Обнаружение и изучение нового инсулятора у Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.26, кандидат биологических наук Четверина, Дарья Александровна

• Четверина, Дарья Александровна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Четверина, Дарья Александровна

Список используемых сокращений ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Цель и задачи исследования

Научная новизна и практическая ценность работы

Апробация работы

Публикации

Благодарности

ГЛАВА I. Роль инсуляторов в регуляции транскрипции генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II у D.melanogaster (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ)

1. Цис-действующие регуляторные последовательности генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II

1.1. Базальный промотор

1.2. Энхансеры

1.3. Сайленсеры

1.4. Инсуляторы

2. Характеристика инсуляторов Drosophila melanogaster

2.1. Инсуляторы генов теплового шока (scs и scs')

2.2. 8и(Нуу)-содержащие инсуляторы

2.2.1. Su(Hw)-инcyлятop

2.2.2. 1А2-инсулятор

2.2.3. Другие Sи(Нш)-связывающие инсуляторы

2.3. Инсуляторы регуляторной области Abd-B гена

2.3.1. Fab

2.3.2. МСР

2.3.3. Fab

2.4. Инсулятор IdefixU

2.5. Инсулятор F(fvb

2.6. Инсулятор SF1 46 3. Модели энхансер-блокирующей активности инсуляторов

3.1. Структурные модели

3.2. Транскрипционные модели

3.3. «Нейтрализация» энхансер-блокирующей активности инсуляторов

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Генетические методы

1.1. Линии Drosophila melanogaster, использованные в данной работе

1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий

1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и mini-white в трансгенных линиях

1.4. Генетические скрещивания

2. Биохимические методы

2.1. Работа с бактериальной линией E.coli DH5a

2.1.1. Среды для культивирования

2.1.2. Приготовление компетентных клеток линии E.coli DH5a

2.1.3. Трансформация плазмидной ДНК в бактерии линии

E.coli DH5a

2.2. Методы работы с ДНК

2.2.1. Рестрикция ДНК, тупление «липких» концов, дефосфорилирование и лигирование фрагментов ДНК

2.2.2. Определение концентрации ДНК

2.2.3. Спиртовое осаждение ДНК

2.2.4. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле

2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из геля

2.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса из бактериальных клеток линии E.coli DH5a 72 2.2.6.1 .Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК 72 2.2.6.2.Максипрепаративное выделение плазмидной ДНК

2.2.7. Выделение геномной ДНК из мух с использованием DEPC

2.3. Саузерн-блот-анализ

2.4. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)

2.4.1. ПЦР с использованием Taq ДНК-полимеразы

2.4.2. ПЦР с колоний E.coli DH5a, несущих плазмиду, с использованием Taq ДНК-полимеразы

2.4.3. ПЦР с использованием Pfu ДНК-полимеразы

2.5. Трансфекция клеток S2 Drosophila и анализ активности люцифераз

2.6. Метод торможения ДНК-белковых комплексов в геле (EMSA,

Electrophoretic Mobility Shift Assays)

2.6.1. In vitro транскрипция — трансляция

2.6.2. Подготовка фрагментов ДНК

2.6.3. Связывание ДНК-фрагментов с 8и(Нлу)-белком

2.6.4. Связывание ДНК-фрагментов с dCTCF-белком

2.6.5. Вертикальный полиакриламидный гель-электрофорез 82 3. Создание трансгенных конструкций

3.1. Конструкции для тестирования фрагмента длиной 825 п.н. на энхансерблокирующую активность

3.2. Конструкции для тестирования влияния Wari-инсулятора на активности других инсуляторных элементов

3.3. Праймеры, использованные для ПЦР-анализа трансгенных линий мух на наличие делеций, вызванных сайт-специфическими рекомбиназами Flp, Сге или эндонуклеазой рестрикции Seel

3.4. Фрагменты ДНК, использованные для in vitro связывания с белками

Su(Hw) и dCTCF методом торможения ДНК-белковых комплексов в геле

3.5. Плазмидные конструкции для выявления функциональной области

Wari-инсулятора

3.6. Плазмидные конструкции для тестирования промоторной активности

Wari-инсулятора

ГЛАВА III. Результаты исследования

1. Новый инсулятор обнаружен непосредственно за геном white

2. Влияние Wari-инсулятора на активность инсуляторных элементов 96 2.1. Влияние Wari-инсулятора на энхансер-блокирующую активность своей второй копии, Su(Hw)- и 1А2-инсуляторов; усиление инсуляции

