 16/8 часов.

5. Определена эффективность ISSR праймеров для оценки генетической стабильности сортов лимона в процессе хранения in vitro. У сортов Новоафонский, Бесколючий и Ударник не было выявлено генетических отклонений после 6-12 месяцев хранения in vitro.

6. Разработан и рекомендован для практического применения протокол поддержания депонированной коллекции лимона в культуре тканей.

Заключение

При оптимизации и приемов микроразмножения и сохранения лимона Citrus limon (L.) Burm. в условиях in vitro были получены микропобеги путем прямого органогенеза из пазушных почек. В процессе микроразмножения и сохранения они характеризовались низкой продуктивностью и жизнеспособностью. С помощью цикла повторных микропрививок удалось повысить эффективность микроразмножения микропобегов в 2 раза, и коэффициент размножения составил 4,6 шт/эксплант на среде КМО +2,0 мг/л БАП + 2,0 мг/л ГК. Этот способ является полезным инструментом и открывает большие возможности для массового размножения и оздоровления элитных генотипов.

Подбор оптимальных режимов культивирования позволил сохранять микропобеги 10 - 12 месяцев без промежуточных субкультивирований в условиях пониженной температуры и освещенности. Сравнение микропобегов, полученных из пазушных почек, с маточными растениями лимона не выявило генетических различий после хранения in vitro в течение 12 месяцев у сортов Бесколючий и Новоафонский, и у сорта Ударник после 6 месяцев хранения. Следовательно, продолжительность хранения в коллекции in vitro до 12 месяцев может быть безопасной для генотипов лимона.

В результате исследований были получены укорененные и адаптированные к нестерильным условиям растения лимона. Включение метода культуры тканей в селекцию и производство цитрусовых может стать полезным инструментом для размножения подвоев, сохранения ценных генотипов, оздоровления от патогенов и безопасного обмена гермоплазмой с другими коллекциями.

Рекомендации для практического применения

На основе полученных результатов разработана технологическая схема микроразмножения и сохранения лимона в условиях in vitro (рис. 35). С целью получения полноценных растений лимона, микроразмножения и сохранения их в культуре тканей предлагается следующая последовательность операций:

1. Введения в культуру тканей: а) Молодые побеги весеннего (апрель - май) прироста освободить от листьев, промыть с хозяйственным мылом и в проточной воде в течение 30 минут. Затем в условиях стерильного помещения обработать побеги 0,3 % растворе Велтолен 25 мин, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной водой. Сегменты побегов длиной 0,7 см с почкой помещаются вертикально на питательную среду — МС + 0,1 мг/л БАЛ + 0,5 мг/л НУК + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л. Культивирование при световом режиме 16/8-5 клк, t +22+2 °С до получения микропобегов. б) Для получения сеянцев - семена стерилизуют 0,3 % раствором велтолен 30 мин. Стерильными инструментами снимают обе семенные оболочки, и помещают семядоли на питательную среду МС + БАЛ 1,0 мг/л + НУК 0,1 мг/л + аденин 10 мг/л + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л, световой режим 16/8-5 клк, t + 22 ± 2 °С. в) Для получения побегов путем микропрививки отдельно готовят подвой и привой. Подвой - сеянцы лимона четырех недель культивирования in vitro, привой - микропобеги из пазушных почек in vitro. Сеянцы декапитируют, оставляя 1,0 - 1,5 см эпикотиль, на месте среза которого делают L-образный разрез коры длиной 1 - 2 мм. В этот разрез помещают привой - меристему с 2-3 примордиями. Микропривитые побеги помещают на среду DKW + БАЛ 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л + сахароза 30,0 г/л+ агар 7,0 г/л, и культивируют при световой режиме 16/8-5 клк, t + 22 ± 2 °С.

2. Для омоложения микропобегов проводят цикл из не менее трех микропрививок, продолжительностью 2-3 месяца каждый. В каждой последующей прививке используют почки предыдущего привоя. После третьей перепрививки микрочеренки привоя высаживают на среду для размножения.

3. Для микроразмножения микропобеги культивируют на среде DKW (или КМО) + БАП 2,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л световой режим 16/8-5 клк, t + 22 ± 2 °С.

4. Для депонирования in vitro используют следующие условия — среда Vt. МС + БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л, сахароза 20,0 г/л, освещение 16/8-1 mik,t+ 10 ± 2 °С.

5. Для укоренения микропобеги помещают на среду Vi МС + НУК 2,0 мг/л + ИМК 1,0 мг/л + сахароза 20,0 г/л + агар 7,0 г/л, световой режим 16/8 -5 клк, t + 22 ± 2 °С.

6. Адаптацию следует проводить в 2 этапа: 1. Высадка укорененных растеньиц в адаптационные камеры с вермикулитом, предварительно прожаренном в сушильном шкафу в течение 6 часов; 2. Высадка на стеллажи или в горшки в тепличные условия.

Рис. 35. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА микроразмножения и сохранения Citrus limon (L.) Burm. в условиях in vitro

Молодые побеги весеннего прироста -стерилизация - 0,3 % Велтолсн 20 мин, трижды промывка стерильной дистводой.

Микроразмноженис - DK.W + БАП 2,0 мг/л + ГК 2,0 мг/л + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л световой режим 16/8-5 клк, t + 22 ± 2 "С.

Введение в культуру пазушных почек it

Высадка в питомник

Регенерация побегов - МС + 0,1 мг/л БАП + 0,5 мг/л НУК + сахароза 25,0 г/л + агар 7,0 г/л. Культивирование при световом режиме 16/8-5 клк, I + 22 ± 2 °С

Укоренение - 'Л MC + НУК 2,0 мг/л + ИМ К 1,0 мг/л + сахароза 20,0 г/л + агар 7,0 г/л, световой режим 16/8 -5 клк, t + 22 ± 2 °С.

Анализ генетической стабильности сортов, депонированных в коллекции in vitro, с помощью ISSR маркеров.

Стерильная культура привоя J

Микропрививка

Введение в культуру семян стерилизация 0,3 % велтойен 25 минут

Семена с=г£>

А и г is

Y

Хранение - Vi MC БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л, сахароза 20,0 г/л, освещение 16/8-1 клк, t + 10 ± 2 °С.

Ювенильные подвои in vitro

Подвой - сеянцы лимона 4-х недель культ-я in vitro, привой - 2-х недельные регенеранты пазушных почек. Среда DKW + БАП 0,1 мг/л + НУК 0,5 мг/л + сахароза 30,0 г/л+ агар 7,0 г/л, световой режим 16/8-5 клк, t + 22 ± 2 "С.

О м

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Самарина, Лидия Сергеевна, 2013 год

Список литературы

1. Березина, В.Ю. Автоматизированный комплекс измерительной аппаратуры для оценки устойчивости растений к стрессовым факторам среды / В.Ю. Березина, Т.А. Гурова // Достижения науки и техники АПК. - 2006. -№ 11.-С. 15-17.

