Молекулярная детекция и новые фенотипические свойства термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Козина, Ирина Владимировна

• Козина, Ирина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Козина, Ирина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ 5 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Термофильные грамположительные анаэробные бактерии

1.1. Местообитания

1.2. Морфология и физиологические свойства

1.3. Филогения и таксономия

Глава 2. Род ТНегтоапаегоЬас1ег

2.1. Таксономия и ареал обитания

2.2. Фенотипические характеристики

Глава 3. Представители рода СаШапаегоЬас1ег

3.1. Таксономия и местообитания

3.2. Фенотипические характеристики

Глава 4. Ферменты термофильных прокариот и их практическое использование

4.1. Ферменты представителей родов СаШапаегоЬа^ег и ТкегтоапаегоЬа^ег

4.2. Агаразы

4.3. СО-дегидрогеназы

Глава 5. Молекулярно-биологические методы исследования микробных сообществ

5.1. Общая схема исследования микробных популяций молекулярно-биологическими методами

5.2. 168 рРНК и филогенетический анализ

5.3. Выделение ДНК

5.4. Полимеразная цепная реакция

5.5. Метод гибридизации с олигонуклеотидными зондами, in situ гибридизация

5.6. Электрофорез в денатурирующем градиентном геле

5.7. Недостатки молекулярно-биологических методов в исследовании экологии термофильных прокариот

5.7.1. Выделение нуклеиновых кислот

5.7.2. ПЦР, клонирование

5.7.3. In situ гибридизация 55 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 6. Материалы и методы исследования

6.1. Объекты исследования

6.2. Условия культивирования

6.3. Микроскопические методы исследования

6.4. Выделение и амплификация ДНК

6.5. Подбор олигонуклеотидных праймеров, зондов, гибридизация и детекция сигнала

6.6. Секвенирование и анализ последовательностей генов 16S рРНК и СО-ДГ

6.7. Биохимические методы исследования

Глава 7. Детекция и идентификация представителей рода Thermoanaerobacter

7.1. ПЦР детекция бактерий с общими бактериальными праймерами

7.2. Детекция и идентификация представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter с родоспецифичным зондом и зондами на группы внутри рода

7.2.1. Подбор зондов

7.2.2. Проверка специфичности зондов

7.2.3. Идентификация чистых культур

7.2.4. Детекция представителей Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в природных образцах и накопительных культурах

Глава 8. Поиск новых термостабильных агараз

8.1. Культивирование штамма, способного к росту на агарозе

8.2. ПЦР амплификация и сиквенс 16S рРНК агаролитической культуры

8.3. Физиологические характеристики роста штамма К

8.4. Выделение и очистка термостабильной агаразы

8.4.1. Агаролитическая активность

8.4.2. Характеристика термостабильной агаразы

Глава 9« Поиск СО-дегидрогеназиого комплекса у бактерий родов Caldanaerobacter и Thermoanaerobacter с помощью специфичных групп праймеров

9.1. Способность штаммов рода Caldanaerobacter к росту на СО

9.2. Исследование карбоксидотрофии у представителей рода Caldanaerobacter и детекция генов ферментного комплекса, обуславливающего гидрогеногенную СО-трофию 86 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94 ВЫВОДЫ 96 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярная детекция и новые фенотипические свойства термофильных бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter»

Актуальность работы. Интерес к термофильным микроорганизмам, которые активно исследуются последние два десятилетия, определяется задачами как фундаментального, так и прикладного характера. Последние в основном связаны с наличием у термофильных прокариот термостабильных ферментов и возможностью их применения в различных областях биотехнологии. Многие микробиологические и биохимические исследования посвящены органотрофным термофильным бактериям, в том числе обладающим способностью к гидролизу различных биомолекул. К ним относятся анаэробные умеренно-термофильные органотрофные бактерии, впервые описанные как представители рода Clostridium, но затем отнесенные к родам Thermoanaerobacterium и Thermoanaerobacter (Lee, 1993). В настоящее время в род Thermoanaerobacter входит 14 видов, выделенных из различных мест обитания: горячих источников (Zeikus et al., 1979), цианобактериальных матов (Бонч-Осмоловская и др., 1997), вулканических озер (Slobodkin et al., 1999), высокотемпературных нефтяных пластов (Cayol et al., 1995) и др. Это умеренные термофилы, облигатные анаэробы с бродильным типом метаболизма, способные в процессе брожения восстанавливать различные неорганические акцепторы электронов - серу, тиосульфат, окисное железо. Экстремально-термофильные организмы, первоначально отнесенные к этому роду (Xue et al., 2001; Kim et al., 2001), впоследствии реклассифицированы как представители нового рода Caldanaerobacter (Fardeau et al., 2004). Представители родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter оказались способными к синтезу протеиназ с новыми, ценными для биотехнологии свойствами (Riessen et al., 2001, Jang et al., 2002). Однако можно предположить, что разнообразие метаболических свойств и биотехнологический потенциал этих микроорганизмов еще далеко не г исчерпаны. Это делает актуальным детальное исследование распространения и метаболического разнообразия термофильных бактерий, относящихся к родам ТЬегтоапаегоЬаМег и СаЫапаегоЪа^ег.

Цель работы. Целью данной работы являлось исследование распространения и разнообразия бактерий рода ТкегтоапаегоЬаМег и СаМапаегоЪаМег молекулярно-биологическими методами.