2.2. Влияние Wari-инсулятора на энхансер-блокирующую активность Wari-, Su(Hw)- и 1А2-инсуляторов, «нейтрализация» инсуляции

2.3. Wari-инсулятор отличается от других найденных ранее инсуляторов

3. Выявление функциональной области Wari-инсулятора

4. Проверка Wari-инсулятора на наличие в его составе промотора гена

CG

ГЛАВА IV. Обсуждения ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Обнаружение и изучение нового инсулятора у Drosophila melanogaster»

Актуальность проблемы

Геном эукариот обеспечивает сложнейшие программы развития и клеточной дифференцировки. Эти программы осуществляются за счет четкой, последовательной активации и инактивации множества генов, белковые продукты которых взаимодействуют друг с другом. На современном этапе развития молекулярной генетики и смежных с ней наук изучение принципов экспрессии генов является одной из важнейших задач. За последние годы было накоплено много информации о нуклеотидной' последовательности ДНК различных организмов. Однако данные о нуклеотидной последовательности генома практически ничего не сообщают о роли отдельных последовательностей в регуляции экспрессии генов. В настоящее время важной задачей является идентификация последовательностей, вовлеченных в регуляцию транскрипции. Анализ возможностей и роли внутригеномных последовательностей несомненно необходим для понимания принципов контроля и поддержания экспрессии генов. Это определяет актуальность таких работ в настоящее время.

Тканеспецифичная и различающаяся на разных стадиях развития организма активация транскрипции генов высших эукариот зависит от активного статуса цис-регуляторных ДНК-элементов: промотора гена, на котором собираются белки основного транскрипционного комплекса, и энхансера, который, посредством регуляторных белков, усиливает транскрипцию гена.

Энхансеры высших эукариот способны активировать гены на больших расстояниях, достигающих нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. Эти регуляторные элементы действуют вне зависимости от положения относительно направления транскрипции гена. Существует несколько моделей функционирования энхансеров, большинство из них предполагает, что белки, связанные с энхансером, непосредственно взаимодействуют с белками, собранными на промоторе, а ДНК между ними выпетливается. Энхансеры практически не обладают специфичностью действия, следовательно, у высших эукариот должны были выработаться механизмы, контролирующие и ограничивающие способность энхансеров к активации генов, направляющие энхансер на активирование только определенного промотора, и, таким образом, определяющие специфичность его действия.

Помимо энхансеров, активирующих экспрессию генов, в геноме был найден другой класс регуляторных элементов, репрессирующих транскрипцию, - сайленсеры. Сайленсеры репрессируют транскрипцию генов, и так же, как и энхансеры, они действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия.

Предполагается, что важная роль в контроле специфичности действия энхансеров и сайленсеров принадлежит еще одному типу регуляторных ДНК элементов - инсуляторам. Инсуляторы блокируют активность энхансера (сайленсера), но это происходит только в том случае, если инсулятор находится между энхансером (сайленсером) и промотором гена. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера, сайленсера и промотора: энхансер (сайленсер) сохраняет способность влиять на незаблокированный инсулятором промотор, а промотор может быть активирован (репрессирован) другим энхансером (сайленсером). В настоящее время, несмотря на достаточно большое количество предложенных моделей действия инсуляторов, детальный механизм их функционирования остается неизвестным.

Большой прогресс в выяснении принципов работы инсуляторов стал возможен в результате использования трансгенных модельных систем с репотерными генами и энхансерами. Одна из популярных трансгенных систем включает использование гена mini-white (модифицированного гена white, белковый продукт которого необходим для пигментации глаз у Drosophila melanogaster) и его тканеспецифичный энхансер. Однако даже хорошо изученная модельная система может преподнести «сюрпризы».

Данная работа посвящена обнаружению и изучению эхансер-блокирующей активности нового инсулятора, названного нами Wari (от White-Abutting Resident Insulator - инсулятор, сопутствующий гену white). В геноме этот инсулятор находится между расположенными друг за другом генами white и CG32795 и присутствует во всех модельных системах, использующих ген mini-white. Выявлена зависимость энхансер-блокирующей активности от наличия двух инсуляторов, один из которых или оба представлены Wari-инсулятором. Продемонстрировано, что взаимодействие Wari-инсулятора с другими инсуляторами может реализовываться как в усилении инсуляции, так и в ее «нейтрализации».