2. Бутенко, Р.Г. Клональное микроразмножение цитрусовых культурой пазушных почек / Р. Г. Бутенко, JI. Н. Шенгелия // Культура клеток растений биотехнология. - М.: Наука, 1986. - С. 110-113.

3. Будаговский, А. Парадоксы оптических свойств зеленых клеток и их практическое применение / А. Будаговский, О. Будаговская, И. Будаговский // Фотоника [Электронный ресурс]. - 2010. - Вып. 6. - Режим доступа: http://vvww.photonics.su/journal/article/2537

4. Весел ова, Т.В. Оценка состояния растений земляники, культивируемых in vitro, люминесцентным методом / Т.В. Веселова, О.Н. Высоцкая, В.А. Веселовский // Физиология растений. - 1994. - Т. 41. - № 6. -С. 942-946.

5. Высоцкая, О.Н. Длительное сохранение in vitro коллекции растений земляники / О.Н. Высоцкая // Физиология растений. - 1994. - № 41. -С. 935-941

6. Глоба-Михайленко, И.Д. Использование метода культуры ткани в цитрусоводстве / И.Д. Глоба-Михайленко // Субтропические культуры. -1980. -№3.- С. 32-35.

7. Глоба-Михайленко, И.Д. Микропрививка мандарина Уншиу / И.Д. Глоба-Михайленко, С. Хусайни // Тез. докл. Всесоюзной конф. молодых ученых и аспирантов. - Тбилиси, 1987. - С. 131.

8. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта / Б.А. Доспехов // М.: Агропромиздат, 1985.-351 с.

9. Зорин, Ф.М. Селекция и агротехника цитрусовых на севере субтропиков / Ф.М. Зорин, И.И. Лаврийчук. - М.: Колос, 1964. - 231 с.

10. Иддагода,'Н. Особенности получения асептической культуры и клональное микроразмножение взрослых растений чая / Н. Иддагода, Н.В. Катаева, Р.Г. Бутенко // Сельскохозяйственная биология. — 1990. — № 5. — С. 98-103.

11. Керкадзе, И.Г. Естественная индуцированная мутация у цитрусовых / И.Г. Керкадзе, Т.Я. Трапаидзе // Информационное обеспечение целевых комплексных научно-технических программ. — Тбилиси, 1982. — 1 (9).-41 с.

12. Климов, C.B. Спонтанная осцилляция замедленной флуоресценции при диагностике устойчивости сельскохозяйственных растений к неблагоприятным факторам внешней среды / C.B. Климов // Сельскохозяйственная биология. - 1996. - № 5. - С. 115-122.

13. Куклев, М.Ю. Разработка флуоресцентной тест-системы для выявления устойчивых к вертициллезу форм томата / М.Ю. Куклев, И.А. Фесенко, Г.И. Карлов // Известия ТСХА. - 2006. - № 4. - С. 115-119.

14. Кулян Р.В. Цитрусовые культуры, как объект для селекции / Р.В. Кулян // Субтропическое и декоративное садоводство. - 2012. - Т.46. - № 1. -Стр. 71-74.

15. Куперман, Ф.М. Морфофизиология растений / Ф.М. Куперман. -М.: Высшая школа, 1984.-240 с.

16. Моисеева, H.A. Морфогенетический статус соматических зародышей Citrus sinensis, содержащихся в зрелых многозародышевых семенах и полученных в культуре in vitro / Н.А.Моисеева, В.Н. Серебрякова, Л. Нарди // Физиология растений. - 2010. - Вып. 57 (5). - С. 771-782.

17. Молканова, О.И. Генетические банки растений: проблемы формирования, сохранения и использования / О.И. Молканова и др. // Вестник удмуртского университета. - 2010. - Вып. 3. - С. 33 - 39.

18. Рибейро, Р.В. Фитохимическая реакция листьев фасоли на тепловой стресс после предварительного водного дефицита / Р.В. Рибейро и др. // Физиология растений. - 2008. - Т. 55, № 3. - С. 387-396.

19. Собчак, P.O. Биоиндикаторное значение флуоресценции хлорофилла некоторых древесно-кустарниковых растений в зимний период / P.O. Собчак, Ю.С. Григорьев // Сибирский экологический журнал. - 2007. -Т. 14(1).-С. 53-59.

20. Сорокина, Г.А. Перспективы использования флуоресценции хлорофилла для оценки устойчивости фотосинтетического аппарата к действию высоких температур / Г.А. Сорокина, H.A. Гаевский, В.М. Гольд // Физиология и биохимия культурных растений. - 1985. - Т. 17 (2). — С. 126130.

21. Трубачёв, В.В. Биологические особенности цитрусовых и их хозяйственная оценка в оранжереях Прикубанской зоны садоводства: дис. ... канд. биол. наук / Tpy6¿4eB Вениамин Владимирович. - Краснодар, 2004 [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.dissercat.com .

22. Фогель, В. А.Каталог коллекции цитрусовых культур ВНИИЦ и CK / В.А. Фогеля. - Сочи, 2008 г. - 55 с.

23. Шенгелия, Л. Н. Метод микропрививок цитрусовых в культуре ш vitro / Л. Н. Шенгелия, Р. Г. Бутенко // Культура клеток растений и биотехнология Кишинев : Штиинца, 1983. - С. 116-117.

24. Шихов, В.Н. О возможности использования метода термоиндукции флуоресценции для оценки функционального состояния ценозов культурных растений / В.Н. Шихов, Т.В. Нестеренко, A.A. Тихомиров // Физиология и биохимия культурных растений. - 2003. - Т. 35, №4.-С. 349-357.

25. Шлык, A.A. Биосинтез хлорофилла и формирование фотосинтетических систем / A.A. Шлык // Теоретические основы фотосинтетической продуктивности. -М., 1972.

26. Abdulaziz, M. Effect of phytohormones on in vitro shoot multiplication and rooting of lime Citrus aurantifolia (Christm.) Swing. / Abdulaziz M., Al-Bahrany // Sci. Hortic. - 2002. - Vol. 95(4). - P. 285-295.

27. Aleza, P. Polyembryony in non-apomictic citrus genotypes / P. Aleza, et al. // Annuals Botany. -2010. - Vol. 106 (4). - P. 533 - 545.

28. Altaf, N. In vitro bud culture of Kinnow tree / N. Altaf// Pak. J. Bot. -2006. - Vol. 38 (3). - P. 597-601.

29. Al-Khayri, J.M. In vitro micropropagation of Citrus aurantifolia (lime) / J.M. Al-Khayri, A.M. Al-Bahrany // Current Science. - 2001. - Vol. 81 (9, 10).-P. 1242-1246.

30. Almeida, W.A.B. In vitro organogenesis optimization and plantlet regeneration in Citrus sinensis and C. limonia / W.A.B. Almeida et al. // Sci. Agr. - 2002. - Vol. 59. - P. 35-40.

31. Amin, M. N. In vitro response of apical bud explants from mature trees of jackfruit (Artocarpus heterophyllus) / M. N. Amin, V. S. Jaiswal // Plant Cell Tissue and Organ Culture. - 1993. - Vol. 33. - Pp. 59-65.