Основные задачи исследования состояли в следующем:

1) разработка методов молекулярной детекции и/или идентификации термофильных бактерий родов ТкегтоапаегоЪа^ег и СаШапаегоЬа&ег;

2) детекция термофильных бактерий рода ТкегтоапаегоЪаМег и СаШапаегоЬа^ег в накопительных культурах и природных образцах;

3) идентификация изолятов, фенотипически сходных с ТкегтоапаегоЪаМег и СаМапаегоЬа&ег, но имеющих новые для этих родов свойства;

4) выделение и характеристика новых представителей этих таксонов;

5) характеристика ферментативных активностей и/или генов, кодирующих новые ферменты, у бактерий группы ТкегтоапаегоЪаМег/СаШапаегоЬаМег.

Научная новизна. Впервые разработаны олигонуклеотидные зонды для детекции и идентификации бактерий родов ТкегтоапаегоЬа^ег и СаШапаегоЬа^ег. Доказана их высокая специфичность, что позволяет детектировать представителей ТкегтоапаегоЬаМег и СаШапаегоЬаМег непосредственно в накопительных культурах и природных образцах, а также идентифицировать штаммы без необходимости культивирования.

Полученные результаты расширяют представление о распространении и физиологии термофильных бактерий родов ТкегтоапаегоЪаМег и СаМапаегоЪа&ег. В то время как все известные ранее виды родов

Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter являлись нейтрофилами с минимальным рН роста 4.7, нами были идентифицированы как представители рода Thermoanaerobacter два анаэробных ацидофильных штамма, способные развиваться при рН 3.5. Впервые бактерии рода Thermoanaerobacter были обнаружены в пробах из глубоководных гидротерм. Впервые для термофильных прокариот установлена способность микроорганизмов родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter к гидролизу агарозы.

Установлено, что некоторым представителям рода Caldanaerobacter свойственна способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода. Сравнительное исследование генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии, проведённое с помощью ПЦР с разработанными нами праймерами, показало их своеобразие у представителей Caldanaerobacter на фоне единства организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов. Полученные данные подтверждаются результатами анализа полных геномов анаэробных карбоксидотрофов.

Практическая ценность работы. Разработанные нами олигонуклеотидные зонды позволяют идентифицировать представителей родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter в накопительных и чистых культурах, минуя стадии определения фенотщшческих дескрипторов, а также детектировать их в природных образцах. Полученные данные важны для развития представлений о распространении и физиологии родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter. Разработанный нами метод может быть использован для экспресс-детекции изолятов, в том числе при поиске представителей новых филогенетических групп.

Описанные нами агаролитические штаммы могут быть использованы для получения термостабильной агаразы с целью ее применения в молекулярной биологии для освобождения нуклеиновых кислот и белков из тугоплавких агарозных гелей.

Разработанные нами методы детекции генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии могут быть использованы для исследования экологии и распространения водородобразующих СО-трофов.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на IV Международном Конгрессе «Экстремофилы-2002» (Италия, Неаполь, 2002), 1-ом Международном FEMS Конгрессе Европейский микробиологов (Словения, Любляна, 2003), XV Международной зимней молодежной научной школе (Москва, 2003), VII Международной конференции «Термофилы-2003 (Экзетер, Англия), V Международном Конгрессе «Экстремофилы-2004» (США, Мэрилэнд, 2004), VIII Международной конференции «Термофилы-2005» (Серфере Парадайс, Австралия, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи, 9 тезисов, 1 статья находится в печати.

Объем работы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах и включает 12 таблиц и 11 рисунков. Работа состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, содержащей описание материалов и методов, результаты и обсуждения исследования, выводов и библиографического списка.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Козина, Ирина Владимировна

выводы

1. Показано, что род ТкегтоапаегоЬаМег может быть разделен на три филогенетические подгруппы, одна из которых была впоследствии реклассифицирована как новый род СаМапаегоЪаМег.

2. Разработан метод идентификации и детекции представителей родов ТкегтоапаегоЬаМег и СаМапаегоЪаМег., основанный на ДНК-ДНК гибридизации на мембранах с помощью высокоспецифичных олигонуклеотидных зондов.

3. Установлено присутствие бактерий рода ТкегтоапаегоЪаЫег в глубоководных гидротермах Восточно- Тихоокеанского поднятия.

4. Среди идентифицированных представителей родов ТкегтоапаегоЪаМег и СаМапаегоЪаЫег обнаружены штаммы, обладающие новыми для этих родов свойствами - способностью к гидролизу агарозы (ТкегтоапаегоЪаМег и СаМапаегоЬаМег) и ацидотолерантностью (ТкегтоапаегоЬаМег), что расширяет представления о физиологии этих родов.

5. Впервые выделены термофильные агаролитические бактерии. Они идентифицированы как представители родов ТкегтоапаегоЬаМег и СаМапаегоЬаМег. Описан новый вид СаМапаегоЬаМег иго пет ¡я, являющийся вторым видом этого рода.

6. Охарактеризована агаролитическая активность штаммов ТкегтоапаегоЬа^ег и СаШапаегоЬас1ег — первых продуцентов термостабильной агаразы.

7. Установлено, что некоторым представителям рода СаЫапаегоЬасгег свойственна способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода.

