Биотехнологические методы ускоренного размножения и оздоровления, селекции бессемянных сортов и создания коллекций генофонда винограда тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.08, доктор сельскохозяйственных наук Дорошенко, Наталья Петровна

• Дорошенко, Наталья Петровна
• доктор сельскохозяйственных наук
• 1999

Оглавление диссертации доктор сельскохозяйственных наук Дорошенко, Наталья Петровна

BBFJTFHHF

1.1. Клональное микроразмножение: достоинства, этапы, необходимые условия. IS

1.2. Оздоровление растений от вирусов через культуру меристемы.

1.3. Культура изолированных зародышей в селекции

1.4. Длительное хранение и создание коллекций in vitro

1.5. Резюме анализа литературных данных

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3. КЛОНАЛЬНОЕ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И ОЗДОРОВЛЕНИЕ РАСТЕНИЙ

3.1. Стерилизация исходных эксплантов и предотвращение ингибирования у них ростовых процессов.

3.2. Меры борьбы с хронической инфекцией, вызываемой медленно растущими патогенами при продолжительном культивировании.

3.3. Выбор питательных сред..

3.3.1. Испытание питательных сред на этапе ввода в культуру тканей эксплантов малых и предельно малых размеров..

3.3.2. Испытание питательных сред на этапе микрочеренкования побегов.

3.4. Оптимизация клонального микроразмножения

3.4.1. Оптимизация питательной среды добавлением

6-БАП на различном уровне углеродного питания

3.4.2. Оптимизация питательной среды добавлением в ее состав стимуляторов роста естественного происхождения .1иЗ

3.4.3. Оптимизация физических условий культивирования винограда in vitro.<.

- з

3=5= Воздействие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона нивкой интенсивности в культуре тканей винограда in vitro.

3.6. Адаптация растений к нестерильным условиям.

3.7. Создание сортовых маточников интенсивного типа из саженцев, оздоровленных и размноженных in vitro.

4. СОЗДАНИЕ БЕССЕМЯННЫХ СОРТОВ ВИНОГРАДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ СЕМЯПОЧЕК Ш VITRO

4.1. Эмбриогенез при самоопылении бессемянных сортов винограда.

4.2. Подбор пар и комбинаций скрещивания.

4.3. Выявление оптимальных сроков изолирования семяпочек

4.4. Подбор питательной среды.

4.5. Морфологическая характеристика сеянцев, полученных из семяпочек в культуре тканей

4.6. Агробиологическая оценка сеянцев.

5. ТЕХНОЛОГИЯ СОХРАНЕНИЯ IN VITRO ГЕНОФОНДА ВИНОГРАДА.

5.1. Депонирование при положительной пониженной температуре.

5.2. Депонирование при температуре +4°С в условиях климатической камеры ИФР им, К.А, Тимирязева.

5.3. Разработка депонирования винограда in vitro с применением ингибитора роста,.

5.4. Разработка метода хранения винограда in vitro с применением осмотических ингибиторов,.,,.,,,.,

5.5. Разработка депонирования растений с применением естественных ингибиторов роста.

5.6. Депонирование при пониженной температуре и освещенности с добавлением естественных ингибиторов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнологические методы ускоренного размножения и оздоровления, селекции бессемянных сортов и создания коллекций генофонда винограда»

В настоящее время в биологической науке и в сельскохозяйственной практике; в том числе и в виноградарстве, на передний край выходит проблема адаптации; так как о ней связаны возможности реализации генотипа в онтогенезе, ареалы культур и, что особенно важно, получение максимаяь ного хозяйственного эффекта.

Усилению адаптации виноградарства в условиях интенсификации должно способствовать применение современных методов биотехнологии.

Появившийся относительно недавно, но уже прочно вошедший в жизнь термин "биотехнология" (биологическая технология) включает в себя два, казалось бы, несовместимых понятия - промышленность и биологию.

Наиболее всеобъемлюще функцию биотехнологии меняно охарактеризовать как целенаправленное превращение материи (и энергии) с помощью организмов иди продуктов их жизнедеятельности.

Термин "биотехнология" впервые использовал венгр Карл Эреки в 1919 г. для обозначения работ, в которых продукты получают о помощью живых организмов. В биологическом энциклопедическом словаре, изданном в 1986 г., биотехнологией называют использование живых организмов и биологических процессов в производстве. Европейская Федерация биотехнологии (ЕПЗ) определяет современную биотехнологию как использование наук о природе (биологии, химии, физики) и инженерных наук (например, электроники) применительно к биосистемам в биоиндустрии, а Европейская комиссия (ЕС) дополняет - для того, чтобы снабдить биологическое сообщество требуемыми продуктами и услугами. Будучи древней сферой производства, биотехнология представляет собой ультрасовременный этап научно-технического прогресса.

Биотехнология решает не только конкретные задачи науки и производства. У нее есть более глобальная методологическая задача - она расширяет и ускоряет с помощью достижений научно-технического прогресса масштабы воздействия человека на живую природу и способствует приспособлению живых систем к условиям существования человека, выступая в роли нового мощного фактора, антропогенной адаптивной эволюции.

