Новые производные пирролидина: синтез и биологическая активность тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Виноградова Любовь Владимировна

• Виноградова Любовь Владимировна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Виноградова Любовь Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Лекарственные мишени и ингибиторы биосинтеза клеточной стенки МЛ

1.2 Энергетический обмен

1.3 Нацеливание на репликацию ДНК и синтез белка (транскрипция и трансляция)

1.4 Другие микобактериальные мишени и влияние на них противотуберкулезных агентов

1.5 Химические зонды для идентификации мишеней у микобактерий

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1 Дизайн новых спироциклических производных пирролидина с антибактериальной активностью

2.1.1 Дизайн новых аналогов ципрофлоксацина, содержащих спироциклические фрагменты 6-азаспиро[3.4]октана, 2-азаспиро[4.4]нонана, 2- азаспиро [4.5]декана, 8-окса-2-азаспиро[4.5]декана

2.1.2 Дизайн 5-нитрофуран-2-карбоксамидных производных, несущих фрагмент 8-замещенного 2,6-диазаспиро[3.4]октана с потенциальной противотуберкулезной активностью

2.1.3 Дизайн новых №[4-(4-фторфенокси)фенил]амидов природных и неприродных аминокислот, потенциальных ингибиторов бактериального белка PBP2a

2.2 Синтез спироциклических аналогов ципрофлоксацина

2.3 Синтез 5-нитрофуран-2-карбоксамидных производных 2,6-диазаспиро[3.4]октана

2.4 Синтез К-[4-(4-фторфенокси)фенил]амидов аминокислот

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

aa3 - цитохромоксидазный комплекс

ABPP - протеомика на основе активности белков

АГ -арабиногалактан

bc1 - цитохромредуктазный комплекс

BDQ - бедаквилин

Boc - трет-бутилоксикарбонильная группа

Cyd bd - цитохром bd

cyt bc1-aa3 - цитохром bc1-aa3

DLM - деламанид

DprE1 - декапренилфосфорил-Р-0-рибозо-2'-оксидаза

DprE2 - декапренилфосфорил-D-2-кетоэритропентозоредуктаза

DR - резистентный к лекарствам

DS - чувствительный к лекарствам

Et - этил

FAS I и FAS II - синтазы жирных кислот I и II

FQ - фторхинолоны

GlcNAc - N-ацетилглюкозамин

gyrA и gyrB - гены, кодирующие топоизомеразу II

HOBt - гидроксибензотриазол

INH - изониазид

InhA - еноил-(ацилпереносящий белок)-редуктаза

KasA - Р-кетоацилсинтаза

LZD - линезолид

MA - миколовые кислоты

MmpL - микобактериальный мембранный белок

MOX - моксифлоксацин

Mtb - Mycobacterium tuberculosis

MurNAc - N-ацетилмураминовая кислота

NADH1 - NADH-дегидрогеназа

NADH2 - NADH-дегидрогеназа

OTf - трифлат

PBP - пенициллин-связывающие белки PBP2a - пенициллин-связывающий белок PG - слой пептидогликана

PK / PD - фармакокинетическое / фармакодинамическое моделирование

PMF - движущая сила протонов

PTM - претоманид

PZA - пиразинамид

RFP - рифампицин

RIF - рифампицин

rpoB - ген, кодирующий Р-субъединицу РНК-полимеразы

SDH - сукцинатдегидрогеназа

TBAF -фторид тетрабутиламмония

WecA - N-ацетилглюкозамин-Ьфосфаттрансфераза

АТФ - Аденозинтрифосфат

ДМФА - ДД-диметилформамид

ЗИ - зона ингибирования

КДИ - ДД-карбонилдиимидазол

ЛУ-ТБ - туберкулез с лекарственной устойчивостью

Ms - мезил

Ме - метил

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

МЛУ-ТБ - туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью

РНКП - РНК-полимераза

рРНК - рибосомная рибонуклеиновая кислота

ТГФ - тетрагидрофуран

ШЛУ-ТБ - туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью ЭТЦ - электрон-транспортная цепь

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые производные пирролидина: синтез и биологическая активность»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Современные проблемы множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) и появление супербактерий привели к снижению и даже утрате эффективности антибиотиков, что значительно затрудняет лечение инфекционных заболеваний. В частности, патогены ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.), а также возбудитель туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), способны приобретать устойчивость к антибиотикам. Известные антимикробные средства и новые разрабатываемые соединения действуют на одни и те же механизмы жизнедеятельности бактериальной клетки: ингибирование репликации и транскрипции бактериальных нуклеиновых кислот, вмешательство в синтез белков, предотвращение синтеза клеточной стенки и повышение проницаемости мембран бактериальных клеток. Возникновение антибиотикорезистентности также тесно связано с этими процессами. В настоящее время существует несколько стратегий обхода антибиотикорезистентности - модификация уже известных молекул антибиотиков (примером могут служить различные поколения пенициллинов и фторхинолонов) и поиск соединений, направленных на новые мишени в бактериальной клетке, например, пенициллин-связывающий белок 2a (PBP2a), отвечающий за возникновение антибиотико-резистентности S. aureus. Если для известных антибиотиков уже проведено углубленное исследование взаимосвязи между химической структурой и антибактериальной активностью, то для новых найденных антибактериальных соединений это еще предстоит сделать. В последнее время появляется все больше работ, в которых показывается, что та или иная структура или фрагмент молекулы присутствует в различных биологически-активных соединениях, не связанных общей мишенью. Такие структуры уже принято называть привилегированными скаффолдами. Внимание привлекают мостиковые и особенно спироциклические фрагменты, которые вызвали значительный интерес из-за их многочисленной биологической активности. Спироциклы представляют собой новый структурный класс для разработки лекарств. Они могут послужить блоками для дальнейшей модификации с целью поиска новых антибактериальных соединений.

Степень разработанности темы

В настоящее время наблюдается увеличенный интерес к спироциклическим фрагментам, которые все чаще упоминаются в литературе. Многие новые лекарственные препараты в своем составе имеют спироциклические структуры. Однако противомикробная активность спироциклических производных пирролидина мало изучена: отсутствуют подробные данные об их биологическом действии в отношении бактерий группы ESKAPE и Mycobacterium

tuberculosis, несмотря на перспективность этого направления с биологической и синтетической точки зрения.

Цель диссертационной работы заключалась в дизайне, синтезе и изучении спектра антибактериальной активности новых спироциклических производных пирролидина - 6-азаспиро[3.4]октана, 2-азаспиро[4.4]нонана, 2-азаспиро[4.5]декана, 8-окса-2-

азаспиро[4.5]декана, 2,6-диазаспиро[3.4]октана и их структурных аналогов.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать дизайн и осуществить синтез:

• ряда новых аналогов ципрофлоксацина, содержащих спироциклические фрагменты 6-азаспиро[3.4]октана, 2-азаспиро[4.4]нонана, 2-азаспиро[4.5]декана, 8-окса-2-азаспиро[4.5]декана;

• серии ранее не описанных 5-нитрофуран-2-карбоксамидных производных, несущих фрагмент 8-замещенного 2,6-диазаспиро[3.4]октана с потенциальной противотуберкулезной активностью;

• новых ^[4-(4-фторфенокси)фенил]амидов природных и неприродных аминокислот, потенциальных ингибиторов бактериального белка PBP2a

2. Оценить биологическую активность полученных соединений.

Научная новизна

Предложен дизайн новых аналогов ципрофлоксацина, содержащих спироциклические фрагменты 6-азаспиро[3.4]октана, 2-азаспиро[4.4]нонана, 2-азаспиро[4.5]декана, 8-окса-2-азаспиро[4.5]декана. Найдено, что наличие антибактериальной активности к патогенам ESKAPE полученных соединений зависит от размера и природы спироциклического фрагмента. Разработан подход для направленной модификации 8-замещенного 2,6-диазаспиро[3.4]октана. Осуществлен синтез новых 5-нитрофуран-2-карбоксамидных производных, несущих фрагмент 8-замещенного 2,6-диазаспиро[3.4]октана и показана их высокая антибактериальная активность, в том числе по отношению к штаммам M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. Предложен дизайн потенциальных ингибиторов бактериального белка PBP2a, и получена серия №[4-(4-фторфенокси)фенил]амидов природных и неприродных аминокислот. Показана высокая антибактериальная активность спироциклических производных пирролидина по отношению к антибиотикорезистентным штаммам S. aureus. Теоретическая и практическая значимость

Разработаны подходы к синтезу новых спироциклических производных 6-

азаспиро[3.4]октана, 2-азаспиро[4.4]нонана, 2-азаспиро[4.5]декана, 8-окса-2-

азаспиро[4.5]декана, и на их основе получены новые аналоги ципрофлоксацина. Показано, что

производные 6-азаспиро[3.4]октана, 2-азаспиро[4.4]нонана обладают активностью к патогенам

группы ESKAPE сравнимой с ципрофлоксацином.

6

Предложенный подход к направленной модификации 8-замещенного 2,6-диазаспиро[3.4]октана позволил получить серию новых 5-нитрофуран-2-карбоксамидных производных, продемонстрировавших антибактериальную активность по отношению к M. tuberculosis и S. aureus. Ведущее соединение - 8-(4-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан показало высокую антибактериальную активность по отношению к штаммам M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью и может быть рекомендовано для дальнейших исследований на животных моделях туберкулеза.

Найден новый класс антибактериальных соединений - N-феноксифениламиды аминокислот. Одно из соединений - №[4-(4-фторфенокси)фенил]-6-(метилсульфонил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан-8-карбоксамид показало высокую антибактериальную активность по отношению к антибиотикорезистентным штаммам S. aureus и может быть рекомендовано для дальнейших исследований in vivo.

Методология и методы исследования

При выполнении диссертационной работы использовали современные методы и последние достижения органического синтеза. Чистоту и структуру всех полученных соединений подтверждали методами физико-химического анализа: 1H и 13С ЯМР-спектроскопией, ВЭЖХ-МС/МС, определением температуры плавления. Выделение и очистку полученных продуктов осуществляли методами экстракции, колоночной хроматографии и перекристаллизации. Биологические свойства целевых соединений исследовали методами in vitro в соответствии с общепринятыми методическими рекомендациями. В ходе работы был проведен анализ и обобщение данных, касающихся синтеза и биологических свойств полученных соединений.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Метод получения новых аналогов ципрофлоксацина, содержащих спироциклические фрагменты 6-азаспиро[3.4]октана, 2-азаспиро[4.4]нонана, 2-азаспиро[4.5]декана, 8-окса-2-азаспиро[4.5]декана;

2. Способ синтеза новых 5-нитрофуран-2-карбоксамидных производных, несущих фрагмент 8-замещенного 2,6-диазаспиро[3.4]октана;

3. Метод получения серии новых №[4-(4-фторфенокси)фенил]амидов аминокислот;

4. Противомикробная активность полученных соединений в отношении штаммов M. tuberculosis и группы патогенов ESKAPE.

Личный вклад автора состоит в анализе литературных данных, постановке задач, планировании эксперимента, а также в обработке и интерпретации данных физико-химических методов анализа, обобщении результатов биологических исследований. Все химические эксперименты, выделение, очистка и подготовка соединений к физико-химическим методам

7

анализа и биологическим испытаниям осуществлены автором лично или под его руководством. Автор участвовал в подготовке материалов к публикациям в научных журналах, представлял результаты работы на конференциях.

Степень достоверности и апробация работы

Достоверность полученных результатов обеспечена тщательным подбором условий проведения экспериментов, применением совокупности современных физико-химических методов определения строения органических соединений (1Н, 13С ЯМР спектроскопией) и их индивидуальности (ВЭЖХ-МС/МС анализ), а также методами статистического анализа (для биологических исследований).

Результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на 6 конференциях: XXII Ежегодной молодежной конференции c международным участием ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва, 2022), международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2023» (Москва, 2023), Восьмой Междисциплинарной конференции «Молекулярные и Биологические аспекты Химии, Фармацевтики и Фармакологии» (Санкт-Петербург, 2023), X Молодежной конференции ИОХ РАН к 300-летию Российской академии наук и 90-летию Института органической химии им. Н.Д. Зелинского (Москва, 2023), I Междисциплинарной всероссийской молодежной научной школе-конференции с международным участием «Молекулярный дизайн биологически активных веществ: Биохимические и медицинские аспекты» (Казань, 2023), школе-конференции для молодых ученых «Антибиотики и факторы бактериальной резистентности к ним» (Москва, 2023).

По теме диссертации опубликовано 3 научные статьи в журналах, индексируемых в международных базах данных Web of Science и Scopus, 6 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Объем диссертации и ее структура

Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 22 рисунка, 11 схем и 13 таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Туберкулез остается одним из наиболее заразных и смертельно опасных заболеваний, которое вызывается микобактериями туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis). Микобактерия — палочковидная бактерия длиной от двух до четырех микрометров. Одной из ее отличительных особенностей является толстая восковая клеточная стенка, состоящая в основном из миколовых кислот. Своеобразная структура клеточной стенки обуславливает устойчивость микобактерий к многочисленным противомикробным препаратам и затрудняет уничтожение патогенных микроорганизмов. Mycobacterium tuberculosis (Mtb) развивается медленно, время генерации составляет около 15-20 часов. Это облигатный аэроб, которому для роста необходим кислород, также это кислотоустойчивая бактерия. Кроме того, Mtb — это внутриклеточный патоген, который способен жить и расти внутри макрофагов хозяина, что позволяет ему ускользать от иммунной системы и вызывать длительные инфекции.

Вопрос разработки эффективных методов лечения туберкулеза остается приоритетным для медицинского сообщества, особенно в свете постоянно возникающей резистентности к противотуберкулезным препаратам. Появление штаммов туберкулеза с лекарственной устойчивостью (ЛУ-ТБ), с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ), с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ) сделало лечение туберкулеза традиционными методами сложным и неэффективным [1]. МЛУ-ТБ вызывается штаммами Mtb, устойчивыми, по крайней мере, к изониазиду (INH) и рифампицину (RIF), двум наиболее мощным противотуберкулезным препаратам [2]. ШЛУ-ТБ — это редкий тип туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ), который устойчив к изониазиду и рифампицину, а также к любому фторхинолону (FQ) и, по крайней мере, к одному из трех инъекционных препаратов второго ряда (амикацину, канамицину или капреомицину).

На сегодняшний день существуют одобренные лечебные схемы, которые позволяют эффективно лечить большинство пациентов с туберкулезом. Однако в последние годы были разработаны новые препараты для лечения более сложных форм лекарственно-устойчивого туберкулеза (ЛУ-ТБ). Среди них стоит выделить бедаквилин, деламанид и линезолид. Тем не менее, в лечении туберкулеза все еще существуют нерешенные проблемы. Большинство противотуберкулезных препаратов не обладают достаточной эффективностью против латентных бацилл и потому современные лечебные схемы требуют продолжительной терапии, что может привести к серьезным побочным эффектам [3]. Это также способствует плохому соблюдению режима лечения и развитию лекарственной устойчивости, что затрудняет борьбу с туберкулезом. Таким образом, существует острая необходимость в разработке противотуберкулезных препаратов, эффективных против латентных бацилл и резистентных штаммов [4].