8. Показано своеобразие генетических детерминант гидрогеногенной карбоксидотрофии у представителей рода СаЫапаегоЪаМег на фоне единства их организации у ряда других филогенетически разнообразных термофилов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Примененный нами метод гибридизации с олигонуклеотидными зондами позволил не только отнести ряд штаммов к группе Thermoanaerobacter- Caldanaerobacter, но и дифференцировать штаммы по принадлежности к родам или одной из двух групп внутри рода Thermoanaerobacter. Полученные результаты расширяют представления о распространении и физиологических свойствах исследуемой группы термофильных прокариот. Впервые нами были обнаружены представители рода Thermoanaerobacter в глубоководных гидротермах Восточно-Тихоокеанского поднятия. Обнаружено, что к роду Thermoanaerobacter, ранее включавшему только нейтрофилов, относятся два ацидофильных штамма, способных расти при pH 3.5.

Установлено, что три штамма, относящиеся к родам Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter, способны к гидролизу агарозы (свойство, впервые обнаруженное у термофильных анаэробов). Ранее микроорганизмы с агаролитической активностью выделяли из морских местообитаний, где источником агара как субстрата для них служили морские красные водоросли. Наши данные указывают на то, что агаролитические прокариоты могут населять также наземные горячие источники, где субстратами для них могут являться полисахариды цианобактерий, образующих цианобактериальные маты (Герасименко и др., 1983; Намсараев и др., 2006). Агаролитическая активность бактерий родов Thermoanaerobacter и Caldanaerobacter охарактеризована на примере штамма В5, идентифицированного нами как Thermoanaerobacter wiegeln. Фермент отличается высокой удельной активностью, высоким температурным оптимумом и может быть использован в препаративной молекулярной биологии.

Реклассифицированный французскими исследователями род СаЫапаегоЬа^ег до настоящего времени содержал только один вид. В данной работе описана анаэробная термофильная бактерия (штамм К67), выделенная из горячего источника Камчатки, представляющая второй вид рода СаМапаегоЬаМег - СаШапаегоЬаМег игопетгз, 8р поу.

Способность к анаэробному использованию СО с образованием водорода свойственна многим термофильным прокариотам (8око1оуа е1 а!., 2002, 2004 а,Ь, 2005, 2006, 2007). Мы установили, что способный как к росту на СО, так и к органотрофному росту штамм 2707, выделенный из гидротерм Камчатки, относится к роду СаШапаегоЬаМег. Таким образом, это второй представитель этого рода, способный к анаэробному росту на СО с продукцией водорода.

Анализ функциональных генов, обуславливающих способность к росту на СО с образованием водорода у ряда анаэробных филогенетически разнообразных представителей ПгтжМез позволил установить ключевую роль в этом процессе генного кластера, кодирующего ферментный комплекс СО-дегидрогеназы и гидрогеназы. Разработанный нами метод может быть применен для экологических исследований природных образцов и накопительных культур. Кластирование генов специализированной гидрогеназы и СО-дегидрогеназы может рассматриваться как специфический признак и геномный маркер филогенетически разнообразных гидрогеногенных карбоксидотрофов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Козина, Ирина Владимировна, 2008 год

1. Гусев М.В., Минеева JI.A. (1992). Микробиология, издательство МГУ.

2. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л., Соколова Т.Г., Слободкин А.И. (2004). Термофильные микробные сообщества: новые физиологические группы, новые местообитания. Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского, Выпуск 12, Москва, Наука.

3. Дуда В.И. (1974). Физиологические и биологические особенности спорообразующих анаэробных бактерий. Жизнь растений; т.1 Ред. Федоров A.A., Красильников H.A., Уранов A.A. Просвещение; 487стр.

4. Лисицын, А. П., Богданов Ю.А. ,Воробьев П.В.; Гурвич Е.Г. (1993). Гидротермальные системы и осадочные формации срединно-океанических хребтов Атлантики, Москва, Наука, 147-160.

5. Логинова Л.Г. (1977). Новые формы термофильных бактерий.М.: Наука.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. (1984). Молекулярное клонирование. М.:Мир,480с.

7. Назина Т.Н., Беляев С.С. (2004). Биологическое и метаболическое разнообразие микроорганизмов нефтяных месторождений. Труды

8. Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН. Юбилейный сборник к 70-летию Интситута. T.XII. // Ред. В.Ф. Гальченко. М.: Наука, 2004

9. Перельман А.И. (1979). Геохимия. М.: Высшая школа, 422 с.

10. Светличный, В.А., Соколова, Т.Г., Герхард, М., и Заварзин, Г.А. (1990). Новая группа анаэробных термофильных карбоксидобактерий, образующих Н2, Доклады Академии Наук, vol. 314, pp. 742-744.

11. Слободкин А.И., Заварзина Д.Г., Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская Е.А. (1999). Диссимиляционное восстановление неорганических акцепторов электронов термофильными анаэробными прокариотами. Микробиология, том 68, № 5, стр. 522 543.

12. Соколова Т.Г. (1993). Анаэробные термофильные карбоксидотрофные бактерии. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва.

13. Шестакова Н. М. (2007). Филогенетическое разнообразие и активность микроорганизмов высокотемпературных нефтяных пластов, Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

14. Amann RI, Binder BJ, Olson RJ, Chisholm SW, Devereux R, Stahl DA. (1990). Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Appl Environ Microbiol. Jun;56(6):1919-25.

15. Amann RI, Zarda B, Stahl DA, Schleifer КЩ1992). Identification of individual prokaryotic cells by using enzyme-labeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes.

