Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Кубланов, Илья Валерьевич

• Кубланов, Илья Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кубланов, Илья Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Термофильные микроорганизмы и их ферменты - термозимы

1.1. Экстремофилы

1.2. Термальные местообитания и термофилы

1.3. Термозимы - ферменты термофильных микроорганизмов

1.4. Механизмы, обуславливающие стабильность белков

1.5. Термостабильные гидролазы

1.5.1. Амилазы

1.5.2. Целлюлазы

1.5.3. Ксиланазы

1.5.4. Хитиназы

1.5.5. Агаразы

1.5 .6. Эстеразы и липазы

Глава 2. Протеолитики и протеазы

2.1 Природные белковые полимеры как субстраты протеаз

2.2. Общие сведения. Классификация

2.3. Термофильные протеолитики и их протеазы

2.3.1. Протеиназы термофильных бактерий

2.3.2. Протеиназы термофильных архей

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Методы

Глава 3. Микробиологические методы

3.1. Отбор образцов и полевые работы

3.2. Культивирование термофильных прокариот в лабораторных условиях

3.3. Выделение чистых культур

3.4. Микроскопия

3.5. Оценка скорости роста

3.6. Определение продуктов роста исследуемых штаммов

Глава 4. Методы работы с ДНК и филогения

4.1. Выделение ДНК

4.2. Амплификация фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК

4.3. Детекция продуктов ПЦР

4.4. Денатурирующий градиентный гель электрофорез (ДГГЭ)

4.5. Секвенирование ПЦР-фрагментов и анализ нуклеотидных последовательностей

4.6. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей

Глава 5. Методы исследования протеолитических ферментов

5.1. Приготовление образцов протеиназ

5.2. ДСН-ПААГ электрофорез и зимограммы

5.3. Гидролиз казеина

5.4. Определение характеристик исследуемых кератиназ

5.5. Гидролиз B-цепи инсулина исследуемыми кератиназами

5.6. Очистка кератиназы из 'Caldanaerobacterproteolyticus' штамм 1523

5 .7. Определение концентрации белка Результаты и обсуждение

Глава 6. Разнообразие термофильных прокариот-гидролитиков в горячих источниках кальдеры Узон

6.1. Фенотипическое разнообразие термофильных прокариот-гидролитиков в горячих источниках кальдеры Узон

6.2. Филогенетическое разнообразие термофильных прокариот-гидролитиков в горячих источниках кальдеры Узон

6.3. Протеолитическая активность в накопительных культурах

Глава 7. Выделение и описание анаэробных термофильных микроорганизмов-гидролитиков

7.1. Dictyoglomus sp. штаммы 1521-1 и 1507

7.2. 'Caldicellulosiruptor hydrothermalis' штамм 108 и 'Caldicellulosiruptor hydrothermalis' штамм

7.3. 'Caldanaerobacterproteolyticus' штамм 1523

7.4. Thermoanaerobacter sp. штамм

7.5. Thermoanaerobacterium aciditolerans штамм 761

7.6. 'Desulfurococcus kamchatkensis' штамм 122In

Глава 8. Определение гидролитических активностей новых изолятов

8.1. Целлюлазы из 'Caldicellulosiruptor hydrothermalis' штамм 108, 'Caldicellulosiruptor kronotskyensis' штамм 2002 и Dictyoglomus sp. штамм 1521

8.2. Протеиназа из 'Desulfurococcus kamchatkensis' штамм 122In 8.3 Рост штаммов 1523-1 и 1004 на белках, включаяя кератины, и продукция ими внеклеточных протеиназ

8.4. Определение кератинолитической активности 'Caldanaerobacter proteolyticus' штамм 1523-1 и Thermoanaerobacter sp. штамм

8.5. Специфичность кератиназ 1523-1 и

8.6. Зависимость активности кератиназ 1523-1 и 1004 от Т и pH

8.7. Физико-химические свойства кератиназ 1523-1 и

8.8. Очистка кератиназы 1523

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые анаэробные термофильные прокариоты и их гидролитические ферменты»

Актуальность проблемы

На сегодняшний день ферменты широко используются человеком в таких областях применения как производство продуктов питания и напитков, химическая промышленность, фармакология, медицина, целлюлозобумажная промышленность, и многих других (Copeland, 2000). Большинство ферментов, нашедших применение на данный момент, было обнаружено и выделено из организмов, обитающих при средних, нейтральных в нашем понимании условиях (Hough и Danson, 1999) - животных, грибов и растений, а также неэкстремофильных микроорганизмов. Тем не менее, несмотря на достоинства ферментов, выделенных из неэкстремофилов, их использование может быть ограничено из-за их нестабильности при экстремальных значениях температуры, рН, солености и т.д., которые могут возникать в различных технологичских процессах. Обнаружение экстремофилов - микроорганизмов, способных расти при высоких и низких температурах и значениях рН, высокой солености, больших давлениях и т.д. дало толчок к исследованию новых свойств их ферментов, имеющих значительный потенциал использования в различных областях деятельности (Adams et al., 1995).

Экстремозимы - ферменты экстремофильных микроорганизмов (Adams et al., 1995) зачастую максимально активны в тех же, что и их продуценты, условиях, а иногда и в более широких областях. Кроме изменений в структуре ферментов, обуславливающих экстремофилию их продуцентов, было обнаружено, что некоторые экстремофилы, особенно представители архей, обладают новыми, уникальными метаболическими путями и благодаря этому могут являться продуцентами ферментов с новыми свойствами (Danson и Hough, 1998; Hough и Danson, 1999). Таким, образом, при изучении экстремофильных микроорганизмов и их ферментов наши знания о пределах и возможностях биокатализа расширяются, благодаря чему увеоичивается набор возможных применений экстремозимов (Adams., 1995). Например, в некоторых случаях экстремозимы могут решить вышеуказанную проблему совместимости условий технологических процессов и хрупкости биологических компонентов и систем, задействованных в них (Danson и Hough, 1998).