32. Amiri, M.E. In vitro technique to study the shoot tip grafting of Primus avium L. (Cherry) var. Seeyahe Mashad / M. E. Amiri // J. Food Agriculture and Environment. -2006. - Vol. 4 (1). - P. 151-154.

33. Ashmore, S.E. Status report on the development and application of in vitro techniques for the conservation of plant genetic resourses / S.E. Ashmore // International plant genetic resources institute. - IPGRI, Rome, 1997. - 67 P.

34. Avenido, R.A. Developing plant regeneration systems for in vitro conservation of mandarin (C. reticulata) and pummel (C. maxima) / R.A. Avenido, et al. // Philippine Journal of Crop Science - 2004. - Vol. 29 (1). - P. 76.

35. Ballester, A. Cold storage of shoot cultures and alginate encapsulation of shoot tips of Camellia japonica L. and Camellia reticulata Lindely / A. Ballester, L.V. Janiero, A.M. Vieites // Sci. Hort. - 1997. - Vol. 71. - P. 67-78.

36. Baruah, A.V. Micropropagation of three endangered Citrus species. 1. Shoot proliferation in vitro / A.V. Baruah, V.A. Nagaraju, Parthasarathy // Annals of Plant Phyhsiology. - 1996. - 10 (2). - P. 124-128.

37. Barlass, M. In vitro plantlet formation from Citrus species and hybrids / M. Barlass, K.G.M. Skene // Scientia Horticulture. - 1982. - Vol. 17. - P. 333341.

38. Batygina, T.V. Phenomenon of polyembryony. Genetic heterogenity of seeds / T.V. Batygina, V.I. Vinogradova // Russian Journal of Developmental Biology. - 2007. - Vol. 38. - P. 126-151.

39. Bauza, L. In vitro propagation of Paeonia sufrtuticosa: Developmental effect of exogenous hormones during the multiplication phase / L. Bauza, M. Jacques, E. Miginiac // Sci. Hortic. - 1994. - Vol. 57. - P. 241-251.

40. Begum, F.A comparative study of axillary shoot proliferation from the nodal explants of three varieties pummelo (Citrus grandis L. Osb.) / F. Begum, et al. // Biotechnology. - 2004. - Vol. 3. - P. 46-62.

41. Benabdesselam, F.M. Micropropagation of Algerian juvenil rootstocks Citrus species / M. Benabdesselam, B. Khettal, F. Bedjou // Life sciences Leaflets - 2011. - Vol. 18. - P. 707-717.

42. Bernet, G.P. Molecular discrimination of lemon cultivars / G.P. Bernet [et al.] //Hortic. Science. -2004. - Vol. 39 (1). - P. 165-169.

43. Bertrand-Desbrunais, B. Slow growth of in vitro conservation of Coffee / B. Bertrand-Desbrunais, M. Noirot, A. Charrier // Plant Cell Tiss. and Org. Cult.-1992.-Vol. 31.-P. 105-110.

44. Bhat, S.R. Regeneration of plants from long-term root culture of lime, Citrus aurantifolia (Christm. Swing) / S.R. Bhat, P. Chitralekha, K.P.S. Chandler // Plant Cell Tissue Org. Cult. - 1992. - Vol. 29. - P. 19-25.

45. Biotechnology in Agriculture and Forestry / ed. by Y.P.S. Bajaj. -Berlin : Springer-Verlag, 1997.-Vol. 18.-P. 327-338.

46. Bonga, J.M. Vegetative propragation in relation to juvenility, maturity and rejuvenation. / ed. by J.M. Bonga, D.J. Durzan // Tissue culture in forestry. -Boston : Dr. W. Junk publishers, 1982. - P. 387-412.

47. Breto, M.P. The diversification of Citrus Clementina Tan., a vegetatively propagated crop species / M.P. Breto, C. Ruiz, J. A. Pina, M. J. Asins // Molecular Phylogenetics and Evolution. - 2001. - Vol. 21. - P. 285-293.

48. Brown, D.C.W. Osmotic requirement for shoot formation in tobacco callus / D.C.W. Brown, D.W.M. Leung, T.A. Thorpe // Physiol. Plant. - 1979.-Vol. 46. -P. 36-41.

49. Brown, D.C.W. Crop improvement through tissue culture / D.C.W. Brown, T.A. Thorpe // World Journal of Microbiology and Biotech. - 1995. - Vol. II.-P. 409-415.

50. Cameron, J.W. Identical of twin hybrids of Citrus xPoncirus from strictly sexual seed parents / Gaber M.J. //Amer. J. Botany. - 1968. - Vol. 55. - P. 199-205.

51. Carimi, F. Somatic embryogenesis and plant regeneration from pistil thin cell layers of Citrus / F. Carimi, F. De Pasquale, F.G. Crescimanno // Plant Cell Reports. - 1999. - Vol. 18. - P. 935-940.

52. Carimi, F. Conservation strategies of citrus germplasm: in vitro and in vivo / F. Carimi // Improvement of the citrus sector by the setting up of the common conservation strategies for the free exchange of healthy citrus genetic resources / ed. by D'Onghia A.-M., Menini U., Martelli G.P. - Bari: Ciheam-IAMB, 2001.-P. 67-72.

53. Carimi, F. Micropropagation of Citrus / F. Carimi // Micropropagation of Woody trees and fruits. / ed. by F. Carimi, F. De Pasquale. - Kluwer Academic Publishers, 2003. - p. 590-619.

54. Cervera, M. Agrobacterium-mediated transformation of citrange: factors affecting transformation and regeneration / M. Cervera [et al.] // Plant Cell Rep. - 1998.-Vol. 18.-P. 271-278.

55. Charrier, A. The implications of biotechnology in germplasm conservation and utilization / A. Charrier, J. Dereuddre, F. Engelmann // Crop Genetic Resources of Africa. - 1991. - Vol. II. - P. 279-286.

56. Chaturvedi, H.C. Method for regeneration viable and fertile citrus plants by tissue culture from explants / H.C. Chaturvedi, Singh S.K., A.K. Sharma // United States Patent № 6,485,975 B1. - 2002.

57. Chen, X.D. Germplasm conservation and microRNA identification of in vitro plantlets in Citrus trees / X.D. Chen // [Electronic journal]. - 2012. - Mode access : http://www.globethesis.com/

58. Chen, W.L. Elimination of in vitro contamination, shoot multiplication, and ex vitro rooting of Aglaonema / W.L. Chen, D.M. Yeh // Hort. Science. — 2007. - Mode access : http://hortsci.ashspublications.org

59. Chiancone, B. Effect of polyamines on in vitro anther culture of Citrus Clementina Hort. ex Tan. / B. Chiancone // Plant Cell Tiss. Organ Cult. -2006.-Vol. 87.-P. 145-153.

60. Citrus Genetics, Breeding and Biotechnology / ed. by I.A. Khan. -CAB International, 2007. - P. 370.

61. Coleman, M.D. Pure culture response of ectomycorhizal fungi to imposed water stress / M.D. Coleman, C.S. Bledsoe, W. Lopushinsky // Can. J. Bot. - 1989. - Vol. 67. - P. 29-39.