Цель и задачи исследования

Основной целью работы явилось изучение энхансер-блокирующих свойств нового инсулятора (названного впоследствии Wari), обнаруженного между генами white и CG32795 у D.melanogaster. В работе были поставлены следующие задачи:

1) Подтвердить присутствие инсулятора за геном white у D. melanogaster.

2) Выяснить возможность влияния Wari-инсулятора на активность других инсуляторных элементов.

3) Выявить функциональную область Wari-инсулятора.

4) Проверить, входит ли в состав Wari-инсулятора промотор гена CG32795.

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе впервые показано наличие инсулятора между генами white и CG32795. Продемонстрировано, что Wari-инсулятор влияет на энхансер-блокирующую активность других инсуляторов: Wari (своей второй копии) и двух Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов, Su(Hw) и 1А2. Показано, что энхансер-блокирующая активность Wari-инсулятора не связана с инсуляторными белками Su(Hw), Mod(mdg4)-67.2. Полученные данные позволили сделать модельную систему более «чистой» (удаление Wari-инсулятора из модельной системы позволяет избежать его влияния) и проанализировать энхансер-блокирующую активность 8и(Нш)-зависимых инсуляторов, Su(Hw) и 1А2, в отсутствие Wari-инсулятора. Результаты данной работы расширяют представление о регуляторных элементах с энхансер-блокирующими свойствами и позволяют по-новому взглянуть на механизм действия инсуляторов, опровергая упрощенные модели их функционирования.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на 10-й международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века»

Пущино, 2006); на международных конференциях Meeting of International

Research Scholars HHMI (Merida, Mexico, 2005); Workshop on Molecular and Cell th

Biology at Spetsai (Spetses, Greece, 2006); 4 Elmau conference on nuclear organization, EMBO (Gosau, Austria, 2006); 48th Annual Drosophila Research Conference (Philadelphia, PA, 2007); 7th Young Scientist Forum and 32nd FEBS Congress (Vienna, Austria, 2007); Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2007).

Публикации

Статьи в научных журналах:

1. Chetverina D, Savitskaya E, Maksimenko O, Melnikova L, Zaytseva O, Parshikov A, Galkin AV, Georgiev P. 2008. Red flag on the white reporter: a versatile insulator abuts the white gene in Drosophila and is omnipresent in mini-white constructs. Nucl. Acids Res. 36, 929-937.

2. Максименко О.Г., Четверина Д.А., Георгиев П.Г. 2006. Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции. Генетика 42 (8), 1029-1044.

Тезисы конференций:

1. Darya Chetverina, Ekaterina Savitskaya, Olga Zaytseva, Alexander Parshikov, Pavel Georgiev. CHARACTERIZATION OF NEW ENDOGENOUS INSULATOR FOUND BETWEEN WHITE AND CG32795 GENES IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to 120th anniversary of M.I.Vavilov, 20-22 September 2007, Kyiv, Ukraine.

2. D. Chetverina, E. Savitskaya, A. Parshikov, M. Karakozova and P. Georgiev. Characterization of new endogenous insulator located downstream the white gene in Drosophila melanogaster. 7th Young Scientist Forum Molecular Networks (YSF Vienna) July 5-7 2007 and 32nd FEBS Congress MOLECULAR MACHINES July 712, Vienna, Austria.

3. Pavel G Georgiev, Darya Chetverina. Study of an endogenous insulator found downstream of the Drosophila mini-white gene. 48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, PA, March 7-11, 2007.

4. Daria Chetverina. Properties of new insulator located at the end of the white gene in D. melanogaster. 4th Elmau Conference On Nuclear Organization At Gostau, Austria. October 12th - October 15th 2006. EMBO Workshop on Nuclear Organization: Systems Biology Meets Chromatin Function.

5. Daria Chetverina. Study of new insulator located downstream of the white gene in D.melanogaster. 40 Years' Spetsai Summer School Anniversary. Workshop on Molecular and Cell Biology at Spetsai: Past, Present and Future - A Forty Years Anniversary. Island of Spetses, Greece - 1-5 September 2006.

6. Четверина Д.А., Савицкая' E.E., Каракозова M.B., Георгиев П.Г. Изучение свойств нового инсулятора, локализованного в З'-нетранслируемой области гена white у D.melanogaster. Материалы 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 17-21 апреля 2006 г.