Термофильные и гипертермофильные микроорганизмы представляют одну из наиболее обширных и активно изучаемых групп экстремофильных микроорганизмов. Продуцируемые ими ферменты, так называемые термозимы (Zeikus et al., 1998), имеют ряд биотехнологических преимуществ перед мезофильными аналогами: прохождение ферментативных реакций при высоких температурах позволяет работать с более высокими концентрациями субстрата из-за снижения вязкости раствора и увеличения коэффициентов диффузии при высоких температурах (Bruins et al., 2001; Eichler, 2001; Egorova и Antranikian, 2005); термостабильные ферменты зачастую обладают повышенной устойчивостью к денатурирующим агентам (например, растворителям, детергентам; Egorova и Antranikian, 2005); снижается риск побочных процессов т.к большинство микроорганизмов, способных оказать нежелательное влияние на протекающие реакции гибнут при температурах выше 70°С. Кроме того, упрощается очистка термозимов, клонированных и экспрессированных в мезофильных микроорганизмах, от остальных белков клеток хозяина благодаря возможности проведения термообработки, при которой многие мезофильные белки денатурируют (Bruins et al., 2001; Vieille и Zeikus, 2001; Bertoldo et al., 2004).

На данный момент известно довольно большое число термофильных микроорганизмов, осуществляющих гидролиз полимерных субстратов. Среди них продуценты гликозидаз умеренно термофильные амилолитические бактерии Bacillus sp. (Krishnan и Chandra, 1983; Gupta et al., 2003), археи Thermococcus profundus (Chung et al., 1995) Pyrococcus sp. (Egorova и Antranikian, 2005), термофильные целлюлолитические бактерии Rhodothermus marinus, Acidithermus cellulolyticus, Caldibacillus cellulovorans (Bergquist et al., 1999), Caldicellulosiruptor и Dictyoglomus spp., археи с ксиланолитической активностью: Thermococcus zilligii (Uhl и Daniel, 1999), Pyrodictium abyssi (Andrade et al., 2001), растущая на агарозе термофильная бактерия 'Caldanaerobacter uzonensis' (Kozina et al., в печати) и др. Термофильные протеолитики представлены бактериями родов Thermoanaerobacter, Thermus, Thermoactinomyces, Fervidobacterium и др., археями родов Desulfurococcus, Thermococcus, Pyrococcus, Aeropyrum и др. Большинство из них растут и используют в качестве источника углерода и/или энергии пептиды благодаря наличию внеклеточных протеаз (в большинстве случаев относящихся к щелочным субтилизин-подобным сериновым протеиназам), активных в широких диапазонах значений рН (Klingeberg et al., 1995; Ward et al., 2002) и температур. Лишь немногие способны использовать в качестве субстрата белки, при гидролизе которых образуются пептиды, используемые большинством остальных протеолитиков. В целом, очевидно, что в природных местообитаниях гидролитики получают некоторое преимущество благодаря способности использовать недоступный для других микроорганизмов субстрат.

Области применения гидролаз, такие как текстильная и бумажная промышленность, выходящая в последнее время на передний план переработка отходов различной природы, и др. постоянно развиваются и расширяются, в связи с чем существует потребность в новых гидролазах, более эффективных, нежели имеющиеся или обладающих новыми свойствами.

Вместе с тем исследования филогенетического разнообразия микроорганизмов в термальных местообитаниях показывают, что большое число термофильных микроорганизмов до сих пор не получено в лабораторных культурах, и, следовательно, их свойства неизвестны (Amann et al., 1995; Barns et al., 1996; Hugenholtz et al., 1998). Среди новых термофильных прокариот могут оказаться и организмы с новыми, биотехнологически привлекательными свойствами. Таким образом, поиск новых термофильных микроорганизмов-гидролитиков остается актуальной проблемой исследований как с научной, так и с прикладной точки зрения.

Цели и задачи исследования

Целью работы было обнаружение, выделение и изучение анаэробных термофильных микроорганизмов-гидролитиков, а также их ферментов.

Задачи исследования состояли в следующем:

1. Изучение филогенетического разнообразия термофильных микроорганизмов-гидролитиков из горячих источников кальдеры Узон.

2. Выделение и характеристика чистых культур анаэробных термофильных гидролитиков.

3. Характеристика термостабильных гидролитических ферментов, продуцируемых новыми изолятами.

Научная новизна и практическая ценность работы

Опробованный метод культивирования накопительных культур в условиях in situ с добавлением различных нерастворимых и слаборастворимых биополимерных субстратов является действенным методом накопления новых гидролитических микроорганизмов.

Определение филогенетического положения наиболее многочисленных микроорганизмов, населяющих полевые накопительные культуры, показало, что в них, помимо представителей уже известных родов бактерий, присутствуют термофильные археи, ранее известные исключительно по природным клонам.

Выделены и охарактеризованы новые целлюлолитические термофильные бактерии 'Caldicellulosiruptor hydrothermalis' и Dictyoglomus sp.; агаролитическая бактерия Dictyoglomus sp., а также протеолитические бактерии 'Caldanaerobacter proteolytics' и Thermoanaerobacter sp. и протеолитическая архея 'Desulfurococcus kamchatkensis

Показана способность протеиназ из 'Caldanaerobacter proteolyticus' и Thermoanaerobacter sp. разрушать трудногидролизуемый белок кератин. Такие свойства обеих кератиназ как активация додецилсульфатом натрия (ДСН), а также остаточная активность в присутствии растворителей, являются новыми для термофильных кератиназ.

Выделенные нами кератиназы ввиду их исключительной активности в присутствии ДСН могут найти широкое применение в качестве добавок к моющим средствам, также привлекательна возможность их использования в качестве биодеградирующих агентов различных трудногидролизуемых белков, таких как кератины.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии», 2003; «Thermophiles 2003»; «Extremophiles 2004»; «Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова», 2004; «Archaea Meeting», 2005; «Biodiversity, molecular biology and biochemistry of thermophiles», 2005; «Химия протеолитических ферментов», 2007.

Место проведения работы

Работа выполнялась в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН и в лаборатории функций и взаимодействий белков молока (FIPL) Национального Института сельскохозяйственных исследований (INRA), г. Нант при докторантуре Университета Нанта, Франция.