62. Danthu, P. Restoration of rooting competence in mature Faidherbia albida, a Sahelian leguminous tree, through serial root sucker micrografting / P. Danthu, B. Hane, P. Sagna, Y. K. Gassama // New For. - 2002. - Vol. 24. - Pp. 239-244.

63. Darworth, 'C.E. Manipulation of endophytic fungi to promote their utility as vegetation biocontrol agents / C.E. Darworth, B.E. Callan // Endophytic Fungi in Grasses and Woody Plants. Systematics. - Ecol. Evol. / ed. by S.C. Redlin, L.M. Carris. - 1996. - P. 209-216.

64. De Fossard, R. A. Micropropagation of some members of the Myrtaceae / De Fossard R. A., De Fossard H. // Acta Hortic. - 1988. - 227. - P. 346-351.

65. Deora,N.S. Micropropagation of Capparis deciduas (Forsk.) Edgew-A tree of arid horticulture / N.S. Deora, N.S. Shekhawat // Plant Cell Rep. - 1995. -Vol. 15.-P. 278-281.

66. Dereuddre, J. Effect of cold hardening in cryopreservation of axially pear (Pyrus communis) shoot tips of in vitro plantlets / J. Dereuddre, C. Scottes, Y.A.M. Duron // C.R. Acad. SCI. - Paris, 1990. - P. 265-272.

67. De Pasquale, F. Characterization of five sour orange clones through molecular markers and leaf essential oils analysis / F. De Pasquale [et al.] // Scientia Hortic. - 2006. - Vol. 109. - P. 54-59.

68. Dice, L.R. Measures of the amount of ecologic association between species / L.R. Dice // Ecology. - 1945. - Vol. 26 (3). - P. 297-302.

69. Dodds, J.H. Experiments in plant tissue culture / J.H. Dodds, L.W. Roberts //New York : Cambrige Univ. Press., 1985.-2nd ed.-P. 172-179.

70. Drew, R.A. The application of biotechnology to the conservation and improvement of tropical and subtropical fruit species / R.A. Drew // Seed and Plant Genetic Resources Service Food and Agriculture Organization of the United Nations. - Rome, 1997. - Mode access : http://typo3.fao.org/

71. Driver, J.A. In vitro propagation of paradox walnut rootstock / J.A. Driver, A.H. Kuniyuki //Hort. Sci. - 1984. - Vol. 19. - P. 507-509.

72. Duron, M. In vitro propagation new apple genotypes / M. Duron // In vitro techniques: propagation and long term storage / ed. by A. Schafer-Menuhr -

1985.-P. 35-39.

73. D'Onghia, A.M. Somatic embryogenesis from style and stigma cultures eliminates Citrus tristeza virus (CTV) and Citrus variegation virus (CVV) / A.M. D'Onghia [et al.] //Fifteenth IOCV Conference, Short Communications. -2002-P. 413^416. — Mode access : http://www.ivia.es/

74. Engelmann, F. In vitro conservation of tropical plant germplasm -review / F. Engelmann // Euphytica. - 1991 - 57. - P. 227 - 243.

75. Engelmann, F. In vitro conservation methods in biotechnology and plant genetic resources: conservation and use / F. Engelmann // CABI Wellingford. -1997.-P. 119-162.

76. Engelmann, F. In vitro conservation of horticultural genetic resources - review of the state or the art / F. Engelmann // IPGRI - 1998. - Mode access : vvchr.agrsci.unibo.it/

77. Estrada-Luna, A. A. In vitro micrografting and the histology of graft union formation of selected species of prickly pear cactus (Opuntia spp.) / A. A. Estrada-Luna [et al.] // Sci. Horticult. - 2002. - Vol. 92. - Pp. - 317-327.

78. El-Sawy, A. Somatic embryogenesis and plant regeneration from undeveloped ovules of Citrus / A. El-Sawy, A. Gomaa, A. Reda, N. Danial // Arab J. Biotech. - 2006. - Vol. 9 (1). - P. 189-202.

79. Ewald, D. The influence of micrografting in vitro on tissue culture behavior and vegetative propagation of old European larch trees / D. Ewald, U. Kretzschmar // Plant Cell, Tissue Organ Cult. - 1996. - Vol. 44. - Pp. 249-252.

80. Fang, D.Q. Identification of closely related citrus cultivars with intersimple sequence repeat markers / D.Q. Fang, M.L. Roose // Theor. Appl. Genet. -1997.-Vol. 95.-P. 408^417.

81. FAO Citrus Fruit Production // Food And Agriculture Organization (FAO) Of The United Nations. - FAOSTAT, 2009. - Mode access : http://faostat.fao.org

82. Farahani, F. Micrografting and micropropagation of olive (Olea europea L. ) Iranian cultivar: Zard / F. Farahani, et al. // African Journal of Plant Science. -2011. - Vol. 5(11). - Pp. 671-675.

83. Febres, V. Citrus transformation: challenges and prospects / V. Febres [et al.] // [Electronic resourse]. - 2011. - Mode access : www.intechopen.com

84. Ford-Lloyd, B. Plant genetic resources: an introduction to their conservation and use / B. Ford-Lloyd, M. Jackson // London : Edvard Arnold Ltd.,

1986.-152 pp.

85. Garcia, R.M.J. Genetic analysis of apomixis in Citms and Poncirus by molecular markers / R.M.J. Garcia, J. Asins, E.A. Forner // Theor. Appl. Genet. - 1999. - Vol. 99. - P. 511-518.

86. Garcia-Luis, A. Explant orientation and polarity determine the morphogenic response of epicotyl segments of Troyer Citrange / A. Garcia-Luis [et al.]// Annals of Botan. - 1999. - Vol. 84.-P. 715-723.

87. Geier, T. Morphogenesis and plant regeneration from cultured organ fragments of Cyclamen persicum / T. Geier // Acta Hort. - 1977. - Vol. 78. - P. 167-174.

88. Germana, M. A. Somatic embryogenesis and plant regeneration from anther culture of C. aurantium and C. reticulata / M.A. Germana // Biologia -2003. - Vol. 58. - P. 843-850.

89. Giladi, I. A method for aseptic culture of bud explants from Citrus trees / I. Giladi, A. Altman, R. Goren // Scientia Horticulturae. - 1979. - Vol. 10 (4).-P. 357-362.

90. Giovanelly, A. Reinvigoration of mature chestnut (Castanea sativa) by repeated graftings and micropropagation / A. Giovanelly, R. Gianni // Tree Physiology. - 2000. - Vol. 20. - Pp. 1243-1248.

91. Gmitter, F.G. Citrus. Biotechnology of perennial fruit crops / F.G. Gmitter, J.W. Grosser, G.A. Moore // Oxon : CAB International, 1992. - P. 335369.

92. Goh, C.J. Plantlet regeneration through different morphogenic pathways in pommelo tissue culture / C.J. Goh [et al.] // Plant Cell Tissue Organ Cult. - 1995. - Vol. 43.-P. 301-303.