В прошлом влияние человека- на живые организмы было ограничено главным образом искусственным отбором. В настоящее время искусственный отбор входит в формирующуюся биотехнологию как одна из ее исторических предпосылок. Этот глобальный (общебиологический) и конкретный (научно-производственный) аспекты взаимоотношений биотехнологий с живой природой тесно смыкаются и стимулируют друг друга. Они представляют собой единую систему, которая на верхнем уровне смыкается с эволюцией, а на нижнем все больше "сращивает" живую природу с социальной и производственной сферами жизни человека,

Сегодня биотехнология включает практически все ветви биологии: классические - зоологию и ботанику как фундамент животноводства и растениеводства и экспериментальные - вирусологию, микробиологию, генетику, физиологию, биохимию и биофизику. Поскольку биотехнология имеет дело с организмами и продуктами их жизнедеятельности, она использует все уровни организации живого - молекулярный, клеточный, организменный и популяционный, Поэтому объектами ее изучения и применения служат отдельные молекулы, в особенности белки и нуклеиновые кислоты, культуры клеток и тканей, целостные одно- и многоклеточные организмы или их отдельные части (органы), сложные сообщества организмов разного уровня организации.

Особый успех выпал на долю клеточной биологии. Клеточные технологии, основанные на культивировании in vitro органов., тканей, клеток и изолированных протопластов высших растений., могут облегчить и ускорить традиционный селекционный процесс,

Р.Г, Вутенко (1964)., Г.С. Муромцев, Р.Г. Вутенко и др. (1990) отмечают следующие клеточные технологии; оплодотворение in vitro, культура незрелых гибридных семяпочек и зародышей, регенерация растений ив тканей летальных гибридов;, экспериментальная гаплои-дия;, клональное микроразмножение новых сортов, гибридов, линий, криосохранение генофонда, Кроме того, клеточные технологии эффективны в создании тестированного на отсутствие вирусов и других патогенов посадочного материала вегетативно размножаемых растений, Последнее особенно важно в виноградарстве,

В последние десятилетия опубликовано большое количество научных сообщений по культуре органов, тканей и клеток винограда in vitro. Обеор этих публикаций сделан А,И, Дитваком и А,Л, Кузьмен-ко (1982), Это позволило им отметить, что несмотря на то, что виноград является многолетним древесным растением, что, как известно, затрудняет и значительно усложняет работы in vitro, исследователям удалось преодолеть множество трудностей и четко .показать широкие потенциальные возможности метода,

На основании изучения имеющихся данных, их критического рассмотрения, учитывая быстрое возрастание количества работ по рассматриваемой проблеме, а также опыт, накопленный нашей лабораторией, можно с уверенностью заключить, что методы куль-туры органов, тканей и клеток in vitro должны занять прочное место в арсенале средств, определяющих значительный прогресс в селекции виноград,а и в деле производства посадочного материала этой древнейшей и широко распространенной сельскохозяйственной культуры.

Актуальность проблемы. Методы in vitro могут вносить ценный вклад на каждом этапе селекционного процесса. Использование кло-нального микроразмножения позволяет сократить сроки размножения новых сортов по сравнению с традиционными методами в 4-5 раз. Преимущества микроразмножения in vitro заключаются в необходимости малого количества исходного материала, минимальной лабораторной площади для культур,v в высоком коэффициенте размножения,

Клональное микроразмножение также является составной частью интегрированной защиты виноградных насаждений, тар: как., благодаря высокому коэффициенту размножения., является наиболее вероятным способом массового размножения перспективных устойчивых сортов винограда, Кроме этого, небольшой размер эксшганта, применяемого для клонального микроразмножения, поверхностная стерилизация его, асептический перенос на питательную среду и субкультивирование в условиях, исключающих инфицирование, приводит к оздоровлен!® полученных растений от филлоксеры, нематод, грибных и бактериальных патогенов,

В борьбе против вирусных болезней винограда не эффективно использование агротехнических или химических методов. Единственным способом борьбы является получение безвирусного посадочного материала и размножение его в условиях, исключающих вторичное заражение,

Наиболее надежным методом оздоровления посадочного материала винограда является использование культуры меристемы in vitro и последующее клональное микроразмножение оздоровленных растений.

Оздоровленный посадочный материал является базисным для создания маточных насаждений и перевода виноградарства на элитную основу, что обеспечит продление эксплуатации виноградников и повышение их продуктивности на 30-40%.

Ееосемянность является ценным хозяйственным признаком для сортов винограда всех направлений использования - потребления в свежем виде, приготовления сушеной продукции. Кроме того., это прекрасное сырье для винодельческой промышленности. Однако, группа бессемянных сортов пока, еще малочисленна. Практически отсутствуют бессемянные сорта в существующем сортименте винограда России.

Перспективным направлением создания бессемянных сортов является использование культуры изолированных семяпочек (зародышей в семяпочке) in vitro. Этот метод основан на получении жизнеспособного потомства от скрещивания бессемянных сортов между собой с последующим культивированием зародышей семени в условиях in vitro. Это открывает принципиально новые перспективы; позволяет сократить продолжительность селекции и увеличить бессемянность.

Важным вкладом в практику сельского хозяйства для вегетативно размножаемых культур стала технология сохранения в культуре in vitro генофонда, используемого в селекции, в виде растущих коллекций - периодически субкяонируемых пробирочных растений, оздоровленных методом культуры меристем. Цель коллекций - обеспечить селекционера в любое время генотипом, несущим искомые признаки, нужные для его работы.