В последние годы особый интерес вызывает изучение белков-мишеней микобактерий туберкулеза с целью разработки новых терапевтических стратегий. Белки-мишени микобактерий играют важную роль в механизмах патогенеза и выживания микобактерий в организме человека. Исследование свойств бактериальных белков могло бы привести к разработке новых противотуберкулезных препаратов, обладающих улучшенной эффективностью и безопасностью. 1.1 Лекарственные мишени и ингибиторы биосинтеза клеточной стенки Ы1Ъ

Клеточная стенка МЛ является основным местом взаимодействия хозяина с патогеном и является главным определяющим фактором прочности и устойчивости бациллы. Сложная и динамичная структура клеточной стенки (рисунок 1) необходима для поддержания целостности клетки, она обеспечивает адаптацию бактерий к условиям хозяина и играет ключевую роль в длительном инфицировании и вирулентности. Клеточная стенка состоит из нескольких основных подструктур: внутреннего слоя пептидогликана (PG), внешнего слоя миколовой кислоты (МА), среднего слоя полисахарида арабиногалактана (АГ), определенных липидов (липоманнан). Эти элементы придают клеткам восковой вид, повышают непроницаемость клеточной стенки и помогают МЛ ускользать от иммунной системы. Ингибирование ключевых ферментов, ответственных за биосинтез этих подструктур, является отличной целью для разработки новых препаратов, так как эти мишени не имеют гомологичных характеристик в организме хозяина [5].

Липоманнан

о л о

го е

п

л о

MMHMHHMMIHHHHHWfMH mHHMIIIIIIWIHIIH

м» мм HIIIIII *•< • МММ» »МММ

Клеточная мембрана

Арабиногалактан

Слой пептидогликана

Рисунок 1. Строение клеточной стенки Mycobacterium tuberculosis [6].

Слой пептидогликана. Пептидогликан состоит из N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) и N-ацетилмураминовой кислоты (MurNAc), которые связаны короткими пептидами. Биосинтез пептидогликана — это сложная последовательность реакций, начиная с синтеза липида II (один из липидов плазматической мембраны бактерий), когда гидрофобный полиизопреновый хвост,

встроенный в мембрану, соединяется с мономером клеточной стенки пептидогликана через пирофосфатный линкер. Затем следует транслокация связанного с мембраной липида II, полимеризация липида II и перекрестное сшивание с пенициллин-связывающими белками (PBP) (включая L,D-транспептидазы) [7]. На липид II воздействуют антибиотики рамопланин и тейксобактин, ингибируя процесс трансгликозилирования и влияя на образование пептидогликана.

Mtb также производит ß-лактамазу, фермент, катализирующий гидролиз ß-лактамных антибиотиков, что объясняет, почему использование этих антибиотиков не включено в лечение туберкулеза. Однако карбапенемы (1, рис. 2А) устойчивы к инактивации ß-лактамазами, и поэтому их включают в лечение туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью, поскольку они воздействуют на биосинтез пептидогликана путем ингибирования L,D-транспептидаз.

Слой миколовой кислоты. Миколовые кислоты (МА) представляют собой 2-алкил, 3-гидрокси длинноцепочечные (C60 - C90) жирные кислоты. Они составляют гидрофобный внешний липидный слой клеточной стенки микобактерий. Этот непроницаемый слой является отличительной чертой клеточной стенки и контролирует прохождение через нее молекул [7]. МА в составе Mtb существует в виде альфа (70%), метокси (10-15%) и кетомиколовых кислот (10-15 %) [8]. Синтазы жирных кислот I и II (FAS I и FAS II) участвуют в синтезе МА. Систему FAS-II можно обнаружить только у бактерий, что превращает эту систему в потенциальную селективную антибактериальную мишень. Еноил-(ацилпереносящий белок)-редуктаза InhA, участвует в системе FAS-II, и на него воздействует изониазид (2, рис. 2Б), препарат первой линии, используемый для лечения туберкулеза. Механизм действия этионамида (3, рис. 2Б) также связан с ингибированием InhA.

ß-кетоацилсинтаза KasA - важный фермент, участвующий в пути синтеза жирных кислот у Mtb. Он играет решающую роль в удлинении жирных кислот, катализируя конденсацию ацил-КоА, продукта пути FAS-I, с малонил-ACP (белком-ацил-переносчиком). KasA является единственным важным членом трех ß-кетоацилсинтаз, кодируемых в геноме Mtb [9] и этот белок был определен в качестве валидированной мишени для лечения туберкулеза [10]. С целью разработки более мощных соединений для оптимизации существующего ингибитора KasA DG167 были использованы структурные подходы [11]. Одним из таких соединений является индазол JSF-3285 (4, рис. 2Б). Биохимические, генетические и рентгеновские исследования подтвердили, что JSF-3285 специфически нацелен на KasA и проявляет значительную активность против этого фермента.

Карбапенемы (1)

Б: ингибиторы синтеза миколовой кислоты

Ингибиторы Мт^З B: ингибиторы синтеза арабиногалактана

ОР7ЕЫ-45 (7) Ингибиторы WecA

Ингибиторы DprE1

Рисунок 2. Отдельные соединения, воздействующие на клеточную оболочку микобактерий туберкулеза. Карбапенемы как ингибиторы L,D-транспептидаз; (Б) ингибиторы биосинтеза миколовых кислот; (В) ингибиторы биосинтеза арабиногалактана.

Миколовые кислоты транспортируются к внешней мембране благодаря бактериальным

мембранным белкам, называемым большими микобактериальными мембранными белками

(MmpL). Геном МЛ кодирует 13 белков MmpL, где MmpL 3, 4, 5, 7, 8, 10 и 11 участвуют в

биосинтезе клеточной стенки МЛ [12]. MmpL3 играет ключевую роль в транспорте миколовой

кислоты. Нарушение функции MmpL3 приводит к накоплению миколовых кислот на внутренней

стороне клеточной мембраны, что приводит к дефекту клеточной стенки и нарушению роста

бактерий [13, 14]. Производное этилендиамина SQ109 (5, рис. 2 Б) является ингибитором MmpL3 и прошло клинические испытания фазы IIb-III. SQ109 также накапливается в легких, месте инфекции, повышая эффективность препарата [15]. К другим перспективным ингибиторам MmpL3 относят индолкарбоксамиды и адамантилмочевины. Сообщалось, что в рамках программы перепрофилирования лекарственного каркаса модулятор каннабиноидных рецепторов римонабант (6, рис. 2Б) и его аналоги диарилпиразола проявляют мощную противотуберкулезную активность [16, 17].

Полисахаридный слой арабиногалактана. Арабиногалактан (АГ) с разветвленной цепью является основным полисахаридом клеточной стенки, составляющим около 35% клеточной стенки и состоящим из остатков арабинозы и галактозы, оба в фуранозной конфигурации. Этот средний слой ковалентно прикреплен к слоям пептидогликана и миколовой кислоты, что требует использования нескольких ферментов, которые являются потенциальными мишенями для создания новых ингибиторов для блокирования образования полисахарида арабиногалактана [18].

Присоединение арабиногалактана к структуре пептидогликана осуществляется через незаменимый линкер — дисахарид L-рамноза-D-N-ацетилглюкозамин. Фермент N-ацетилглюкозамин-1-фосфаттрансфераза, GlcNAc-1-P трансфераза (WecA), катализирует первую стадию биосинтеза этого линкера. Нуклеозидный антибиотик CPZEN-45 (7, рис. 2В), производное капразамицина, воздействует на микобактериальный фермент WecA и ингибирует рост Mtb [19, 20].

Ферменты декапренилфосфорил^^-рибозо-2'-оксидаза (DprEl) и декапренилфосфорил-D-2-кетоэритропентозоредуктаза (DprE2) участвуют в двухстадийной эпимеризации декапренилфосфорил^^-рибофуранозы в декапренилфосфорил^^-арабинофуранозу [21]. Декапренил-фосфоарабиноза является строительным блоком арабинановой части миколил-арабиногалактанового компонента клеточной стенки микобактерий. Каталитическая активность DprEl необходима для роста микобактерий [22]. Различные химические каркасы, такие как азаиндолы, аминохинолоны, бензотиазиноны, бензотиазолы, динитробензамиды, нитробензамиды, пиразолопиридины, хиноксалины, триазолы и тиадиазолы, продемонстрировали ингибирование DprEl [23]. Производные бензотиазинона BTZ-043 и PBTZ169 (8, 9 рис. 2 В) в настоящее время проходят II фазу клинических испытаний и продемонстрировали высокую эффективность против M. Tuberculosis [24, 25]. Также соединения TBA-7371 (10, рис. 2В) и OPC-167832 (11, рис. 2В), находящиеся в настоящее время в фазе II и фазах I/II клинических испытаний соответственно, показали многообещающие результаты [ 26, 27].

1.2 Энергетический обмен

Электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) микобактерий туберкулеза играет важную роль в обеспечении энергетических нужд этого патогена. Она состоит из ряда белковых комплексов, которые участвуют в передаче электронов и создании электрохимического градиента через мембрану. Начало электронно-транспортной цепи Mtb обычно связывают с комплексом I, или NADH дегидрогеназой, который окисляет NADH и передает электроны на убихинон (с участием комплекса II) (схематическое изображение ЭТЦ Mtb представлено на рисунке 3). Затем электроны переходят к комплексу III, или цитохрому bc1-aa3, который связан с протонным насосом и переносит электроны на цитохром с. Цитохром c передает электроны на комплекс IV, или цитохром aa3, который является конечным акцептором электронов и связан с окислением молекулярного кислорода в воду [28]. В процессе этого происходит перенос протонов через мембрану, создается электрохимический градиент. Этот электрохимический градиент, созданный электронно-транспортной цепью, используется микобактериями туберкулеза для синтеза АТФ [29]. Процесс синтеза АТФ осуществляется с помощью фермента АТФ-синтазы, который использует энергию электрохимического градиента для превращения АДФ и фосфата в АТФ.

Таким образом, электронно-транспортная цепь микобактерий туберкулеза является ключевым компонентом источника энергии для микроорганизма, и ее изучение может предоставить новые возможности для разработки противотуберкулезных лекарственных препаратов.

NADH2. Клофазимин (12, рис. 4), принадлежащий к классу минофеназинов, используется против проказы и недавно был перепрофилирован для создания высокоэффективных и значительно сокращенных схем лечения МЛУ-ТБ [31, 32]. 12, по-видимому, является пролекарством и, вероятно, восстанавливается НАДН-хинон оксидоредуктазой типа II (NDH-2). 12 предположительно конкурирует с менахиноном (МК-4), важным кофактором в микобактериальной ЭТЦ, и контролирует точку входа электрона в дыхательную цепь [33].

TBI-166 (13, рис. 4) является более мощным производным, чем исходный аналог 12, и проявляет активность in vitro против штаммов с лекарственной устойчивостью и штаммов с множественной лекарственной устойчивостью [34]. 13 не проявляет антагонизма или синергизма при тестировании с другими противотуберкулезными препаратами, такими как INH, RFP, BDQ, претоманид, линезолид (LZD) и PZA, но демонстрирует эффективность при комбинированном режиме лечения туберкулеза (например, TBI-166 + BDQ + LZD) [35].

Несколько аналогов фенотиазина обладают противотуберкулезным действием in vitro и подавляют рост Mtb в модели острой инфекции у мышей. Механизм действия аналогов

фенотиазина (хлорпромазина (14, рис. 4), трифлуоперазина (15, рис. 4) и тиоридазина (16, рис. 4)

заключается в ингибировании активности NADH: менахиноноксидоредуктазы [36, 37]. Цитоплазма

явннштишг

I Inner membrane 'J

ШЙМЁ1

. Nt

Клофазимин

TBI-166 Хлорпромазин Тиоридазин Трифлуоперазин

Q203 Лансопразол

Пиразинамид

Бедаквилин TBAJ-587 TBAJ-876 Скварамид

SQ109

Рисунок 3. Схематическое изображение микобактериальной цепи переноса электронов, изображающей NADH-дегидрогеназу 1 (NADH1), менахинон (MQ), NADH-дегидрогеназу 2 (NADH2), сукцинатдегидрогеназу (SDH), цитохромредуктазный комплекс bc1 III, цитохромоксидазный комплекс aa3 IV, цитохромоксидазу bd (Cyd bd) и АТФ-синтазные мишени. [30].

Цитохром bc1-aa3. Цитохром bc1-aa3 является ферментом, который играет важную роль в дыхательной цепи микобактерий туберкулеза. Он отвечает за трансформацию энергии из химической формы в электрическую форму, необходимую для жизнедеятельности клетки. Процесс работы цитохрома bc1-aa3 основан на принципе переноса протонов через мембрану клетки. В процессе передачи электронов, цитохром bc1-aa3 создает градиент протонов, который затем используется ферментом ATФ-синтазой для синтеза молекулы АТФ. Цитохром bc1-aa3 имеет небольшое сходство с человеческими ферментами. Это дает возможность разработки специфичных ингибиторов, которые будут действовать исключительно на целевую мишень.

Производные имидазопиридина являются примерами эффективных ингибиторов. В частности, Q203 (17, рис. 4) - один из таких препаратов, который в настоящее время проходит II фазу клинических испытаний и способен ингибировать штаммы Mtb с множественной лекарственной устойчивостью и широкой лекарственной устойчивостью [38, 39]. Еще одним препаратом, структурно похожим на Q203, является TB-47 (18, рис. 4), который также проявил активность против чувствительных и устойчивых к лекарствам штаммов Mtb, включая активные и латентные формы туберкулеза.

Некоторые другие соединения, такие как лансопразол (19, рис. 4) - ингибитор протонной помпы желудка, оказались эффективными в скрининге уже одобренных FDA препаратов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Виноградова Любовь Владимировна, 2024 год

лЛ //

р С1

481", 49% 48ё, 61% 4811,66% 481,67% 48], 58%

491,75% 49ё, 33% 49И, 75% 491,70% 49], 58%

Схема 9. Реагенты и условия: 1 Я8О2С1, БШ, СН2С12, 0°С^комн.т., 18 ч; ii. СБзСООН, СН2С12, 0 °С^-комн.т., 1 ч; 111. 5-нитрофуран-2-карбоновая кислота, КДИ, ДМФА, комн.т., 1 ч.

В основе дизайна серии 51 был использован аналогичный соединению-лидеру 35

спироциклический скаффолд с фрагментом 1,2,4-триазола, однако с измененными положением

5-нитрофуран-2-карбоксамидного остатка. В данном случае это были 5-нитрофуран-2-

карбоксамидные производные пирролидина, а сульфамидные фрагменты вводились по азоту

азетидинового цикла. Исходным соединением послужил также амин 47 (схема 10). В результате

были получены 5 нитрофурановых производных 5^^.