7. P. Georgiev, М. Kostuchenko, Е. Kravchenko, D. Chetverina, О. Maksimenko, А. Parshikov, L. Melnikova, A. Golovnin. The mechanisms of long-distance interactions and insulator action in Drosophila melanogaster. HHMI, Merida, Mexico 2005

Благодарности

Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю, Георгиеву Павлу Георгиевичу, за предоставленную тему исследований, плодотворные дискуссии, ценные замечания. Автор благодарит сотрудников Лаборатории Регуляции генетических процессов за создание и поддержание дружеской и творческой атмосферы внутри коллектива. Автор благодарит своих коллег Ерохина Максима Максимовича, Максименко Оксану Геннадьевну, Тощакова Степана Владимироваича за всестороннюю помощь в процессе выполнения работы. Автор благодарит дирекцию Института Биологии гена за предоставление возможности проведения научных исследований. Отдельную благодарность автор выражает Грабовской Любовь Сергеевне за понимание и поддержку на всех этапах подготовки диссертационной работы.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная генетика», Четверина, Дарья Александровна

выводы

1. Обнаружен новый инсулятор у D.melanogaster, который находится между генами white и CG32795. Этот инсулятор назван инсулятором Wari.

2. Продемонстрировано, что Wari-инсулятор способен функционально взаимодействовать со своей второй копией, а также с Su(Hw)- и 1А2-инсуляторами.

3. Выяснено, что энхансер-блокирующая активность Wari-инсулятора не зависит от сигнала полиаденилирования гена white. Показано, что функциональным (обладающим полной энхансер-блокирующей активностью) является участок Wari-инсулятора длиной 368 п.н.

4. Показано, что Wari-инсулятор не обладает промоторной активностью.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Четверина, Дарья Александровна, 2008 год

1. Максименко О.Г., Четверина ДА., Георгиев П.Г. (2006) Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции. Генетика 42 (8), 1029-1044.

2. Максименко О.Г., и Георгиев П.Г. (2007) Изучение структуры 1А2-инсулятора Drosophila melanogaster. Доклады Академии наук. 416(3), 404-407.

3. Belozerov V.E., Majumder P., Shen P., Cai, H.N. (2003) A novel boundary element may facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila. EMBO J. 22, 3113-3121.

4. Blanton J., Gaszner M., Schedl P. (2003) Protein : protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo. Genes Dev. V. 17. P. 664-675.

5. Brasset E., and Vaury, C. (2005) Insulators are fundamental components of the eukaryotic genomes. Heredity 94, 571-576.

6. Brasset E., Bantignies F., Court F., Cheresiz S., Conte C., Vaury C. (2007) Idefix insulator activity can be modulated by nearby regulatory elements. Nucl. Acid. Res. 35,2661-2670.

7. Brown J.L., Mucci D., Whiteley M., Dirksen M.L., Kassis J.A. (1998) The Drosophila Polycomb group gene pleiohomeotic encodes a DNA binding protein with homology to the transcription factor YY1. Mol Cell. 1(7): 1057-64.

8. Buchner K., Roth P., Schotta G., Krauss V., Saumweber H., Reuter G., Dorn R. (2000) Genetic and molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila. Genetics. V. 155. P. 141-157.

9. Burke T.W., and Kadonaga J.T. (1996) Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. Genes Dev. 10(6):711-24.

10. Burke T.W., and Kadonaga J.T. (1997) The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes Dev. 11(22):3020-31.

11. Busturia A., Lloyd A., Bejarano F., Zavortink M., Xin H., Sakonju S. (2001) The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleiohomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development. 128(11):2163-73.

12. Butler J.E., and Kadonaga J.T. (2001). Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA core promoter motifs. Genes Dev. 15(19):2515-9

13. Butler J.E., and Kadonaga J.T. (2002) The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16(20):2583-92

14. Byrd K., and Corces V.G. (2003) Visualization of chromatin domains created by the gypsy insulator of Drosophila. J. Cell Biol. V. 162. P. 565-574.

15. Cai, H., and Levine, M. (1995) Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. Nature 376, 533-536.

16. Cai, H., and Levine, M: (1997) The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embryo. EMBO J. 16(7):1732-41

17. Cai, H., and Shen, P. (2001) Effects on cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 291, 493-495.

18. Capelson M., and Corces V. (2005) The ubiquitm ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator. Mol. Cell. V. 20. P. 105-16.

19. Capelson M., and Corces V.G. (2004) Boundary elements and nuclear organization. Biol. Cell 96, 617-629.

20. Chen Q., Lin L., Smith S., Lin Q., Zhou J. (2005) Multiple promoter targeting sequences exist in Abdominal-B to regulate long-range gene activation. Dev. Biol. 286, 629-636.