Достоинство сохранения генотипов в виде коллекций in vitro заключается в возможности разместить на 1 иА площади в камере для культивирования более тысячи пробирок с растениями.

Насущной необходимостью является обеспечение коллекций материалом, находящимся под угрозой исчезновения.

Таким образом, в виноградарстве существует потребность в надежных методах хранения генофонда in vitro, также желательно участие в постоянном международном обмене материалом.

Цель и зядячи исследований. Цель исследований - разработать:

- технологический процесс клепального микроразмножения и оздоровления посадочного материала ценных аборигенных, интродуциро-ванных и новых высокопродуктивных, устойчивых к болезням, вредителям и неблагоприятным внешним условиям сортов винограда, обеспечивающий ускоренное размножение их с сохранением генетических особенностей, биологических и агрономических свойств;

- метод селекции винограда на бессемянность скрещиванием бессемянных сортов между собой и последующим культивированием изолированных семяпочек in vitro;

- методы сохранения in vitro коллекции сортов винограда для консервации генетических ресурсов, регионального и международного обмена коллекционным материалом.

Задачи исследований:

- усовершенствовать стерилизацию исходных эксплантов и мероприятия, исключающие ингкбирование ростовых процессов;

- разработать меры борьбы с хронической инфекций, вызываемой медленно растущими патогенами, проявляющимися при продолжительном культивировании пробирочных растений;

- подобрать питательную среду с тем, чтобы обеспечить оптимальные условия ввода в культуру тканей эксплантов малых (0,17-0,S5 мм) и предельно малых размеров (0,075-0,1 мм), обеспечивающих оздоровление растений, а также оптимальные условия на этапе микрочеренкования;

- разработать способы оптимизации клонального микроразмноже

- усовершенствовать адаптацию пробирочных растений к нестерильным условиям;

- разработать способы создания сортовых маточников интенсивного типа из саженцев, оздоровленных и размноженных in vitro;

- осуществить подбор родительских сортов и комбинаций скрещивания при селекции на беосемянкость;

- определить сроки изолирования семяпочек и пересадки их на питательные среды;

-подобрать питательные среды, способствующие образованию жизнеспособных эмбрионов;

- разработать методы "минимализации" роста пробирочных растений для продолжительного хранения винограда in vitro.

Положения, выносимые на защиту.

1, Теоретическое обоснование новых биотехнологических приемов технологического процесса клонального микроразмножения и оздоровления растений:

- способ регенерации растений из зксплантов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров, повышение регенерационной способности меристем;

- комплекс питательных сред на всех этапах развития от формирования меристематических зон, регенерации из них растений, укоренения регенерантов до высадки в грунт;

- способы оптимизации клонального микроразмножения;

- способ адаптации растений к нестерильным условиям,

2, Научно-методические разработки по селекции бессемянных сортов винограда:

- использование бессемянных родителей о последующей культу

- 11 рой изолированных семяпочек in vitro;

- приемы повышения эмбриогенеза при самоопылении и скрещивании бессемянных сортов,

3. Метод создания коллекции генофонда путем минимализации роста растений,

4, Практические рекомендации:

- по использованию технологии клонального микроразмножения и оздоровления посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа;

- по использованию в селекции стеноспермокарпических бессемянных сортов винограда, обеспечивающих при самоопылении и скрещивании высокий уровень эмбриогенеза и получение гибридных сеянцев.

Заключение диссертации по теме «Виноградарство», Дорошенко, Наталья Петровна

- 244 -ВЫВОДЫ

Проведенные исследования по применению методов биотехнологии в виноградарстве позволяют сделать следующие выводы и предложения:

1, При введении в культуру различных эксплантов: зеленых побегов с вегетирующих кустов винограда;, зеленых побегов, выращенных в лаборатории из вызревшей лозы; зеленых побегов, полученных в лаборатории из оздоровленных и адаптированных к нестерильным условиям растений; меристем установлен положительный результат применения в качестве дезифектанта гипохлорита кальция в концентрации 10% при экспозиции 30 мин. Экспозицию можно уменьшить до 20 мин,, если в качестве эксплантов использовать побеги о оздоровленных растений, Уменьшить ингибирование ростовых процессов и инфицирование при вводе эксплантов в куль-туру можно добавлением в питательную среду активированного угля (0,1%) или бициллина (0,1 мг/л),

2, Ввод в культуру эксплантов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых равмеров (0,075-0,1 мм) необходимо осуществлять на питательной среде Мурасиге и Окуга в два этапа: сначала на твердой питательной среде в течение 3-4 недель, а затем экспланты, увеличившиеся до 2 мм и более, переносить на жидкую питательную среду на мостики из фильтровальной бумаги, пробирки помещать на аппарат роллерного типа для культивирования их во вращающемся состоянии, Оптимальное содержание цитокинина 6-Б.АП для большинство сортов как в твердой, так и в жидкой питательной среде составляет 1,0 мг/л,

3, Совместное воздействие СВЧ-лучей и лазера (тонкий луч) на меристемы, высаженные на твердую среду, способствует ускоренному прохождению им фаз развития, увеличению размерных характеристик, снижает гибель из-за некроза тканей и обеспечивает, в конечном итоге, повышение регенерационной способности меристем в 5,5 pasa,