16. Appl Environ Microbiol. Sep;58(9):3007-11.

17. Amann R.T., (1995). Fluorescently labeled, RNA-targeted oligonucleotide probes in the study of microbial ecology. Mol Ecol 4:543-554.

18. Amann R, Ludwig W. (2000). Ribosomal RNA-targeted nucleic acid probes for studies in microbial ecology. FEMS Microbiol Rev. 2000 Dec;24(5):555-65. Review.

19. Artiushin S, Stipkovits L, Minion FC. (1993). Development of polymerase chain reaction primers to detect Mycoplasma hyopneumoniae.Mol Cell Probes. Oct;7(5):381-5.

20. Ashlcin A., Dziedzic J.M. 1987. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria // Science 235: 1517-1520.

21. Bateson, M. M., J. Weigel, and D. M. Ward. (1989). Comparative analysis of 16S ribosomal RNA sequences of thermophilic fermentative bacteria isolated from hot spring cyanobacterial mats. Syst. Appl. Microbiol. 12:1-7

22. Beimfohr C., Krause A., Amann R., Ludwig W., Schleifer K-H.(1993). In situ identification of lactococci, enterococci, and streptococci. Syst Appl Microbiol 16:450-456.

23. Ben-Bassat, A. & Zeikus, J. G. (1981). Thermobacteroides acetoethylicus gen. nov. sp. nov., a new chemoorganotrophic, anaerobic, thermophilic bacterium. Arch Microbiol 128, 365-370;

24. Bentley RW, Leigh JA. (1995). Development of PCR-based hybridization protocol for identification of streptococcal species. J Clin Microbiol. May;33(5): 1296-301

25. Boehringer Mannheim Gmb. H, Biocemica. The DIG system users guide for filter hybridization. A laboratory manual. 1995.

26. Bonch-Osmolovskaya, E.A., Miroshnichenlco, M.L.,Slobodkin, A.I., Sokolova, T.G., Karpov, G.A., Kostrikina,N.A., Zavarzina, D.G., Prokof eva, M.I.,Rusanov, I.I., and Pimenov, N.V. (1999). Distribution and Diversity of

27. Anaerobic Lithotrophic Prolcaryotes in Terrestrial Hydrotherms of Kamchatka. Mikrobiologiya, 1999, vol. 68, pp. 398-406

28. Britschgi TB, Giovannoni SJ. (1991). Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA gene cloning and sequencing. Appl Environ Microbiol. Jun;57(6):l707-13.

29. Bruce KD, Hiorns WD, Hobman JL, Osborn AM, Strike P, Ritchie DA.( 1992).Amplification of DNA from native populations of soil bacteria by using the polymerase chain reaction. Appl Environ Microbiol. 0ct;58(10):3413-6.

30. Cayol JL, Ducerf S, Patel BK, Garcia JL, Thomas P, Ollivier B. (2000). Thermohalobacter berrensis gen. nov., sp. nov., a thermophilic, strictly halophilic bacterium from a solar saltern. Int J Syst Evol Microbiol. Mar;50 Pt 2:559-64.

31. Cook, G. M., P. H. Janssen, and H. W. Morgan. (1991). Endospore formation by Thermoanaerobium brockii HTD4. Syst. Appl. Microbiol. 14:240-244.

32. Cook, G. M., Rainey, F. A., Patel, B. K. & Morgan, H. W. (1996).Characterization of a new obligately anaerobic thermophile, Thermoanaerobacter wiegeln. Int J Syst Bacteriol 6, 123-127)

33. Corpet F., 1988. Multiple sequence alignment with hierarchical clustering Nucleic Acids Res. 16:10881-10890

34. DeLong E.F., Wickham G.S., Pace N.R. (1989). Phylogenetic stains:ribosomal RNA-based probes for the identification of singl microbial cells. Science 243:1360-1363.

35. DeLong EF, Taylor LT, Marsh TL, Preston CM.(1999). Visualization and enumeration of marine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluorescent in situ hybridization. Appl Environ Microbiol. Dec;65(12):5554-63.

36. DeLong EF, Pace NR.(2001 ^Environmental diversity of bacteria and archaea. SystBiol. 2001 Aug;50(4):470-8.

37. Edwards U, Rogall T, Blocker H, Emde M, Bottger EC (1989). Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Res. Oct 11;17(19):7843-53

38. Engle M, Li Y, Woese C, Wiegel J. Isolation and characterization of a novel alkalitolerant thermophile, Anaerobranca horikoshii gen. nov., sp. nov. Int J Syst Bacteriol. 1995 Jul;45(3):454-61.

39. Ensign SA, Bonam D, Ludden PW.(1989). Nickel is required for the transfer of electrons from carbon monoxide to the iron-sulfur center(s) of carbon monoxide dehydrogenase from Rhodospirillum rubrum. Biochemistry. Jun 13;28(12):4968-7.

40. Erbeznik, M., Dawson, K. A. & Strobel, H. J. (1998). Cloning and characterization of transcription of the xylAB operon in Thermoanaerobacter ethanolicus. J Bacteriol 180, 1103-1109.

41. Fardeau ML, Patel BK, Magot M, Ollivier B (1997).Utilization of serine, leucine, isoleucine, and valine by Thermoanaerobacter brockii in the presence of thiosulfate or Methanobacterium sp. as electron acceptors.Anaerobe. Dec;3(6):405-10.