N0,

я= *—СН3

51а, 41% 51Ь, 40% 51с, 41% 51(1,38% 51е,26%

Схема 10. Реагенты и условия: 1 5-нитрофуран-2-карбоновая кислота, КДИ, ДМФА, комн.т., 1 ч; 70%; и. СБзСООН, СН2С12, 0 °С^комн.т., 1 ч; Ш. Я8О2С1, БШ, СН2С12, 0°С^комн.т., 18 ч.

Соединения серии (52) имеют скаффолд, в котором азетидиновый цикл был заменен на

пирановый и алициклические циклы С4-С6. Исходными соединениями для этого послужили

амины 15Ь, 15d, 15^ 15^ полученные нами ранее для синтеза производных ципрофлоксацина.

Четыре соединения 52Ь, d, f, i были синтезированы аналогично 50 (табл. 6).

Таблица 6. Структура и выходы соединений 52Ь,а,1",1

[Г/—соон О * 02М^О ад^ЧА-л 1 7>Л -~ КДИ, ДМФА 15Ь, 15с1, Ш, 151, 52Ь. 52(1, 5Н, 521

№ Структура Выход, % № Структура Выход, %

52Ь 47 52Г 41

52а 51 521 53

Одним из подходов при оптимизации соединения-лидера является концепция упрощения, при которой исключаются некоторые структурные фрагменты исходной молекулы. Мы реализовали эту идею на примере серии 54, полностью исключив пирролидиновый фрагмент с исчезновением спироциклической структуры. Исходными соединениями послужили азетидины 53а-с, которые были получены ранее в нашей лаборатории (схема 11). 5-нитрофуран-2-карбоксамидные производные 54а-с были получены аналогично соединениям 50.

к

\

54а, 16% 54Ь, 13% 54с, 35%

Схема 11. Реагенты и условия: 1 СБзСООН, СШСЬ, 0 °С^-комн.т., 1 ч; п. 5-нитрофуран-2-карбоновая кислота, КДИ, ДМФА, комн.т., 1 ч.

Таким образом в ходе оптимизации структуры молекулы 35 нами были получены 5 серий

соединений, не описанных ранее 5-нитрофуран-2-карбоксамидных производных. Строение и

чистота полученных соединений были подтверждены данными 1H ЯМР, 13С ЯМР спектроскопии и масс-спектрометрии высокого разрешения.

Исследования противотуберкулезной активности соединений проводились in vitro5 на штамме Mycobacterium tuberculosis H37Rv, чувствительном к антибиотикам. Полученные данные (табл. 7) показывают, что в ходе оптимизации мы не смогли повысить активность предложенных молекул. Причем даже на ближайших аналогах соединения-лидера 35, активность полностью терялась. Для исключения возможных ложноположительных и ложноотрицательных результатов исследования in vitro соединений 35, 46a-b, 49a-j, 51a-e, 52b, 52d, 52f, 52i, 54a-c были проведены несколько раз.

Таким образом, результаты этого и предыдущего этапа работы показывают, что для проявления активности в молекуле важны следующие компоненты:

1) наличие 5-нитрофуран-2-карбоксамидного фрагмента, который располагается именно по азетидиновому циклу, а не по пирролидиновому;

2) в 8 положении спироцикла присутствие именно фрагмент К-метил-1,2,4-триазола;

3) наличие метансульфониламидной группы.

Данные по активности 8-(4-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-6-(метилсульфонил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октана 35 позволяют говорить с одной стороны о том, что нами обнаружена высокоактивная молекула, преодолевающая антибиотикорезистентный барьер Mycobacterium tuberculosis, а с другой стороны данные связи структура-активность (SAR) несомненно требуют более детального исследования в будущем возможной мишени, на которую направлено действие этого соединения. Также следует отметить найденный нами новый хемотип (соединения 54а-с) наиболее близкий по структуре соединению 5, ранее показавшему хорошие данные по активности in vivo, это позволяет рассматривать соединения 54а-с, как отправную точку для дальнейшей оптимизации.

Таблица 7. Выходы соединений 52i, 54a-c, их минимальная ингибирующая концентрация (МИК) в отношении штамма Mtb H37Rv.

Соединение 52i 54a 54b 54c Этамбутол Изониазид

МИК, мкг/мл 3.1 12.5 25 6.2 0.78-2.0 0.025-0.05

Все полученные в ходе этого этапа работы соединения были исследованы на антибактериальную активность in vitro4 по отношению к патогенам ESKAPE. Было установлено, что полученные соединения проявляют активность исключительно против S. aureus, причем 10 соединений (табл. 8) имеют значения МИК, сравнимые с ципрофлоксацином. Это позволяет рекомендовать соединения 49b и 54с для дальнейших исследований на антибиотико-резистентных штаммах S. аureus.

Таблица 8. Антибактериальная активность соединений 24d, 30, 39, 40, 42, 45, 49b, 52f, 52i, 54c, их минимальная ингибирующая концентрация (МИК) в отношении S. aureus.

Соединение МИК, мкг/мл Соединение МИК, мкг/мл

24d 1.275 45 5

30 5.6 49b 0.171

39 2.65 52f 2.3

40 0.7 52i 2.95

42 1.35 54c 0.19

Cip 1.25

*Cip - ципрофлоксацин

2.4 Синтез ^[4-(4-фторфенокси)фенил]амидов аминокислот

Исходным соединением для синтеза двух серий соединений 62 и 63 послужил 4-фторфенол 55, который вводили в реакцию с 4-фторэтилбензоатом 56 или 4-фторнитробензолом 57. Последующий щелочной гидролиз сложного эфира 58 с высоким выходом приводил к кислоте 60 (выход по 2 стадиям 86%). Восстановление нитропроизводного 59 проводили водородом при атмосферном давлении, используя 10% Pd/C в качестве катализатора (выход 82%). Далее проводили конденсацию амина 61 и кислоты 60 с соответствующими Вос-защищенными аминокислотами и моно-Вос-защищенными диаминами. Полученные продукты обрабатывали 4Н HCl в диоксане, удаляя дареда-бутилоксикарбонильную защиту и получая целевые производные 62a-o и 63a,b (табл. 9).

Скрининг антибактериальной активности4 синтезированных соединений проводился в отношении патогенов ESKAPE, штаммы бактерий, использованные в экспериментах: Enterococcus faecium (ATCC 19434, NCTC 7171), Staphylococcus aureus (ATCC 29213, NCTC 12973), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883, NCTC 9633), Acinetobacter baumannii (ATCC 19606, NCTC 12156), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853, NCTC 12903), Enterobacter aerogenes (NCTC 9735). Первоначально скрининг был проведен диско-диффузионным методом (ДДМ) Тестирование чувствительности микроорганизмов к группе соединений проводили в соответствии со стандартной рабочей процедурой Европейского комитета по тестированию антимикробной чувствительности (EUCAST). Восприимчивость к веществам оценивали в сравнении с диаметром зоны подавления роста бактерий вокруг диска с ципрофлоксацином (таблица 10).

Дополнительно антибактериальную активность оценивали путем определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) методом серийных разведений. Данные тестов in vitro соединений 62a-o и 63a,b показали, что все соединения, содержащие фрагмент пирролидина, проявляли высокую активность, сравнимую с ципрофлоксацином (табл. 11). В результате первичного скрининга было определено вещество-лидер 62g.

50

Таблица 9. Структура и выходы соединений 62a-o и 63a,b.

-С он Jn. К,СО, ДМФ/ о— ^г^ 130°С, 12 ч F f4C \ 1)RR'NH, HBTU, Et3N 0 7S6 ДМФА, комн.т., 12 ч ГТ XI —-О L1 -- Y^I fy^™* , 2) 4M HCI в диоксане, ° 86% КОМН.Т., 8 ч 24-44% ^ О ^ 1JRCOOH, HBTU, Et3N О * f^X X" jL _f^lT Xll ДМФА'К0МН-Т"124 NHC-R ^>-N02 F^^ s9 ^N02 XX XX 62l"° 57 2) 4M HCI в диоксане, 0 „ 25-67% 82% комн.т., 8 ч

62a 62b 62c 62d 62e 62f

R н 0х H V V-NH n h 3 h H \ cIt4 h

Выход*,% 55 52 50 33 35 50

62g 62h 62i 62j 62k 621

R о n—v n h HN—v 5 h <$ h X n h Oy h '

Выход*,% 27 39 66 25 32 30

62m 62n 62o 63a 63b

R nh2 h n h r,r'= nh2

Выход*,% 67 35 64 44 24

*Выход дан по последней стадии. Для изучения активности 62g на нозокомиальных штаммах была проведена серия

исследований4 с клиническими изолятами Staphylococcus aureus, обладающими

полирезистентностью к официнальным антибиотикам: амоксиклав, амоксициллин, ампициллин,

ампициллин/сульбактам, ванкомицин, доксициклин, левофлоксацин, линезолид, меропенем,

моксифлоксацин, офлоксацин, фурагин, фурадонин, рокситромицин, цефазолин, цефокситин,

цефтриаксон, цефуроксим, ципрофлоксацин.

Таблица 10. Антибактериальная активность (зона ингибирования (ЗИ, мм) соединений 62а-е, 63а,Ь и ципрофлоксацина (положительный контроль) против патогенов панели ESKAPE.

Соединение E. faecium S. aureus K. pneumoniae A. baumannii P. aeruginosa E. cloacae

ЗИ (мм)

62a 0 0 0 0 0 0

62b 9 7 15 0 13.3 19

62c 0 12 0 10 10 0

62d 9 0 0 0 0 0

62e 8 0 0 0 0 0

62f 0 0 0 0 0 0

62g 9 9 0 0 0 0

62h 9 11 0 0 0 0

62i 9 0 0 0 0 0.

62j 9 13 0 0 0 11

62k 0 0 0 0 0 0

62l 9 0 0 0 0 0

62m 0 0 0 0 0 0

62n 9 7 0 0 0 0

63a 0 0 0 0 0 0

63b 0 0 0 0 0 0

Cip 17 21 27 14 25 21

* С1р - ципрофлоксацин

Таблица 11. Минимальная ингибирующая концентрация соединений 62Ь,с^,И.],п и ципрофлоксацина (положительный контроль) против патогенов панели ESKAPE.

Соединение E. faecium S. aureus K. pneumoniae A. baumannii P. aeruginosa E. cloacae

МИК (мкг/мл)

62b 0.75 >6 0.75 >6 3.00 1.50

62c нт** 0.37 нт 0.74 0.74 1.48

62g 0.33 0.33 1.30 1.30 нт 2.6

62h 3.10 0.39 нт нт нт 1.55

62j 0.33 0.65 2.60 2.60 нт 2.60

62n 6.20 0.39 1.55 3.10 нт 3.10

Cip 1.25 1.25 0.60 2.50 0.60 3.00

* С1р - ципрофлоксацин

** нт - не тестировался

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводилось капельным методом согласно МУК 4.12.1890-04 и EUCAST v.10.0. Изучение чувствительности бактерий каждого вида группы ESKAPE осуществляли с использованием антибиотиков, предусмотренных Рекомендациями МАКМАХ «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам» (2021).

МИК находились в диапазоне 0,09-0,75 мкг/мл и в большинстве случаев были в 10-100 раз ниже контрольных МИК (табл. 12). Они были значительно ниже, чем МИК соединения 7 (2 мкг/мл) против мультирезистентных штаммов MRSA.

Таблица 12. Антибактериальная активность соединения 62g и ципрофлоксацина (положительный контроль) против клинических изолятов MRSA с множественной устойчивостью.

Staphylococcus aureus, ЗИ (мм) + МИК (мкг/мл)

Штамм Соединение 62g МИК ципрофлоксацина Профиль чувствительности к АБ

ЗИ (мм) МИК (мкг/мл)

2692 9 0.75 0 R

4225 11 0.375 0 R

5436 9 0.75 32 R

8316 14 0.75 0 R

7854 10 0.75 16 R

2713 9 0.75 0 R

7135 9 0.75 0 R

966 9 0.093 1 I

2598 9 0.093 0.5 R

4844 9 0.093 0.5 S

6041 11 0.75 16 R

3014 14 0.75 0 R

4687 12 0.1875 0 S

4624 9 0.1875 0.5 S

4724/5 7 0.75 0.5 I

1516 11 0.093 0.5 I

R - резистентные штаммы S - чувствительные к антибиотику штаммы

I - штаммы с так называемой клинической резистентностью, у которых пограничные значения чувствительности в МИК к антибиотику

Таким образом, был предложен и осуществлен синтез серии новых соединений с высокой

активностью против грамположительных патогенов панели ESKAPE. Спироциклическое

производное 62g показало отличные результаты МИК (0.093-0.75 мкг/мл) против метицилин-

резистентных штаммов Staphylococcus aureus (MRSA) и может быть рекомендовано для

дальнейших доклинических исследований.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Ход реакции контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках c алюминиевой подложкой (Силикагель 60 F254, Merck, Германия). Визуализацию пластин осуществляли в УФ-свете (254 нм), раствором нингидрина, с последующим прогреванием.

Адсорбционную колоночную хроматографию проводили на силикагеле Kieselgel 60 (0.040 - 0.063 мм или 0.063 - 0.200 мм) (Merck, Германия). Все операции с реагентами, чувствительными к влаге и кислороду, проводили в атмосфере сухого аргона в тщательно высушенной посуде.

Растворители удаляли упариванием на роторном испарителе (давление 10^20 мм. рт.ст.; температура 20 ^ 40 °С), с последующей отсушкой остатка на масляном насосе при давлении 0,1 мм. рт.ст.

В работе использовали растворители марок «хч», «чда» и «осч» отечественного производства.

Структуры всех синтезированных соединений подтверждены с помощью спектроскопии ЯМР. Спектры ЯМР 1Н, 13С регистрировали на импульсном Фурье-спектрометре Bruker DPX-300 (Bruker, Германия) в ДМСО^6, CDCb, D2O-DC1 с рабочей частотой 300 МГц (1Н) и 75 МГц (13С). Химические сдвиги 5 приведены в миллионных долях (мд) относительно внутреннего стандарта тетраметилсилана (5, 0.000 мд). Константа спинспинового взаимодействия (J) указана в Гц. При описании спектров приняты следующие сокращения: с - синглет, ушир.с - уширенный синглет, д - дублет, дд - дублет дублетов, дт - дублет триплетов, т - триплет, тд - триплет дублетов, кв -квартет, м - мультиплет.

Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) получены на приборе Axima Resonance (Shimadzu, Япония). Спектры ВЭЖХ-МС получены с помощью системы, включающей жидкостной хроматограф Agilent 1290 Infinity (Agilent, США), масс-спектрометр AB Sciex 6500 QTRAP LCMS Shimadzu 8030.

Температуру плавления определяли с использованием аппарата SMP3 (Stuart Scientific,

UK).