93. Gulsen, O. Chloroplast and nuclear genome analysis of parentage of lemons / O. Gulsen, M.L. Roose // J. Am. Soc. Hort. Sci. - 2001. - Vol. 126 (2). -P. 210-215.

94. Gupta, M. Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple-sequence repeats / M. Gupta [et al.] // Theor Appl Genet. - 1994. - Vol. 89. - P. 998-1006.

95. Hackett, W. P. Maturation and rejuvenation in woodyspecies. / W. P. Hackett, J. R. Murray // Micropropagation of Woody Plants / Ed. by M.R. Ahuja.Kluwer. - Academic Publishers, Dordrecht, 1993. - Pp. 93-105.

96. Han, S. H. Effect of embryogenic callus conditions on plant regeneration in Satsuma mandarin (Citrus unshiu Marc.) / S.H. Han, S.K. Kang, H.J., H.Y. Kim. // J. of Plant Biotechnology. - 2002. - Vol. 4(1).- P. 29-32.

97. Hancevic, K. The production of Citrus tristeza virus-free Zorica Rana, a Croatian selection of Satsuma mandarin / K. Hancevic, D.H. Musinov, S. Cerni // Journal of Food, Agriculture and Environment. - 2009. - Vol. 7 (3, 4). - P. 254257.

98. Hao, Y. J. Occurrence of chromosomal variations and plant regeneration from long term cultured Citrus callus / Y.J. Hao, X.X. Deng. // In vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. - 2002. - Vol. 38 (5). - P. 472480.

99. Helander, M.L. Natural variation and effects of anthropogenic environmental changes on endophytic fungi in trees / M.L. Helander, S. Neuvonen, H. Ranta // Fungi in Grasses and Woody Plants / ed. by Redlin S. C., Carris L. M. Endophytic. - Syst. Ecol. Evol. - 1996. - P. 197-207.

100. Herman, E.B. Non-axenic plant tissue culture: possibility and opportunities / E.B. Herman // Acta Hort. - 1990. - Vol. 280. - P. 233-248.

101. Hopkins, W.G. Introduction to plant physiology / W.G. Hopkins // New York : John Wily & Sons Inc., 1995. - P. 1-20.

102. Hussein, E. Genetic analysis in some Citrus accessions using microsatellite and AFLP based markers / E. Hussein, S. Abd-Allaa, A. Awad, M. Hussein // Arab J. Biotech. - 2003. - Vol. 2. - P. 202-223.

103. Hvoslef-Eide, A.K. Effect of pre-storage conditions on storage of in vitro cultures of Nephrolepis exallata L. and Cordyline fruticosa L. / A.K. Hvoslef-Eide // Plant Cell Tiss. and Org. Cult. - 1992. - Vol. 28. - P. 167-174.

104. Jajoo, A. In vitro propagation of Citrus limonia Osbeck through nucellar embryo culture / A. Jajoo // Current Research Journal of Biological Sciences. - 2010. - Vol. 2 (1). - P. 6-8.

105. Jinren, Z. Studies on germplasm conservation in viti-o of plantlets and the changes of endogenous hormones in the process of conservation in Citrus plants / Z. Jinren [et al.] // China Papers. - 2010. - Mode access : http://mt.chma-papers.com/l/?p=l 61736

106. Kameswara, R.N. Plant genetic resources: Advancing conservation and use through biotechnology / R.N. Kameswara // African Journal of Biotechnology. - 2004. - Vol. 3 (2). - P. 136-145.

107. Kanchanapoom, K. Micropropagation and in vitro germplasm conservation of endangered Musa balbisiana 'Kluai Hin' (BBB group) / K. Kanchanapoom, N. Promsorn // African Journal of Biotechnology. - 2012. - Vol. 11 (24).-P. 6464-6469.

108. Kitto, S.L. In vitro propagation of Carrizo citrange / S.L. Kitto, M.J. Young//Hort. Science. - 1981.-Vol. 16.-P. 305-306.

109. Khan, I.A. Frequency and characteristics of nucellar and zygotic seedlings in three cultivars of trifoliate orange / I.A. Khan, M.L. Roose // Journal of American Society for Horticultural Science. - 1988. - Vol. 113. - P. 105-110.

110. Kotsias, D. An investigation on the effect of different plant growth regulating compounds in in vitro shoot tip and node culture of lemon seedlings / D. Kotsias, P.A. Roussos // Sci. Hortic. - 2001. - Vol. 89. - P. 115-128.

111. Koltunow, A.M. Anther, ovule, seed, and nucellar embryo development in Citrus sinensis cv. Valencia / A.M. Koltunow, K. Soltys, N. Nito et al. // Can. J. Bot. - 1995. - Vol. 73.-P. 1567-1582.

112. Krueger, R.R. Use of molecular markers in management of citrus germplasm resources / R.R. Krueger, M.L. Roose // Jour, of the Amer. Soc. for Hort. Sci. - 2003. - Vol. 128 (6). - P. 827-837.

113. Kumar, S. ISSR polymorphism in Indian wild orange (Citrus indica Tanaka, Rutaceae) and related wild species in North-east India / S. Kumar, S.N.

Jena, N.K. Nair // Sci. Hortie. - 2010. - Vol. 123 (3). - Mode access : http://www.researchgate.net/

114. Kumar, G. In vitro micropropagation of different species of Citrus / G. Kumar, R. Srivastara // Research J. of Biotech. - 2012. - Vol. 7 (4). - P. 96.

115. Kwaitkowski, S. Serial microtuber formation as a long-term conservation for in vitro potato germplasm / S. Kwaitkowski, M.V. Martin, C.R. Brown // Amer. Pot. J. -r-1988. - Vol. 65. - P. 369-375.

116. Kwapata, M. Micropropagation: principe et technique. / La multiplication végétative des ligneux en agroforesterie, World agroforestry Centre, ICRAFT, 2003.-P. 142.

117. Lane, W.D. Regeneration of apple plants from shoot meristem tips / W. D. Lane // Plant Sci Lett. - 1978. - Vol. 13. - P. 281-285.

118. Lata, H. In vitro germplasm conservation of Podophyllum peltatum L. under slow growth conditions / H. Lata [et al.] Il In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. -2010.-Vol. 46.-P. 22-27.

119. La Patra, S. Potential for cross-contamination of in vitro explants cultures initiated from Ichthyophonus-infected rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) / S. LaPatra, R. Kocan, P. Hershberger // Journal of Fish Diseases. - 2008. - Vol. 31. P. 317-320.

120. Leakey, R. R. B. Physiology of vegetative reproduction / R. R. B. Leakey // Encyclopedia of Forest Sciences, 2004. - [Electronic resourse] [e-mail].

121. Lin, R. In Vitro Conservation Of Germplasm By Tube Plantlets And The Related Physiological And Anatomical Studies In Citrus In Fujian Province / R. Lin // [Electronic journal]. - 2007. - Mode access : http://www.globethesis.com/

122. Lipavska, H. Uptake of mannitol from media by in vitro grown plants / H. Lipavska, D. Vreugdenhil // Plant Tiss. And Org. Cult. - 1996. - Vol. 45. - P. 103-107.