42. Farrelly V, Rainey FA, Stackebrandt E. (1995). Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. Jul;61(7):2798-801.

43. Fell JW. (1993).Rapid identification of yeast species using three primers in a polymerase chain reaction.Mol Mar Biol Biotechnol. Jun;2(3): 174-80.

44. Fox, J.D., He, Y., Shelver, D., Roberts, G.P. & Ludden, P.W. (1996b) Characterization of the region encoding the CO-induced hydrogenase of Rhodospirillum rubrum. J. Bacteriol. 178, 6200-6208

45. Fuhrman JA, Comeau DE, Hagstrôm A, Chan AM. (1988).Extraction from Natural Planktonic Microorganisms of DNA Suitable for Molecular Biological Studies.Appl Environ Microbiol. Jun;54(6): 1426-1429.

46. Fukusawa S, Kobayashi F (1987). Propeties of agarase from a luminous bacterium, Vibrio harvei. Agric Biol Chem 51:269-270.

47. Gold P. (1992). Use of a novel agarose gel-digesting enzyme for easy and rapid purification of PCR-amplified DNA for sequencing. Biotechniques. Jul;13(l):132-4.

48. Hattori S, Kamagata Y, Hanada S, Shoun H. (2000). Thermacetogenium phaeum gen. nov., sp. nov., a strictly anaerobic, thermophilic, syntrophic acetate-oxidizing bacterium. Int J Syst Evol Microbiol. Jul;50 Pt 4:1601-9.

49. Head I.M, Gray N.D, Clarke K.J., Picup R.W., Jones J.G. (1996). The phylogenetic position and ultrastructure of the uncultured bacterium Achromatium oxaliferum. Microbiology 142:2341-2354.

50. Head I.M., Saunders J.R., Pickup R.W. (1997). Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms. Microb Ecol 35:1-21.

51. Hahn D, Amann RI, Ludwig W, Akkermans AD, Schleifer KH.(1992). Detection of micro-organisms in soil after in situ hybridization with rRNA-targeted, fluorescently labelled oligonucleotides. J Gen Microbiol. May;138(5):879-87.

52. Holben WE, Jansson JK, Chelm BK, Tiedje JM.(1988). DNA Probe Method for the Detection of Specific Microorganisms in the Soil Bacterial Community. Appl Environ Microbiol. Mar;54(3):703-711.

53. Hudson, J. A., H. W. Morgan, and R. M. Daniel. (1990). Cellulolytic properties of an extremely thermophilic anaerobe. Appl. Microbiol. Biotechnol. 33:687-691.

54. Hungate, R. E. (1969). A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. Methods Microbiol 3B, 117±132.

55. Hunger W, Claus D (1978). Reisolation and growth conditions of Bacillus agar-exedens. Ant Leeuwen 44:105-113.

56. Jang J., Kim C., Pyun R., Kim S. (2002). A novel subtilisin-like serine protease from Thermoanaerobacter yonseiensis KB-1: its cloning, expression, and biochemical properties // Extremophiles. V. 6 № 3. P. 233-243.

57. Jeanthon C.(2000). Molecular ecology of hydrothermal vent microbial communities // Antonie van Leeuwenhoek. V. 77 № 2. P. 117-133.

58. Jin, F., Yamasato, K. & Toda, K. (1988). Clostridium thermocopriae sp. nov., a cellulolytic thermophile from animal feces, compost, and a hot-spring in Japan. IntJSyst Bacteriol 38, 279-281.

59. Johnson, J. L., and B. L. Francis. (1975). Taxonomy of the Clostridia: ribosomal ribonucleic acid homology among the species. J. Gen. Microbiol. 88:229-244

60. Kerby, R.L., Ludden, P.W., and Roberts, G.P. (1997). In vivo nickel insertion into the carbon monoxide dehydrogenase of Rhodospirillum rubrum:molecular and physiological characterization of cooCTJ. JBacteriol 179(7):2259—2266.

61. Kim B.C., Grote R., Lee D.W., Antranikian G, Pyun YR. (2001). Thermoanaerobacter yonseiensis sp. nov., a novel extremely thermophilic, xylose-utilizing bacterium that grows at up to 85 degrees C // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 51 № 4. p. 539-548.

62. Kim DJ, Jang HJ, Pyun YR, Kim YS. (2002). Cloning, expression, and characterization of thermostable DNA polymerase from Thermoanaerobacter yonseiensis J Biochem Mol Biol. 2002 May 31 ;35(3):320-9.

63. Kuisiene N, Raugalas J, Stuknyte M, Chitavichius D. (2007). Identification of the genus Geobacillus using genus-specific primers, based on the 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer. FEMS Microbiol Lett. Dec;277(2):165-72.

64. Laemmli, V.K. //Nature 1970. V. 227. P. 680-685.

65. Lane D.J. (1991). 16S/23S rRNA sequencing // Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Ed. Stackebrandt E., Goodfellow M. New York: John Wiley & Sons,. P. 115-147.

66. Larsen, L., Nielsen, P. & Ahring, B. K. (1997). Thermoanaerobactermathranii sp. nov., an ethanol-producing, extremely thermophilic anaerobic bacterium from a hot spring in Iceland. Arch Microbiol 168, 114-119

67. Lee S., Malone C., Kemp P.F. (1993). Use of multiple 16S rRNA targeted fluorescent probes to increase signal strength and measure cellular RNA from natural planktonic bacteria. Marine Ecol Prog Ser 101:193-201.