Подбор олигонуклеотидных праймеров и зондов был проведен сотрудником лаборатории к.б.н. A.B. Лебединским (ИНМИ РАН). Выделение ДНК, проведение ПЦР и ДГГЭ анализ генов 16S рРНК были выполнены совместно с сотрудниками лаборатории A.A. Переваловой и к.б.н. Г.Б. Слободкиной. Определение состава Г+Ц пар в ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию выполняли совместно с к.б.н. A.M. Лысенко и к.б.н. H.A. Черных (ИНМИ РАН). Определение последовательностей генов 16S рРНК и филогению чистых культур выполняли совместно с к.б.н. Б.Б. Кузнецовым, к.б.н. Т.В. Колгановой (Центр Биоинженерии РАН). Электронную микроскопию накопительных и чистых культур проводили совместно с H.A. Кострикиной (ИНМИ РАН). Масс-спектрометрию, ВЭЖХ хроматографию и др. Исследования свойств ферментов проводили при содействии М. Далгаларрондо (М. Dalgalarrondo, INRA, Nantes), а также сотрудников лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. под руководством заведующего лабораторией д.х.н., проф. Румша Л.Д.

Автор приносит искреннюю благодарность всем коллегам, принимавшим участие на различных этапах работы: A.B. Лебединскому, A.A. Переваловой, Г.Б. Слободкиной, М.Л. Мирошниченко, A.M. Лысенко, H.A. Черных, H.A. Кострикиной, М.И. Прокофьевой, К.И. Мишариной, К.Б. Цирульникову, С.Х. Биджиевой, Б.Б. Кузнецову, Т.В. Колгановой и М. Далгаларрондо а также сотрудникам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН, Россия и лаборатории функций и взаимодействий белков молока INRA, Нант, Франция, за помощь в данной работе, а также за создание замечательной, способствующией рабочей и творческой дейтельности, атмосферы. Автор благодарит посольство Франции в Москве за предоставленную стипендию во время прохождения докторантуры в Университете Нанта. Автор благодарит Льва Давидовича Румша за критические и справедливые замечания, а также Алину Княженцеву за исправление множества ошибок, скрывшихся от взгляда автора. Автор выражает глубокую признательность Маше Прокофьевой за неоценимую помощь в освоении автором микробиологических методов, а также сотруднику лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ РАН

Кириллу Цирульникову за большую помощь в работе с протеиназами. Огромную благодарность автор выражает руководителям Т. Эртле и Е.А Бонч-Осмоловской, за постоянное внимание, а также помощь в обсуждении результатов и направлений дальнейших иследований. Отдельную благодарность автор выражает Елизавете Александровне Бонч-Осмоловской, за все. За огромный вклад в становлении автора как микробиолога, а также за участие и поддержку, оказываемую автору как внутри лаборатории, так и вне ее.

Финансовая поддержка

Работа была поддержана Программами РАН "Молекулярная и клеточная биология", "Биоразнообразие" и "Эволюция биосферы", проектами РФФИ №00-04-48924, №02-04-48112, №03-04-49000, программами ИНТАС №99-1250, №01-250 и №04-83-2725.

Статьи

1. Kublanov, I. V., Prokofeva, M. I., Kostrikina, N. A., Kolganova, Т. V., Tourova, T. P., Wiegel, J. and Bonch-Osmolovskaya, E. A. 2007. Thermoanaerobacterium aciditolerans sp. nov., a moderate thermoacidophile from a Kamchatka hot spring. Int J Syst Evolut Microbiol 57, 260-264.

2. Кубланов, И.В., К.Б. Цирульников, E.H. Калиберда, Л.Д. Румш, Т. Эртле, и Е.А. Бонч-Осмоловская. 2007. Кератиназа из анаэробной термофильной бактерии Thermoanaerobacter штамм 1004, выделенной из горячего источника Байкальской рифтовой зоны. Микробиология, в печати.

3. Kublanov, I.V., A.A. Perevalova, G.B. Slobodkina, S. Bidzhieva, Т. Kolganova, E.N. Kaliberda, L.D. Rumsh, T. Haertle and E.A. Bonch-Osmolovskaya. Biodiversity of thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities in Uzon Caldera hot springs studied by in situ enrichment method. Applied Environm. Microbiol., submitted.

4. Kublanov. I.V. M. Dalgalarrondo, T. Kolganova, J.M. Chobert, E.A. Bonch-Osmolovskaya and T. Haertle. Characterization of SDS-activated serine proteinase with keratinolytic activity produced by anaerobic thermophilic bacterium Caldanaerobacter sp. strain 1523-1. Appl. Biochem. Biotechnol., submitted.

5. Miroshnichenko, M.L., I.V. Kublanov, N.A. Kostrikina, T.P. Tourova, T.V. Kolganova, N.K. Birkeland and E.A. Bonch-Osmolovskaya. Caldicellulosiruptor kronotskyensis sp. nov. and Caldicellulosiruptor hydrothermalis sp. nov., two novel extremely thermophilic cellulolytic anaerobic bacteria from Kamchatka thermal springs. Int. J. Syst. Microbiol., on revision.

Тезисы

1. Kublanov, I.V., I.V. Subbotina, B.B. Namsaraev and E.A. Bonch-Osmolovskaya. Исследование термофильных прокариот, обладающих гидролитической активностью, выделенных из горячих источников Байкальского региона. Международная конференция «Биоразнообразие и функционирование микробных сообществ водных и наземных систем Центральной Азии», 21-29 июля 2003 г., Улан-Удэ, Россия. С 76-77.

2. Kublanov, I.V., Subbotina, I.V., Chernyh, N.A., Kostrikina, N.A., Turova, T.P. Bonch-Osmolovskaya, E.A. Screening for new anaerobic thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities. Thermophiles Conference, 15-19 September 2003, Exeter, UK. Abstract PI.25.

3. Kublanov, I.V. K.B. Tsiroulnikov, M. Dalgalarrondo, T. Haertle and E.A. Bonch-Osmolovskaya. New anaerobic thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities. Extremophiles Conference, 19-23 September 2004, Cambridge, USA. Abstract № 188.