123. Liu, X. Clonal propagation of guava (Psidium guajava L.) on nodal expiants of mature elite cultivar / X. Liu, G. Yang // [Electronic resource]. - 2011. - Mode access : http://www.pagepress.org/

124. Lloyd, G.Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture / G. Lloyd, B. McCown // Combined Proceedings of the International Plant Propagators' Society. - 1981. - Vol. 30. - P. 421^427.

125. Maggon, R. Promotion of adventitious bud regeneration by ABA in combination with BAP in epicotyls and hypocotyl expiants of sweet orange (Citrus sinensis L. Osbeck) / R. Maggon, B.D. Singh // Sci Hortic. - 1995. - Vol. 63. - P. 123-128.

126. Malaurie, B. Medium-term and long-term in vitro conservation and safe international exchange of yam {Dioscorea spp.) germplasm / B. Malaurie // [Electronic resource]. - 1998. - Mode access : http://eib.ucv.cl/

127. Marin, M.L. Conservation of Citrus germplasm in vitro / M.L. Marin, N. Duran-Vila // Am. Soc. Hort. Sei. - 1991.-Vol. 116.-P. 740-746.

128. Mauk, P.A. Questions and Answers to Citrus Management / P.A. Mauk, T. Shea // California : UCCE Riverside County, 1994. - 3rd Ed. - Mode access : http://homeorchard.ucdavis.edu/

129. Mngomba, S.A. Efficacy and utilization of fungicides and other antibiotics for aseptic plant cultures / S.A. Mngomba [et al.] // Fungicides for Plant and Animal Diseases. —2012. - Mode access : http://www.intechopen.com.

130. Moges, A. D. Slow growth in vitro preservation of African violet {Saintpaulia ionantha Wendl.) shoot tips / A.D. Moges, N.S. Karam, R.A. Shibli // Advanced in Hort. Sei. - 2003. - Vol. 17. - P. 1-8.

131. Montalvo-Peniche, M.C. In Vitro germplasm conservation of Habanero pepper (iCapsicum chínense Jacq.) / M.C. Montalvo-Peniche [et al.] // Hort. Science. - 2007. - Vol. 42 (5). - P. 1247-1252.

132. Moshkov, I.E. Plant growth regulators III: gibberellins, ethylene, abscisic acid, their analogues and inhibitors; miscellaneous compounds / I. E. Moshkov [et al.] // Plant propagation by tissue culture / ed. by George E.F., Hall M.A., De Klerk G.J. - Dordrecht: Springer, 2008. - P. 227-282.

133. Mukhtar, R. In Vitro Regeneration and Somatic Embryogenesis in {Citrus aurantifolia and Citrus sinensis) / R. Mukhtar, M.M. Khan, R. Rafiq // Internat. J. of Agricul. and Biol. -2005. - Vol. 07 (3). - P. 518-520.

134. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15.-P. 473-497.

135. Murashige, T. Growth factor requirements of citrus tissue culture / T. Murashige, D.P.F. Tucker // Proc.lst Intl. Citrus Symp. / ed. by H.D. Chapman. -Univ. of California, Riverside, 1969.-Vol. III.-P. 1155-1161.

136. Murashige, T. A technique of shoot apex grafting and its utilization towards recovering virus-free Citrus clones / T. Murashige [et al.] // Hort. Science. -1972.-Vol. 7.-P. 118-119.

137. Nax, A.A. In vitro studies on micrografting techniquein two cultivars of citrus to produce virus free plants / A.A. Nax, M.J. Jaskani, H. Abbas, M. Qasim // Pak. J. Bot. - 2007. - Vol. 39 (5). - P. 1773-1778.

138. Navarro, L. Improvement of shoot-tip grafting in vitro for virus free citrus / L. Navarro, C.N. Roistacher, T. Murashige // Americ. Soc. Hort. Sei. -1975.- Vol. 100.-P. 471-479.

139. Navarro, L. Citrus shoot-tip grafting in vitro and its application: a review. / L. Navarro // Proc. Int. Citriculture. - 1981. - Vol. 1. - P. 452^156.

140. Navarro, L. Aberrant citrus plants obtained by somatic embryogenesis of nucellus cultured in vitro / Navarro L., Ortiz J., Juárez J. // Hort. Science. -1985.-Vol. 20.-P. 21.4-215.

141. Navarro, L. Aberrant citrus plants obtained by somatic embryogenesis of nucelli cultured in vitro / L. Navarro, J. M. Ortiz, J. Juarez // Hort. Science. -1985.-Vol. 20.-P. 214-215.

142. Navarro, L. Application of shoot-tip grafting in vitro into woody species / L. Navarro // Acta Horticult. - 1988. - Vol. 227. - P. 43-55.

143. Navarro, L. Therapy and citrus improvement. Improving therapy methods for citrus germplasm exchange / L. Navarro, E. L. Civerolo, J. Juarez, S. M. Garmsey // Proc. 9th Conf. of Int. Org. of Citrus Virologists. - IOCV Riverside, 1991.-P. 400-408.

144. Navarro, L. Citrus shoot tip grafting in vitro / L. Navarro // Biotechnology in Agr. and Forestry. - 1992. - Vol. 18. - P. 327-338.

145. Negash, A. In vitro conservation of enset under slow-growth conditions / A. Negash [et al.] // Plant Cell, Tissue and Organ Culture - 2001. -Vol. 66.-P. 107-111.

146. Niang, D. In vitro micrografting of Sterculia setigera Del. / D. Niang, et al. // African Journal of Biotechnology. -2010. - Vol. 9(50). - Pp. 8613-8618.

147. Niedz, R.P. Control of in vitro contamination of explants from greenhouse- and field-grown trees / R.P. Niedz, M.G. Bausher // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. -2002. -Vol. 38. - P. 468-471.

148. Niedz, R.P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semipermeable membranes / R.P. Niedz // Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 2006. - Vol. 84. - P. 353-357.

149. Nito, N. In Vitro plantlet formation from juice vesicle callus of Satsuma (Citrus imshiu Marc.) / N. Nito, M. Iwamasa // Plant Cell Tiss. Org. Cult. -1990.-Vol. 20.-P. 137-140.

150. Oh, S.D. In vitro micropropagation of Yooza (Citrus junos) 1. Plant regeneration from callus induction from shoot tips / S.D. Oh, W.S. Song, J.S. Kim, E.H. Park. // J. of Korean Society for Hort. Sci. - 1991. - Vol. 32 (1). - P. 87-96.

151. Omura, M. Shoot tip culture of citrus. Culture condition / M. Omura, T. Hidaka // Bull. Fruit Tree Res. Stat. - 1992. - Vol. 22. - P. 23-26.

152. Orlikowska, T. Effect of in vitro storage at +4 °C on survival and proliferation of two apple rootstocks / T. Orlikowska // Plant Tiss. And Organ Cult. - 1992. - Vol. 31. - P. 1-7.