68. Leigh, J. A., Mayer, F. & Wolfe, R. S. (1981). Acetogenium kivui, a new thermophilic hydrogen oxidizing, acetogenic bacterium. Arch Microbiol 129, 275-280.

69. Liesack W., Weyland H., Stackebrandt E. (1991). Potential risks of gene amplification by PCR as determined by 16S rDNA analysis of a mixed culture of strict barophilic bacteria. Microb Ecol 21:191-198.

70. Ludwig W, Schleifer KH. (1994). Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis. FEMS Microbiol Rev. 1994 Oct; 15(2-3): 155-73. Review.

71. Macnaughton SJ, O'Donnell AG, Embley TM.(1994).Permeabilization of mycolic-acid-containing actinomycetes for in situ hybridization with fluorescently labelled oligonucleotide probes.Microbiology. Oct; 140 ( Pt 10):2859-65.

72. Magot M, Ollivier B, Patel BIC.(2000). Microbiology of petroleum reservoirs. Antonie Van Leeuwenhoek. 2000 Feb;77(2):103-16.

73. Maidak B.L., Cole J.R., Lilburn T.G., Parker C.T., Jr, Saxman P.R., Farris R.J., Garrity G.M., Olsen G.J., Schmidt T.M., Tiedje J.M. (2001). The RDP-II (Ribosomal Database Project) // Nucleic Acids Res. V. 29. № 1. P. 173 4.

74. Manz, W., Amann R., Ludwig W., Wagner M.,Schleifer K.-H. (1992). Phylogenetic oligonucleotide probes for the major subclasses of the proteobacteria: problems and solutions.Syst Appl Microbiol 15:593-600.

75. Marmur, J. (1961) A procedure for the isolation of desoxyribonucleic acid from microorganisms. J.Mol.Biol. 3: 208-218.

76. Meyer O, Schlegel HG.(1983). Biology of aerobic carbon monoxide-oxidizing bacteria.Annu Rev Microbiol. 1983;37:277-310. Review.

77. Moré MI, Herrick JB, Silva MC, Ghiorse WC, Madsen EL.( 1994).Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment.

78. Appl Environ Microbiol. May;60(5): 1572-80.

79. Mori K, Hanada S, Maruyama A, Marumo K (2002). Thermanaeromonas toyohensis gen. nov., sp. nov., a novel thermophilic anaerobe isolated from a subterranean vein in the Toyoha Mines. Int J Syst Evol Microbiol. Sep;52 (Pt 5):1675-80.

80. Morrice LM, McLean MW, Long WF, Williamson FB (1984). ß-Agarases from Pseudomonas atlantica. Hydrobiologia 116/117:576-579.

81. Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG. (1993). Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. Mar;59(3):695-700.

82. Onyenwoke RU, Brill JA, Farahi K, Wiegel J. (2004). Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch ( Firmicutes).Arch Microbiol. 2004 Oct; 182(2-3): 182-92.

83. Onyenwoke RU, Kevbrin VV, Lysenko AM, Wiegel J.(2007). Thermoanaerobacter pseudethanolicus sp. nov., a thermophilic heterotrophic anaerobe from Yellowstone National Park. Int J Syst Evol Microbiol. Oct;57(Pt 10):2191-3.

84. Pace NR, Stahl DA, Lane DJ, Olsen GJ (1986). The analysis of natural microbial populations by ribosomal RNA sequenses. Adv Microb Ecol 9:1-55.

85. Pfennig, N. & Lippert, K. D. (1966). Über das Vitamin B12 bedürfnis phototropher Schwefel bacterien. Arch Microbiol 55, 245-256

86. Plügge CM, Balk M, Zoetendal EG, Stams AJ. (2002). Gelria glutamica gen. nov., sp. nov., a thermophilic, obligately syntrophic, glutamate-degrading anaerobe. Int J Syst Evol Microbiol. Mar;52(Pt 2):401-7.

87. Potin P, Richard C, Rochas C, ICloareg B (1993). Purification and characterization of the alfa.-agarase from Alteromonas agarolyticus (Cataldi) comb nov., strain GJ1B. Eur J Biochem 214:599-607.

88. Poulsen LK, Ballard G, Stahl DA.(1993). Use of rRNA fluorescence in situ hybridization for measuring the activity of single cells in young and established biofilms. Appl Environ Microbiol. May;59(5): 1354-60.

89. Qian Z, Wang JQ, Zhou CQ, Ma YH, Liu SQ.(2006). Expression and catalysis of glucokinase of Thermoanaerobacter tengcongensis at different temperatures. Wei Sheng Wu Xue Bao. 2006 Apr;46(2):243-8.

90. Ragsdale SW. (2004). Life with carbon monoxide. Crit Rev Biochem Mol Biol. 2004 May-Jun;39(3): 165-95.

91. Rainey, FA, Ward NL, Morgan HW, Toalster R, Stackebrandt E.(1993). Phylogenetic analysis of anaerobic thermophilic bacteria: aid for their reclassification. JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. p. 4772-4779 Vol. 175, No. 15

92. Rainey FA, Fritze D, Stackebrandt E. (1994). The phylogenetic diversity of thermophilic members of the genus Bacillus as revealed by 16S rDNA analysis. FEMS Microbiol Lett. 115(2-3):205-l 1.