4, Оптимальной средой на этапе микрочеренкования, обеспечивающей необходимое развитие пробирочных растений, является основная питательная среда Мураоиге и Скуга. Для предотвращения вероятности возникновения генетических изменений возможна замена этой среды на среду Ли и де Фоссарда, в меньшей степени поддерживающую каллуоный рост. Эффективность применения этой среды установлена для культивирования сортов; Алан 1, Агат донской, Ромулуо, Рус-бол, Восторг,

5, Разработаны способы оптимизации клепального микроразмножения на этапе микрочеренкования, Под воздействием СВЧ-лучей у пробирочных растений увеличивается суточная скорость роста в 1,7-2,4 раза, число образовавшихся узлов на побеге - в 1,2-1,5 раза, что позволяет сократить период культивирования до 50-60 дней, Естественные стимуляторы роста из размолотых семян винограда в концентрации 0,25-0,5% способствуют значительному увеличению корневой системы пробирочных растений, лучшему росту побегов, развитию большей листовой поверхности, увеличению общей массы побегов. 6-БАП в количестве 0,05 мг/л обеспечивает оптимальное соотношение между длиной корней и побегов, стимулирует рост побегов, образование более крупных листьев, увеличение марсы растений, повышение жизнеспособности растений. Таким образом, исследованные способы оптимизации улучшают развитие пробирочных растений и обеспечивают закладку большего числа узлов на побеге, чем повышают эффективность клонального микроразмножения при высоком качестве микрочеренков,

6, Способ адаптации пробирочных растений к нестерильным ус

- 246 ловиям заключается в выборе и подготовке субстратов, последовательной обработке растений, извлеченных из пробирок, 1%-ным раствором маргандевокиолого калия и раствором индолилуксусной кислоты (10-15 мг/л), высадке растений в торфоперегнойные горшочки с субстратом, помещение их в индивидуальные пакеты из прозрачного пластикового материала с последующим культивированием на стеллажах ускоренного выращивания растений при температуре 25-27и0, освещенности 8-10 тыс, люксов, световом периоде 16 час. в течение 21-30 дней. Приживаемость растений в процессе адаптации составляет 96,6-97,4%.

7. Отеноопермокарпичеокие бессемянные сорта винограда могут при самоопылении образовывать жизнеспособные зародыши и растения, Однако уровень эмбриогенеза низкий. Эмбриогенез практически отсутствовал у сортов, имеющих массу семяпочек до 10 мг, и при ранних сроках изолирования (40 дней после цветения), что можно объяснить отсутствием в семяпочках полноценных зародышей. При массе семяпочек более 10 мг и более поздних сроках изолирования успех культуры семяпочек при самоопылении обусловлен генотипом бессемянного сорта, Из 14 изученных сортов и форм жизнеспособные зародыши и растения получены лишь у Русбола, гибридов N 311 и 342, Среди них по уровню эмбриогенеза выделяется Русбол, у которого жизнеспособные эмбрионы обнаружены во вое годы наблюдения. Учитывая это и то, что этот сорт является донором бессемянности, считаем перспективным использовать его в селекции бессемянных сортов in vitro,

8= Комбинационную способность выбранных пар бессемянных сортов винограда in vitro характеризуют следующие показатели: естественное прорастание семяпочек, наличие эмбрионов и змбрионопо-добных структур при вскрытий непророоших семяпочек; получение се

- 247 янцев кз проросших семяпочек и эмбрионов, выделенных при вскрытии семяпочек. Непосредственное прорастание семяпочек на питательной средеs более высокий эмбриогенез и образование сеянцев отмечены в тех комбинациях скрещивания, где материнскими формами были Кишмиш ЦТ Л, 1-15-7-1, 1-15-5-7} а отцовскими - Кишмиш уникальный, Русбол и Коринка русская, Большее число семяпочек проросло в комбинации скрещивания Кишмиш ЦГЛ х Русбол - 26,2 и 52,4%. Показатели эмбриогенеза увеличиваются в годы с теплым вегетационным периодом, когда сумма активных температур составляет 3500-3700°С и сопровождается выпадением повышенного количества осадков в мае (126 мм в 1991 г,) ив июне (86 мм в 1995 г.).

9, Более высокий уровень эмбриогенеза отмечен в тех комбинациях скрещивания, где масса абортивных семяпочек была 28-35 г. Однако четкой зависимости между фенотипом и генотипом для эмбриогенеза не установлено, что указывает на важность родительских комбинаций. В пределах отдельных комбинаций скрещивания увеличение массы семяпочек приводит к образованию большего числа жизнеспособных зародышей. Не обнаружено четкой закономерности между уровнем эмбриогенеза и размерными характеристиками семяпочек, уровнем эмбриогенеза и индексом семяпочек. Можно лишь отметить, что при низких показателях индекса (22,6) и при высоких (219,0) образование жизнеспособных эмбрионов было минимальным, а лучшие показатели эмбриогенеза отмечены при индексе семяпочек в пределах 80-95 единиц,