4. Кубланов, И.В., К.Б. Цирульников, Л.Д, Румш, Т. Эртле и Е.А. Бонч-Осмоловская. Новая кератинолитическая протеиназа из термофильной прокариоты. Международная конференция по физико-химической биологии, посвященная 70-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, 2004 г., Москва, Россия. С. 78.

5. Kublanov, I.V., E.A. Bonch-Osmolovskaya and Т. Haertle. Hyperthermophilic archaea with proteolytic activity from Kamchatka hot springs. Archaea Meeting, 2-4 June 2005, Hohenkammer, Germany. Abstract, p. 64.

6. Kublanov, I.V., E.A. Bonch-Osmolovskaya and T. Haertle. New hyperthermophilic crenarchaeota with proteolytic activity isolated from Uzon Caldera hot springs. International workshop "Biodiversity, molecular biology and biochemistry of thermophiles". 20-26 August 2005, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. Abstract, p. 29.

7. Мишарина, К.И., К.Б. Цирульников, С.Х. Биджиева, И.В. Кубланов, Е.А. Бонч-Осмоловская и Л.Д. Румш. Новые термостабильные протеиназы из гипертермофильной археи. Симпозиум «Химия протеолитических ферментов», 23-25 апреля, 2007 г., Москва, Россия. С. 74.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Кубланов, Илья Валерьевич

выводы

1. При инкубации биополимеров в горячих источниках кальдеры Узон было показано присутствие в этих местообитаниях активных и разнообразных сообществ термофильных бактерий и архей, способных гидролизовать биополимеры.

2. В накопительных культурах, полученных в условиях in situ, были выявлены как известные ранее, так и новые организмы с гидролитическими свойствами. Изучение филогенетического положения компонентов полевых накопительных культур позволяет сделать предположения о фенотипических свойствах представителей «некультивируемых» таксонов, что в свою очередь может помочь в их выделении.

3. Выделено и описано 5 новых видов термофильных бактерий и архей ('Caldicellulosiruptor hydrothermalis'Caldicellulosiruptor kronotskyensis 'Caldanaerobacter proteolytics', Thermoanaerobacterium aciditolerans и 'Desulfurococcus kamchatkensis'), использующих биополимерные субстраты - целлюлозу и белки, включая трудногидролизуемые кератины.

4. Выделен первый представитель рода Dictyoglomus, растущий на агарозе и подтверждена способность представителей этого рода к росту на целлюлозе, обусловленному продукцией внеклеточной целлюлазы.

5. Установлено, что способность к росту на а-кератине свойственна, помимо новых изолятов, ряду коллекционных штаммов -Thermoanaerobacter siderophilus, Desulfurococcus fermentans и Desulfurococcus mobilis. Представители рода Desulfurococcus являются первыми идентифицированными гипертермофильными археями, использующими кератины.

6. Кератиназы из 'Caldanaerobacter proteolyticus' и Thermoanaerobacter sp. обладают рядом новых для термофильных кератиназ свойств, таких как

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инкубация полимерных субстратов в условиях свободного обмена воды в горячих источниках кальдеры Узон позволила получить обогащенные накопительные культуры, растущие в максимально приближенных к естественным условиях. Оказалось, что в каждом исследованном источнике присутствуют микроорганизмы, ответственные за гидролиз различных полимерных субстратов, и внесение последних индуцирует развитие соответствующего сообщества. Доминирующие в использующей карбоксиметил целлюлозу накопительной культуре бактерии, близкие роду Dictyoglomus, были выделены в чистую культуру 1521-1, у которой впервые для этого рода была зарегистрирована целлюлазная активность. Кроме того, из накопительной культуры 1507ag также была выделена первая растущая на агарозе бактерия рода Dictyoglomus.

Способность к росту на а-кератине за счет наличия связанной с клетками протеиназы была обнаружена нами у новой гипертермофильной археи 'Desulfurococcus kamchatkensis'. Это первый микроорганизм отдела Crenarchaeota, способный расти на данном субстрате. Однако массовое развитие новых умеренно-термофильных архей в накопительных культурах с белковыми субстратами, сопровождающееся продукцией высокоактивных внеклеточных протеиназ, делает актуальным их дальнейший поиск и выделение в чистую культуру.

Обнаруженные в супернатантах накопительных культур высокомолекулярные внеклеточные протеиназы коррелируют с присутствием представителей сем. Thermoanaerobacteriaceae. Из накопительной культуры 1523cas, в супернатанте которой была детектирована высокомолекулярная протеиназа (Рис. 11 А, Б), был выделен представитель этого семейства продуцент внеклеточной кератиназы размером -220 кДа 'Caldanaerobacter proteolyticus'. Мы установили, что кератиназы Thermoanaerobacter sp. штамм 1004 и 'С. proteolyticus' (штамм 1523-1) обладают рядом свойств, не известных

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кубланов, Илья Валерьевич, 2007 год

1. Банникова, Г.Е., С.А. Лопатин, В.П. Варламов, В.В. Кузнецов, И.В. Козина, М.Л. Мирошниченко, Н.А. Черных, Т.П. Турова и Е.А. Бонч- Осмоловская. Термофильные бактерии гидролизующие агар: характеристика термостабильной агаразы. Микробиология. В печати.

2. Кевбрин, В.В. и Г.А. Заварзин. 1992. Влияние соединений серы на рост галофильной гомоацетатной бактерии Acetohalobium arabaticum. Микробиология. 61: 812-817.

3. Adams, M.W.W. 1993. Enzymes and proteins from organisms that grow near and above 100°C. Annu. Rev. Microbiol. 47: 627-58.

4. Adams, M.W.W., F.B. Perler, and R.M. Kelly. 1995. Extremozymes: expanding the limits of biocatalysis. Bio/Technology. 13: 662-668.

5. Akasako, A., M. Haruki, M. Oobatake, and S. Kanaya. 1997. Conformational stabilities of Escherischia coli RNase HI variants with a series of amino acid substitutions at a cavity within the hydrophobic core. J. Biol. Chem. 272: 18686-18693.

6. Amann, R.I., W. Ludwig, and K.-H. Schleifer. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microb. Rev. 59: 143-169.