93. Raskin L, Stromley JM, Rittmann BE, Stahl DA.(1994).Group-specific 16S rRNA hybridization probes to describe natural communities of methanogens. Appl Environ Microbiol. Apr;60(4): 1232-40.

94. Rees G, Rainey FA, Harfoot CG (1994). Characterization of a novel obligate anaerobe that ferments agar. Arch Microbiol 162:395-400

95. Rees GN, Patel BK, Grassia GS, Sheehy AJ.Anaerobaculum thermoterrenum gen. nov., sp. nov., a novel, thermophilic bacterium which ferments citrate. Int J Syst Bacteriol. 1997 Jan;47(l): 150-4.

96. Reysenbach AL, Giver LJ, Wickham GS, Pace NR. (1992). Differential amplification of rRNA genes by polymerase chain reaction. Appl Environ Microbiol. Oct;58(10):3417-8.

97. Riessen S., Antranikian G. (2001). Isolation of Thermoanaerobacter keratinophilus sp. nov., a novel thermophilic, anaerobic bacterium with keratinolytic activity // Extremophiles. V. 5 № 6. P. 399-408.

98. Rochelle PA, Fry JC, Parkes RJ, Weightman AJ.(1992). DNA extraction for 16S rRNA gene analysis to determine genetic diversity in deep sediment communities. FEMS Microbiol Lett. Dec 15;79(l-3):59-65.

99. Roh Y, Liu SV, Li G, Huang H, Phelps TJ, Zhou J. (2002). Isolation and characterization of metal-reducing thermoanaerobacter strains from deep subsurface environments of the Piceance Basin, Colorado. Appl Environ Microbiol. Dec;68(12):6013-20.

100. Sahm K, MacGregor BJ, Jergensen BB, Stahl DA.(1999).Sulphate reduction and vertical distribution of sulphate-reducing bacteria quantified byrRNA slot-blot hybridization in a coastal marine sediment. Environ Microbiol. 1999 Feb;l(l):65-74.

101. U.Schmid, H.Giesel, S.M. Schoberth, and H.Sahm (1986).Thermoanaerobacter finnii spec.nov., a new ethanologenic sporogenous bacterium. System.Appl.Microbiol. 8, 80-85.

102. Shieh WY, Jean WD (1998). Alterococcus agarolyticus, gen. nov., sp. nov., a halophilic thermophilic bacterium capable of agar degradation. Can J Microbiol 44:637-645.

103. Skovhus TL, Holmstrom C, Kjelleberg S, Dahllof I. (2007). Molecular investigation of the distribution, abundance and diversity of the genus Pseudoalteromonas in marine samples. FEMS Microbiol Ecol. Aug;61(2):348-61. Epub 2007 Jun 16

104. A. I. Slobodkin, D. G. Zavarzina, T. G. Sokolova, and E. A. Bonch-Osmolovskaya. (1999). Dissimilatory Reduction of Inorganic Electron Acceptors by Thermophilic Anaerobic Prokaryotes. Microbiology, Vol. 68, No. 5, 1999, pp. 600-622.

105. Slobodkin AI. (2005). Thermophilic microbial metal reduction Mikrobiologiia. 2005 Sep-Oct;74(5):581-95.

106. B Soboh, D Linder and R Hedderich. (2004). A multisubunit membrane-bound NiFe. hydrogenase and an NADH-dependent Fe-only hydrogenase in thefermenting bacterium Thermoanaerobcicter tengcongensis. Microbiology, 150, 2451-2463.

107. Spector, T. // Anal. Biochem. 1978. V. 86. P.141-146.

108. Stackebrandt,E. and Woese,C. (1981). The evolution of prokaryotes. In Molecular and cellular aspects of microbial evolution. Carlise,M.J., Collins,J.R., and Moseley,B.E.B. (eds). Cambridge: Cambridge University Press, 1-31.

109. Steffan, R. J., J. Goksoyr, A. K. Bej, R. M. Atlas. (1988). Recovery of DNA from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 54:2908-2915

110. Stahl DA, Flesher B, Mansfield HR, Montgomery L.(1988).Use of phylogenetically based hybridization probes for studies of ruminal microbial ecology. Appl Environ Microbiol. May;54(5): 1079-84

111. Stetter K.O. (1999). Extremophiles and their adaptation to hot environments. FEBS Lett. Jun 4;452(l-2):22-5.

112. Stoffels M, Ludwig W, Schleifer KH. (1999). rRNA probe-based cell fishing of bacteria.

113. Environ Microbiol. 1999 Jun;l(3):259-71.

114. Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G., Kostrikina, N.A., and Zavarzin, G.A. (1991). Anaerobic Extremely Thermophilic Carboxydotrophic Bacteria in Hydrotherms of Kunashir Island, Microb. Ecol., 1991, vol. 21, pp. 1-10.

115. Svetlichnyi, V.A., Sokolova, T.G., Kostrikina, N.A., and Lysenko, A.M. (1994). Carboxydothermus restrictus sp.nov.—A New Thermophilic Anaerobic Carboxydotrophic Bacterium. Mikrobiologiya, vol. 63,pp. 523-528.

116. Svetlitchnyi, V., Peschel, C., Acker, G., and Meyer, O. (2001).Two membrane-associated NiFeS-carbon monoxide dehydrogenases from theanaerobic carbon-monoxide-utilizing eubacterium Carboxydothermus hydrogenoformans. JBacteriol 183(17):5134-5144.

