Изучение функциональных активностей инсуляторов из регуляторных областей генов yellow и white у D. melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.26, кандидат биологических наук Ерохин, Максим Максимович

• Ерохин, Максим Максимович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ерохин, Максим Максимович

Список используемых сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Научная новизна и практическая ценность работы

Апробация работы

Публикации

Благодарности

ГЛАВА I. Роль инсуляторов в регуляции транскрипции генов, транскрибируемых РНК-полимеразой II у D.melanogaster (ОБЗОР

ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ)

1. Регуляторные элементы ДНК и РНК-полимеразаП-зависимая транскрипция

1.1. Промотор

1.2. Активация и репрессия транскрипции 16 1.2.1 Энхансеры 17 1.2.2. PRE/TRE-элементы и сайленсинг

1.3. Инсуляторы

2. Характеристика инсуляторов Drosophila melanogaster

2.1. Инсуляторы генов теплового шока (scs и scs')

2.2. Sи(Ну/)-содержащие инсуляторы

2.2.1. 8и(Нуу)-инсулятор

2.2.2.1А2-инсулятор

2.2.3. Другие 8и(Нл¥)-связывающие инсуляторы

2.3. Инсуляторы регуляторной области Abd-B гена

2.3.1. Fab7 (Frontabdominal-7)

2.3.2. МСР

2.3.3. Fab

2.4. Инсулятор Wari

2.5. Другие инсуляторы Drosophila 48 3. Модели энхансер-блокирующей активности инсуляторов

3.1. Структурные модели

3.2. Транскрипционные модели

3.3. «Нейтрализация» энхансер-блокирующей активности инсуляторов

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Генетические методы 59 1.1.1. Линии Drosophila melanogaster, использованные в данной работе

1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение' трансгенных линий

1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и mini-white в трансгенных линиях

1.4. Генетические скрещивания

2. Биохимические методы

2.1. Работа с бактериальной линией Е. coli DH5а

2.1.1. Среды для культивирования

2.1.2. Приготовление компетентных клеток линии E.coli DH5a

2.1.3. Трансформация плазмидной ДНК в бактерии линии E.coli DH5a

2.2. Методы работы с ДНК

2.2.1. Рестрикция ДНК, тупление «липких» концов, дефосфорилирование и лигирование фрагментов ДНК

2.2.2. Определение концентрации ДНК

2.2.3. Спиртовое осаждение ДНК

2.2.4. Горизонтальный электрофорез в агарозном геле

2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из геля

2.2.6. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса из бактериальных клеток линии E.coli DH5a 71 2.2.6.1 .Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК

2.2.6.2.Максипрепаративное выделение плазмидной ДНК

2.2.7. Выделение геномной ДНК из мух с использованием DEPC

2.3. Саузерн-блот-анализ

2.4. Метод полимеразной цепной реакции (ПНР)

2.4.1. ПЦР с использованием Taq ДНК-полимеразы

2.4.2. ПЦР с колоний E.coli DH5a, несущих плазмиду, с использованием Taq ДНК-полимеразы

2.4.3. ПЦР с использованием Pfu ДНК-полимеразы

2.4.4. ПЦР с использованием Hot-Start Taq-ДНК-полимеразы

2.5. Трансфекция клеток S2 Drosophila и анализ активности люцифераз

2.6. Анализ активности гена (3-галактозидазы в мухах 79 Создание трансгенных конструкций

3.1. Конструкции для тестирования инсулятора Wari на сайленсер-блокирующую активность

3.2. Конструкции для тестирования взаимодействий инсуляторов и промоторов

3.3. Получение конструкций для изучения инсуляторов на клеточных линиях дрозофила

Иммунопреципитация хроматина

4.1. Иммунопреципитация хроматина, выделенного из клеточной культуры дрозофила S

4.2. Иммунопреципитация хроматина на разных стадиях развития дрозофила

4.3. Праймеры, использованные для анализа материала методом ПЦР в реальном времени, полученного при иммунопреципитации хроматина

ГЛАВА III. Результаты исследования

1. Изучение сайленсер-блокирующей активности Wari-инсулятора D. melanogaster

1.1. Wari-инсулятор обладает сайленсер-блокирующей активностью

1.2. Фрагмент Wari-инсулятора длиной 368 п.н. достаточен для энхансер-блокирующей и сайленсер-блокирующей активностей инсулятора

1.3. Инсуляторные белки Е(у)2 и CP 190 взаимодействуют с Wari-инсулятором in vivo

1.4. Снижение уровня экспрессии гена е(у)2 влияет на PRE-блокирующую, но не на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора in vivo

2. Изучение взаимодействия между инсуляторами и промоторами у D. melanogaster

2.1. Wari- и 1А2-инсуляторы функционально взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно

2.2. 1А2-инсулятор способен взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе

2.3. Четырех сайтов связывания для белка Su(Hw) достаточно для обеспечения активации промотора гена yellow GAL4-активатором

2.4. Белок CP 190 присутствует на минимальном промоторе гена теплового шока при взаимодействии промотора с 1А2инсулятором 109 3. Создание новой системы для исследования инсуляторов D. melanogaster

ГЛАВА IV. Обсуяедения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение функциональных активностей инсуляторов из регуляторных областей генов yellow и white у D. melanogaster»

Актуальность проблемы

Транскрипция является ключевым этапом, на котором контролируется уровень экспрессии генов. Инициация и регуляция транскрипции ДНК у высших эукариот с участием РНК-полимеразы II зависит от множества факторов: от цис-действующих регуляторных ДНК-последовательностей и-транс-действующих белков. Цис-действующие регуляторные ДНК-последовательности включают энхансеры, сайленсеры, базальный промотор, инсуляторы. Энхансеры - ДНК-последовательности, представляющие собой сайты связывания белков-активаторов транскрипции. Энхансеры высших эукариот могут располагаться на разном расстоянии от промотора контролируемого ими гена. Так, некоторые энхансеры способны активировать гены на больших расстояниях, достигающих нескольких десятков тысяч пар нуклеотидов. Энхансеры действуют вне зависимости от положения относительно направления транскрипции гена. Сайленсеры — элементы, оказывающие негативное влияние на транскрипцию генов; на них собираются белковые комплексы, подавляющие экспрессию генов. К сайленсерам относятся ДНК-элементы для сборки комплекса белков группы Polycomb (PRE - Polycomb Response Element). Так же как и энхансеры, сайленсеры действуют вне зависимости от их положения относительно направления транскрипции гена и не обладают специфичностью действия. Предполагается, что важная роль в контроле специфичности действия энхансеров и сайленсеров принадлежит инсуляторам. В настоящее время сформулированы два независимых критерия, по которым регуляторный элемент может быть отнесен к инсуляторам: способность блокировать энхансеры и служить барьером между транскрипционно активным хроматином и гетерохроматином. Инсуляторы блокируют активность энхансера, но это происходит только в том случае, если инсулятор находится между энхансером и промотором гена. При этом инсуляторы не влияют непосредственно на активность энхансера и промотора, то есть энхансер сохраняет способность влиять на незаблокированный инсулятором промотор, а промотор может быть активирован другим энхансером. Для некоторых инсуляторов показана способность блокировать репрессию, опосредованную сайленсерами.

В настоящее время существует две группы моделей функционирования инсуляторов. Модели первой группы предполагают физическое прикрепление белков, взаимодействующих с ДНК-последовательностью, инсулятора либо к ядерному матриксу, либо к ядерной оболочке и/или стабильные взаимодействия между белковыми компонентами инсуляторов, что приводит к образованию петель, являющихся независимыми доменами транскрипции генов. Модели второй группы постулируют, что инсуляторы блокируют передачу (прием) сигнала от энхансера к промотору. Предполагается существование нестабильных взаимодействий между белками, взаимодействующими с инсуляторами и белками других регуляторных элементов (энхансеров или промоторов).

Несмотря на большое количество накопленной информации, ни одна из. этих моделей не может объяснить все свойства инсуляторов. Становится очевидным, что как дальнейшее изучение многообразия инсуляторов, так и изучение их функциональных свойств необходимо для понимания механизма их действия и роли в регуляции транскрипции.

Данная работа посвящена изучению свойств Wari- и 1А2-инсуляторов D. melanogaster. В геноме Wari-инсулятор находится между расположенными друг за другом генами white и CG32795, в непосредственной близости от З'-конца гена white. 1А2-инсулятор был обнаружен между геном yellow и achaete-scute генным комплексом, в. непосредственной близости от З'-конца гена yellow. В данной работе показано, что Wari-инсулятор обладает сайленсер-блокирующей активностью. Продемонстрировано, что Wari- и 1 А2-инсуляторы взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно. Разработана новая модельная система для тестирования ДНК-последовательностей на инсуляторную активность.

Цель и задачи исследования

Основной целью работы явилось изучение свойств Wari- и 1А2-инсуляторов.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) Выяснить способность Wari-инсулятора блокировать сайленсер из регуляторной области гена Ubx.

2) Определить входят ли инсуляторные белки CP 190 и Е(у)2 в состав белкового комплекса Wari-инсулятора.

3) Выяснить возможность взаимодействия Wari- и 1А2-инсуляторов с промоторами генов white и yellow, соответственно.

4) Разработать модельную систему для тестирования ДНК-последовательностей на инсуляторную активность в клеточных культурах D. melanogaster.