10. Сроки изолирования семяпочек оказывают значительное влияние на образование эмбрионов и развитие на них растений, Прослеживается тенденция увеличения числа эмбрионов и эмбрионоподоб-кых структур при более поздних сроках изолирования семяпочек на 80-100-й день после оплодотворения до 26,5-31,8%, Однако в комби

- 248 нациях скрещивания Кишмиш лучистый х Русбол и 1-15-5-7 х Кишмиш уникальный эффективными оказались более ранние сроки изолирования - 65 и 50 дней после опыления,Число развившихся растений намного меньше числа образовавшихся эмбрионов, особенно при раннем изолировании семяпочек. При более поздних сроках образование растений увеличивается и максимальной величины достигает при изолировании в 80 дней - 10«1%, а затем снижается до 9,01 при 100 днях изолирования,

И, Установлена высокая степень взаимодействия между комбинацией скрещивания, средой и сроком изолирования семяпочек. Влияние питательной среды на жизнеспособность семяпочек четко прослеживается во всех комбинациях скрещивания. Наибольшее число жизнеспособных зародышей получено на среде Уайта, результативность которой резко снизилась - в 1,5-3,0 раза при добавлении поливи-нилпирролидона, Еще хуже были результаты на питательной среде Ли и де Фоссарда.

12, Сеянцы, полученные от естественного прорастания семяпочек, отличались разнокачественноотью как в пределах отдельных комбинаций скрещивания, так и между ними. Полноценные сеянцы о развитым 'центральным и боковыми корнями, с достаточно развитым побегом получены в комбинациях скрещивания Кишмиш ЦГЛ х Коринка русская (50 и 65 дней), Кишмиш ЦГЛ х Кишмиш уникальный (80 дней), Кишмиш ЦГЛ х Русбол (65 дней), 1-15-5-7 х Кишмиш уникальный (50 и 100 дней), В комбинации скрещивания 1-15-7-1 х Кишмиш уникальный из проросших семяпочек получены лишь аномальные сеянцы. Это относится и к сеянцам, полученным при самоопылении Русбола и гибрида N 342, Аномальное развитие сеянцев, в основном, приводит к их гибели, Одним из способов их спасения может быть их микрочеренкование, в результате которого получены пробирочные растения, пригодные для адаптации и для дальнейшего микрочеренкования.

13, Пониженная положительная температура (среднемесячная температура 10,5-12,0°С, 12,6-16,9°С о минимумом 4-8°С и освещенность (500 люксов) способствуют ограничению роста растений в пробирках, более продолжительному культивированию их бее пересадок и является одним из путей создания коллекции генофонда in vitro. Предложены новые условия хранения коллекционного генофонда, винограда in vitro без пересадок в течение 10-12 мес. и более за счет использования специальной среды и температуры 4°0, обеспечивающих значительную экономию трудовых и материальных затрат,

14, Рост пробирочных растений винограда можно замедлить добавлением к питательной среде гормональных или осмотических ингибиторов, повышением концентрации 6-БАП и сахарозы. Ретардант 000 в концентрации 1 мг/л оказывает влияние на замедление роста пробирочных растений и увеличение периода без пересадок до 6 месяцев. Сорбит, добавленный в питательную среду в количестве 30-60 мг/л тормозит рост пробирочных растений и способствует более продолжительному хранению их без пересадок при культивировании как на свету, так и в темноте; как на твердой, так и на жидкой питательной среде, 6-БАП в концентрации 0,1 мг/л при 6,0% содержании сахарозы способствует минимализации роста пробирочных растений, что можно использовать для длительного хранения коллекций винограда,

15, Доказан ингибирующий эффект растительной добавки в питательную среду в виде тонкоразмолотых семян винограда или в виде вытяжки из них. Добавление в питательную среду семян винограда в виде тонкоразмолотого порошка в количестве 1,0% к объему среду уменьшает ростовые процессы в 3,4 раза, а в виде 20%-ной вытяжки -в 2,3 раза, благодаря чему увеличивается продолжительность хранения растений без пересадок.

- 250

16, По степени ингибирования роста растений и увеличению продолжительности хранения изученные способы минимализации роста характеризуются следующим образом: продолжительность между пересадками составляет 4 месяцев - добавление в питательную среду сорбита; продолжительность между пересадками 6 месяцев - культивирование при положительной пониженной температуре и освещенности, добавление в питательную среду хлорхолинхлорида, добавление в питательную среду 6-БАП на утроенном содержании сахарозы; продолжительность между пересадками составляет 7-8 месяцев: добавление в питательную среду тонкоразмолотых семян винограда и культивирования при температуре 25-27°0, добавление в питательную среду тонкоразмолотых семян винограда и культивирование при пониженной положительной температуре и освещенности; продолжительность между пересадками составляет 12 месяцев: культивирование в климатической камере при температуре 4°С на питательной среде мураоиге и Скуга, модифицированной для хранения,

РЕКОМЕНДАЦИИ

Научным учреждениям рекомендуется:

1, Технология клонального микроразмножения и оздоровления посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа, которая включает: а) организацию работы по клональному микроразмножению и оздоровлению виног рада:

- создание технологической линии для асептического получения исходных зксплантов и дальнейшего их культивирования;

- характеристику необходимой химической посуды, оборудования , материалов и инвентаря;

- нормативно-технические данные, применяемые для приготовления питательных сред;