117. Tanner, R. S., E. Stackebrandt, G. E. Fox, R. Gupta, L. G. Magnum, and C. R. Woese. (1982). A phylogenetic analysis of anaerobic eubacteria capable of synthesizing acetate from carbon dioxide. Curr. Microbiol. 7:127-132.

118. Tebbe, C. C., W. Vahjen. (1993). Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Appl. Environ. Microbiol. 59:2657-2665

119. Trebesius K, Amann R, Ludwig W, Mühlegger K, Schleifer KH.(1994). Identification of Whole Fixed Bacterial Cells with Nonradioactive 23 S rRNA-Targeted Polynucleotide Probes. Appl Environ Microbiol. Sep;60(9):3228-3235.

120. Trevors, J. T., H. Lee, S. Cook. (1992). Direct extraction of DNA from soil. Microb. Releases 1:111-115.

121. Tsai, Y., B. H. Olson. (1991). Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 57:1070-1074

122. Uffen RL.(1983). Metabolism of carbon monoxide by Rhodopseudomonas gelatinosa: cell growth and properties of the oxidation system. J Bacteriol. Sep;155(3):956-65.

123. Van der Meulen HJ, Harder W, Veldkamp H (1974). Isolation and characterization of Cytophaga flevensis sp. nov., a new agarolytic flexibacterium. Ant Leeuwen 40:329-346.

124. Van de Peer Y., De Wachter R. (1994). TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. V.10. P. 569-570.

125. Van de Peer, Chapelle S, De Wachter R (1996). A quantitative map of nucleotide substitution rates in bacterial rRNA. Nucl Acids Res 24:3381-3391.

126. Vanfossen AL, Lewis DL, Nichols JD, Kelly RM. Polysaccharide degradation and synthesis by extremely thermophilic anaerobes. Ann N Y Acad Sci. 2008 Mar; 1125:322-37. Review.

127. Vieille C, Zeikus GJ.( 2001). Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol Mol Biol Rev. Mar;65(l):l-43.

128. Wallner G, Amann R, Beisker W.(1993). Optimizing fluorescent in situ hybridization with rRNA-targeted oligonucleotide probes for flow cytometric identification of microorganisms. Cytometry. 14(2): 13 6-43.

129. Ward D.M., Bateson M.M., Weller R., Ruff-Roberts A.L. (1992). Ribosomal RNA analysis of microorganisms as they occur in nature. Adv MicrobEcol 12:219-286.

130. Wang G.C.-Y., Wang Y. (1996). The frequency of chimeric molecules as a consequence of PCR co-amplification of 16S rRNA genes from different bacterial species. Microbiology 142:1107-1114.

131. Watt, R.K. and Ludden, P.W. (1998). The identification, purification, and characterization of CooJ. A nickel-binding protein that is co-regulated with the Ni-containing CO dehydrogenase from Rhodospirillum rubrum. J Biol Chem 273(16): 10019-10025.

132. Watt, R.K. and Ludden, P.W. (1999). Nickel-binding proteins. Cell Mol Life Sci 56(7—8):604-625.

133. Wiegel, J., Ljungdahl, L. G. & Rawson, J. R. (1979). Isolation from soil and properties of the extreme thermophile Clostridium thermohydrosidfuricum. J Bacteriol 139, 800-810

134. Wiegel, J., Braun, M., and Gottschalk, G .(1981 ^.Clostridium thermoautotrophicum Species Novum, a Thermophile Producing Acetate from Molecular Hydrogen and Carbon Dioxide. Curr. Microbiol., vol. 5, pp. 255-260.

135. Wiegel, J., and L. G. Ljungdahl. (1986). Genus Thermoanaerobacter, p. 1379-1383. In P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe, and J. G. Holt (ed.), Bergey's manual of systematic bacteriology, vol. 2. The Williams & Wilkins Co., Baltimore.

136. Wiegel J. (1998).Anaerobic alkalithermophiles, a novel group of extremophiles. Extremophiles. Aug;2(3):257-67.

137. Woese,C.R., Kandler,0., and Wheelis,M.L. (1990). Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria, and Eucarya. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87: 4576-4579.

138. Wolin, E. A., Wolin, M. J. & Wolfe, R. S. (1963). Formation of methane by bacterial extracts. J Biol Chem 238, 2882-2888.

139. Xue Y., Xu Y., Liu Y., Ma Y., Zhou P. (2001).Thermoanaerobacter tengcongensis sp. nov., a novel anaerobic, saccharolytic, thermophilic bacterium isolated from a hot spring in Tengcong, China // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. V. 51 № 4. P.1335-1341.

140. Zarda B, Amann R, Wallner G, Schleifer KH.(1991). Identification of single bacterial cells using digoxigenin-labelled, rRNA-targeted oligonucleotides. J Gen Microbiol. Dec;137(12):2823-30.

141. Zeikus J.G.,Hegge P.W., and Anderson M.A (1979). Thermoanaerobacter brockii gen. nov. and spec, nov., a new chemoorganotrophic, caldoactive, anaerobic bacterium //. Arch. Microbiol. V. 122. P. 41-48.

142. Zhi XY, Tang SK, Li WJ, Xu LH, Jiang CL. (2006). New genus-specific primers for the PCR identification of novel isolates of the genus Streptomonospora.FEMS Microbiol Lett. Oct;263(l):48-53.

143. Zuckerkandl E, Pauling L (1965). Molecules as documents of evolutionary history. J Theor Biol 8:357-366.y>