5)

Научная новизна и практическая ценность работы

В работе впервые показано наличие у Wari-инсулятора сайленсер-блокирующей активности. Показано, что инсуляторные белки CP 190 и Е(у)2 являются белковыми компонентами Wari-инсулятора. Продемонстрировано прямое участие Е(у)2 в сайленсер-блокирующей, но не в энхансер-блокирующей активности Wari-инсулятора. В данной работе показано, что инсуляторы Wari и 1А2 взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно. Разработана новая модельная система для быстрого анализа ДНК-последовательностей на наличие инсуляторной активности. Результаты данной работы позволяют объяснить механизм действия инсуляров через их способность непосредственно взаимодействовать с промоторами генов. Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2008» (7-11 апреля 2008 года) и «Ломоносов-2009» (13-18 апреля 2009 года); на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 года); на 13-ой международной конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2009); на международных конференциях 9th Young Scientist Forum Labyrinth of cells and molecules (YSF, Prague) July 2-4 2009 and 34rd FEBS Congress "Life's Molecular Interactions", Prague, Czech Republic, 4-9 july, 2009; EMBO conference Nuclear Structure and Dynamics, France, Isle sur la Sorgue, 30 Sept - 4 Oct, 2009.

Публикации

Статьи в научных журналах:

1) М. М. Ерохин, П. Г. Георгиев, Д. А. Четверина. Создание новой системы для исследования инсуляторов Drosophila melanogaster. ДАН. 2009. том 428 (1): 115-117. Тезисы конференций:

1) М. Erokhin, D. Chetverina and P. Georgiev. Analysis of the barrier activity' of Wari insulator in D. melanogaster. EMBO conference Nuclear Structure and Dynamics, France, Isle sur la Sorgue, 30 Sept - 4 Oct, 2009

2) Четверина Д.А., Ерохин M.M, Георгиев П.Г. Новые свойства. 1А2- и Wari-инсуляторов Drosophila melanogaster. Пущино. 28 сентября - 2 октября 2009.

3) D.Chetverina, M.Erokhin and P.Georgiev. Characterization of the barrier activity of Wari insulator in D. melanogaster. 34rd FEBS Congress "Life's Molecular Interactions". Prague, Czech Republic, 4-9 july, 2009.

4) M.Erokhin, D.Chetverina and P.Georgiev. New insights into the role of 1A2 and Wari insulators in D.melanogaster. 9th Young Scientist Forum Labyrinth of cells and molecules (YSF Prague) July 2-4 2009 and 34rd FEBS Congress "Life's Molecular Interactions". Prague, Czech Republic, 4-9 july, 2009.

5) Ерохин M.M. Изучение взаимодействия инсуляторов 1A2 и Wari с. промоторами генов у D. melanogaster. Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009". 13-18 апреля 2009.

6) Четверина Д.А., Ерохин М.М., Максименко О.Г., Георгиев П.Г. Изучение функциональных активностей Wari-инсулятора D. melanogaster. IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11-15 мая, 2008.

7) Ерохин М.М., Четверина Д.А., Георгиев П.Г. Изучение барьерной активности WARI-инсулятора у Drosophila melanogaster. Материалы. Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008». Москва. 7-11 апреля, 2008.

Благодарности

Автор выражает огромную благодарность своему научному руководителю Георгиеву Павлу Георгиевичу и Четвериной Дарье Александровне за предоставленную тему исследований, плодотворные дискуссии, ценные замечания. Автор благодарит сотрудников лаборатории регуляции генетических процессов за создание и поддержание дружеской и. творческой атмосферы внутри коллектива. Автор благодарит своих коллег за любезно предоставленные антитела: Антона Головнина, Маргариту Костюченко, Софью Георгиеву, Алексея Краснова, Дарью Копытову. Автор благодарит дирекцию Института Биологии гена за предоставление возможности проведения научных исследований. Отдельную благодарность автор выражает Грабовской Любовь Сергеевне за понимание и поддержку на всех этапах подготовки диссертационной работы.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная генетика», Ерохин, Максим Максимович

выводы

1) Показано, что Wari-инсулятор способен блокировать сайленсер из регуляторной области гена Ubx.

2) Установленно, что белки CP 190 и Е(у)2 взаимодействуют с Wari-инсулятором in vivo. При этом белок Е(у)2 необходим только для сайленсер-блокирующей активности Wari-инсулятора.

3) Разработана модельная система для изучения взаимодействия инсуляторов с промоторами генов. С использованием этой системы показано, что Wari- и 1А2-инсуляторы взаимодействуют с промоторами генов white и yellow, соответственно. Продемонстрировано, что белковый комплекс, собирающийся на сайтах связывания для белка Su(Hw), достаточен для взаимодействия с промотором гена yellow.

4) Показано физическое взаимодействие инсулятора 1А2 с минимальным промотором гена теплового шока 70.