- состав и приготовление питательной среды; б) технологический процесс клонального микроравмножения и оздоровления посадочного материала; в) закладку временных маточников суперинтеноивного типа, уход за ними, необходимую основную документацию,

2. Способ регенерации растений из меристематнчеоких эксплан-тов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров (0,075-0,1 мм) с целью оздоровления их от вирусов. Предлагается схема регенерации растений из этих зкоплантов,

Окема регенерации растений из зксплантов малых (0,17-0,25 мм) и предельно малых размеров (0,075-0,1 мм) а) ВЫДЕЛЕНИЕ МЕРИСТЕМ I б) ЭТАП ВВОДА ЗКСПЛАНТОВ В КУЛЬТУРУ

Твердая питательная среда Мурасиге и Скуга - 3/4 макроэлементов + Р0д - 170 мг/л, б-ЕАП - 1,0 мг/л, в) Жидкая питатель-ная среда Мурасиге-Скуга - 3/4 макроэлементов + РО4 170 мг/л, 5-ВАЛ - 1,0 мг/л, косые мостики из фильтровальной бумаги, пробирки на вращающемся аппарате роллерного типа, I в) ЭТАП СОБСТВЕННО ММКРОРАЗМНОЖЕНИЯ - образование новых побегов из пазушных почек и меристематичеоких бугорков. Жидкая питательная среда Мурасиге и Скуга по прописи, б-ЕАП в первом пассаже - 1,0 мг/л, со второго пассажа - 2,0 мг/л, I г) ЭТАП УКОРЕНЕНИЯ - на жидкой питательной среде Мурасиге и Скуга - 1/4 макроэлементов + 10 г/л сахарозы +0,1 мг/л ЙУК, I д) ЭТАП МИКРОЧЕРЕНКОВАНЙЯ - получение побегов нормальных пропорций с последующим их делением на однопочковые микрочеренки, которые используются в качестве вторичных зксплантов для повторения цикла размножения,

3, для борьбы с хронической инфекцией, вызываемой медленно растущими па,тогенами, появляющимися при продолжительном культивировании, предлагается способ, позволяющий сохранить в культуре ценные формы и сорта винограда, Он заключается в обработке пробирочных растений перед очередной пересадкой их 5,0% раствором ги-похлорита кальция в течение 35 мин,, допустима также обработка 10,0% гипохлоритом кальция в течение 5 мин,

4, Рекомендуется применение Шй низкой интенсивности миллиметрового диапазона для повышения регенерационной способности меристем и оптимизации клонального микроразмножения на этапе микрочеренкования побегов. Комбинированная обработка меристем лучами ОВЧ и узкополосным лазером в течение 75 мин. способствует увеличению регенерационной способности меристем более чем в 5 раз, ОВЧ-лучи оказывают положительное влияние на увеличение скорости роста пробирочных растений, длины и массы побегов, числа микрочеренков, сокращение периода культивирования и, в конечном итоге, на повышение эффективности клонального микроразмножения,

5, Добавление в питательную среду тонкоразмолотых семян винограда в концентрации 0,35-0,5% обеспечивает повышение эффективности клонального микроразмножения более чем на 35%:, а в концентрации 1-2% или 20%-ной вытяжки тормозит ростовые процессы пробирочных растений, увеличивает в 4-5 раз промежутки времени между пересадками растений и рекомендуется для длительного хранения винограда in vitro,

6, Метод селекции бессемянных сортов винограда с использованием обоих бессемянных родителей, последующим извлечением гибридных семяпочек и культивированием их in vitro. Учитывая высокий уровень эмбриогенеза и комбинационную способность выбранных пар бессемянных сортов, рекомендуются в качестве материнских форм Кишмиш ЦГЛ, 1-15-7-1, 1-15-5-7, а в качестве отцовских Кишмиш уникальный, Русбол и Коринка русская. Рекомендуются сроки изолирования семяпочек от 50 до 100 дней после оплодотворения с уточнением их для каждого конкретного сорта.

ПРОИЗВОДСТВУ РЕКОШЩУЕТСЯ

1, Технология закладки сортовых маточников интенсивного типа оздоровленными саженцами винограда клонального микроразмножения, которая включает;

- создание комплекса из нескольких пленочных или стационарных теплиц и участка земли, прилегающего к ним;

- выбор участка под теплицы и подготовку его к закладке маточника;

- выбор способа закладки маточника; а) высадка растений в пленочную теплицу на постоянное место по схеме посадки 1,5-2 х 0,4 м; б) высадка растений в пленочную теплицу по схеме 40x30 ом с последующей выкопкой полученных саженцев, хранением их и высадкой в открытый грунт на постоянное место; в) закладка маточников в стационарной теплице в два этапа; в первый год растения in vitro высаживают по уплотненной схеме (30x10 ом) в теплице или в открытом грунте, а затем пересаживают в теплицу по схеме 90x90 см и формируют три побега; г) высадка растений в открытый грунт с предварительной закалкой их;

- определение оптимальных и допустимых сроков посадки растений;

- уход за маточными насаждениями; полив, проветривание, многократные подвязки побегов, удаление пасынков, чеканка побегов, защиту растений в теплицах от милдью и оидиума, подготовку растений к зимнему периоду.

