Некультивируемые формы бактерий: выявление и изучение экспрессии генов с помощью количественного варианта полимеразной цепной реакции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Аляпкина, Юлия Сергеевна

• Аляпкина, Юлия Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Аляпкина, Юлия Сергеевна

Содержание.

Введение.

Обзор литературы.

Глава 1. Некультивируемык формы патогенных бактерий и методы их обнаружения.

1.1. Общие сведения о некультивируемых формах бактерий.

1.2. Методы обнаружения НФ бактерий.

1.2.1. Метод прямого подсчета жизнеспособных клеток.

1.2.2. Метод прямого подсчета бактериальных клеток при использовании флуоресцентных красителей.

1.2.3. Методы, основанные на извлечении электронов из электроннотранспортной цепи жизнеспособных клеток.

1.2.4. Метод иммунофлуоресценции.

1.2.5. Метод люминометрии.

1.2.6. Метод проточной флуоресцентной цитометрии.

1.2.7. Молекулярно-генетические методы.

1.3. Генетический контроль процесса перехода бактерий в НС.

Глава 2. Полимеразная цепная реакция.

2.1. Общие сведения о полимеразной цепной реакции.

2.2. Теоретические основы количественного анализа.

2.3. Синтез модифицированных праймеров (олигонуклеотидов).

2.3.1. Общие критерии выбора праймеров.

2.3.2. Твердофазный синтез олигонуклеотидов.

2.3.3. Введение модификаций в олигонуклеотиды.

2.4. Детекция и анализ ПЦР-продуктов.

2.4.1. Методы количественного определения продуктов конкурирующей ПЦР.

2.4.2. Методы, основанные на иммобилизации ПЦР-продуктов на твердом носителе.

2.4.3. Кинетический ПЦР-анализ, основанный на использовании флуорофоров.

Собственные исследования.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1. Культивирование микроорганизмов и их идентификация.

3.1.1. Культивирование Yersinia pseudotuberculosis.

3.1.2. Культивирование Salmonella typhimurium.

3.1.3. Получение некультивируемых форм Salmonella typhimurium.

3.2. Синтез праймеров.

3.2.1. Выбор праймеров и зондов для ПЦР-анализа.

3.2.2. Синтез и очистка немодифицированных праймеров и зондов.

3.2.3. Синтез и очистка модифицированных праймеров.

3.3. Проведение ПЦР.

3.3.1. Реактивы для полимеразной цепной реакции.

3.3.1. Выделение ДНК и подготовка проб для проведения ПЦР.

3.3.2. Программы для проведения полимеразной цепной реакции.

3.4.1 вариант количественного анализа продуктов ПЦР.

3.4.1. Модификация поверхности микропланшета.

3.4.2. Иммобилизация олигонуклеотида на поверхности микропланшета.

3.4.3. Выделение амплифицированного ПЦР-фрагмента из легкоплавкой агарозы.

3.4.4. Гибридизация амплифицированного фрагмента с зондом, иммобилизованным на поверхности микропланшета.

3.4.5. Колориметрическая детекция биотина (реакция с коньюгатом).

3.4.6. Построение калибровочных прямых и оценка результатов.

3.5. II вариант количественного анализа продуктов ПЦР.

3.5.1. Реакцйя обратной транскрипции.

3.5.2. Покрытие поверхности микропланшета авидином.

3.5.3. Иммобилизация амплифицированного ПЦР-фрагмента на поверхности микропланшета.

3.6.3. Проявление и измерение флуоресцентной метки.

3.6.4. Получение калибровочных прямых и оценка результатов.

Глава 4. Результаты и обсуждение.

4.1. Структура и разработка количественных вариантов анализа продуктов ПЦР. .85 4.1.1. Введение-метки в амплифицируемый фрагмент (1 этап).

4.1.2. Специфическое связывание амплифицированного фрагмента с целью отделения его от компонентов реакционной смеси (2 этап).

4.1.3. Количественная детекция введенной метки (3 этап).

4.1.4. Сравнительная характеристика I и II вариантов количественного анализа ПЦР-продуктов.

4.2. Применение I количественного варианта анализа ПЦР-продуктов для выявления НФ патогенных бактерий.

4.2.1. Изучение динамики численности Y ersiniapseudotuberculosis в объектах внешней среды.

4.2.2. Характеристики I количественного варианта анализа ПЦР-продуктов.

4.3. Применение II варианта количественного анализа результатов ПЦР для оценки экспрессии генов Salmonella typhimurium в процессе перехода клеток в некультивируемое состояние.

4.3.1. Описание модели при изучении процесса перехода клеток Salmonella typhimurium в некультивируемое состояние.

4.3.2. Разработка методического подхода к изучению экспрессии генов в НФ бактерий.