7. Amend, J.P. and E.L. Shock. 2001. Energetics of overall metabolic reactions of thermophilic and hyperthermophilic Archaea and Bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 25: 175-243.

8. Andrade, C.M., W.B. Aguiar and G. Antranikian. 2001. Physiological aspects involved in production of xylanolytic enzymes by deep-sea hyperthermophilic archaeon Pyrodictium abyssi. Appl. Biochem. Biotechnol. 91-93: 655-669.

9. Antranikian, G., C. Vorgias and C. Bertoldo. 2005. Extreme environments as a resource for microorganisms and novel biocatalists. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 96: in press.?

10. Argos, P., M.G. Rossmann, U.M. Grau, H. Zuber, G. Frank and J.D. Tratschin. 1979. Thermal stability and protein structure. Biochemistry. 18: 5698-5703.

11. Baross, J.A., and S. E. Hoffman. 1985. Submarine hydrothermal vents and associated gradient environments as sites for the origin and avolution of life. Origins of life. 15: 327-345.

12. Basak, A., B.B. Touré, C. Lazure, M. Mbikay, M. Chrétien and NG. Seidah. 1999. Enzymatic characterization in vitro of recombinant proprotein convertase PC4. Biochem. J. 343: 29-37.

13. Bergquist, P.L., M.D. Gibbs, D.D. Morris, V.S.J. Te'o, D.J. Saul and H.W. Morgan. 1999. Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic bacteria. FEMS Microbiol. Ecol. 28: 99-110.

14. Bertoldo, C., C. Dock and G. Antranikian. 2004. Thermoacidophilic microorganisms and their novel biocatalysts. Eng. Life Sei. 4: 521-531.

15. Birnboim, H. C., and J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523

16. Blöchl, E., R. Rachel, S. Burggruf, D. Hafenbranl, H.W. Jannasch and K.O. Stetter. 1997. Pyrolobus fumarii, gen. and sp. nov., represents a novel group of archaea, extending the upper temperature limit for life to 113°C. Extremophiles. 1: 14-21.

17. Blumentals, I.I., A.S. Robinson and R.M. Kelly. 1990. Characterization of sodium dodecyl sulfate-resistant proteolytic activity in the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus. Appl. Environ. Microbiol. 56: 19921998.

18. Bredholt, S., J. Sonne-Hansen, P. Nielsen, I.M. Mathrani, and B.K. Ahring. 1999. Caldicellulosiruptor kristjanssonii sp. nov., a cellulolytic, extremely thermophilic, anaerobic bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 49:991-996.

19. Brock, T.D. 1967. Life at high temperatures. Science. 158: 1012-1019.

20. Brown, S.H., H.R. Costantino, and R.M. Kelly. 1990. Characterization of amylolytic enzyme activities associated with the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus furiosus. Appl. Environ. Microbiol. 56: 19851991.

21. Bruins, M., A. Janssen and R. Boom. 2001. Thermozymes and their applications. Appl. Biochem. Biotechnol. 90: 155-186.

22. Choi, I.G., W.G. Bang, S.H. Kim and Y.G. Yu. 1999. Extremely thermostable serine-type protease from Aquifexpyrophilus. J. Biol. Chem. 274: 881-888.

23. Chung, Y.C., T. Kobayashi, H. Kanai, T. Akiba and T. Kudo. 1995. Purification and properties of extracellular amylase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus profundus DT5432. Appl. Environ. Microbiol. 61: 1502-1506.

24. Copeland, R.A. 2000. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis. Wiley-VCH, Inc.

25. Corpet, F. 1988. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic. Acid. Res. 16: 10881-10890.

26. Cowan, D.A., and R.M. Daniel. 1982. Purification and some properties of an extracellular protease (caldolysin) from an extreme thermophile. Biochim. Biophys. Acta. 705: 293-305.

27. Cowan, D.A., K.A. Smolenski, R.M. Daniel and H.W. Morgan. 1987. An extremely thermostable extracellular proteinase from a strain of the archaebacterium Desulfurococcus growing at 88°C. Biochem. J. 247: 121-133.

28. Cregg, K., and Rogers G.E. 1986. Feather keratin: composition, structure and bioenergetics. In: Bereiter-Hahn, J., Maltotsy, A.G., Richards, K.S. (eds) Biology of the integument, Vertebrates vol II, Springer, Berlin, Heidelberg, New York, 666-694.

29. Dalev, P.G. 1994. Utilisation of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate. Biores. Technol. 48: 265-267.

30. Danson, M.J. and D.W. Hough. 1998. Structure, function and stability of enzymes from the Archaea. Trends Microbiol. 6: 307-314.

31. Dargatz, H., T. Diefenthal, V. Witte, G. Reipen, and D. von Wettstein.1993. The heterodimeric protease clostripain from Clostridium histolyticum is encoded by a single gene. Mol. Gen. Genet. 240: 140-145.

32. Das, T.K., S. Mazumdar and S. Mitra. 1998. Characterization of a partially unfolded structure of cytochrome c induced by sodium dodecyl sulphate and the kinetics of its refolding. Eur. J. Biochem. 254: 662-670.

33. De Azeredo, L.A.I., M.B. De Lima, R.R.R. Coelho and D.M.G. Freire.2006. Thermophilic protease production by Streptomyces sp. 594 in submerged and solid-state fermentations using feather meal. J. Appl. Microb. 100: 641647.

34. Deckert, G., Warren, P.V., Gaasterland, T. et al., 1998. The complete genome of the hyperthermophilic bacterium Aquifex aeolicus. Nature. 392: 353-363. пока не нужно

35. Demirjian, D.C., F. Moris-Varas, and C.S. Cassidy. 2001. Enzymes from extremophiles. Curr. Opin. Chem. Biol. 5: 144-151.

36. De Toni, C.H., M.F. Richter, J.R. Chagas, J.A.P. Henriques and C. Termignoni. 2002. Purification and characterization of an alkaline serine endopeptidase from feather-degrading Xanthomonas maltophilia strain. Can. J. Microbiol. 48: 342-348.