Список литературы диссертационного исследования доктор сельскохозяйственных наук Дорошенко, Наталья Петровна, 1999 год

1. Берникова Н.В., Дорошенко Н.П. Использование зародышей исемяпочек в селекции бессемянных сортов винограда /Сб. Совершенствование приемов возделывания винограда. Новочеркасск, 1990, -С, 157-169«

2. Девятков Н.Д., Голант М.Б., Бецкий О.В. Миллиметровые волны и их роль в процессах жизнедеятельности. М,, 1991.

3. Дорошенко Н.П. Перспективный метод вегетативного размножения винограда //Садоводство и виноградарство. 1990, - N 3. -С. 19-21.

4. Дорошенко Н.П. Применение биоантиокоидантов при культивировании винограда in vitro: Тез. докладов V международной конференции "Биоантиоксидант". М., 1998. - С, 282-283,

5. Дорошенко Н.П., Полешук А.Ф. Создание маточника перспективных сортов винограда в совхозе "Россия" //Виноград и вино России, 1993, - N 3. - С, 31-23,

6. Дорошенко Н.П., Хохлова М.А. Способ создания коллекции генофонда "ин витро" //Виноград и вино России", 1993, - N 6, -С, 18-21.

7. Дорошенко Н.П., Хохлова М.А., Высоцкая О.Н., Попов A.C., Баскакова О.Ю. Хранение коллекции винограда "ин витро" при пониженной температуре //Виноград и вино России, 1994, - N 3, - О, 24-27,

8. Дженеев С.Ю., Литвак А.И., Насимов А.З. Использование стимуляторов роста при адаптации растений, полученных ин витро (Рукопись деп, во ВНИИТЭИагропром (31,10,90 г.).

9. Дубовенко А,П. Инструкция по ускоренному размножению винограда одноглазковыми зелеными черенками с использованием теплиц, Ялта, 1980,

10. Евсеева Р.П., Кравцов П.В, Влияние гиббереллиновой кислоты на прорастание изолированных зародышей яблони и груши в условиях стерильной культуры /Труды ЦГЛ им. И,В,Мичурина, 1977. -Вып, 18, - С, 39-42,

11. Еремин Г.В., Плеханова М.Н., Царенко В.П. В садах и питомниках США, Садоводство и виноградарство, 1991, 11; 42-44,

12. Жакоте А,Г. Обратная связь //Энциклопедия виноградарства, Кишинев, 1986, - С, 306,

13. Жученко A.A. Адаптивный потенциал культурных растений.

14. Кишинев, 1988= С. 238-253.

15. Кравцов П.В. и др. действие регуляторов роста на дифференциацию и органогенез зародышей плодовых растений в стерильной культуре // Применение физиологически активных веществ в садоводстве. 1974« - N 2, - G, 87-94,

16. Кравцов П.В. Опыт применения культуры изолированных зародышей в селекции плодовых растений //Культура изолированных органов, тканей и клеток растений /Тр. 1-й Всесоюзн. конф. М.,1970, С. 41-44.

17. Кравцов П.В., Кравцова Л.В. Рост изолированных зародышей и семян плодовых растений в условиях стерильной культуры при добавлении в среду дрожжевого экстракта /Тр. Центр, генетической лаборатории им. И.В.Мичурина. 1971« - Вып. 12= - С. 241-244,

18. Крылова Н.В., Степаненко В,И, Проникают ли вирусы в апикальную меристему растений /Труды биолого-почвенного института.1971. С. 4.

19. Культура изолированных зародышей и некоторые другие приемы выращивания растений "ин витро". Методические рекомендации. -М., 1974, 60 с.

20. Куроаков Г.А. Применение культуры изолированных зародышей при отдаленной гибридизации сливы //Культура изолированных органов, тканей и клеток растений /Труды 1-й Всесоюзной конф. М., 1970, - и, 47-50,

21. Литвак А.И., Кузьменко А.П. Культура клеток, тканей и органов винограда In vitro //Селекция устойчивых сортов винограда. Кишинев, 1982. - С, 116-139.

22. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М., Гусев М.В. Изменение ростовых характеристик при воздействии на микроводоросли электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности //Вестник МГУ. 1990, - N 16, - С. 42,

23. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М. Изменение Фотосинтетической активности микроводорослей под влиянием электромагнитного излучения //Физиология растений, 1992, - Вып. 39, - N 5, - 0, 1004,

24. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М. и др. Некоторые закономерности взаимодействия ЗМН ММ диапазона с микроводорослями //Применение КВЧ излучения низкой интенсивности в биологии и медицине. - М,, 1989, - 84 с,

25. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М. и др. Стимулирующее действие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности на рост микроводорослей. Вестник МГУ,-1990. - Вып. 16. - N 1, - 32 с,

26. Трошин Л.П. VI Международный симпозиум по селекции винограда //Виноградарство и виноделие. 1995, - К 1. - С, 5-12,

27. В кн.: Вирусные болезни ягодных культур и винограда. 1975, -М. - С. 264-265,

28. Штеренберг П.М., Милкус Б.Н., Березовский. Вирусные болезни винограда на Украине //Вирусы и вирусные болезни растений,- Киев, 1974, С. 262-265,