Основная процедура синтеза соединений 12a-d на примере получения этил 2-циклобутилиденацетата (12a) jf COzEt

К охлажденной до 0 °С суспензии NaH (60% дисперсия в минеральном масле 5,5 г, 0,082 моль) в абсолютизированном ТГФ (150 мл) при перемешивании добавляли триэтилфосфоноацетат (17,4 г, 0,086 моль). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре в течение 30 мин. Затем охлаждали до 0°C,

после чего добавляли циклобутанон 11a (5 г, 0,071 моль) в ТГФ (50 мл). Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры еще раз и перемешивали при этой температуре в течение ночи. Затем реакционную массу разбавляли этилацетатом и промывали последовательно насыщенным раствором NaHCO3, водой и насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na2SO4. Растворитель удаляли под вакуумом. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя гексаном и увеличивая полярность элюента добавлением этилацетата от 0 до 10 %. Выход 8,5 г (85%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CH3CN-JJ+D2O) 5 5.61-5.52 (м, J = 2.3 Гц, 1H), 4.05 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 3.10 - 2.97 (м, 2H), 2.88 - 2.74 (м, 2H), 2.10-1.94 (p, J = 7.9 Гц, 2H), 1.18 (т, J = 7.1 Гц, 3H). 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^) 5 167.79, 165.82, 112.33, 59.46, 33.80, 32.38, 17.62, 14.61.

этил 2-(дигидро-2#-пиран-4(3#)-илиден)ацетат (12b)

4.07 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 3.64 (дт, J = 13.3, 5.5 Гц, 4H), 2.89 (т, J = 5.6 Гц, 2H), 2.29 (т, J = 5.5 Гц, 2H), 1.19 (т, J = 7.1 Гц, 3H).

Выход 6,3 г (73%) бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 5.60 - 5.53 (м, 1H), 4.10 (кв, J = 7.1 Гц, 2H), 2.85 - 2.74 (м, 2H), 2.21 - 2.11 (м, 2H), 1.70 - 1.48 (м, 6H), 1.24 (т, J = 7.2 Гц, 3H).

Выход 6,2 г (68%) бесцветное масло. 1Н ЯМР (300 МГц, CDClз) 5 5.83-5.74 (м, 3 = 2.3 Гц, 1Н), 4.14 (кв, 3 = 7.2 Гц, 2Н), 2.82 - 2.70 (м, 2Н), 2.49 - 2.36 (м, 2Н), 1.82 - 1.57 (м, 4Н), 1.26 (т, 3 = 7.1 Гц, 3Н).

Основная процедура синтеза соединений 14a-d

К раствору соответствующего ненасыщенного эфира 12а^ (21 ммоль) в ацетонитриле (50 мл) добавляли фторид лития (83 ммоль) и (метоксиметил)-1-фенил-Ы-(триметилсилилметил)метанамин (25 ммоль). Полученную смесь перемешивали при 60 °С в течение ночи. Растворитель удаляли на вакуумном роторном испарителе, остаток растворяли в этилацетате (50 мл), и раствор промывали насыщенным раствором уксусной кислоты (3 х 25 мл). Объединенные водные растворы экстрагировали этилацетатом (2 х 100 мл), водную фазу подщелачивали до рН 8,0 с помощью насыщенного раствора K2COз и снова экстрагировали

Выход 5,9 г (70%) бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 5.71 (с, 1H),

этил 2-циклогексилиденацетат (2c) C02Et

этил 2-циклопентилиденацетат (12d) C02Et

этилацетатом (2 х 100 мл). Объединенные органические растворы сушили над безводным Na2SO4, растворитель удаляли на роторном испарителе. Остаток растворяли в этаноле (25 мл), затем добавляли 10% Pd/C (0,25 г) и смесь гидрировали в автоклаве при 100 атм. и комнатной температуре в течение 12 ч. Затем реакционную смесь фильтровали через слой целита, фильтрат выпаривали. Остаток растворяли в этилацетате (50 мл) и порциями добавили Boc2O (20,75 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, после чего промывали 5% раствором лимонной кислоты (3 х 50 мл), сушили над безводным Na2SO4, растворитель удаляли на роторном испарителе. Очистку проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя хлористым метиленом и постепенно повышая полярность до системы 1% метанола в хлористом метилене.

6-трет-бутил 8-метил-6-азаспиро[3,4]октан-6,8-дикарбоксилат (14а)

4.21-4.00 (м, 2H), 3.46-3.26 (м, 4H), 2.94 (дд, J = 12.3, 6.3 Гц, 1H), 2.17-1.67 (м, 6H), 1.40 (с, J = 21.9 Гц, 9H), 1.21 (т, J = 7.1 Гц, 3H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-de) 5 172.06, 171.98, 154.06, 153.94, 78.84, 60.60, 56.95, 56.65, 51.11, 50.42, 47.23, 47.04, 46.89, 46.46, 31.78, 31.44, 28.57, 27.42, 27.31,

15.81, 14.61. Масс-спектр, m/z: 284.2 (M+H+). 2-трет-бутил-4-этил-8-окса-2-азаспиро[4,5]декан-2,4-дикарбоксилат (14b) ЕЮ ^

оКТ°с

О--7 Выход 3,44 г (53%) прозрачное масло. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-de) 5 4.21-4.01 (м, 2H), 3.76-3.60 (м, 2H), 3.42 (дт, J = 26.0, 10.8 Гц, 5H), 3.20 (дд, J = 10.7, 4.1 Гц, 1H), 2.90 (дд, J = 8.5, 5.2 Гц, 1H), 1.79 (тд, J = 13.5, 4.1 Гц, 1H), 1.48 (д, J = 9.8 Гц, 1H), 1.40 (с, 9H), 1.39-1.27 (м, 3H), 1.20 (т, J = 7.1 Гц, 3H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО- d6) 5 172.28, 172.06, 154.13, 153.97, 78.77, 60.41, 54.68, 54.29, 51.95, 50.86, 46.85, 45.25, 44.32, 35.38, 35.28, 30.63, 30.51, 28.54,

25.82, 23.29, 23.14, 22.90, 14.51. Масс-спектр, m/z: 314.2 (M+H+). 2-трет-бутил-4-метил-2-азаспиро[4,4]декан-2,4-дикарбоксилат (14с)

Выход 2,96 г (46%) прозрачное масло. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-de) 5 4.23-3.96 (м, 2H), 3.50-3.38 (м, 2H), 3.36-3.22 (м, 1H), 3.15-3.00 (м, 1H), 2.80 (к, J = 6.9 Гц, 1H), 1.68-1.44 (м, 5H), 1.43-1.35 (м, 10H), 1.34-1.04 (м, 9H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО- de) 5 172.28,

Выход 2,87 г (49%) прозрачное масло. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-de) 5

NBoc

172.06, 154.13, 153.97, 78.77, 60.41, 54.68, 54.29, 51.95, 50.86, 46.85, 45.25, 44.32, 35.38, 35.28, 30.63, 30.51, 28.54, 25.82, 23.29, 23.14, 22.90, 14.51. Масс-спектр, m/z: 312.2 (M+H+). 2-трет-бутил-4-этил-2-азаспиро[4.4]нонан-2,4-дикарбоксилат (14d)

Выход 3.4 г (56%), прозрачное масло. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-<^) 5 4.203.98 (м, 2H), 3.49-3.39 (м, 2H), 3.32 (с, 1H), 3.08 (дд, J = 10.2, 6.1 Гц, 1H), 2.89 (дт, J = 17.3, 6.5 Гц, 1H), 2.81-2.58 (м, 1H), 1.80-1.68 (м, 1H), 1.66-1.50 (м, 5H), 1.46-1.29 (м, 11H), 1.19 (т, J = 7.1 Гц, 3H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^) 5 172.98, 172.80, 169.83, 154.03, 153.91, 78.82, 57.22, 56.96, 52.31, 51.89, 51.41, 50.71, 50.05, 47.91, 47.84, 36.66, 36.33, 32.49, 28.54, 24.63, 24.55, 24.39, 24.34. Масс-спектр, m/z: 294.2 (M+H+).

Основная процедура синтеза соединений 15a-k.

К раствору соответствующего спиросоединения (14a-d) (2 г, 7 ммоль) в этаноле (15 мл) добавляли гидразин N2H4 (64% водный раствор, 1 мл). Полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 8 часов, охлаждали до комнатной температуры. Растворитель удаляли под вакуумом. Остаток растворяли в этаноле (25 мл) и добавляли циклопропилизотиоцианат (0,87 г, 9 ммоль, 1,25 eq.). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 2 часов и затем охлаждали до комнатной температуры. Добавляли насыщенный водный раствор K2CO3 (5 мл), смесь снова доводили до температуры кипения с обратным холодильником и перемешивали при этой температуре в течение 8 часов. После охлаждения до комнатной температуры растворитель удаляли под вакуумом. Остаток растворяли в воде (25 мл) и раствор нейтрализовали 5%-ным водным раствором HCl. Полученный осадок отделяли фильтрованием и растворяли в этаноле (25 мл). Добавляли суспензию свежеприготовленного никеля Ренея в минимальном количестве этанола и полученную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 12 часов. После охлаждения до комнатной температуры смесь фильтровали через целит, фильтрат концентрировали в вакууме. Очистку проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя хлористым метиленом и постепенно повышая полярность до системы 1% метанола в хлористом метилене. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в 1,4-диоксане (5 мл) и добавляли 4М раствор HCl в 1,4-диоксане (5 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение ночи и концентрировали в вакууме. Остаток перекристаллизовывали из этанола.

Гидрохлорид 8-(4-Циклопропил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-6-азаспиро[3.4]октана (15а)

орн

N==\

Выход 1.1 г (62%), белое твердое вещество, W= 121-123 °C. ^ ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) 5 10.14 (с, 1H), 9.73 (с, J = 28.2 Гц, 1H), 9.61 (с, 1H), 3.99 (т, J = 6.0 Гц, 1H), 3.723.54 (м, 2H), 3.54-3.30 (м, 3H), 2.29-2.03 (м, 2H), 1.99-1.79 (м, 3H), 1.78-1.56 (м, 1H), 1.31-1.05 (м, 4H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) 5 154.84, 144.29, 55.37, 54.20, 49.03, 48.63, 47.61, 31.92, 27.34, 26.46, 15.82, 7.17, 6.87. Масс-спектр, m/z: 219.4 (M+H+).

Гидрохлорид 8-(4-пропил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-6-азаспиро[3.4]октана (15b)

ООн

N=( /-

м N—' .

Выход 0.88 г (49%), белое твердое вещество, W= 128-129 °C. 1H ЯМР (300

МГц, ДМСО-^б) 5 10.26 (с, 1H), 9.79 (с, 2H), 4.25-4.12 (м, 2H), 3.99 (дд, J = 7.2, 5.4 Гц, 1H), 3.653.26 (м, 4H), 2.21-2.01 (м, 2H), 1.97-1.75 (м, 5H), 1.74-1.49 (м, 1H), 0.92 (т, J = 7.3 Гц, 3H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) 5 153.33, 144.06, 55.37, 54.06, 48.72, 47.62, 47.14, 31.44, 26.25, 23.28, 15.77, 11.01. Масс-спектр, m/z: 221.2 (M+H+).

Гидрохлорид 8-[4-(Циклопропилметил)-4#-1,2,4-триазол-3-ил]-6-азаспиро[3.4]окта-на (15c)

орн

N=(

^ Выход 0.82 г (44%), белое твердое вещество, W= 103-104 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) 5 10.30 (с, 1H), 10.02-9.68 (м, 2H), 4.13 (д, J = 7.0 Гц, 2H), 4.00 (т, J = 6.0 Гц, 1H), 3.51-3.28 (м, 3H), 2.19-1.99 (м, 3H), 1.95-1.75 (м, 3H), 1.76-1.51 (м, J = 4.5 Гц, 1H), 1.50-1.16 (м, J = 12.3 Гц, 1H), 0.70-0.41 (м, 4H);13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) 5 153.33, 144.06, 55.37, 54.06, 48.72, 47.62, 47.14, 31.44, 26.25, 23.28, 15.77, 11.01. Масс-спектр, m/z: 233.4 (M+H+).

Гидрохлорид 4-(4-Метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-азаспиро[4.4]нонана (15d)

ост

м N— ,

Выход 1.05 г (62%), белое твердое вещество, W= 150-151 °C. 1H ЯМР (300

МГц, ДМСО-^б) 5 10.27 (с, 1H), 9.93 (с, 1H), 9.73 (с, 1H), 3.94-3.86 (м, 1H), 3.83 (с, 3H), 3.73-3.40 (м, 2H), 3.34-3.05 (м, 2H), 1.97-1.75 (м, 1H), 1.48 (тд, J = 33.8, 26.4, 7.5 Гц, 8H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) 5 154.18, 144.64, 54.28, 54.12, 48.19, 35.78, 33.15, 31.13, 24.14, 23.99. Масс-спектр, m/z: 207.4 (M+H+).

Гидрохлорид 4-(4-циклопропил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-азаспиро[4.4]нонана (15e)

'NH

N-

^ Выход 1.01 г (54%), белое твердое вещество, W= 135-136 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-Je) 5 10.23 (с, 1H), 9.95 (с, 1H), 9.79 (с, 1H), 3.93 (с, 1H), 3.80-3.42 (м, 3H), 3.37-3.06 (м, 2H), 1.94-1.78 (м, J = 11.6 Гц, 1H), 1.77-1.36 (м, 7H), 1.33-0.99 (м, J = 37.2 Гц, 4H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) 5 155.26, 144.16, 54.43, 53.98, 48.30, 41.14, 36.24, 31.20, 27.69, 24.28, 24.14, 7.28, 6.73. Масс-спектр, m/z: 233.2 (M+H+).

Гидрохлорид 4-(4-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-азаспиро[4.5]декана (15f) ~NH

м N— ,

Выход 1.06 г (59%), белое твердое вещество, W= 147-148 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) 5 10.17 (с, 1H), 9.84 (с, 1H), 9.51 (с, 1H), 3.80 (с, J = 18.5 Гц, 3H), 3.73-3.47 (м, J = 14.5 Гц, 3H), 3.43-3.28 (м, 1H), 3.26-3.10 (м, 1H), 1.83 (д, J = 11.3 Гц, 1H), 1.65-1.18 (м, 7H), 1.160.61 (м, 2H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^6) 5 152.88, 145.12, 55.37, 51.44, 47.13, 46.99, 42.69, 34.37, 32.80, 29.84, 25.31, 23.40, 22.69. Масс-спектр, m/z: 221.4 (M+H+).