21. Chung J.H., Whiteley M., Felsenfeld G. (1993) A 5' element of the chicken beta-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74, 505-514.

22. Conte C., Dastugue В., Vaury C. (2002a) Coupling of enhancer and insulator properties identified in two retrotransposons modulates their mutagenic impact on nearby genes. Mol. Cell Biol. 22, 1767-1777.

23. Conte C., Dastugue В., Vaury C. (2002b) Promoter competition as a mechanism of transcriptional interference mediated by retrotransposons. EMBO J. 21(14):3908-16

24. Cramer P. (2004). RNA polymerase II structure: from core to functional complexes. Curr Opin Genet Dev. 14(2):218-26

25. Cuvier O., Hart C.M., Kas E., Laemmli U.K. (2002) Identification of a multicopy chromatin boundary element at the borders of silenced chromosomal domains. Chromosoma. V. 110. P. 519-531.

26. Cuvier O., Hart C.M., Laemmli U.K. (1998) Identification of a class of chromatin boundary elements. Mol. Cell. Biol. V. 18. P. 7478-7486.

27. Dorsett D. (1993) Distance-independent inactivation of an enhancer by the suppressor of Hairy-wing DNA-binding protein of Drosophila. Genetics. 134(4): 1135-44.

28. Gaszner M., and Felsenfeld G. (2006) Insulators: Exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nat. Rev. Genet. 7, 703-713.

29. Gaszner M., Vazquez J., Schedl P. (1999) The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. Genes Dev. 13,2098-2107.

30. Gause m., Hovhannisyan H., Kan Т., Kuhfittig S., Mogila V., Georgiev P. (1998) hobo Induced rearrangements in the yellow locus influence the insulation effect of the gypsy su(Hw)-binding region in Drosophila melanogaster. Genetics. 149(3): 1393-405.

31. Gdula D.A., and Corces V.G. (1997) Characterization of functional domains of the su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations. Genetics. V. 145. P. 153-161.

32. Georgiev, P., and Kozicina, M. (1996) Interaction between mutations in' the suppressor of Hairy wing and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster^ affecting the phenotype of gypsy-induced mutations. Genetics 142, 425-436.

33. Gerasimova Т. I., Byrd K., Corces V. G. (2000) A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. Mol. Cell. V. 6. P. 1025-1035.

34. Gerasimova T.I., and Corces V.G. (1998) Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin>insulator. Cell. V. 92. P.511-521.

35. Gerasimova T.I., Gdula D.A., Gerasimov D.V., Simonova O., Corces V.G. (1995). A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation. Cell 82, 587-597.

36. Geyer P.K., and Clark I. (2002) Protecting against promiscuity: the regulatory.role of insulators. Cell Mol Life Sci. 59(12):2112-27

37. Geyer P.K., and Corces V.G. (1987) Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes Dev. 1, 996-1004.

38. Geyer P.K., and Corces V.G. (1992) DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev. 6(10):1865-73

39. Ghosh D., Gerasimova T.I., Corces V.G. (2001) Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. EMBO J. V. 20. P. 25182527.

40. Golic K.G., Lindquist S. (1989) The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell 59, 499-509.

41. Golovnin A., Birukova I., Romanova O. , Silicheva M. , Parshikov A., Savitskaya E. , Pirrotta V., Georgiev P. (2003) An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-scute gene complex in Drosophila. Development 130, 3249-3258.

42. Golovnin A., Melnick E., Mazur A., Georgiev P. (2005) Drosophila Su(Hw) insulator can stimulate transcription of a weakened yellow promoter over a distance. Genetics. V. 170. P.1133-1142.

43. Gyurkovics H., Gausz J., Kummer J., Karch F. (1990) A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation. EMBO J. 9(8):2579-85

44. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. (1996) Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex. Genes Dev. 10, 3202-3215.

45. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. (1997) A Polycomb and GAGA dependent silencer adjoins the Fab-7 boundary in the Drosophila bithorax complex. Genetics. 146(4):1365-80

46. Hahn S. (2004) Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery. Nat Struct Mol Biol. 11(5):394-403.

47. Harrison D.A., Gdula D.A., Coyne R.S., Corces V.G. (1993). A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on* enhancer function. Genes Dev. 7, 1966-1978.