37. Eggen, R., A. Geerling, J. Watts and W.M. De Vos. 1990. Chearacterization of pyrolysin, a hyperthermoactive serine protease from the archaebacterium Pyrococcus furiosus. FEMS Microbiol. Lett. 71: 17-20.

38. Egorova, K., and Antranikian G. 2005. Industrial relevance of thermophilic Archaea. Curr. Opin. Microbiol. 8: 649-655.

39. Eichler, J. 2001. Biotechnological uses of archaeal extremozymes. Biotechnol. Adv. 19:261-278.

40. Facchiano, A.M., G. Colonna and R. Ragone. 1998. Helix stabilizing factors and stabilization of thermophilic proteins: an X-ray based study. Protein Eng. 11: 753-760.

41. Fischer, S. G., and L. S. Lerman. 1980. Separation of random fragments of DNA according to properties of their sequences. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80:1579-1583.

42. Friedrich, A.B. and Antranikian, G. 1996. Keratin degradation by Fervidobacterium pennivorans, a novel thermophilic anaerobic species of the order Thermotogales. Appl. Environ. Microbiol. 62-8: 2875-2882.

43. Fusek, M., X. Lin and J. Tang. 1990. Enzymatic properties of thermopsin. J. Biol. Chem. 265: 1496-1501.

44. Gao, J., M.W. Bauer, K.R. Shockley, M.A. Pysz, and R.M Kelly. 2003.

45. Growth of hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus on chitin involves two family 18 chitinases. Appl. Environ. Microbiol. 69-6: 3119-3128.

46. Garrity, G.M., J.A. Bell and T.G. Lilburn. 2005. Taxonomic outline of the Prokaryotes. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2H0 Edition

47. Gimenez, M.I., C.A. Studdert, J.J. Sanchez and R.E. De Castro. 2000. Extracellular protease of Natrialba magadii: purification and biochemical characterization. Extremophiles. 4: 181-188.

48. Gooday, G. 1990. The ecology of chitin degradation. Adv. Microb. Ecol. 11: 387-430.

49. Gupta, R., Beg, Q.K., and Lorenz, P. 2002. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 15-32.

50. Gupta, R., Gigras, P., Mohapatra, H., Goswami, V., and Chauhan, B.2003. Microbial alpha-amylases: a biotechnological perspective. Process. Biochem. 38: 1599-1616.

51. Hanzawa, S., T. Hoaki, H.W. Jannasch and T. Maruyama. 1996. An extremely thermostable serine protease from a hyperthermophilic archaeum, Desulfurococcus strain SY, isolated from deep-sea hydrothermal vent. J. Mar. Biotechnol. 4: 121-126.

52. Hicks, P.M., K.D. Rinker, J.R. Baker and R.M. Kelly 1998. Homomultimeric protease in the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima has structural and amino acid sequence homology to bacteriocins in mesophilic bacteria. FEBS Letters. 440: 393-398.

53. Hobel, C.F., V.T. Marteinsson, G.O. Hreggvidsson and J.K. Kristjansson.2005. Investigation of the microbial ecology of intertidal hot springs by using diversity analysis of 16S rRNA and chitinase genes. Appl. Environ. Microbiol. 71: 2771-2776.

54. Hough, D.W. and M.J. Danson. 1999. Extremozymes. Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 39-46.

55. Huang, C.Y., B.K. Patel, R.A. Mah, and L. Baresi. 1998. Caldicellulosiruptor owensis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, xylanolytic bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:91-97.

56. Huang, X.P. and C. Monk. 2004. Purification and characterization of a cellulase (CMCase) from newly isolated thermophilic aerobic bacterium Caldibacillus cellulovorans gen. nov., sp. nov. World J. Microbiol. Biotechnol. 20: 85-92.

57. Hubbard, S.J., K.-H. Gross, and P. Argos. 1994. Intramolecular cavities in globular proteins. Protein Eng. 7: 613-626.

58. Hugenholtz, P., C. Pitulle, K.L. Hershberger, and N.R. Pace. 1998. Novel division level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring. Journal of Bacteriology 180:366-376

59. Jang, H.J., B.C. Kim, Y.R. Pyun and Y.S. Kim. 2002.A novel subtilisin-like serine protease from Thermoanaerobacter yonseiensis KB-1: cloning, expression, and biochemical properties. Extremophiles. 6: 233-243.

60. Jukes, T.H. and C.R. Cantor. 1969. Evolution of protein molecules. In Mammalian Protein Metabolism, pp21-32. Edited by H. N. Munro. New York Academic Press

61. Jurgens, G. 2002. Molecular phylogeny of Archaea in boreal forest soil, freshwater and temperate estuarine sediment. Academic dissertation in microbiology. Helsinki 2002.

62. Juszczak, A., S. Aono and M.W.W. Adams. 1991. The extremely thermophilic eubacterium Thermotoga maritima, contains a novel iron-hydrogenase whose cellular activity is depeHOent upon tungsten. J. Biol. Chem. 266: 13834-13841.

63. Kalisz, HM. 1988. Microbial proteinases. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 36: 1-65.

64. Kannan, Y., Y. Koga, Y. Inoue, M. Haruki, M. Takagi, T. Imanaka, M. Morikawa and S. Kanaya. 2001. Active subtilisin-like protease from a hyperthermophilic archaeon in a form with a putative prosequence. Appl. Environ. Microbiol. 67: 2445-2452.

65. Keyhani, N.O. and S. Roseman. 1999. Physiological aspects of chitin catabolism in marine bacteria. Biochim. Biophys. Acta. 1473: 108-122.

66. Krishnan, Т. and A.K. Chandra. 1983. Purification and characterization of a-amylase from Bacillus licheniformis CUMC305. Appl. Environ. Microbiol. 46: 430-437.

67. Kristjansson, J.K., and G.O. Hreggvidsson. 1995. Ecology and habitats of extremophiles. World J. Microbiol. Biotechnol. 11: 17-25.

68. Kumar, C.G. and H. Takagi. 1999. Microbial alkaline proteases: from a bioiHOustrial viewpoint. Biotechnol. Adv. 17: 561-594

69. Kvist, Т., B.K. Ahring, and P. Westermann. 2006. Archaeal diversity in Icelandic hot springs. FEMS Microbiol. Ecol. 59: 71-80. надо прочесть еще

70. Ladenstein, R., and B. Ren. 2006. Protein disulfides and protein disulfide oxidoreductases in hyperthemophiles. FEBS. J. 273: 4170-4185.

71. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural protein during the assemblage of the head of bacteriophage T4. Nature. 227: 680-685.

72. Lane, D. J. 1991. 16S/23S rRNA sequencing, p. 115-175. In E. Stackebrandt and M. Goodfellow (ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y.

73. Langbein, L., M.A. Rogers, H. Winter, S. Praetzel, U. Beckhaus, H.R. Rackwitz, and & J. Schweizer. 1999. The catalog of human hair keratins. I. Expression of the nine Type I members in the hair follicle. J. Biol. Chem. 274: 19874-19884.

74. LeClair, G.R., A. Buchan and J.T. Hollibaugh. 2004. Chitinase gene sequences retrieved from diverse aquatic habitats reveal environmental-specific distributions. Appl. Environ. Microbiol. 70: 6977-6983.

75. Lin, X. and J. Tang. 1990. Purification, characterization, and gene cloning of thermopsin, a thermostable acid protease from Sulfolobus acidocaldarius. J. Biol. Chem. 265: 1490-1495.

76. Lin, X., C.G. Lee, E.S. Casale and J.C.H. Shih. 1992. Purification and characterization of keratinase from a feather-degrading Bacillus licheniformis strain. Appl. Environ. Microbiol. 58: 3271-3275.

77. Linden, A., O. Mayans, W. Meyer-Klaucke, G. Antranikian and M. Wilmanns. 2003. Differential regulation of a hyperthemophilic a-amylase with a novel (Ca, Zn) two-metal center by zinc. J. Biol. Chem. 278: 98759884.

78. Meyer-Dombard, D.R., E.L. Shock, and J.P. AmeHO. 2005. Archaeal and bacterial communities in geochemically diverse hot springs of Yellowstone National Park, USA. Geobiology. 3: 211-227.

79. Morana, A, M. Moracci, A. Ottombrino, M. Ciaramella, M. Rossi, and M. De Rosa. 1995. Industrial-scale production and rapid purification of an archaeal beta-glycosidase expressed in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Appl. Biochem. 22: 261-268.

80. Naeem, A., F. Fatima and R.H. Khan. 2006. Characterization of partially folded intermediates of papain in presence of cationic, anionic and nonionic detergents at low pH. Biopolymers. 83: 1-10.

81. Nam, G., D. Lee, H. Lee, N. Lee, B. Kim, E. Choe, J. Hwang, M. Suhartono and Y. Pyun. 2002. Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly keratinase-producing thermophilic anaerobe. Arch. Microbiol. 178: 538-547.

82. Nelson, K.E., R.A. Clayton, S.R. Gill, et al., 1999. Evidence for lateral gene transfer beween Archaea and Bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima. Nature. 399: 323-338.

83. Nesterenko, M. V., M. Tilley and S.J. Upton. 1994. A simple modification of Blum's silver stain method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 28: 239-242.

84. Niehaus, F., C. Bertoldo, M. Kahler, and G. Antranikian. 1999. Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51: 711-729.

85. Pace, C.N. 1992. Contribution of the hydrophobic effect to globular protein stability. J. Mol. Biol. 226: 29-35.

86. Parry, D.A.D., and P.M. Steinert. 1999. Intermediate filaments: molecular architecture, assembly, dynamics and polymorphism. Quart. Rev. Biophys. 32: 99-187.

87. Peek, K., R.M. Daniel, C. Monk, L. Parker and T. Coolbear. 1992. Purification and characterization of a thermostable proteinase isolated from Thermus sp. strain Rt41A. Eur. J. Biochem. 207: 1035-1044.

88. Peeples, T.L., and R.M. Kelly. 1995. Bioenergetic Response of the Extreme Thermoacidophile Metallosphaera sedula to Thermal and Nutritional Stresses. Appl. Environ. Microbiol. 61: 2314-2321.

89. Rashin, A.A., M. Iofin, and B. Honig. 1986. Internal cavities and buried waters in globular proteins. Biochemistry. 25: 3619-3625.

90. Rawlings, N.D. and A.J. Barrett. 1994. Classification of peptidases. Methods Enzymol. 244: 1-18.

91. Rawlings, N.D. and A.J. Barrett. 1994. Families of serine peptidases. Methods Enzymol. 244: 19-61.

92. Rawlings, N.D. and A.J. Barrett. 1994. Families of cysteine peptidases. Methods Enzymol. 244: 461-486.

93. Reynolds, E.S. 1963. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy. J. Cell. Biol. 17: 208-212.

94. Riessen, S. and G. Antranikian. 2001. Isolation of Thermoanaerobacter keratinophilus sp. nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with keratinolytic activity. Extremophiles. 5: 399-408.

95. Riffel, A., F. Lucas, P. Heeb and A. BrandeUi. 2003. Characterization of a new keratinolytic bacterium that completely degrades native feather keratin. Arch. Microbiol. 179: 258-265.

96. Saiki, T., Y. Kobayashi, K. Kawagoe, and T. Beppu. 1985. Dictyoglomus thermophilum gen. nov., sp. nov. a chemoorganotrophic, anaerobic, thermophilic bacterium. Int. J. Syst. Bacterid. 35:253-259.

97. Sako, Y., P.C. Croocker and Y. Ishida. 1997. An extremely heat-stable extracellular proteinase (aeropyrolysin) from the hyperthermophilic archaeon Aeropyrum pernix Kl. FEBS Letters. 415: 329-334.

98. Sangali, S. and A. Brandelli. 2000. Feather hydrolysis by a Vibrio sp. strain kr2. J. Appl. Microbiol. 89: 735-743.

99. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 74: 5463-5467.

100. Schiraldi, С., M. Giuliano and M. De Rosa. 2002. Perspectives on biotechnological applications of archaea. Archaea. 1: 75-86. пока не используется

101. Schmidt, M., A.M. Lupas and D. Finley. 1999. Structure and mechanism of ATP depended-proteases. Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 584-591.