Гидрохлорид 4-[4-(циклопропилметил)-4#-1,2,4-триазол-3-ил]-2-азаспиро[4.5]дека-на (15g)

N

м N

'Выход 1.07 г (52%), белое твердое вещество, W= 136-137 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) 5 10.28 (с, 1H), 9.87 (с, 1H), 9.60 (с, 1H), 4.08-3.86 (м, J = 21.8 Гц, 3H), 3.76-3.46 (м, 3H), 3.42-3.08 (м, 2H), 1.83 (д, J = 11.0 Гц, 1H), 1.63-1.17 (м, 9H), 1.12-0.85 (м, J = 23.5 Гц, 2H), 0.66-0.41 (м, 4H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^) 5 152.34, 143.91, 55.39, 51.33, 50.34, 47.14, 42.70, 34.22, 29.91, 25.34, 23.33, 22.76, 11.00, 4.82, 4.41. Масс-спектр, m/z: 261.2 (M+H+). Гидрохлорид 4-(4-бензил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-азаспиро[4.5]декана (15h)

О

Выход 0.97 г (42%), белое твердое вещество, W= 164-165 °C. 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 10.06 (с, 1H), 9.71 (с, 1H), 9.29 (с, 1H), 7.46-7.15 (м, 5H), 5.57-5.24 (м, 2H), 3.703.54 (м, 2H), 3.52-3.34 (м, J = 23.1 Гц, 1H), 3.31-3.15 (м, 2H), 1.72 (д, J = 8.7 Гц, 1H), 1.53-1.34 (м, J = 6.0 Гц, 2H), 1.34-1.00 (м, 6H), 0.96-0.76 (м, 1H), 0.73-0.49 (м, J = 23.6 Гц, 1H); 13C ЯМР (75

МГц, CDCI3) 5 144.74, 141.67, 129.45, 128.99, 128.55, 51.44, 48.46, 47.85, 47.24, 47.11, 46.61, 42.58, 34.12, 31.74, 30.16, 25.29, 22.99, 22.85. Масс-спектр, m/z: 297.2 (M+H+).

Гидрохлорид 4-(4-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-8-окса-2-азаспиро[4.5]декана (15i)

~NH

Выход 1.04 г (58%), белое твердое вещество, W= 158-159 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) 5 10.28 (с, 1H), 10.00 (с, 1H), 9.61 (с, 1H), 3.83 (с, 3H), 3.78-3.47 (м, 6H), 3.463.27 (м, J = 11.3 Гц, 3H), 1.82 (д, J = 12.7 Гц, 1H), 1.75-1.57 (м, J = 14.8 Гц, 1H), 1.44-1.15 (м, J = 4.3 Гц, 2H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) 5 152.74, 145.05, 64.49, 64.06, 50.80, 46.73, 45.01, 42.31, 33.96, 32.99, 30.02. Масс-спектр, m/z: 223.2 (M+H+).

Гидрохлорид 4-(4-циклопропил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-8-окса-2-азаспиро[4.5]декана

(15j)

NiВыход 0.71 г (36%), белое твердое вещество, W= 145-146 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) 5 10.25 (s, 1H), 10.03 (с, 1H), 9.67 (с, 1H), 3.93-3.10 (м, 7H), 1.92-1.60 (м, 3H), 1.24 (дт, J = 91.8, 38.8 Гц, 8H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) 5 153.84, 144.62, 66.80, 64.60, 64.12, 51.09, 46.92, 44.84, 34.56, 30.41, 7.46, 6.83. Масс-спектр, m/z: 249.4 (M+H+).

Гидрохлорид 4-[4-(циклопропилметил)-4#-1,2,4-триазол-3-ил]-8-окса-2-азаспиро-[4.5]декана (15k)

^ Выход 1.06 г (51%), белое твердое вещество, W= 129-130 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) 5 10.42 (с, 1H), 10.04 (с, 1H), 9.69 (с, 1H), 4.22-3.88 (м, 2H), 3.85-3.24 (м, 9H), 1.82 (д, J = 12.6 Гц, 1H), 1.64 (тд, J = 12.8, 4.7 Гц, 1H), 1.42-1.15 (м, J = 42.7 Гц, 3H), 0.69-0.36 (м, 4H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) 5 152.17, 143.90, 64.43, 64.12, 55.41, 50.67, 50.43, 46.86, 45.03, 42.32, 33.81, 30.05, 10.97, 4.84, 4.41. Масс-спектр, m/z: 263.4 (M+H+).

Основная процедура синтеза соединений 2a-k

Соединение 16 (98 мг, 0,24 ммоль) растворяли в ацетонитриле (10 мл) и при перемешивании прикапывали раствор спироциклического амина 15а-к (0,48 ммоль) и триэтиламина (66 мкл, 0,48 ммоль) в ацетонитриле. Перемешивание продолжали при 60°С в течение 10 часов. Летучие вещества удаляли в вакууме. Очистку проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя хлористым метиленом и постепенно

повышая полярность до системы 5% метанола в хлористом метилене. Фракции, содержащие продукт, объединяли и концентрировали в вакууме. Остаток растворяли в 2% водном растворе NaOH и оставляли перемешиваться при комнатной температуре на ночь. Реакционную смесь подкисляли 5%-ным водным раствором лимонной кислоты до pH 4-5. Образовавшийся осадок отфильтровывали, промывали водой и сушили на воздухе.

1-Циклопропил-7-[8-(4-циклопропил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-6-аза-спиро[3.4]-окт-6-ил]-6-фтор-4-оксо- 1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота (2а)

А

Выход 38 мг (35%), белое твердое вещество, W= 201-202 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) 5 15.48 (с, 1H), 8.56 (с, 1H), 8.43 (с, 1H), 7.80 (д, J = 14.2 Гц, 1H), 7.08 (д, J = 7.3 Гц, 1H), 4.04 (д, J = 9.4 Гц, 2H), 3.94-3.62 (м, J = 9.9 Гц, 4H), 3.52-3.39 (м, 1H), 2.14 (т, J = 7.1 Гц, 2H), 2.03-1.68 (м, 4H), 1.33-0.98 (м, 8H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O) 5 178.53, 168.98, 155.20, 154.24, 150.98, 150.05, 146.59, 144.33, 144.18, 142.56, 117.22, 117.13, 113.59, 113.28, 108.86, 103.05, 62.88, 56.15, 50.10, 47.71, 38.37, 34.37, 29.03, 26.31, 18.16, 13.37, 10.16. HRMS (ESI) m/z вычисленный для C25H27FN5O3 [M+H+] 464.2097 Да, обнаруженный 464.2102 Да.

8-(4-1-Циклопропил-6-фтор-4-оксо-7-[8-(4-пропил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-6-азаспи-ро[3.4]окт-6-ил]- 1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота (2b)

;х)Уон

_ А

I м._/ 1

Выход 47 мг (43%), белое твердое вещество, W= 189-190 °C. 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 15.54 (с, 1H), 8.51 (с, J = 14.0 Гц, 1H), 7.79 (д, J = 14.1 Гц, 1H), 7.07 (д, J = 7.3 Гц, 1H), 4.14-3.91 (м, J = 7.1 Гц, 4H), 3.91-3.63 (м, 4H), 2.13-2.01 (м, 1H), 1.96-1.83 (м, 2H), 1.811.62 (м, 2H), 1.34-1.08 (м, 4H), 0.87 (т, J = 7.3 Гц, 3H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O) 5 178.53, 168.98, 155.20, 154.24, 150.98, 150.05, 146.59, 144.33, 144.18, 142.56, 117.22, 117.13, 113.59, 113.28, 108.86, 103.05, 62.88, 56.15, 50.10, 47.71, 38.37, 34.37, 29.03, 26.31, 18.16, 13.37, 10.16; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C25H29FN5O3 [M+H+] 464.2254 Да, обнаруженный 464.2250 Да.

1-Циклопропил-7-{8-[4-(циклопропилметил)-4#-1,2,4-триазол-3-ил]-6-азаспиро[3.4]-окт-6-ил}-6-фтор-4- оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота (2c)

N

о о

N' ^N

' А

N=\ м N—,

V

Ь> Выход 25 мг (22%), белое твердое вещество, W= 172-173 °C. 1H ЯМР

(300 МГц, D2O-DC1) 5 8.77 (с, 1H), 8.12 (д, J = 14.5 Гц, 1H), 7.13 (д, J = 13.6 Гц, 1H), 3.50-3.34 (м, J = 7.4 Гц, 3H), 3.33-3.14 (м, 4H), 3.05 (с, 1H), 1.38-1.26 (м, 2H), 1.23-0.89 (м, J = 8.7 Гц, 4H), 0.680.32 (м, J = 61.3 Гц, 5H), -0.05 (д, J = 7.6 Гц, 2H), -0.31 (с, 2H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O-DC1) 5 169.00, 167.82, 154.29, 153.52, 150.16, 148.25, 144.31, 144.15, 142.18, 141.11, 111.00, 110.88, 110.54, 110.22, 102.28, 60.06, 52.79, 52.15, 47.55, 41.33, 37.81, 32.73, 26.14, 15.69, 9.30, 7.86, 4.52, 4.34; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C26H29FN5O3 [M+H+] 478.2254 Да, обнаруженный 478.2251 Да. 1-Циклопропил-6-фтор-7-[4-(4-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-азаспиро[4.4]-нон-2-

ил]-4-оксо- 1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота (2d)

о о

г

А

N'

I ____л

Выход 35 мг (33%), белое твердое вещество, W= 205-206 °C. 1H ЯМР (300 МГц, D2O-DC1) 5 8.57 (с, 1H), 8.14 с, 1H), 7.12 (д, J = 13.1 Гц, 1H), 3.49 (с, 1H), 3.34 (с, 1H), 3.13 (с, 3H), 3.09-2.82 (м, 4H), 1.03-0.46 (м, J = 6.7 Гц, 10H), 0.46-0.31 (м, 2H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O-DC1) 5 166.04, 165.05, 164.98, 152.41, 150.71, 147.34, 145.40, 141.31, 141.15, 140.62, 138.19, 108.35, 108.22, 107.48, 99.40, 57.30, 51.07, 50.38, 38.25, 34.96, 34.38, 31.12, 28.63, 21.07, 5.01; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C24H22FN5O3 [M+H+] 452.2097 Да, обнаруженный 452.2100 Да. 1-Циклопропил-7-[4-(4-циклопропил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-азаспиро[4.4]-нон-2-

ил]-6-фтор-4-оксо- 1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота (2e)

о о

J' "N'

N

Выход 32 мг (28%), белое твердое вещество, W = 188-189 °C. 1H ЯМР (300 МГц, D2O-DC1) 5 8.59 (с, 1H), 8.11 (д, J = 19.6 Гц, 2H), 7.11 (д, J = 12.8 Гц, 1H), 3.53 (с, 1H), 3.29 (д, J = 32.0 Гц, 2H), 3.09 (с, 3H), 2.77 (с, 1H), 1.08-0.30 (м, 19H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O-DC1) 5 166.16, 165.73, 165.02, 158.51, 154.02, 151.34, 145.42, 142.67, 140.57, 138.27, 113.98, 108.17, 100.34, 99.39, 98.45, 50.45, 43.65, 38.78, 34.96, 28.80, 25.59, 21.35, 9.93, 5.09, 4.31, 4.06, -10.57; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C26H29FN5O3 [M+H+] 477.2254 Да, обнаруженный 477.2257 Да.

1-Циклопропил-6-фтор-7-[4-(4-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-азаспиро[4.5]-дец-2-ил]-4-оксо- 1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота(21)

о о

он

Выход 49 мг (44%), белое твердое вещество, W = 228-229 °C. 1H

-пл.

ЯМР (300 МГц, D2O-DC1) 5 8.53 (с, 1H), 8.16 (с, 1H), 7.17 (д, J = 13.4 Гц, 1H), 3.38 (с, 2H), 3.14 (с, 3H), 3.11-2.92 (м, J = 30.1 Гц, 4H), 2.33 (с, 2H), 1.03-0.09 (м, 17H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O-DC1) 5 166.01, 165.17, 151.26, 145.50, 141.00, 138.11, 108.57, 99.51, 54.54, 49.89, 43.75, 39.91, 35.00, 32.01, 31.26, 27.17, 21.85, 19.91, 19.54, 5.02; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C25H29FN5O3 [M+H+] 466.2254 Да, обнаруженный 466.2253 Да.

1-Циклопропил-7-{4-[4-(циклопропилметил)-4#-1,2,4-триазол-3-ил]-2-азаспиро[4.5]-дец-2-ил}-6-фтор-4- оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота (2g)

(300 МГц, D2O-DC1) 5 8.73 (с, 1H), 8.18 (с, J = 14.4 Гц, 1H), 7.18 (д, J = 12.8 Гц, 1H), 3.60-3.48 (м, 1H), 3.46-3.23 (м, 4H), 3.18-2.91 (м, 4H), 1.07-0.91 (м, 1H), 0.86-0.21 (м, 16H), -0.03 (д, J = 7.6 Гц, 2H), -0.22--0.37 (м, 2H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O-DC1) 5 166.19, 165.30, 165.14, 156.51, 150.97, 147.58, 145.54, 142.67, 139.66, 138.30, 99.57, 54.57, 50.13, 49.58, 43.75, 40.20, 35.09, 33.05, 32.13, 27.44, 22.04, 20.00, 19.78, 6.51, 5.15, 1.89, 1.55; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C28H33FN5O3 [M+H+] 506.2567 Да, обнаруженный 506.2571 Да.

7-[4-(4-Бензил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-азаспиро[4.5]дец-2-ил]-1-циклопропил-6-фтор-4-оксо- 1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота (2h)

(300 МГц, D2O-DC1) 5 8.75 (с, 1H), 8.30 (с, 1H), 7.37-7.09 (м, 1H), 6.96-6.52 (м, 5H), 5.17-4.57 (м, 2H), 3.54-2.76 (м, 5H), 1.21--0.25 (м, J = 227.7 Гц, 15H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O-DC1) 5 215.98, 166.06, 164.97, 151.76, 145.43, 141.35, 140.06, 138.13, 128.34, 127.02, 126.78, 126.10, 123.13, 123.09, 122.97, 108.11, 99.39, 54.57, 50.35, 48.30, 43.53, 40.07, 35.12, 31.95, 27.58, 27.32, 27.06, 21.86, 19.76, 5.22; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C31H33FN5O3 [M+H+] 542.2567 Да, обнаруженный 542.2563 Да.

о о

Выход 50 мг (42%), белое твердое вещество, W= 201-202 °C. 1H ЯМР

о о

Выход 24 мг (19%), белое твердое вещество, W= 250-252 °C. 1H ЯМР

1-Циклопропил-6-фтор-7-[4-(4-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-8-окса-2-азаспиро[4.5]-

дец-2-ил]- 4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота (2i)

о о

Выход 50 мг (45%), белое твердое вещество, W= 224-225 °C. 1H ЯМР (300 МГц, D2O-DC1) 5 8.74 (с, 1H), 8.19 (с, 1H), 7.18 (д, J = 12.6 Гц, 1H), 3.65-3.37 (м, J = 41.5 Гц, 2H), 3.33-3.01 (м, J = 34.8 Гц, 9H), 3.05-2.74 (м, 2H), 1.23-1.00 (м, 2H), 0.97-0.76 (м, 1H), 0.720.57 (м, 3H), 0.53-0.39 (м, 2H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O-DC1) 5 166.14, 165.22, 151.04, 147.38, 145.47, 141.53, 140.82, 138.31, 108.36, 107.90, 107.58, 99.51, 61.87, 53.34, 49.44, 40.74, 39.44, 35.11, 31.39, 31.10, 27.01, 5.13; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C24H27FN5O4 [M+H+] 468.2047 Да, обнаруженный 468.2050 Да.