5) Разработана новая модельная система для идентификации инсуляторов и исследования их свойств на культурах клеток D. melanogaster.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе проведено изучение свойств инсуляторов 1А2 и Wari из областей генов yellow и white D. melanogaster. Показано, что Wari-инсулятор, также как и 1А2 (что было известно ранее), обладает сайленсер-блокирующей активностью. Несмотря на различные ДНК-связывающие компоненты, оба эти инсулятора обладают рядом общих белковых факторов, в том числе CP 190 и Е(у)2. При этом как для одного, так и для другого инсулятора белок Е(у)2 необходим только для барьерной, но не для энхансер-блокирующей активности. Показано, что взаимодействие белков CP 190 и Е(у)2 с ДНК-последовательностью Wari-инсулятора является стадиоспецифичным. С целью лучшего понимания механизма действия инсуляторов разработана трансгенная система для изучения взаимодействий инсуляторов и промоторов. Показано, что Wari-инсулятор функционально взаимодействует с промотором гена white, а 1А2-инсулятор — с промотором гена yellow. При этом для взаимодействия с промотором гена yellow достаточен только инсуляторный комплекс. Продемонстрировано, что 1А2-инсулятор способен взаимодействовать с двумя промоторами в одной системе. Методом иммунопреципитации хроматина подтверждено наличие прямого взаимодействия между инсулятором 1А2 и минимальным промотором гена теплового шока 70. Для сокращения затрачиваемого времени на исследование инсуляторов разработана удобная модельная система, с помощью которой можно изучать и осуществлять поиск инсуляторов в клеточных культурах D. melanogaster.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ерохин, Максим Максимович, 2009 год

1. (2006) Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции. Генетика 42 (8), 1029-1044.

2. Ряховский АА, Тиллиб СВ. (2007) Иммунопреципитационное картирование TRX-ассоциированных участков хромосом в промоторе гена fkh в клетках слюнных желез Drosophila melanogaster. Генетика 43 (9), 1181-1189.

3. Bartkuhn М, Straub Т, Herold М, Herrmann М, Rathke С, Saumweber Н, Gilfillan GD, Becker PB, Renkawitz R. (2009) Active promoters and insulators are marked by the centrosomal protein 190. EMBOJ. 28: 877-888.

4. Belozerov VE, Majumder P, Shen P, Cai HN. (2003) A novel boundary element may facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila. EMBOJ. 22: 3113-3121.

5. Blanton J, Gaszner M, Schedl P. (2003) Protein: protein interactions and the pairing of boundary elements in vivo. Genes Dev. 17: 664-675.

6. Brasset E, and Vaury C. (2005) Insulators arc fundamental components of the eukaryotic genomes. Heredity 94: 571-576.

7. Brown JL, Mucci D, Whiteley M, Dirksen ML, Kassis JA. (1998) The Drosophila Polycomb group gene pleiohomeotic encodes a DNA binding protein with homology to the transcription factor YY1. Mo I Cell 1:1057-1064.

8. Buchner K, Roth P, Schotta G, Krauss V, Saumweber H, Reuter G, Dorn R. (2000) Genetic and molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila. Genetics 155: 141—157.

9. Burke TW, Kadonaga JT. (1996) Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. Genes Dev. 10:711-724.

10. Burke TW, Kadonaga JT. (1997) The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes Dev. 11:3020-3031.

11. Bushey AM, Dorman ER, Corces VG (2008) Chromatin insulators: regulatory mechanisms and epigenetic inheritance. Mol Cell 32:1-9

12. Bushey AM, Ramos E, Corces VG. (2009) Three subclasses of a Drosophila insulator show distinct and cell type-specific genomic distributions. Genes Dev. 23:1338-1350.

13. Busturia A, Lloyd A, Bejarario F, Zavortink M, Xin H, Sakonju S. (2001) The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleiohomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development. 128:2163-2173.

14. Butler JE, Kadonaga JT. (2001) Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA core promoter motifs. Genes Dev. 15:2515-2519.

15. Butler JE, Kadonaga JT. (2002) The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16:2583-2592

16. Byrd K, Corces VG. (2003) Visualization of chromatin domains created by the gypsy insulator of Drosophila. J. Cell Biol. 162: 565-574.

17. Cai HN, Levine M. (1997) The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embryo. EMBO J. 16:1732-1741

18. Cai H, and Levine M. (1995) Modulation of enhancer-promoter interactions by insulators in the Drosophila embryo. Nature 376: 533-536.

19. Cai H, and Shen P. (2001) Effects on cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity. Science 291: 493-495.

20. Capelson M. and Corces V. (2005) The ubiquitin ligase dTopors directs the nuclear organization of a chromatin insulator. Mol Cell 20: 105-116.

21. Capelson M. and Corces V.G. (2004) Boundary elements and nuclear organization. Biol. Cell 96: 617-629.

22. Conte C, Dastugue B, Vaury C. (2002b) Promoter competition as a mechanism of transcriptional interference mediated by retrotransposons. EMBO J. 21:3908-3916

23. Conte C, Dastugue B, and Vaury C. (2002a) Coupling of enhancer and insulator properties identified in two retrotransposons modulates their mutagenic impact on nearby genes .Mol. Cell Biol. 22: 1767-1777.