102. Schönheit, P. and T. Schäfer. 1995. Metabolism of hyperthermophiles. World J. Microbiol. Biotechnol. 11: 26-57.

103. Schrooyen, P.M.M., P.J. Dijkstra, R.C. Oberthiir, A. Bantjes and J. Feijen. 2001. Stabilization of solutions of feather keratins by sodium dodecyl sulfate. J. Colloid. Interface. Sei. 240: 30-39.

104. Shames, R.B., L.W. Knapp, W.E. Carver, LD. Washington and R.H. Sawyer. 1989. Keratinization of the outer surface of the avian scutate scale: Interrelationship of alpha and beta keratin filaments in a cornifying tissue. Cell Tissue Res. 275: 85-92.

105. Shirley, B.A., P. Stanssens, U. Hahn and C.N. Pace. 1992. Contribution of hydrogen bonding to the conformational stability of ribonuclease Tl. Biochemistry. 31: 725-732.

106. Smith, C.A., H.S. Toogood, H.M. Baker, R.M. Daniel and E.N Baker. 1999. Calcium-mediated thermostability in the subtilisin superfamily: the crystal structure of Bacillus Ak.l protease at 1.8 A resolution. J. Mol. Biol. 294: 1027-1040.

107. Spear, J.R., J.J. Walker, T.M. McCollom, and N.R. Pace. 2004. Hydrogen and bioenergetics in the Yellowstone geothermal ecosystem. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7): 2555-2560.

108. Svetlichny, V.A., and T.P. Svetlichnaya. 1988. Dictyoglomus turgidus sp. nov., a new extremely thermophilic eubacterium isolated from hot springs of the Uzon volcano caldera. Microbiology (Eng. Transl. of Mikrobiologiya). 57:364-369.

109. Takami, H., T. Akiba, and K. Horikoshi. 1990. Characterization of an alkaline protease from Bacillus sp. no. AH-101. Appl. Environ. Microbiol. 33: 519-523.

110. Takayanagi, T., K. Ajisaka, Y. Takiguchi, and K. Shimahara. 1991. Isolation and characterization of thermostable chitinases from Bacillus licheniformis X-7u. Biochem. Biophys. Acta. 1078: 404-410.

111. Teplyakov, A.V., I.P. Kuranova, E.H. Harutyunyan, B.K. Vainshtein, C. Frommel, W.E. Hohne and K.S. Wilson. 1990. Crystal structure of thermitase at 1.4 À resolution. J. Mol. Biol. 214: 261-279.

112. Tsiroulnikov, K., H. Rezai, E. Bonch-Osmolovskaya, P. Nedkov, A. Gousterova, V. Cueff, A. Godfroy, G. Barbier, F. Métro, J.-M. Chobert, P.

113. Clayette, D. Dormont, J. Grosclaude and T. Haertlé. 2004. Hydrolysis ofthe amyloid prion protein and nonpathogenic meat and bone meal by anaerobic thermophilic prokaryotes and Streptomyces subspecies. J. Agric. Food. Chem. 52: 6353-6360.

114. Uhl, A.M. and R.M. Daniel. 1999. The first decription of an archaeal hemicellulase: the xylanase from Thermococcus zilligii AN1. Extremophiles. 3: 263-267.

115. Van De Peer, Y. and R. De Wachter. 1994. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput Applic Biosci 10: 569-570.

116. Vieille, C. and G.J. Zeikus. 2001. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microb. Molec. Biol. Rev. 65: 1-43.

117. Volkin, D.B., and A.M. Klibanov. 1987. Thermal destruction processes in proteins involving cystine residues. J. Biol. Chem. 262: 2945-2950.

118. Ward, D.E., K.R. Shockley, L.S. Chang, R.D. Levy, J.K. Michel, S.B. Conners and R.M. Kelly. 2002. Proteolysis in hyperthermophilic microorganisms. Archaea. 1: 63-74.

119. Wiegel, J., and L.G. Ljungdahl. 1981. Thermoanaerobacter ethanolicus gen. nov., spec, nov., a new, extreme thermophilic, anaerobic bacterium. Arch. Microbiol. 128: 343-348.

120. Woese C.R., O. Kandler, and M.L. Wheelis. 1990. Towards a natural system of organisms: Proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 4576-4579.

121. Wu, J., Y. Bian, B. Tang, X. Chen, P. Shen, and Z. Peng. 2004. Cloning and analysis of WF146 protease, a novel thermophilic subtilisin-like protease with four inserted surface loops. FEMS Microbiol. Lett. 230: 251258.

122. Xiao, X., X. Yin, J. Lin, L. Sun, Z. You, P. Wang and F. Wang. 2005. Chitinase genes in lake sediment of Ardley island, Antarctica. Appl. Environ. Microbiol. 71: 7904-7909.

123. Yamamura, S., Y. Morita, Q. Hasan, K. Yokoyama and E. Tamiya.2002. Keratin degradation: a cooperative action of two enzymes from Stenotrophomonas sp. Bichem. Biophys. Res. Comm. 294: 1138-1143.

124. Yokoyama, H. and I. Matsui. 2005. A novel thermostable membrane protease forming an operon with stomatin homolog from the hyperthermophilic archaebacterium Pyrococcus horikoshii. J. Biol. Chem. 280: 6588-6594.

125. Zahn, H., J. Föhles, M. Nienhaus, A. Schwan and M. Spei. 1980. Wool as a biological composite structure. Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Dev. 19: 496-501.

126. Zeikus, J.G., C. Vieille and A. Savchenko. 1998. Thermozymes: biotechnology and structure-function relationships. Extremophiles. 2: 179-183.

127. Zhang, J., J. Liu, J. Zhou, Y. Ren, X. Dai and H. Xiang. 2003. Thermostable esterase from Thermoanaerobacter tengcongensis: high level expression, purification and characterization. Biotechnol. Lett. 25: 1463-1467.

128. Zillig, W., K.O. Stetter, D. Prangishvilli, W. Schafer, S. Wunderl, D. Janekovic, I. Holz, and P. Palm. 1982. Desulfurococcaceae, the second family of the extremely thermophilic, anaerobic, sulfur-respiring