48. Hart C.M., Cuvier O., Laemmli U.K. (1999) Evidence for an antagonistic relationship between the boundary element-associated factor BEAF and the transcription factor DREF. Chromosoma. V. 108. P. 375-383.

49. Hart C.M., Zhao K., Laemmli U.K. (1997) The scs' boundary element: characterization of boundary element-associated factors. Mol Cell Biol. 17(2):999-1009.

50. Hochheimer A., and Tjian R. (2003) Diversified; transcription initiation complexes expand promoter selectivity and tissue-specific gene expression. Genes Dev. 17(11): 1309-20.

51. Hochheimer A., Zhou S., Zheng S., Holmes M.C., Tjian R. (2002) TRF2 associates with DREF and directs promoter-selective gene expression in Drosophila. Nature. 420(6914):439-45. .

52. Holohan E.E., Kwong C., Adryan В., Bartkuhn M., Herold M., Renkawitz R., Russell S., White R. (2007) GTGF genomic binding sites in Drosophila and the organization of the bithorax complex. PLoS > Genet. 3, el;12.

53. Jack J:, Dorsett D., Dclotto Y., Liu S.( 1991) Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer. Development. 113(3):735-47.

54. Jones K.A., and Kadonaga J.T. (2000) Exploring the transcription-chromatin interface. Genes Dev. 14(16): 1992-6:

55. Kadonaga J.T. (2002) The DPE, a core promoter element for transcription by RNA polymerase Ш Exp Mol Med. 34(4):259-64.

56. Kadonaga J.T. (2004) Regulation of RNA polymerase II transcription by sequence-specific DNA binding factors. Cell. 116(2):247-57.

57. Karch F., Galloni M., Sipos L., Gause J., Gyurkoviks H., Schedl P. (1994) Мер and Fab-7: molecular analysis of putative boundaries of cis-regulatory domains in the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 22(15):3138-46.

58. Karcss R.E., and Rubin G.M. (1984) Analysis of P transposable element functions in Drosophila. Cell 38, 135-146.

59. Kellum R., and Schedl P. (1991) A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64, 941-950.

60. Kellum R., and Schedl P. (1992) A group of scs elements function1 as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol. Cell. Biol. 12, 2424-2431.

61. Kim J., Shen В., Rosen C., Dorsett D. (1996) The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein. Mol. Cell. Biol. V. 16. P.3381-3392.

62. Krasnov A.N., Kurshakova M.M., Ramensky V.E., Mardanov P.V., Nabirochkina E.N., Georgieva S.G. (2005) A retrocopy of a gene can functionally displace the source gene in evolution. Nucleic Acids Res. 33(20):6654-61. Print 2005.

63. Kuhn E.J., and Geyer, P.K. (2003) Genomic insulators: Connecting properties to mechanism. Curr. Opin. Cell Biol. 15, 259-265.

64. Kuhn E.J., Viering M.M., Rhodes K.M.", Geyer P.K. (2003) A test of insulator interactions in Drosophila. EMBO J. 22, 2463-2471.

65. Kuhn, E.J., Hart C.M., Geyer P.K. (2004) Studies of the role of the Drosophila scs and scs' insulators in defining boundaries of a chromosome puff. Mol' Cell Biol. 24(4): 1470-80.

66. Kurshakova M., Maksimenko O., Golovnin A., Pulina M., Georgieva S., Georgiev P., Krasnov A. (2007) Evolutionary conserved E(y)2/Susl protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila. Mol Cell. 27(2):332-8.

67. Kutach A.K. and Kadonaga J.T. (2000) The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Mol Cell Biol. 20(13):4754-64.

68. Labrador M., and Corces V.G. (2002) Setting the boundaries of chromatin domains and nuclear organization. Cell. 111(2): 151-4.

69. Lagrange Т., Kapanidis A.N., Tang H., Reinberg D., Ebright R.H. (1998) New core promoter element in RNA polymerase Il-dependent transcription: sequence-specific DNA binding by transcription factor IIB. Genes Dev. 12(l):34-44.

70. Levine M., and Tjian R. (2003) Transcription regulation and animal diversity. Nature. 424(6945): 147-51.

71. Lim C.Y., Santoso В., Boulay Т., Dong E., Ohler U., Kadonaga J.T. (2004) The MTE, a new core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Genes Dev. 18(13):1606-17.

72. Lin Q., Chen Q., Lin L., Zhou J. (2004) The promoter targeting sequence4 mediates epigenetically heritable transcription memory. Genes Dev. 18, 2639-2651.