153. Ou, Y.J.S Studies On Ultrastructure And Calcium Distribution During In Vitro Conservation Of Plantlets In Citrus Microcarpa / Y.J.S Ou // [Electronic journal]. - 2011. - Mode access : http://www.globethesis.com/

154. Pattnaik, S.K. Rapid clonal propagation of three mulberries, Morus cathayana Hemsl, M. ihou Koiz, M. serrata Roxb, through in vitro culture of apical shoot buds and nodal explants from mature trees / S.K. Pattnaik, P.K. Chand // Plant Cell Rep. - 1997. - Vol. 16. - P. 503-508.

155. Paudial, K.P. In vitro propagation of pummelo (C. grandis L. Osbeck) / K. P. Paudial, N. Haq // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. - 2000. - Vol. 36. - P. 511-516.

156. Payghamzadeh, K. In vitro propagation of walnut / K. Payghamzadeh // African Journal of Biotechnology. - 2011. - Vol. 10 (3). - P. 290-311.

157. Perez-Tornero, C.I. An efficient protocol for micropropagation of lemon (Citrus limon) from mature nodal segments / C.I. Perez-Tornero, I. Talion, I. Porras //Plant Cell Tiss. Organ Cult. -2010. - Vol. 100. - P. 263-271.

158. Perez-Tornero, O. Medium-term storage of apricot shoot tips in vitro minimal growth methods / O. Perez-Tornero, F. Ortin-Parraga, J. Egea, L. Burgos // HortScience. - 1999. - Vol. 34. - P. 1277-1278.

159. Perez-Tornero, O. Assessment of polyembryony in lemon: rescue and in vitro culture of immature embryos / O. Perez-Tornero, I. Porras // Plant Cell Tissue Organ Cult. - 2008. - Vol. 93 (2). - P. 173-180.

160. Perez-Clemente, R.M. In vitro tissue culture approaches for the study of salt stress in citrus / R.M. Perez-Clemente, A. Montoliu, P. Lopez et al. // Biosaline Agriculture and High Salinity Tolerance. - 2008. - P. 37-42.

161. Perez-Molphe-Balch, E. In vitro plant regeneration of Mexican lime and mandarin by direct organogenesis / E. Perez-Molphe-Balch, N. Ochoa-Alejo // HortSci. - 1997. -Vol. 32. - P. 931-934.

162. Perrier, X. DARwin software / X. Perrier, J. Jacquemoud-Collet // [Electronic resource]. - 2006. - Mode access : http://darwin.cirad.fr/darwin.

163. Rahman, M.M. In vitro propagation of banyan tree (Ficus benghalensis L.) - A multipurpose and keystone species of Bangladesh /M.M. Rahman, M.N. Amin, M.F. Hossain // Plant Tissue Cult. Biotech. - 2004. - Vol. 14 (2).-P. 135-142. ■

164. Ramage, C.M. Inorganic nitrogen requirements during shoot organogenesis in tobacco leaf discs / C. M. Ramage, R.R.Williams // J. Exp. Bot. -2002.-Vol. 53.-P. 1437-1443.

165. Randall, P. In vitro gennination of Citrus seed / P. Randall // Proc. Fla. State Hort. Soc.-2008.-Vol. 21.-P. 148-151.

166. Rangan, T.S. In vitro initiation of nucelar embryos in monoembryonic citrus / T. S. Rangan, T. Murashige, W. P. Bitters // Hort. Science. - 1968. - Vol. 3.-P. 226-227.

167. Rathore, J.S. Micropropagation of mature tree of Citrus limon / J.S. Rathore, M.S Rathore, M. Singh et al. II Indian journal of biotechnology. - 2007. -Vol 6.-P. 239-244. ■

168. Reed, B.M. Improved survival of in vitro stored Rubus germplasm / B.M. Reed // J. Am. Hort. Sci. - 1993. - Vol. 118. - P. 890-895.

169. Reed, B.M. Cryopreservation and long-term storage of pear germplasm / B.M. Reed [et al.] // In vitro Cell. Dev. Biol. - Plant. - 1998. - Vol. 34. - P. 256-260.

170. Reed, B.M. In vitro storage conditions for mint germplasm / B.M. Reed //Hort. Science. - 1999. - Vol. 34. - P. 350-352.

171. Revilla, M.A. In vitro reinvigoration of mature oil tree (Olea europaea L.) through micrografting / M. A. Revilla, et al. // In vitro Cell. Dev. Biology-Plant. - 1996. - Vol. 32. - Pp. 257-261.

172. Saini, H. K. Direct shoot organogenesis and plant regeneration in rough lemon (Citrus jambiri Lush.) / H. K. Saini, M. S. Gill, M. I. S. Gill // Indian Journal of Biotechnology. - 2010. -Vol. 9.-P. 419-423.

173. Samanhudi, In vitro axillary bud multiplication of Citrus nobilis Lour, in Indonesia / Samanhudi, S. A. Tetrani, M. Rahayu // Journal of Life Sciences. -2010. - Vol. 4 (4). - P. 39-44.

174. Sanogo, D. Micropropagation et rajeunissement in vitro de Khaya senegalensis (Desr.) Juss. / D. Sanogo // Mémoire de DEA de Biologie Végétale, F ST, UCAD. - 1995. - P. 65.

175. Savidan, Y. Apomixis genetics and breeding / Y. Savidan // Plant Breeding Reviews.-2000. -Vol. 18.-P. 13-85.

176. Sarkar, D. Factors affecting minimal growth conservation of potato microplants in vitro / D. Sarkar, P.V. Naik // Euphytic. - 1998. - Vol. 102. - P. 275-280.

177. Saunt, J. Citrus varieties of the world / J. Saunt // England, Sinclair International Ltd., 1990.-P. 126.

178. Shahsavar, A.R. Characterization of Citrus germplasm including unknown variants by inter-simple sequence repeat (ISSR) markers / A.R. Shahsavar [et al.] // Sei. Hortic. - 2007. - Vol. 112. - Mode access : http://pubget.com

179. Shailendra, V. In vitro adventitious shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Feronia limonia. L. (Swingle) / V. Shailendra [et al.] // In Vitro Cell. Dev. Bio - Plant. - 2005. - Vol. 41. - P. 296-302.

180. Shankar, A.A. Evaluation of inter-simple sequence repeat analysis for mapping in Citrus and extension of the genetic linkage map / A.A. Shankar, G.A. Moore // Theor. Appl. Genet. -2001. - Vol. 102. - P. 206-214.

181. Sharma, S. Production of Indian citrus ringspot virus free plants of Kinnow employing chemotherapy coupled with shoot tip grafting / S. Sharma [et al.] // J. Of Central European Agriculture. - 2007. - Vol. 8 (1). - P. 1-8.

182. Sharma, S. In vitro propagation of citrus rootstocks / S. Sharma, A. Prakash, A. Tele // Not. Bot. Hort. Agrobot. Cluj. - 2009. - Vol. 37 (1). - P. 8488.

183. Shibli, R.A. In vitro acclimatization of Ciysantemum morifolium Ramat. after in vitro water stress / R.A. Shibli // Plant Tiss.Cult. - 1991 - Vol. 1. -P. 97-100.