24. Cramer P. (2004) RNA polymerase II structure: from core to functional complexes. Curr Opin Genet Dev. 14:218-226 •

25. Cuvier О, Hart CM, Kas E, Laemmli UK. (2002) Identification of a multicopy chromatin boundary element at the borders of silenced chromosomal domains. Chromosoma. 110: 519-531.

26. Cuvier O, Hart CM, Laemmli UK. (1998) Identification of a class of chromatin boundary elements. Mol. Cell. Biol. 18: 7478-7486.

27. Dejardin J, and Cavalli G. (2004). Chromatin inheritance upon Zestemediated Brahma recruitment at a minimal cellular memory module. EMBO J. 23: 857-868.

28. Dorman E, Bushey A, Corces V. (2007) The role of insulator elements in large-scale chromatin structure in interphase. Curr Opin Genet Dev. 18 : 682-690.

29. Dorsett D. (1993) Distance-independent inactivation of an enhancer by the suppressor of Hairy-wing DNA-binding protein of Drosophila. Genetics. 134:1135-1144.

30. Gaszner M, and Felsenfeld G. (2006) Insulators: Exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms. Nat. Rev. Genet. 7: 703-713.

31. Gaszner M, Vazquez J, Schedl P. (1999) The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction. Genes Dev.13:2098-2107.

32. Gause M, Hovhannisyan H, Kan T, Kuhfittig S, Mogila V, Georgiev P. (1998) hobo. Induced rearrangements in the yellow locus influence the insulation effect of the gypsy su(Hw)-binding region in Drosophila melanogaster. Genetics. 149:1393-1405.

33. Gause M, Morcillo P, Dorsett D. (2001) Insulation of enhancer-promoter communication by a gypsy transposon insert in the Drosophila cut gene: cooperation between suppressor of hairy-wing and modifier of mdg4 proteins. Mol. Cell. Biol. 21: 4807—4817.

34. Gdula DA, Corces VG. (1997) Characterization of functional domains of the su(Hw) protein that mediate the silencing effect of mod(mdg4) mutations. Genetics. 145: 153161.

35. Gerasimova TI, Corces VG. (1998) Polycomb and Trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell 92: 511-521.

36. Gerasimova TI, Lei EP, Bushey AM, Corces VG. (2007) Coordinated control of dCTCF and gypsy chromatin insulators in Drosophila. Mol Cell 28:761-772.

37. Gerasimova TI, Gdula DA, Gerasimov DV, Simonova O, Corces VG. (1995). A Drosophila protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation. Cell 82: 587-597.

38. Geyer PK, Corces VG. (1992) DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein. Genes Dev. 6:1865-1873.

39. Geyer PK, and Corces VG. (1987) Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in' Drosophila melanogaster. Genes Dev. 1: 996-1004.

40. Ghosh D, Gerasimova TI, Corces VG. (2001) Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4) proteins required for gypsy insulator function. EMBOJ. 20: 2518-2527.

41. Golic KG, and Lindquist S. (1989) The FLP recombinasc of yeast catalyzes site-specific recombination in thq Drosophila genome. Cell 59: 499-509.

42. Golovnin A, Melnikova L, Volkov I, Kostuchenko M, Galkin AV, Georgiev P. (2008) 'Insulator bodies' are aggregates of proteins but not of insulators. EMBO Rep. 9:440-445.

43. Golovnin A., Melnick E., Mazur A., Georgiev P. (2005) Drosophila Su(Hw) insulator can stimulate transcription of a weakened yellow promoter over a distance. Genetics. 170: 1133-1142.

44. Golovnin A, Birukova I, Romanova O, Silicheva M, Parshikov A, Savitskaya E, Pirrotta, V and Georgiev P. (2003) An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the Achaete-scute gene complex in Drosophila. Development 130: 3249-3258.

45. Grimaud C, Negre N, Cavalli G. (2006) From genetics to epigenetics: the tale of Polycomb group and trithorax group genes. Chromosome Res. 2006. 14: 363-375.

46. Guelman S, Suganuma T, Florens L, Weake V, Swanson SK, Washburn MP, Abmayr SM, Wokrman JL (2006) The essential gene wda encodes a WD40 repeat subunit of Drosophila SAGA required for histone H3 acetylation. Mol. Cell Biol. 26:7178-7189.

47. Gyurkovics H, Gausz J, Kummer J, Karch F. (1990) A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation. EMBO J. 9:2579-2585.

48. Hagstrom K, Muller M, Schedl P. (1997) A Polycomb and GAGA dependent silencer adjoins the Fab-7 boundary in the Drosophila bithorax complex. Genetics. 146:13651380.