73. Lin Q., Wu D., Zhou J. (2003) The promoter targeting sequence facilitates and restricts a distant enhancer to a single promoter in the Drosophila embryo. Development 130, 519-526.

74. Lindsley D.L., and Zimm-G.G. (1992) The genome of Drosophila. melanogaster. (Academic Press, New York).

75. Majumder P., and Cai H.N. (2003) The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila'embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5223-5228.

76. Mallin D.R., Myung J.S., Patton J.S., Geyer P.K. (1998) Polycomb group repression is blocked by the Drosophila suppressor of Hairy-wing su(Hw). insulator. Genetics. 148(l):331-9.

77. Martin M., Meng Y. В., Chia W. (1989) Regulatory elements involved in the tissue-specific expression of the yellow gene of Drosophila. Mol. Gen. Genet. 218, 118-126.

78. Mazo A.M., Mizrokhi L.J., Karavanov A.A., Sedkov Y.A., Krichevskaya A.A., Ilyin Y.V. (1989). Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products interact with a region gypsy (mdg4) regulating its transcriptional activity. EMBO J. V. 8. P. 903911.

79. Melnikova L., Gause M., Georgiev P. (2002) The gypsy insulators flanking yellow enhancers do not form a separate transcriptional domain in Drosophila melanogaster: the enhancers can activate an isolated yellow promoter. Genetics. 160(4): 1549-60.

80. Mihaly J., Hogga I., Barges S., Galloni M., Mishra R.K., Hagstrom K., Muller M., Schedl P., Sipos L., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. (1998) Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex. Cell. Mol. Life Sci. V. 54. P. 60-70.

81. Mihaly J., Hogga I., Gausz J., Gyurkovics H., Karch F. (1997) In.situ dissection of theFab-7 region-of the bithorax complex into a chromatin domain boundary and a Polycomb-response element. Development. 124(9): 1809-20.

82. Muravyova E., Golovnin A., Gracheva E., Parshikov A., Belenkaya.T., Pirrotta V., Georgiev P. (2001) Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291,495-498.

83. Nabirochkin S., Ossokina M., Heidmann T. (1998) A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence. J. Biol. Chem. V. 273. P. 2473-2479.

84. Namciu S.J., Blochlinger K.B., Fournier R.E.K. (1998) Human matrix attachment regions insulate transgene expression from chromosomal position effects in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. 18; 2382-2391.

85. Pai С., Lei С., Ghosh D., Corces V. (2004) The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator. Mol. Cell. V. 16. P. 737-48.

86. Park S.Y., Kim Y.S., Yang D.J., Yoo M.A. (2004) Transcriptional regulation of the Drosophila catalase gene by the DRE/DREF system. Nucleic Acids Res. 32(4): 131824.

87. Parnell Т., Kuhn E., Gilmore В., Helou C., Wold M., Geyer P. (2006) Identification of genomic sites that bind the Drosophila'suppressor of Hairy-wing insulator protein. Mol. Cell Biol. 26, 5983-93.

88. Parnell T.J., Viering M.M., Skjesol A., Helou C., Kuhn E.J., Geyer P.K. (2003) An endogenous suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 13436-13441.

89. Pick L., Schier A., Affolter M., Schmidt-Glenewinkel Т., Gehring W.J: (1990) Analysis of the ftz upstream element: germ layer-specific enhancers are independently autoregulated. Genes Dev. 4(7): 1224-39.

90. Pirrotta V. (1988) Vectors for P-mediated transformation in Drosophila. Biotechnology 10,437-456.

91. Pirrotta V., Steller H., Bozzetti M.P. (1985) Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white gene. EMBO J. 4(13A):3501-8.

92. Qian S., Varjavand В., Pirrotta V. (1992) Molecular analysis of the zeste-white interaction reveals a promoter-proximal element essential for distant enhancer-promoter communication. Genetics 131, 79-90.

93. Ramos E., Ghosh D., Baxter E., Corces V. (2006) Genomic organization of gypsy chromatin.insulators in Drosophila melanogaster. Genetics 172, 2337-2349.

94. Rodin S., Georgiev P. (2005) Handling three regulatory elements in one transgene: Combined use of cre-lox, FLP-FRT, and I-Scel recombination systems. Biotechniques 39, 871-876.

95. Rodin S., Kyrchanova O., Pomerantseva E., Parshikov A., Georgiev P. (2007) New properties of Drosophila fab-7 insulator. Genetics. 177(1):113-21.