29. Adwinckle (H.S.) et Buturao (Т) Culture of grape cultivara from apical meristems., 1980, Prao, 7-Conf I.C. Septembre. 8-12, Niagara Tails (Canada); 339-341,

30. Barlass M. Micropropagation of temperate fruits-application and limitation. Acta Horticulturas, 1989, - 240, - P. 373-379,

31. Barlass M., Ramming D.W., Davis H.P. In ovulo embryo culture: a breeding technigue to rescue seedless x seed1esstable grape. Australian Grapegrowes Winkmaker. Adelaide. - 1988. 292, - P, 123-125,

32. Barlass, M, and Skene, K.G.M.: Clonal propagation through tissue culture. Austral Grapegrower and Winemaker. 1979, 16/191, - P= 12-13=- 274

33. Barlass, M. and Skene, К.G.M., In vitro propagation of grapevine (Yitis vinifera L.) from fragmented shoot apices. Vi-tis. - 1978. - 17. - F. 335-340.

34. Barlass M. et Skene К.G.M. Long Term storage of grape in vitro. Fao/I.B.P.G.R. Plant Genetic Resources News letter. -1983. 53. - P. 19-El.

35. Barlass M., Skene, K.G.M., Lee, Т.Н. Tissue culture and disease control. Proceeding of the 6 the Australian Wine Industry Technical Conference, 14-17, luly, 1986,

36. Bhulhar J.S., Dhillon B.S., Gibberellin like naturty in berries of seeded and seedless grapes. Indian J. Hort.- 1977.31. - P. 36E-371.

37. Bini G. Prove di colture in vitra di meristemi apicali di Vitis vinifera L. Rw. Ortoflorofruttio Ital. 1976. - 60. - P. 285-295,

38. Blaich R. Investigation on meristem and organ cultures in vitro for selection and conservation of genotypes of the grapevine. Bulletin de Li 0.I.V. 1985. - 58, - P. 391-395.

39. Bouquet A., Davis H.P. Culture in vitro d'ovule et de vigne (vitis vinifera) appliquée a la selection de variétés de raisin de table sans pépins //Agronomie. 1989. - 9/6. - P. 565-574,

40. Bower D. lane. Genetic resources worldwide //Trends Bio-technol. 1989. - 7/5, - P. 111-116.

41. Brendel G. Einsatz der in vitro Kultur von Reben zur Produktion von Verstufenplanzqut in der Zuchtung//Wein-Wissenschaft 1986. - 41/4. - P. 264-270,

42. Tomorrow. Ed.O.H. Franfel I.G. Hawkes, p.p. Cambridgi University Press, 1975,

43. Fanizza G., Ricciardi L. The response of a range of genotypes of Vitis vinifera to sequential shoot tip cultures at high temperatures //Euphytioa, 1988, - 39/1. - P. 19-23,

44. Forsline, P.Z. Progress in developing a nations program for mal us and vitis germplasm maintenance and evaluation in the USA //Acta hortic. Hrades Kralove. 1988. - 224, - P. 33-38,

45. Fossard R.A. The horizons of tissue culture propagation. A seminar directed by Dr. Fossard for N.S.W. Association of Nurserymen Ltd., University of Sydnea, 3-4 December, 1977; 1-14,

46. Galzy (Rose) Culture in vitro des apex de Vitis rupest-ris. C.R. Acad, So, Paris, Serle D, 1972, - 274, - P, 210-213,- 277

47. Sil, Galzy R. Les possibilités de conservation in vitro d'une collection de clones de vignes //Bulletin de 1:0.I.V. 1985, -550, - P. 378-890,

48. Kusïïianovio Slobodan, Gavran Mira, Problem viroza u vinog-radarstvu //lugosl, vinogr. i vinor, 1989. - 3-4. - P. 29-31,

49. Latuoo, I.M.; Molnar. I. Preliminary results on the in vitro mass propagation of grapes from shoot-tip meristem //Fruit Science Reports. 1985= - 12. - P. 83-85.

50. Lee N., Wsetzstein H.Y. In vitro propagation of Muscadine grape by axillary shoot proliferation //Journal of the American Society for Horticultural Science, 1990= - 115. - P, 324-329=

51. Lehoesky I., Luntz 0,, Lazarl,, Kolber M., Mikulas I., Farkas Q. Production of virus-free grape propagation maternal in Hungary, Univ, Gent, - 1992, - 57/2A, - P. 333-339,

52. Lewandowski, V.T. Rooting and acclimatization of micropropagated Vitis labrusca Delaware //Hortsoienoe. 1991. - 26.- P, 586-589,

53. Li. J.-R.; Eaton, G.W. Growth and rooting of grape shoot apices in vitro //Horticultural Science, 1984= - 19, - P. 64-65=

54. Martin C. et al. Vignes et techniques de cultures "in vitro". Quelques résultats d'une collaboration entre recherche publiques et entrefris privel //Bulletin de L'O.I.V. 1987=- 675-676, P, 447-458=

55. Martinez M,0,, î.L. Mantilla. Morphological and Yield

56. Spiegel-Roy p., Sahar N. and I. Baron. Seedless x seedless grape prageny; Technigue results and perspectives. Proceedings of the 5 th International Symposium on Grape Breeding, 1989. P. 432-438.