49. Hagstrom K, Muller M, and Schedl P. (1996) Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex. Genes Dev. 10:3202—3215.

50. Hahn S. (2004) Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery. Nat Struct Mol Biol. 11:394-403.

51. Harrison DA, Gdula DA, Coyne RS, Corces VG. (1993). A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function.• Genes Dev. 7: 1966-1978.

52. Hart CM, Cuvier O, Laemmli UK. (1999) Evidence for an antagonistic relationship between the boundary element-associated factor' BEAF and the transcription factor DREF. Chromosoma. 108: 375-383.

53. Hart CM, Zhao K, Laemmli UK. (1997) The scs' boundary element: characterization of boundary element-associated factors. Mol Cell Biol. 17:999-1009.

54. IIirose F, Yamaguchi M, Kuroda K, Omori A, Hachiya T, Ikeda M, Nishimoto Y, Matsukage A. (1996) Isolation and characterization of eDNA for DREF, a promoter-activating factor for Drosophila DNA replication-related genes. J Biol Chem. 271:39303937.

55. Hochheimer A, Tjian R. (2003) Diversified transcription initiation complexes expand promoter selectivity and tissue-specific gene expression. Genes Dev. 17:1309-1320.

56. Hochheimer A, Zhou S, Zheng S, Holmes MC, Tjian R. (2002) TRF2 associates with DREF and directs promoter-selective gene expression in Drosophila. Nature 420:439445.

57. Holohan EE, Kwong C, Adryan B, Bartkuhn M, Herold M, Renkawitz R, Russell S, White R. (2007) CTCF genomic binding sites in Drosophila and the organization of the bithorax complex. PLoS Genet. 3, el 12.

58. Dorsett D, Delotto Y, Liu S. (1991) Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer. Development. 113:735-747.

59. Kadauke S, Blobel. (2009) Chromatin loops in gene regulation. Biochimica et Biophysica Acta. 1789: 17-25.

60. Kadonaga JT. (2002) The DPE, a core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Exp Mol Med. 34:259-264.

61. Kadonaga JT. (2004) Regulation of RNA polymerase II transcription by sequence-specific DNA binding factors. Cell. 116:247-257.

62. Karch F, Galloni M, Sipos L, Gausz J, Gyurkovics H, Schedl P. (1994) Мер and Fab-7: molecular analysis of putative boundaries of cis-regulatory domains in the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 22:3138-3146.

63. Karess RE and Rubin GM. (1984) Analysis of P transposable element functions in Drosophila. Cell 38: 135-146.

64. Kellum R and Schedl P. (1991) A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64: 941-950.

65. Kellum R and Schedl P. (1992) A group of scs elements function as domain boundaries in an enhancer-blocking assay. Mol. Cell Biol. 12: 2424-2431.

66. Kim J, Shen B, Rosen C, Dorsett D. (1996) The DNA-binding and enhancer-blocking domains of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein. Mol. Cell Biol. 16: 33813392.

67. Krasnov AN, Kurshakova MM, Ramensky VE, Mardanov PV, Nabirochkina EN, Georgieva SG. (2005) A retrocopy of a gene can functionally displace the source gene in evolution. Nucleic Acids Res. 33:6654-6661.

68. Kuhn EJ, Hart CM, Geyer PK. (2004) Studies of the role of the Drosophila scs and scs1' insulators in defining boundaries of a chromosome puff. Mol Cell Biol. 24(4): 1470-1480.

69. Kuhn, E.J., and Geyer, P.K. (2003) Genomic insulators: Connecting properties to mechanism. Curr. Opin. Cell Biol. 15: 259-265.

70. Kutach AK, Kadonaga JT. (2000) The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Mol Cell Biol. 20:47544764.

71. Kyrchanova O, Chetverina D, Maksimenko O, Kullyev A, Georgiev P. (2008) Orientation-dependent interaction between Drosophila insulators is a property of this class of regulatory elements. Nucleic Acids Res. 36:7019-7028.

72. Lagrange T, Kapanidis AN, Tang H, Reinberg D, Ebright RH. (1998) New core promoter element in RNA polymerase II-dependent transcription: sequence-specific DNA binding by transcription factor IIB. Genes Dev. 12:34-44.

73. Levine M, Tjian R. (2003) Transcription regulation and animal diversity. Nature. 424:147-151.

74. Lim CY, Santoso B, Boulay T, Dong E, Ohler U, Kadonaga JT. (2004) The MTE, a new core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Genes Dev. 18:1606' 1617.

75. Lin Q, Chen Q, Lin L, Zhou J. (2004) The promoter targeting sequence mediates epigenetically heritable transcription memory. Genes Dev. 18: 2639-2651.

76. Lin Q, Wu D, Zhou J. (2003) The promoter targeting sequence facilitates and restricts a . distant enhancer to a single promoter in the Drosophila embryo. Development 130: 519526.