96. Rong Y.S., Titen S.W., Xie H.B., Golic M.M., Bastiani M., Bandyopadhyay P., Olivera B.M., Brodsky M., Rubin G.M., Golic K.G. (2002) Targeted mutagenesis by homologous recombination in D. melanogaster. Genes Dev. Jun 15;16(12):1568-81.

97. Roseman R.R., Pirrotta V., Geyer P.K. (1993) The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. EMBO J. 12, 435-442.

98. Rubin G.M., and Spradling A.C. (1982) Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science 218, 348-353.

99. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

100. Schweinsberg S., Hagstrom K., Gohl D., Schedl P., Kumar R.P., Mishra R., Karch F. (2004) The enhancer-blocking activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites. Genetics. 168(3): 1371-84.

101. Scott K.S., and Geyer P.K. (1995) Effects of the su(Hw) insulator protein on the expression of the divergently transcribed Drosophila yolk protein genes. EMBO J. 14, 6258-6267.

102. Scott K.S., Taubman A.D., Geyer P.K. (1999) Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. Genetics. V. 153. P. 787-798.

103. Siegal M.L., and Hartl D.L. (2000) Application of Cre/loxP in Drosophila. Site-specific recombination and transgene co-placement. Methods Mol. Biol. 136, 487495.

104. Sigrist C.J., and Pirrotta V. (1997) Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila polycomb response element (PRE) butallow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics 147, 209221.

105. Smale S.T. (2001) Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation. Genes Dev. 15(19):2503-8

106. Smale S.T., Kadonaga J.T. (2003) The RNA polymerase II core promoter. Annu Rev Biochem. 72:449-79.

107. Smith P. A., V. G. Corces. (1995) The suppressor of Hairy-wing protein regulates the tissue-specific expression of the Drosophila gypsy retrotransposon. Genetics. V. 139. P. 215-228.

108. Spradling A.C., and-Rubin G.M. (1982) Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science 218, 341-347.

109. Stogios P.J., Downs G.S., Jauhal J.J.S., Nandra S.K., Prive G.G. (2005) Sequence and structural analysis of BTB domain proteins. Genome Biol. V. 6. P. R82.

110. Strutt H., Cavalli G., Paro R. (1997) Co-localization of Polycomb protein and GAGA factor on regulatory elements responsible for the maintenance of homeotic gene expression. EMBO J. 16(12):3621-32.

111. Szutorisz H., Dillon N., Tora L. (2005) The role of enhancers as centres for general transcription factor recruitment. Trends Biochem Sci. 30(ll):593-9.

112. Udvardy A., Maine E., Schedl P. (1985) The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains. J. Mol. Biol. V. 185. P. 341-358.

113. Valenzuela L., and Kamakaka RT. (2006) Chromatin insulators. Annu. Rev. Genet. 40, 107-138.

114. Vazquez J., and Schedl P. (1994) Sequences required for enhancer blocking activity of scs are located within two nuclease-hypersensitive regions. EMBO J. V. 13. P. 5984-5993.

115. Vazquez J., and Schedl P. (2000) Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in Drosophila melanogaster. Genetics. V. 155. P. 1297-1311.

116. Wei W., and Brennan M. D. (2001) The gypsy insulator can act as a promoter-specific transcriptional stimulator. Mol. Cell. Biol. V. 21. P. 7714-7720.

117. Weis L., and Reinberg D. (1992) Transcription by RNA polymerase II: initiator-directed formation of transcription-competent complexes. FASEB J. 6(14):3300-9.

118. West A.G., and Fraser P. (2005) Remote control of gene transcription. Hum. Mol. Genet. 14, 101-111.

119. Zhao H., and Dean A. (2005) Organizing the genome: enhancers and insulators. Biochem Cell Biol. 83(4):516-24.

120. Zhao K., Hart С. M., Laemmli U. K. (1995) Visualization of chromosomal domains with boundary clement-associated factor BEAF-32. Cell. V. 81. P. 879-889.

121. Zhou J., and Levine M. (1999) A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell. 99(6):567-75.

122. Zhou J., Ashe H., Burks C., Levine M. (1999) Characterization of the transvection mediating region of the abdominal-B locus in Drosophila. Development. 126(14):3057-65.

123. Zhou J., Barolo S., Szymanski P., Levine M. (1996) The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. Genes Dev. V. 10. P. 3195-3201.