1-Циклопропил-7-[4-(4-циклопропил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-8-окса-2-азаспиро[4.5]-

дец-2-ил]-6-фтор- 4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота (2j)

о о

FnYoH

iP А

Выход 45 мг (38%), белое твердое вещество, W= 211-212 °C. 1H ЯМР (300 МГц, D2O^DC1) 5 8.70 (с, 1H), 8.16 (с, 1H), 7.16 (д, J = 13.3 Гц, 1H), 3.58 (с, 1H), 3.422.76 (м, 11H), 1.10 (с, 2H), 0.95-0.29 (м, 11H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O-DC1) 5 166.09, 165.17, 152.31, 150.69, 147.33, 145.44, 141.47, 141.32, 140.71, 138.28, 108.22, 107.88, 99.47, 61.92, 53.56, 49.70, 40.70, 39.72, 35.09, 31.42, 27.12, 25.69, 5.11, 4.43, 4.17; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C26H29FN5O4 [M+H+] 494.2203 Да, обнаруженный 494.2200 Да.

1-Циклопропил-7-{4-[4-(циклопропилметил)-4#-1,2,4-триазол-3-ил]-8-окса-2-аза-

спиро[4.5]дец-2-ил}-6- фтор-4-оксо-1,4-дигидрохинолин-3-карбоновая кислота (2k)

о о

Ь> Выход 50 мг (41%), белое твердое вещество, W= 208-209 °C. 1H ЯМР

(300 МГц, D2O-DC1) 5 8.86 (с, 1H), 8.16 (с, 1H), 7.16 (д, J = 13.3 Гц, 1H), 3.62-3.46 (м, 1H), 3.442.99 (м, J = 60.8 Гц, 10H), 2.97-2.66 (м, 2H), 1.06 (с, 2H), 0.87-0.29 (м, J = 33.3 Гц, 8H), -0.03 (д, J = 7.4 Гц, 2H), -0.29 (с, 2H); 13C ЯМР (75 МГц, D2O-DC1) 5 166.03, 165.13, 159.71, 150.46, 145.39, 141.27, 139.30, 138.22, 124.77, 107.54, 99.41, 61.82, 53.26, 49.45, 40.56, 39.53, 35.03, 31.05, 27.03, 6.40, 5.04, 1.80, 1.42; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C27H31FN5O4 [M+H+] 508.2360 Да, обнаруженный 508.2358 Да.

трет-бутил-3-(2-этокси-2-оксоэтилиден)азетидин-1-карбоксилат (18)

ею2с

>

I ^ N"

\ ^ К охлажденной до 0 °С суспензии NaH (60% дисперсия в минеральном масле, 1,88 г, 0,047 моль, 1,15 экв.) в абсолютизированном ТГФ (150 мл) при перемешивании добавляли триэтилфосфоноацетат (11 г, 0,054 моль, 1,2 экв.). Реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре в течение 30 мин. Затем охлаждали до 0°C, после чего добавляли трет-бутил-3-оксазетидин-1-карбоксилат (7 г, 0,041 моль, 1,0 экв.) в ТГФ (50 мл). Реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры еще раз и перемешивали при этой температуре в течение ночи. Затем реакционную массу разбавляли этилацетатом и промывали последовательно насыщенным раствором NaHCO3, водой и насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na2SÜ4. Растворитель удаляли под вакуумом. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя гексаном и увеличивая полярность элюента добавлением этилацетата от 0 до 10%. Выход 9.1 г (92%), бесцветное масло. Спектральные данные соединения 18 соответствуют литературным: 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 5.74 (дд, J = 4.5, 2.2 Гц, 1H), 4.80 (дд, J = 6.3, 2.9 Гц, 2H), 4.57 (дт, J = 5.3, 2.7 Гц, 2H), 4.31-4.02 (м, 2H), 1.45 (с, 9H), 1.26 (т, J = 7.1 Гц, 3H). Масс-спектр, m/z: 242.2 (M+H+).

2-(трет-бутил) 8-этил-6-бензил-2,6-диазаспиро[3,4]октан-2,8-дикарбоксилат (19) Ph

> N

C02Et

К раствору соединения 18 (5 г, 20,75 ммоль, 1 экв.) в ацетонитриле (50 мл) добавляли LiF (2,15 г, 83 ммоль, 4 экв.) и (метоксиметил)-1-фенил-Ы-(триметилсилилметил)метанамин (6,25 г, 25 ммоль, 1,2 экв.). Полученную смесь перемешивали при 60°C в течение ночи. Растворитель удаляли под вакуумом, остаток растворяли в этилацетате (50 мл). Органическую фазу промывали насыщенным водным раствором лимонной кислоты (3 х 25 мл). Объединенные водные фазы экстрагировали этилацетатом (2х100 мл). pH водной фазы доводили до 8 насыщенным водным раствором K2CO3 и экстрагировали этилацетатом (2 х 100 мл). Объединенные органические фазы сушили над безводным Na2SÜ4 и концентрировали под вакуумом, получая 4,3 г (выход 56%) соединения 19 в виде бесцветного масла. Этот продукт использовали на последующих стадиях без дополнительной очистки. Спектральные данные соединения 19 соответствуют литературным: 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^5) 5 7.46-7.14 (м, 5H), 4.22-4.00 (м, 2H), 3.94 (дд, J = 16.6, 8.4 Гц, 2H), 3.78-3.51 (м, 5H), 3.12 (т, J = 7.6 Гц, 1H), 2.832.66 (м, 4H), 1.36 (с, 9H), 1.19 (т, J = 7.1 Гц, 3H). Масс-спектр, m/z: 375.4 (M+H+).

Основная процедура синтеза соединений 20a-d

К раствору соединения 19 (1 г, 3,35 ммоль, 1,0 экв.) в 1,4-диоксане (10 мл) добавляли водный раствор (1 мл) LiOH-ШО (0,175 г, 4,2 ммоль, 1,25 г). экв.) и полученную смесь перемешивали в течение 12 часов. К реакционной массе добавляли HOBt (0,56 г, 4,2 ммоль, 1,25 экв.), EDC-HCl (0,81 г, 4,2 ммоль, 1,25 экв.) и соответствующий амин (1,4 экв.) и полученную смесь перемешивали в течение 12 часов. Растворитель удаляли в вакууме и остаток растворяли в этилацетате (50 мл). Органическую фазу последовательно промывали 10% водным раствором K2CO3, насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na2SO4.

2-шрет-Бутоксикарбонил-6-бензил-8-(метилкарбамоил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан

(20а)

Ph.

I

I О 0 н Выход 0.68 г (66%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCb) 5 7.387.19 (м, 5H), 7.00 (с, 1H), 3.88 (д, J = 4.4 Гц, 1H), 3.85 (д, J = 5.0 Гц, 1H), 3.79 (д, J = 8.4 Гц, 1H), 3.69 (д, J = 9.1 Гц, 1H), 3.63 (с, 1H), 3.01 (д, J = 9.7 Гц, 1H), 2.89-2.62 (м, 6H), 1.39 (с, 9H); 13C ЯМР (75 МГц, CDCb) 5 173.52, 156.08, 138.07, 128.53, 128.45, 127.33, 79.56, 65.33, 59.44, 57.16, 53.85, 42.07, 28.28, 25.99; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C20H30N3O3 [M+H+] 360.2287 Да, обнаруженный 360.2291 Да.

2-шрет-Бутоксикарбонил-6-бензил-8-(изобутилкарбамоил)-2,6-диазаспиро[3.4]ок-тан (20b)

TS 0 н i

Выход 0.36 г (68%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 7.40-7.10 (м, 6H), 3.90 (д, J = 8.9 Гц, 2H), 3.80 (д, J = 8.5 Гц, 1H), 3.69 (д, J = 9.1 Гц, 1H), 3.63 (с, 2H), 3.15-2.98 (м, 3H), 2.92 (дд, J = 9.6, 2.7 Гц, 1H), 2.80 (дд, J = 6.5, 2.7 Гц, 1H), 2.73-2.52 (м, 2H),

I.82-1.60 (м, 1H), 1.39 (с, 9H), 0.87 (дд, J = 6.7, 1.0 Гц, 6H); 13C ЯМР (75 МГц, CDCI3) 5 178.85, 167.17, 155.96, 138.18, 128.53, 128.37, 127.24, 79.69, 64.33, 59.41, 57.47, 43.93, 43.22, 29.65, 28.26,

II.60, -0.05; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C23H36N3O3 [M+H+] 402.2756 Да, обнаруженный 402.2761 Да.

2-шрет-Бутоксикарбонил-6-бензил-^-(циклопропилметил)-2,6-диазаспиро-[3.4]ок-тан-8-карбоксамид (20c)

> м

о 0 н Выход 0.38 г (72%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCb) 5 7.40-7.14 (м, 5H), 3.91 (д, J = 9.2 Гц, 2H), 3.81 (д, J = 8.5 Гц, 1H), 3.70 (д, J = 9.0 Гц, 1H), 3.64 (д, J = 1.8 Гц, 1H), 3.14-3.02 (м, 2H), 2.92 (дд, J = 9.5, 2.8 Гц, 1H), 2.80 (дд, J = 6.6, 2.9 Гц, 1H), 2.722.57 (м, 2H), 1.03-0.77 (м, 1H), 0.57-0.35 (м, 2H), 0.25-0.08 (м, 2H); 13C ЯМР (75 МГц, CDCb) 5 172.72, 138.13, 128.48, 128.44, 127.35, 79.52, 65.67, 59.49, 57.17, 54.05, 43.98, 41.98, 28.27, 10.71, 3.39; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C23H34N3O3 [M+H+] 400.2600 Да, обнаруженный 400.2597 Да.

2-шрет-Бутоксикарбонил-1-(6-бензил-2,6-диазаспиро[3.4]окт-8-ил)-^,^-диметилме-танамин (23d)

Ph

> N

/

N

^ Соединение 20d синтезировали по общей методике для соединений

20а^ (1 г, 2,66 ммоль) и использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Раствор полученного соединения 20d (0,7 г, 1,8 ммоль, 1 экв.) в абсолютном ТГФ (3 мл) добавляли к суспензии LiAlH4 (0,07 г, 1,8 ммоль, 1 экв.) в ТГФ (10 мл) при -70°С. Реакционную смесь перемешивали при этой температуре в течение 30 минут и давали достичь температуры -5 °С. Затем реакционную массу охлаждали до -30 °С и избыток LiAlH4 разлагали последовательным добавлением воды (0,1 мл), 15%-ного водного раствора №ОН (0,1 мл) и воды (0,3 мл). Образовавшийся осадок отфильтровывали и фильтрат концентрировали в вакууме. Полученный альдегид 22d сразу же использовали на следующем этапе. Его растворяли в СН2О2 (10 мл) и при интенсивном перемешивании прикапывали 33% водный раствор диметиламина (0,5 мл). Затем порциями добавляли триацетоксиборгидрид натрия (0,96 г, 4,5 ммоль, 2,5 экв.) и полученную смесь перемешивали в течение ночи. Добавляли насыщенный водный раствор №НСОз и экстрагировали этилацетатом (3 раза по 100 мл). Объединенные органические экстракты промывали последовательно 10% водным раствором К2СО3, насыщенным раствором №С1, сушили над безводным №2804. Растворитель удаляли под вакуумом. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя СН2О2 и увеличивая полярность элюента добавлением метанола от 0 до 10 %. Выход 0.25 г (72%) бесцветное масло. 1Н ЯМР (300 МГц, СБСЬ) 5 7.47-7.06 (м, 5Н), 4.07 (д, 3 = 8.8 Гц, 1Н), 3.78 (с, 2Н), 3.66-3.48 (м, 3Н), 3.01-2.91 (м, 1Н), 2.89 (д, 3 = 9.3 Гц, 1Н), 2.55 (д, 3 = 9.3 Гц, 1Н), 2.45-2.30 (м, 1Н), 2.30-2.15 (м, 9Н), 1.42 (с, 9Н); 13С ЯМР (75 МГц, СБСЬ) 5 156.38, 138.61, 128.65, 128.22, 126.97, 79.28, 65.56, 61.35, 60.07,

59.18, 45.67, 41.99, 41.73, 28.33; HRMS (ESI) m/z вычисленный дляC2lHз4NзO2 [M+H+] 360.2651 Да, обнаруженный 360.2655 Да.

2-шрет-Бутоксикарбонил-8-(1-бензил-5-метил-1#-имидазол-2-ил)-6-метил-2,6-диа-заспиро[3.4]октан (28)

Pd/C (0,25 г) и смесь гидрировали в автоклаве при начальном давлении водорода 100 атм. в течение 12 часов. Реакционную смесь фильтровали через слой целита и фильтрат концентрировали в вакууме. Выход соединения 25 составил 1,6 г (количественный), полученного в виде бесцветного масла. Его использовали непосредственно на следующем этапе без дополнительной очистки.