77. Lindslcy DL, and Zimm GG. (1992) The genome of Drosophila melanogaster. (Academic Press, New York).

78. Maeda R, Karch F. (2007) Making connections: boundaries and insulators in Drosophila. Curr Opin Genet Dev. 17: 394-399.

79. Majumder P, Cai HN. (2003) The functional analysis of insulator interactions in the Drosophila embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5223-5228.

80. Mallin DR, Myung JS, Patton JS, Geyer PK. (1998) Polycomb group repression is blocked by the Drosophila suppressor of Hairy-wing su(Hw). insulator. Genetics.148:331-339.

81. Mazo AM, Mizrokhi LJ, Karavanov AA, Sedkov YA, Krichevskaja AA, Ilyin YV. (1989) Suppression in Drosophila: su(Hw) and su(f) gene products internet with a region gypsy (mdg4) regulating its transcriptional activity. EMBO J. 8: 903-911.

82. Melnikova L, Gause M, Georgiev P. (2002) The gypsy insulators flanking yellow enhancers do not form a separate transcriptional domain in Drosophila melanogaster. the enhancers can activate an isolated yellow promoter. Genetics 160(4): 1549-1560.

83. Mihaly J, Hogga I, Barges S, Galloni M, Mishra RK, Hagstrom K, Miiller M, Schedl P, Sipos L, Gausz J, Gyurkovics H, Karch F. (1998) Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex. Cell. Mol. Life Sci. 54: 60-70.

84. Mohan M, Bartkuhn M, Herold M, Philippen A, Heinl N, Bardenhagen I, Leers J, White RA, Renkawitz-Pohl R, Saumweber H, Renkawitz R. (2007) The Drosophila insulator proteins CTCF and CP 190 link enhancer blocking to body patterning. EMBO J. 26:42034214.

85. Muravyova E, Golovnin A, Gracheva E, Parshikov A, Belenkaya T, Pirrotta V and Georgiev P. (2001) Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators. Science 291: 495-498.

86. Nabirochkin S, Ossokina M, Heidmann T. (1998) A nuclear matrix/scaffold attachment region co-localizes with the gypsy retrotransposon insulator sequence. J. Biol. Chem. 273: 2473-2479.

87. Ohtsuki S, Levine M, Cai HN. (1998) Different core promoters possess distinct regulatory activities in the Drosophila embryo. Genes Dev. 12:547-556.

88. Pai C, Lei C, Ghosh D, Corces V. (2004) The centrosomal protein CP 190 is a component of the gypsy chromatin insulator. Mol. Cell. 16: 737-748.

89. Panning B, Taatjes D. (2008) Transcriptional Regulation: it takes a village. Mol Cell. 31: 622-629.

90. Park SY, Kim YS, Yang DJ, Yoo MA. (2004) Transcriptional regulation of the Drosophila catalase gene by the DRE/DREF system. Nucleic Acids Res. 32:1318-24.

91. Parnell T, Kuhn E, Gilmore B, Helou C, Wold M, and Geyer P. (2006) Identification of genomic sites that bind the Drosophila suppressor of Hairy-wing insulator protein. Mol. Cell Biol. 26: 5983-5993.

92. Parnell TJ, Viering MM, Skjesol A, Helou C, Kuhn EJ and Geyer PK. (2003) An endogenous suppressor of haiiy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. 100: 13436-13441.

93. Petruk S, Sedkov Y, Riley KM, Hodgson J, Schweisguth F, Hirose S, Jaynes JB, Brock HW, Mazo A. (2006) Transcription of bxd noncoding RNAs promoted by trithorax represses Ubx in cis by transcriptional interference. Cell 127:1209-1221.

94. Pick L, Schier A, Affolter M, Schmidt-Glenewinkel T, Gehring WJ. (1990) Analysis of the ftz upstream element: germ layer-specific enhancers are independently autoregulated. Genes Dev. 4:1224-1239.

95. Pirrotta V, Steller H, Bozzetti MP. (1985) Multiple upstream regulatory elements control the expression of the Drosophila white, gene. EMBO J. 4:3501-3508.

96. Pirrotta V. (1988) Vectors for P-mediated transformation in Drosophila. Biotechnology 10: 437-456.

97. Ramos E, Ghosh D, Baxter E and Corces V. (2006) Genomic organization of gypsy chromatin insulators in Drosophila melanogaster. Genetics 172: 2337-2349.

98. Rodin S, Kyrchanova O, Pomerantseva E, Parshikov A, Georgiev P. (2007) New properties of Drosophila fab-7 insulator. Genetics 177:113-121.

99. Rodin S, Georgiev P. (2005) Handling three regulatory elements in one transgene: Combined use of cre-lox, FLP-FRT, and I-Scel recombination systems. Biotechniques 39: 871-876.

100. Roseman RR, Pirrotta V, and Geyer PK. (1993) The su(Hw) protein insulates expression of the Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects. EMBO J. 12: 435^142.