184. Shibli, R.A. Osmotic adjustment and growth responses of three (Chrysanthmum morifolium Ramat.) cultivars to osmotic stress induced in vitro / R.A. Shibli, L.A. M. Smith, A.L. Spomer // J. Plant Nutr. - 1992. - Vol. 15. - P. 1373-1381.

185. Shibli, R.A. Slow growth in vitro conservation of bitter almond (Amigdalus communis L.) / R.A. Shibli [et al.] II Advanced in Hort. Sei. - 1999. -Vol. 13.-P. 33-34.

186. Shibli, R.A. Criopreservation of 'Nabali' olive {Olea europeae L.) somatic embrios by encapsulation-dehydration and encapsulation-vitrification / R.A. Shibli, K.A. Al-Juboory // Cryoletters. - 2000. - Vol. 21. - P. 357-366.

187. Shibli, R. A. In vitro conservation of plant genetic resourses: a review / R. A. Shibli [et al.] // World J. of Agricultural Sci. - 2006. - Vol. 2 (4). - P. 372382.

188. Singh, B. In vitro micrografting for the production of Indian citrus ringspot virus (ICRSV) - free plants of kinnow mandarin (iCitrus nobilis Lour X C. deliciosa Tenora) / B. Singh [et al.] // Plant Biotechnol. Rep. - 2008. - Vol. 2 - P. 137-143.

189. Singh, I.P. Comparative growth of mycrografted plantlets and seedlings of citrus varieties / LP. Singh, V.A. Parthasarathy // Agrotrypica. - 2003. -Vol. 15 (1). - P. 9-16.

190. Singh, S. In Vitro Propagation of Citrus reticulata Blanco and Citrus limon Burm. / S. Singh [et al.] // Hort. Science. - 1994. - Vol. 29 (3). - P. 214216.

191. Singh, S. Citrus biotechnology: Achievements, limitations and future directions / S. Singh, M.V. Rajam // Physiol. Mol. Biol. Plants. - 2009. - Vol. 15(1).-P. 3-22.

192. Singh, S. Highly efficient and rapid plant regeneration in Citrus sinensis / S. Singh, M. V. Rajam // J. Plant Biochemistry & Biotechnology. - 2010. -Vol. 19 (2).-P. 195-202.

193. Siragusa, M. The genetic variability of Sicilian lemon germplasm revealed by molecular marker fingerprints / M. Siragusa, F. De Pasquale, L. Abbate // J. Amer. Soc. Hort. Sci. - 2008. - Vol. 133 (2). - P. 242-248.

194. Smith, M.K. Current applications of tissue culture in plant propagation and improvement / M.K. Smith, R.A. Drew // Australian Journal of Plant Physiology. - 1990. - Vol. 17. - P. 267-289.

195. Song, W.S. Plant regeneration in Citrus grandis Osbeck through somatic embryogenesis. 1. Effect of plant growth regulators on embryogenic callus induction and somatic embryogenesis / W. S. Song, S. D. Oh, H. M. Cho, J. H. Park// Res. Rep. Rural Devel. Admin. Biotech. - 1991. - Vol. 33. - P. 14-21.

196. Spolaore, S. A simple protocol for transient gene expression in ripe fleshy fruit mediated by Agrobacterium / S. Spolaore, L. Trainotti, G. Casadoro // Exp. Bot. -2001.- Vol. 52. - P. 845-850.

197. Tahtamouni, R.W. Preservation at low temperature and cryopreservation in wild pear (Pyrus siriaca) / R.W. Tahtamouni, R.A. Shibli // Advansed in Hort. Sci. - 1999.-Vol. 13.-P. 156-160.

198. Thanh, N.N. Micropropagation of "Volkamer" lemon (C. Volkameriana) as citrus rootstock / N.N. Thanh, C.N. Minh. // [Electronic resource]. -2010. - Mode access : http://www.ctu.edu.vn/

199. Tomaz, M.L. Somatic embryogenesis in Citrus spp.: carbohydrate stimulation and histodifferentiation / M.L.Tomaz, B.M.J. Mendes, F.D.A. Mourao et al. // In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. - 2001. - Vol. 37. - P. 446^152.

200. Usman, M. In vitro multiple shoot induction from nodal expiants of citrus cultivars / M. Usman, S. Muhammad, B. Fatima // Cent. Eur. Agric. - 2005. -Vol. 6.-P. 435-442.

201. Van Hoof, P. Méthode pratique de culture de méristèmes de fraisiers / P. Van Hoof // Bulletin de la Société Royale Botanique Belge. - 1974. - Vol. 107. - P. 5-6.

202. Van Le, B. High frequency shoot regeneration from trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.) using the thin cell layer method / B. Van Le [et al.]. // Life Sciences. - 1999. - Vol. 322. - P. 11056-11111.

203. Wang, P.J. Micropropagation through meristem culture / P.J. Wang, A. Charles // Biotechnology in agriculture and forestry. High-Tech and propagation. - 1991. - Vol. 17. - P. 32-52.

204. Wang, Z.C. In vitro conservation of Citrus germplasm / Z.C. Wang // [Electronic journal]. - 2004. - Mode access : http://www.globethesis.com/.

205. Wilson, S.B. Media composition and light effect storability and post storage recovery of micropropagated Hosta plantlets / S.B. Wilson, N.C. Rajapakse, R.E. Young // Annual Review of Plant Physic. - 2000. - Vol. 29. - P. 121-148.

206. Wochok, Z.S. Gibberellic acid promotes Atriplex shoot multiplication and elongation / Z.S. Wochok, C.J. Sluis // Plant. Sci. Lett. - 1980. - Vol.17. - P. 363-369.

207. Withers, L.A. The test tube genebank - a safe alternative to field conservation / L.A. Withers J.M.M. Engels // IBPGR Newsl. for Asia and the Pacific. - 1990. - Vol. 3. - P. 1-2.

208. Zandvoort, E.A. In vitro storage of Xanthosoma spp. under minimal growth conditions / E.A. Zandvoort, M.J.H. Hulshof, G. Staritski // Plant Cell Tiss. And Org. Cult. - 1994. - Vol. 36. - P. 309-316.

209. Zhang, J. Studies On Germplasm Conservation In Vitro Of Plantlets And The Changes Of Endogenous Hormones In The The Process Of Conservation In Citrus Plants / J. Zhang // [Electronic journal]. - 2009. - Mode access : http://www.globethesis.com/

210. Zimmermann, U. Physical aspects of water relations of plant cells / U. Zimmermann, E. Steudle // Advances in Botanical Research. - 1978. - Vol. 6. - P. 45-117.

211. www.phytotechlab.com

212. www.botanicblog.ru

213. http://dic.academic.ru/dic.nsf/enc_biology/1277

214. http://forum.bestflowers.rU/viewtopic/t/53512/start/120/

215. http://www.homecitrus.ru/

216. http://evrogen.ru/

217. http://www.limon-citron.ru/ru/few-of-the-citrus.html

218. http://gryadka.net/