К интенсивно перемешиваемому раствору 25 (1,6 г, 5,3 ммоль, 1 экв.) в СН2О2 (25 мл) добавляли 37% водный раствор формальдегида (1 мл), а затем порциями добавляли триацетоксиборгидрид натрия (2,8 г, 13,3 ммоль, 2,5 экв.). Полученную смесь перемешивали в течение ночи. К реакционной массе добавляли насыщенный водный раствор №НС03 (10 мл), после органическую фазу последовательно промывали 10% водным раствором К2СО3, насыщенным раствором №С1, сушили над безводным №2804, фильтровали и концентрировали в вакууме. Растворитель удаляли под вакуумом. Полученный продукт 26 (1,2 г, 72%, в предположении аналитической чистоты) использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

К раствору 26 (1 г, 3,4 ммоль, 1,0 экв.) в 1,4-диоксане (10 мл) добавляли водный раствор LiOH•H2O (1 мл, 0,175 г, 4,2 ммоль, 1,25 экв.) и полученную смесь перемешивали в течение 12 часов. После этого добавляли HOBt (0,56 г, 4,2 ммоль, 1,25 экв.), EDC•HCl (0,81 г, 4,2 ммоль, 1,25 экв.) и пропаргиламин (0,29 г, 4,7 ммоль, 1,4 экв.). Полученную смесь перемешивали в течение 12 часов. Растворитель удаляли в вакууме и остаток растворяли в этилацетате (50 мл). Раствор последовательно промывали 10% водным раствором К2СО3, насыщенным раствором №С1, сушили над безводным №2804. Растворитель удаляли под вакуумом с получением 0,68 г (66% в предположении аналитической чистоты) продукта 27 в виде бесцветного масла, которое использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

К раствору соединения 27 (0,3 г, 0,97 ммоль, 1 экв.) в толуоле (10 мл) добавляли бензиламин (0,13 г, 0,24 ммоль, 1,25 экв.), Zn(OTf)2 (0,088 г, 1,21 ммоль 0,25 экв.). Смесь кипятили с обратным холодильником с ловушкой Дина-Старка в течение 8 часов. Реакционную массу охлаждали до комнатной температуры последовательно промывали 10% водным

/

К раствору 19 (2 г, 5,3 ммоль) в этаноле (25 мл) добавляли 10%

раствором K2CO3, насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na2SO4 и растворитель удаляли под вакуумом. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя CH2O2 и увеличивая полярность элюента добавлением метанола от 0 до 10 %. Фракции, содержащие целевое соединение, объединяли и упаривали под вакуумом с получением соединения 28. Выход 0,29 г (75%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 7.35-7.19 (м, 3H), 6.96-6.86 (м, 2H), 6.83 (с, 1H), 5.19-4.93 (м, 2H), 3.77 (д, J = 8.6 Гц, 1H), 3.60 (д, J = 9.5 Гц, 1H), 3.47-3.29 (м, 3H), 3.11 (д, J = 9.3 Гц, 1H), 3.05 (т, J = 8.6 Гц, 1H), 2.33 (с, 3H), 2.15 (д, J = 0.7 Гц, 3H), 1.39 (с, 9H); 13C ЯМР (75 МГц, CDCI3) 5 155.97, 147.40, 136.58, 129.02, 127.85, 127.40, 125.84, 125.47, 79.24, 68.07, 62.57, 46.39, 44.59, 44.36, 41.55, 28.31, 9.70; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C23H33N4O2 [M+H+] 397.2603 Да, обнаруженный 397.2598 Да.

2-трет-Бутоксикарбонил-6-метил-8-(5-метилоксазол-2-ил)-2,6-диазаспиро[3.4]ок-

добавляли Zn(OTf)2 (0,088 г, 1,21 ммоль, 0,25 экв.) и смесь кипятили с обратным холодильником с ловушкой Дина-Старка в течение 16 часов. Реакционную массу охлаждали до комнатной температуры и смесь последовательно промывали 10% водным раствором K2CO3, насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na2SO4, растворитель удаляли под вакуумом. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя CH2O2 и увеличивая полярность элюента добавлением метанола от 0 до 10 %. Фракции, содержащие целевое соединение, объединяли и упаривали под вакуумом с получением соединения 29. Выход 0,14 г (47%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 6.63 (д, J = 1.2 Гц, 1H), 4.00 (д, J = 8.6 Гц, 1H), 3.89 (д, J = 8.6 Гц, 1H), 3.60 (д, J = 9.2 Гц, 1H), 3.51 (т, J = 8.0 Гц, 1H), 3.41 (д, J = 9.2 Гц, 1H), 3.18-3.10 (м, 1H), 3.06 (д, J = 9.4 Гц, 1H), 2.82-2.70 (м, 2H), 2.39 (с, 3H), 2.27 (с, 3H), 1.40 (с, 9H); 13C ЯМР (75 МГц, CDCI3) 5 162.33, 156.09, 148.93, 122.69, 79.38, 67.35, 59.58, 46.23, 43.93, 41.86, 28.26, 10.79; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C16H26N3O3 [M+H+] 308.1974 Да, обнаруженный 308.1980 Да.

2-трет-Бутил-6-бензил-8-(4-метил-4Н-1,2,4-триазол-3-ил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан-2-карбоксилат (33)

тан (29)

/

К раствору соединения 27 (0,3 г, 0,97 ммоль, 1 экв.) в толуоле (10 мл)

> м

k, /

К раствору 19 (3 г, 8 ммоль) в этаноле (25 мл) добавляли N2H4 (64%

водный раствор, 1 мл). Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 8 часов. После охлаждения реакционной массы до комнатной температуры, смесь концентрировали под вакуумом с получением соединения 32 (2,8 г, количественно, в предположении аналитической чистоты), которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.

К раствору 32 (2 г, 5,5 ммоль, 1 экв.) в этаноле (25 мл) по каплям добавляли CH3NCS (0,5 г, 6,8 ммоль, 1,25 экв.) и полученную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 2 часов. Добавляли насыщенный водный раствор K2CO3 (5 мл) и нагревали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 8 часов. Реакционную смесь концентрировали в вакууме, остаток растворяли в воде (25 мл) и раствор подкисляли до pH 7-5% водным раствором HC1. Образовавшийся осадок отфильтровывали и растворяли в этаноле (25 мл). Добавляли суспензию свежеприготовленного никеля Ренея в минимальном количестве этанола и кипятили с обратным холодильником при интенсивном перемешивании в течение 12 часов. При охлаждении до комнатной температуры, реакционную смесь фильтровали через целит и фильтрат концентрировали в вакууме. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя CH2CI2 и увеличивая полярность элюента добавлением метанола от 0 до 10 %. Фракции, содержащие целевое соединение, объединяли и упаривали под вакуумом с получением соединения 33. Выход 1,22 г (58%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCb) 5 8.08 (с, 1H), 7.39-7.13 (м, 5H), 4.01-3.84 (м, 2H), 3.74-3.59 (м, 6H), 3.53 (т, J = 8.0 Гц, 1H), 3.35 (д, J = 9.5 Гц, 1H), 3.28 (т, J = 8.8 Гц, 1H), 3.12 (д, J = 9.4 Гц, 1H), 2.97-2.86 (м, 1H), 2.80 (д, J = 9.4 Гц, 1H), 1.37 (с, 9H); 13C ЯМР (75 МГц, CDCI3) 5 156.25, 154.24, 144.60, 138.35, 128.65, 128.34, 127.19, 79.74, 64.86, 59.57, 58.88, 43.59, 42.08, 30.78, 28.23; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C21H30N5O2 [M+H+] 384.2399 Да, обнаруженный 384.2405 Да.

2-шрет-Бутоксикарбонил-6-(метилсульфонил)-8-(4-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан (34)

V=o

N Соединение 33 гидрировали, аналогично соединению 25, с получением 0,76 г бесцветного масла. К раствору этого масла (0,35 г, 1,1 ммоль, 1,0 экв.) в СШСЬ

(10 мл) по каплям добавляли Et3N (0,14 г, 1,37 ммоль, 1,25 экв.). Смесь охлаждали до 0°С и прикапывали MsCl (0,16 г, 1,37 ммоль, 1,25 экв.). После перемешивания смеси в течение ночи ее последовательно промывали 10% водным раствором K2CO3, насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na2SO4, растворитель удаляли под вакуумом. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя CH2O2 и увеличивая полярность элюента добавлением метанола от 0 до 10 %. Фракции, содержащие целевое соединение, объединяли и упаривали под вакуумом с получением соединения 34. Выход 0,22 г (53%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCb) 5 8.11 (с, 1H), 3.04-3.95 (м, 2H), 3.91-3.75 (м, 4H), 3.64-3.52 (м, 2H), 1.40 (с, 9H).; 13C ЯМР (75 МГц, CDCb) 5 156.03, 152.70, 144.60, 80.13, 61.23, 55.73, 53.35, 51.38, 43.74, 41.23, 35.65, 30.95, 28.20; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C15H26N5O4S [M+H+] 372.1705 Да, обнаруженный 372.1701 Да.

2-трет-Бутоксикарбонил-6-бензил-8-(5-метил-4Н-1,2,4-триазол-3-ил)-2,6-диазаспи-ро[3.4]октан (37)

Ph

раствору гидрохлорида ацетамидина (0,16 г, 1,73 ммоль, 1,25 экв.) в абсолютном метаноле (10 мл) добавляли MeONa (0,093 г, 1,73 ммоль, 1,25 экв.). Смесь перемешивали в течение 30 минут, после чего добавляли неочищенный 32 (0,5 г, 1,39 ммоль, 1,0 экв.) и перемешивание продолжали в течение ночи. Растворитель удаляли в вакууме и остаток нагревали при 170°С в токе аргона в течение 15 мин. Остаток растворяли в этилацетате (25 мл), промывали 10% водным раствором K2CO3, насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na2SO4. Растворитель удаляли под вакуумом. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя CH2Cl2 и увеличивая полярность элюента добавлением метанола от 0 до 10 %. Фракции, содержащие целевое соединение, объединяли и упаривали под вакуумом с получением соединения 37. Выход 0,26 г (48%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCb) 5 7.39-7.13 (м, 5H), 3.92 (дд, J = 37.4, 8.6 Гц, 2H), 3.70 (к, J = 12.8 Гц, 2H), 3.59-3.41 (м, 3H), 3.202.99 (м, 2H), 2.91 (т, J = 8.0 Гц, 2H), 2.38 (с, 3H), 1.37 (м, 9H); 13C ЯМР (75 МГц, CDCb) 5 156.29, 138.23, 128.69, 128.42, 127.27, 79.68, 64.71, 59.87, 53.40, 45.16, 43.19, 28.30, 8.08, -0.05; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C21H30N5O2 [M+H+] 384.2399 Да, обнаруженный 384.2404 Да.

2-трет-Бутоксикарбонил-6-бензил-8-(3-циклопропил-1Н-1,2,4-триазол-5-ил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан (38)

V Синтезирован аналогично 37. Выход 0.23 г (42%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 7.39-7.16 (м, 5H), 3.91 (дд, J = 41.5, 8.6 Гц, 2H), 3.69 (к, J = 12.8 Гц, 2H), 3.57-3.41 (м, 3H), 2.04-1.86 (м, 1H), 1.38 (с, 9H), 1.00-0.94 (м, 4H).; 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) 5 156.29, 138.23, 128.69, 128.42, 127.27, 79.68, 64.71, 59.87, 53.40, 45.16, 43.19, 28.30, 8.08, -0.05; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C23H32N5O2 [M+H+] 410.2556 Да, обнаруженный 410.2561 Да.

2-шрет-Бутоксикарбонил-6-бешил-8-(3-метил-1,2,4-оксадиазол-5-ил)-2,6-диазаспи-ро[3.4]октан (41)

добавляли водный раствор LiOH•H2O (1 мл, 0,175 г, 4,2 ммоль, 1,25 экв.) и смесь перемешивали в течение 12 часов. Добавляли HOBt (0,56 г, 4,2 ммоль, 1,25 экв.), EDC•HCl (0,81 г, 4,2 ммоль, 1,25 экв.) и ацетамидоксим (0,35 г, 4,7 ммоль, 1,4 экв.) и полученную смесь перемешивали в течение 12 ч. Растворитель удаляли под вакуумом и остаток растворяли в этилацетате (50 мл). Органическую фазу последовательно промывали 10% водным раствором K2COз, насыщенным раствором №С1, сушили над безводным Na2SO4. Растворитель удаляли под вакуумом. Остаток растворяли в толуоле (25 мл), добавляли ТВЛГ (100 мг) и полученную смесь нагревали с обратным холодильником с ловушкой Дина-Старка в течение 6 часов. Реакционную смесь концентрировали под вакуумом. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя СН2О2 и увеличивая полярность элюента добавлением метанола от 0 до 10 %. Фракции, содержащие целевое соединение, объединяли и упаривали под вакуумом с получением

соединения 41. Выход 0,48 г (41%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 7.41-7.17 (м, 5H), 3.94 (дд, J = 33.0, 8.6 Гц, 2H), 3.78-3.59 (м, 4H), 3.49 (д, J = 9.3 Гц, 1H), 3.33-3.21 (м, 1H), 3.09 (д, J = 9.4 Гц, 1H), 2.90-2.72 (м, 2H), 2.40 (с, 3H), 1.39 (с, 9H).; 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-dö) 5 178.85, 167.17, 155.96, 138.18, 128.53, 128.37, 127.24, 79.69, 59.41, 57.47, 43.93, 43.22, 28.26, 11.60, -0.05; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C21H29N4O3 [M+H+] 385.2239 Да, обнаруженный 385.2244 Да.

Ph

МеК раствору соединения 19 (1 г, 2,29 ммоль, 1 экв.) в 1,4-диоксане

2-трет-Бутоксикарбонил-6-(метилсульфонил)-2,6-диазаспиро[3.4]-октан-8-карбоно-вая кислота (43)

Чо

-OY"-" С0гн

0 К раствору соединения 25 (0,31 г, 1,10 ммоль, 1 экв.) в CH2O2 (10 мл)

по каплям добавляли Et3N (0,14 г, 1,37 ммоль, 1,25 экв.). Смесь охлаждали до 0°C, добавляли по каплям MsCl (0,16 г, 1,37 ммоль, 1,25 экв.) и перемешивали в течение ночи. Затем реакционную массу промывали 10% водным раствором K2CO3, насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na2SO4. Растворитель удаляли под вакуумом. Остаток растворяли в метаноле (10 мл) и по каплям при перемешивании добавляли 25% водного раствора КОН (1 мл). Смесь перемешивали в течение 1 часа, концентрировали в вакууме и остаток растворяли в воде. Раствор подкисляли до pH 6 5% водным раствором HCl. Полученный осадок отфильтровывали и сушили над гранулами NaOH, получая соединение (43). Выход 0.76 г (100%), белое твердое вещество, W= 102-103 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^) 5 12.94 (с, 1H), 3.99-3.68 (м, 4H), 3.46-3.29 (м, 3H), 3.22 (дд, J = 7.4, 6.0 Гц, 1H), 2.91 (с, 3H), 1.36 (с, 9H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) 5 172.53, 155.92, 79.12, 56.42, 49.37, 48.78, 41.60, 34.30, 28.45; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C13H23N2O6S [M+H+] 335.1276 Да, обнаруженный 335.1280 Да.

2-трет-Бутоксикарбонил-8-(3-циклопропил-1,2,4-оксадиазол-5-ил)-6-(метилсуль-фонил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан (44)

гГЪ

^ К раствору 43 (0,25 г, 0,75 ммоль, 1 экв.) в CH2O2 (10 мл) добавляли КДИ (0,15 г, 0,94 ммоль, 1,25 экв.) и смесь перемешивали в течение 1 часа, после чего добавляли N'- гидроксициклопропанкарбоксимимид (0,094 г, 0,94 ммоль, 1,25 экв.) и перемешивание продолжали в течение ночи. Реакционную смесь промывали 1% водным раствором HCl (2 х 15 мл), сушили над безводным Na2SO4. Растворитель удаляли под вакуумом. Остаток растворяли в толуоле (25 мл), добавляли TBAF (100 мг) и смесь нагревали с обратным холодильником с ловушкой Дина-Старка в течение 6 часов. Реакционную смесь упаривали досуха. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя CH2O2 и увеличивая полярность элюента добавлением метанола от 0 до 10 %. Фракции, содержащие целевое соединение, объединяли и упаривали под вакуумом с получением соединения 44. Выход 0,19 г (63%), бесцветное масло. 1H ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 4.02-3.91 (м, 2H), 3.85 (т, J = 7.6 Гц, 1H), 3.81-

3.65 (м, 5H), 3.56 (д, J = 9.9 Гц, 1H), 2.08 (дт, J = 8.3, 4.9 Гц, 1H), 1.41 (с, 9H), 1.13-0.88 (м, 4H); 13C ЯМР (75 МГц, CDCI3) 5 156.03, 152.70, 144.60, 80.13, 55.73, 51.38, 43.74, 41.23, 35.65, 30.95, 28.20; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C17H27N4O5S [M+H+] 399.1702 Да, обнаруженный 399.1697 Да.