101. Rubin GM, and Spradling AC. (1982) Genetic transformation of Drosophila with transposable element vectors. Science 218: 348-353.

102. Sambrook J, Fritsch E, Maniatis T. (1989) Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

103. Sanchez-Eisner T, Gou D, Kremmer E, Sauer F. (2006). Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ashl to Ultrabithorax. Science 311:11181123.

104. Schuettengruber B, Chourrout D, Vervoort M, Leblanc B, Cavalli G. (2007) Genome regulation by polycomb and trithorax proteins. Cell 128:735-745

105. Schweinsberg S, Hagstrom K, Gohl D, Schedl P, Kumar RP, Mishra R, Karch F. (2004) The enhancer-blocking activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites. Genetics 168:1371-84.

106. Scott KS, Taubman AD, Geyer PK. (1999) Enhancer blocking by the Drosophila gypsy insulator depends upon insulator anatomy and enhancer strength. Genetics 153: 787-798.

107. Siegal ML, Hartl DL. (2000) Application of Cre/loxP in Drosophila. Site-specific recombination and transgene co-placement. Methods Mol. Biol. 136: 487-495.

108. Sigrist CJ and Pirrotta V. (1997) Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila polycomb response element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes. Genetics 147: 209-221.

109. Smale ST, Kadonaga JT. (2003) The RNA polymerase II core promoter. Annu Rev Biochem. 72:449-479.

110. Smale ST. (2001) Core promoters: active contributors to combinatorial gene regulation. Genes Dev. 15:2503-2508.

111. Smith P A, Corces VG. (1995) The suppressor of Hairy-wing protein regulates the tissue-specific expression of the Drosophila gypsy retrotransposon. Genetics 139: 215— 228.

112. Soshnev AA, Li X, Wehling MD, Geyer PK. (2008) Context differences reveal insulator and activator functions of a Su(Hw) binding region. PLoS Genet. 4: el000159.

113. Spradling AC and Rubin GM. (1982) Transposition of cloned P elements into Drosophila germ line chromosomes. Science 218: 341—347.

114. Stogios PJ, Downs GS, Jauhal JS, Nandra SK, Prive GG. (2005) Sequence and structural analysis of BTB domain proteins. Genome Biol. 6: R82.

115. Strutt H, Cavalli G, Paro R. (1997) Co-localization of Polycomb protein and GAGA factor on regulatory elements responsible for the maintenance of homeotic gene expression. EMBO J. 16:3621-3632.

116. Szutorisz H, Dillon N, Тога L. (2005) The role of enhancers as centres for general transcription factor recruitment. Trends Biochem Sci. 30:593-599.

117. Udvardy A, Maine E, Schedl P. (1985) The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains. J. Mol. Biol. 185: 341-358.

118. Valenzuela L, Kamakaka RT. (2006) Chromatin insulators. Annu. Rev. Genet. 40: 107-138.

119. Vazquez J, Schedl P. (1994) Sequences required for enhancer blocking activity of scs are located within two nuclcase-hypersensitive regions. EMBO J. 13: 5984-5993.

120. Vazquez J, Schedl P. (2000) Deletion of an insulator element by the mutation facet-strawberry in Drosophila melanogaster. Genetics. 155: 1297—1311.

121. Wallace J, Felsenfeld G. (2007) We gather together: insulators and genome organization. Curr Opin Genet Dev. 17: 400-407.

122. Wei W, Brennan MD. (2001) The gypsy insulator can act as a promoter-specific transcriptional stimulator. Mol. Cell. Biol. 21: 7714-7720.

123. Weis L, Reinberg D. (1992) Transcription by RNA polymerase II: initiator-directed formation of transcription-competent complexes. FASEB J. 6:3300-3309.

124. Wendt KS, Yoshida K, Itoh T, Bando M, Koch B, Schirghuber E, Tsutsumi S, Nagae G, Ishihara K, Mishiro T, Yahata K, Imamoto F, Aburatani II, Nakao M, Imamoto N, Maeshima K, Shirahige K, Peters JM. Nature 451:796-801.

125. West AG and Fraser P. (2005) Remote control of gene transcription. Hum. Mol. Genet. 14: 101-111.

126. Zhao H, Dean A. (2005) Organizing the genome: enhancers and insulators. Biochem Cell Biol. 83:516-524.

127. Zhao K, Hart CM, Laemmli UK. (1995) Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32. Cell. 81: 879-889.

128. Zhou J, Ashe H, Burks C, Levine M. (1999) Characterization of the transvection mediating region of the abdominal-B locus in Drosophila. Development. 126:3057-3065.

129. Zhou J, Levine M. (1999) A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo. Cell. 99:567-575.

130. Zhou J, Barolo S, Szymanski P, Levine M. (1996) The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo. Genes Dev. 10: 3195-3201.