Основная процедура синтеза соединений 21a-c, 24d, 30, 31, 35, 36, 39, 40, 42, 45.

К раствору 5-нитро-2-фурановой кислоты (75 мг, 0,47 ммоль) в ДМФА (3 мл) добавляли КДИ (97 мг, 0,6 ммоль) при 0°C и раствор перемешивали в течение 1 часа. К раствору соответствующего Вос-защищенного спироциклического амина (0,60 ммоль) в CH2CI2 (5 мл) при 0 °C добавляли трифторуксусную кислоту (1 мл) и смесь перемешивали в течение 1 часа. Раствор концентрировали под вакуумом, поддерживая температуру бани ниже 30°С. Остаток растворяли в ДМФА (3 мл), по каплям добавляли триэтиламин (0,19 г, 1,9 ммоль) и после 30-минутного перемешивания смесь добавляли к раствору имидазолида 5-нитро-2-фурановой кислоты, полученному, как описано выше. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем реакционную массу выливали в воду (25 мл) и экстрагировали этилацетатом (3 х 20 мл). Объединенные органические фазы промывали насыщенным раствором NaCl, сушили над безводным Na2SO4. Растворитель удаляли под вакуумом. Остаток подвергали колоночной хроматографии на силикагеле, элюируя CH2CI2 и увеличивая полярность элюента добавлением метанола от 0 до 10 %.

6-Бензил-^-метил-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан-8-карбоксамид

(21а)

Ph^

0 Это соединение синтезировали по общей методике из 20a (0,22 г, 0,6

ммоль). Выход 133 мг (56%), белое твердое вещество, W= 132-135 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-dö) смесь ротамеров 5 8.06 (с, 1H), 7.75 (дд, J = 8.8, 3.9 Гц, 1H), 7.40-7.15 (м, 7H), 4.45 (дд, J = 27.0, 9.3 Гц, 1H), 4.31 (с, 1H), 4.10-3.74 (м, 3H), 3.67-3.51 (м, 2H), 3.07-2.82 (м, 4H), 2.75-2.52 (м, 7H), 1.37-1.14 (м, 2H), 0.96-0.73 (м, 1H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-dö) смесь ротамеров 5 172.28, 156.47, 151.81, 147.95, 147.82, 139.15, 128.88, 128.85, 128.59, 127.27, 117.35, 117.31, 113.49, 113.43, 65.50, 64.72, 61.17, 59.29, 59.21, 56.69, 55.20, 51.47, 51.33, 43.53, 25.91, 25.88; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C20H23N4O5 [M+H+] 399.1668 Да, обнаруженный 399.1673 Да.

6-Бензил-^-изобутил-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]-октан-8-карбокса-мид (21b)

bv^w

» O H

N

О

Это соединение синтезировали по общей методике из 20b (0,24

г, 0,6 ммоль). Выход 148 мг (56%), белое твердое вещество, W= 166-165 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) смесь ротамеров 5 8.13 (дд, J = 10.8, 5.4 Гц, 1H), 7.73 (дт, J = 16.3, 8.2 Гц, 1H), 7.427.09 (м, 7H), 4.47 (дд, J = 33.9, 9.4 Гц, 1H), 4.37-4.24 (м, 1H), 4.12 (д, J = 10.3 Гц, 1H), 4.00-3.75 (м, 2H), 3.64-3.50 (м, 2H), 3.08-2.68 (м, 6H), 2.67-2.53 (м, 2H), 1.62 (дд, J = 11.3, 6.7 Гц, 1H), 0.890.61 (м, 7H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^) смесь ротамеров, 5 196.40, 193.60, 174.10, 173.50, 171.66, 168.54, 161.80, 159.89, 156.37, 151.78, 147.97, 147.91, 146.43, 146.33, 145.57, 139.77, 139.14, 134.96, 133.64, 129.86, 129.54, 128.97, 128.85, 128.59, 128.45, 128.31, 127.87, 127.28, 121.61, 121.53, 121.50, 121.45, 120.72, 118.14, 117.31, 113.49, 113.45, 105.49, 65.02, 64.74, 60.90, 59.40, 59.30, 59.23, 56.64, 56.51, 55.38, 55.26, 51.51, 51.44, 46.53, 43.47, 28.38, 28.34, 20.44, 20.35; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C23H29N4O5 [M+H+] 441.2137 Да, обнаруженный 441.2134 Да.

6-Бешил-^-(циклопропилметил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан-8-карбоксамид (21c)

г, 0,6 ммоль). Выход 126 мг (48%), белое твердое вещество, W= 180-181 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) смесь ротамеров 5 8.42-8.08 (м, 1H), 7.76 (дд, J = 8.9, 3.9 Гц, 1H), 7.45-7.11 (м, 8H), 4.62-4.26 (м, 2H), 4.14 (д, J = 10.4 Гц, 1H), 3.94 (д, J = 9.2 Гц, 1H), 3.81 (д, J = 11.1 Гц, 1H), 3.693.47 (м, 3H), 3.14-2.77 (м, 6H), 2.62 (дд, J = 16.4, 8.9 Гц, 2H), 1.00-0.70 (м, 1H), 0.33 (дд, J = 18.6, 7.1 Гц, 2H), 0.10 (дд, J = 9.1, 4.1 Гц, 2H).; 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-^б) смесь ротамеров, 5 171.59, 156.38, 151.79, 147.97, 147.91, 139.16, 128.88, 128.85, 128.74, 128.60, 127.27, 117.32, 113.46, 65.22, 64.65, 61.03, 59.30, 59.22, 56.51, 56.35, 55.26, 51.34, 43.54, 43.34, 43.30, 11.33, 11.30, 3.66, 3.55, 3.46; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C23H27N4O5 [M+H+] 439.1981 Да, обнаруженный 439.1986 Да.

1-[6-Бензил-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]окт-8-ил]-^,^-диметилметан-

Ph

Это соединение синтезировали по общей методике из 20c (0,185

амин (24d)

Ъ^Я

N

/

N

О

^ Это соединение синтезировали по общей методике из 20d (0,215 г, 0,6

ммоль). Выход 91 мг (38%), белое твердое вещество, W= 154-155 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-de) смесь ротамеров 5 7.77 (д, J = 1.9 Гц, 1H), 7.76 (д, J = 1.9 Гц, 1H), 7.43-7.15 (м, 14H), 4.68 (д, J = 9.5 Гц, 1H), 4.39 (с, 2H), 4.31 (д, J = 10.4 Гц, 1H), 4.17 (д, J = 9.6 Гц, 1H), 3.94 (к, J = 10.1 Гц, 2H), 3.70 (д, J = 10.4 Гц, 1H), 3.63-3.48 (м, 5H), 2.98-2.55 (м, 8H), 2.44-2.25 (м, 5H), 2.10 (т, J = 10.9 Гц, 17H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-de) смесь ротамеров, 5 156.64, 156.48, 151.80, 148.01, 147.96, 139.28, 135.52, 128.84, 128.57, 127.21, 117.20, 113.45, 65.42, 65.36, 64.58, 61.25, 61.13, 60.33, 59.67, 58.65, 58.48, 58.27, 54.17, 45.74, 45.69, 43.23, 43.14, 41.77, 41.47.; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C21H27N4O5 [M+H+] 399.2032 Да, обнаруженный 399.2028 Да.

8-(1-Бензил-5-метил-1#-имидазол-2-ил)-6-метил-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспи-ро[3.4]октан (30)

0,6 ммоль). Выход 74 мг (28%), белое твердое вещество, W= 165-167 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-^б) смесь ротамеров 5 7.74 (дд, J = 13.4, 3.8 Гц, 1H), 7.28-7.06 (м, 3H), 7.02-6.81 (м, 3H), 6.73 (д, J = 7.7 Гц, 1H), 5.37-5.06 (м, 2H), 4.24 (д, J = 9.5 Гц, 1H), 4.15 (д, J = 10.2 Гц, 1H), 3.943.53 (м, 4H), 3.38 (д, J = 19.3 Гц, 4H), 3.17-2.94 (м, 2H), 2.76-2.54 (м, 2H), 2.46-2.36 (м, 1H), 2.23 (с, 3H), 2.17-2.00 (м, 4H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-dö) смесь ротамеров, 5 155.99, 151.74, 151.57, 148.01, 147.85, 147.65, 138.48, 138.23, 128.98, 128.91, 127.69, 127.51, 127.38, 127.19, 126.15, 125.97, 125.77, 125.72, 117.17, 117.12, 113.46, 68.02, 67.52, 65.66, 63.11, 62.97, 62.02, 58.47, 55.04, 45.96, 45.87, 45.24, 45.10, 43.51, 43.40, 41.95, 41.87.; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C23H26N5O4 [M+H+] 436.1984 Да, обнаруженный 436.1988 Да.

6-Метил-8-(5-метил-1,3-оксазол-2-ил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]-

Это соединение синтезировали по общей методике из 29 (0,184 г, 0,6 ммоль). Выход 99 мг (48%), белое твердое вещество, ^л.= 175-176 °С 1Н ЯМР (300 МГц, ДМСО-^) смесь ротамеров 5 7.77 (д, J = 3.9 Гц, 1Н), 7.72 (д, J = 3.9 Гц, 1Н), 7.32 (д, J = 3.9 Гц, 1Н), 7.27 (д, J = 3.9 Гц, 1Н), 7.02 (с, 1Н), 6.80-6.73 (м, 2Н), 4.57 (к, J = 9.6 Гц, 2Н), 4.31 (д, J = 10.1

Это соединение синтезировали по общей методике из 28 (0,237 г,

октан (31)

Гц, 1H), 4.17 (д, J = 10.4 Гц, 1H), 4.05 (д, J = 10.4 Гц, 1H), 3.97 (д, J = 10.0 Гц, 1H), 3.84-3.64 (м, 3H), 3.55-3.44 (м, 4H), 3.12-2.94 (м, 4H), 2.76 (ддд, J = 17.3, 7.5, 4.9 Гц, 4H), 2.30 (с, 5H), 2.25 (с, 3H), 2.22 (с, 2H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-dö) смесь ротамеров, 5 162.41, 162.31, 156.55, 156.43, 151.85, 149.25, 149.19, 147.67, 147.61, 122.93, 117.41, 113.42, 113.36, 66.17, 64.16, 59.94, 59.25, 58.90, 58.79, 55.23, 45.46, 45.41, 44.98, 41.89, 10.82.; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C16H19N4O5 [M+H+] 347.1355 Да, обнаруженный 347.1360 Да.

6-(Метилсульфонил)-8-(4-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро[3.4]октан (35)

ммоль). Выход 138 мг (56%), белое твердое вещество, W= 180-182 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-dö) смесь ротамеров 5 8.44 (с, 1H), 7.78 (д, J = 3.9 Гц, 1H), 7.73 (д, J = 3.9 Гц, 1H), 7.30 (т, J = 4.1 Гц, 1H), 4.57 (к, J = 9.5 Гц, 2H), 4.21-3.84 (м, 5H), 3.84-3.58 (м, 6H), 3.56-3.37 (м, 1H), 2.85 (д, J = 9.7 Гц, 3H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-dö) смесь ротамеров, 5 156.67, 152.31, 151.83, 147.80, 147.70, 145.65, 117.39, 113.50, 113.45, 62.50, 59.36, 57.62, 56.55, 55.27, 53.97, 51.20, 51.05, 44.12, 43.99, 34.59, 34.52, 30.92.; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C15H19N6O6S [M+H+] 411.1086 Да, обнаруженный 411.1091 Да.

6-Бензил-8-(4-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро-[3.4]октан (36)

ммоль). Выход 157 мг (62%), белое твердое вещество, W= 152-153 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-dö) смесь ротамеров 5 8.65-8.20 (м, 1H), 7.84-7.59 (м, 2H), 7.57-7.16 (м, 5H), 7.02 (с, 1H), 4.773.96 (м, 4H), 3.94-3.06 (м, 13H), 2.85 (дд, J = 21.6, 9.0 Гц, 1H), 2.68 (дд, J = 16.7, 8.9 Гц, 1H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-dö) смесь ротамеров, 5 156.60, 154.43, 154.32, 151.79, 147.75, 145.30, 139.09, 135.51, 129.86, 129.54, 128.91, 128.86, 128.62, 127.32, 122.04, 117.32, 113.43, 65.48, 64.63, 64.49, 61.43, 59.33, 58.92, 58.72, 54.82, 44.51, 30.77; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C21H23N6O4 [M+H+] 423.1780 Да, обнаруженный 423.1777 Да.

6-Бензил-8-(5-метил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6-диазаспиро-[3.4]октан (39)

Это соединение синтезировали по общей методике из 34 (0,22 г, 0,6

Ph

N" Это соединение синтезировали по общей методике из 33 (0,23 г, 0,6

Ph^

vi

м^\Это соединение синтезировали по общей методике из 37 (0,23 г, 0,6 ммоль). Выход 108 мг (43%), белое твердое вещество, W= 168-170 °C. 1H ЯМР (300 МГц, ДМСО-de) смесь ротамеров 5 8.57-8.26 (м, 1H), 7.87-7.60 (м, 2H), 7.52-7.13 (м, 6H), 7.02 (с, 1H), 4.823.93 (м, 4H), 3.89-3.52 (м, 7H), 3.27-3.04 (м, 2H), 2.99-2.55 (м, 3H); 13C ЯМР (75 МГц, ДМСО-de) смесь ротамеров 5 158.23, 156.60, 154.43, 154.32, 151.79, 147.91, 147.75, 145.30, 139.09, 135.51, 129.86, 129.54, 128.91, 128.86, 128.62, 127.82, 127.32, 122.04, 117.32, 113.43, 66.85, 65.48, 64.63, 64.49, 61.43, 59.33, 58.92, 58.72, 54.82, 45.93, 44.51, 43.31, 30.77.; HRMS (ESI) m/z вычисленный для C21H23N6O4 [M+H+] 423.1780 Да, обнаруженный 423.1784 Да.

6-Бешил-8-(5-циклопропил-4#-1,2,4-триазол-3-ил)-2-(5-нитро-2-фуроил)-2,6диаза-спиро[3.4]октан (40)

Ph

>