4.3.3. Экспрессия генов в процессе перехода и пребывания Salmonella typhimurium в НС.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Некультивируемые формы бактерий: выявление и изучение экспрессии генов с помощью количественного варианта полимеразной цепной реакции»

В настоящее время хорошо известно, что в ответ на стрессовые условия окружающей среды бактерии способны переходить в состояние покоя, или так называемое "некультивируемое состояние" (НС), характеризующееся резко сниженной метаболической активностью и временной потерей способности к размножению. Феномен существования жизнеспособных бактерий в НС имеет серьезное значение в инфекционной патологии людей и животных, так как установлено, что некультивируемые формы (НФ) патогенных бактерий сохраняют свои вирулентные свойства. Эндемичность многих природноочаговых сапронозных инфекций и сохранение их возбудителей в межэпидемические периоды могут быть связаны со способностью этих возбудителей образовывать НФ. Процесс развития и совершенствования методологии выявления НФ бактерий тесно взаимосвязан с процессом познания и изучения свойств НФ бактерий, механизмов перехода бактерий в НС и их рекультивации, роли НФ в инфекционной патологии людей и животных. Он обусловлен:

• невозможностью индикации возбудителей в НФ бактериологическими методами;

• пониманием недостаточности микробиологических методов, как стандартных методов оценки биологической безопасности природных экосистем, исследователями и службами практического здравоохранения и чрезвычайных ситуаций;

• постоянно растущим количеством данных о бактериях, обладающих способностью переходить в НС.

Среди всех методов выявления НФ бактерий, разработанных к настоящему времени, особо выделяется группа молекулярно-генетических методов, обладающих высокой чувствительностью, специфичностью и универсальностью. Молекулярно-генетический метод на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в настоящее время является наиболее адекватным для обнаружения НФ бактерий в объектах окружающей среды. Возможность совершенствования и развития различных модификаций ПЦР позволяет решать большой спектр научных и прикладных задач, связанных с НФ бактерий. "Классический" вариант ПЦР подразумевает качественный ответ на вопрос о наличии в исследуемом образце ДНК выявляемого микроорганизма. Это существенно ограничивает его использование. Создание количественного варианта ПЦР позволило бы значительно расширить возможности исследования абиотических факторов, приводящих к образованию НФ, молекулярно-генетических основ этого процесса, а также решения ряда научно-прикладных задач, например, при проведении микробиологического мониторинга за возбудителями в окружающей среде и при лечении инфекционных заболеваний человека. Поэтому задача разработки молекулярно-генетических методов, обладающих всеми достоинствами ПЦР (чувствительностью, специфичностью и универсальностью) и сочетающих в себе количественный анализ, особенно актуальный при детекции НФ бактерий в окружающей среде и контроле возбудителя при лечении инфекционных заболеваний, является актуальной.

Цель работы заключается в разработке количественной методики оценки результатов полимеразной цепной реакции при выявлении некультивируемых форм патогенных бактерий и изучении экспрессии генов в процессе перехода и длительного существования бактерий в некультивируемом состоянии.

Задачи исследования

1. Отработать методы автоматического синтеза "активированных" олигонуклеотидов, содержащих на 5'-конце реакционноспособные аминогруппы для присоединения нерадиоактивных молекулярных меток.

2. Отработать методы введения меток в амплифицированный фрагмент ДНК как с целью его идентификации, так и с целью выделения из реакционной смеси.

3. Отработать условия количественного выявления иерсиний и сальмонелл в препаратах очищенных ДНК и лизатах чистых культур этих микроорганизмов.

4. С помощью разработанного метода провести модельные эксперименты по наблюдению за состоянием популяций микроорганизмов в процессе длительного культивирования в различных стрессовых для клеток условиях.

5. Разработать методический подход к количественному определению активности генов в процессе перехода и длительного существования бактерий в НС.

Научная новизна:

• С помощью разработанного метода количественной оценки результатов ОТ-ПЦР впервые показана дифференцированная экспрессия генов в клетках Salmonella typhimurium, находящихся в НС. В НФ бактерий экспрессируются гены, продукты которых необходимы для сохранения жизнеспособности.

• Впервые предложен методический подход на основе последовательных реакций обратной транскрипции и разработанного количественного варианта ПЦР для выявления и доказательства жизнеспособности бактерий в НС. Метод исключает возможность индикации нежизнеспособных, мертвых клеток, содержащих неразрушенный генетический материал, так как маркером присутствия и жизнеспособности бактерий в этом случае является короткоживущая специфическая молекула мРНК заведомо экспрессирующегося в НФ и известного исследователю гена. На модельном эксперименте с Salmonella typhimurium показано, что указанный метод можно рекомендовать для выявления жизнеспособных НФ различных бактерий в окружающей среде.

Практическая значимость:

Разработаны два варианта количественной анализа результатов полимеразной цепной реакции, основанные на иммобилизации ПЦР-продуктов на твердом носителе с последующим количественным определением иммобилизованного материала и включающие следующие этапы: 1) введение молекулярной метки в амплифицированный фрагмент; 2) специфическое связывание амплифицированного фрагмента с целью отделения его от компонентов реакционной смеси; 3) количественную детекцию метки. Методы характеризуются разным решением этапов анализа и могут быть использованы для выявления бактерий в образцах различной природы, в том числе и в клинической диагностике. В данной работе методы применены для выявления НФ и количественной оценки числа бактерий Yersinia pseudotuberculosis и Salmonella typhimurium в субстратах внешней среды. В сочетании с бактериологическим методом они позволяют дифференцировать НФ возбудителей и количественно оценивать их концентрацию в почвах и водоемах.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, результаты исследований были отмечены на конкурсе молодых ученых НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН. Работа доложена на: VI конференции Российской Федерации «Новые направления биотехнологии» (г.Пущино, 1994 г.), научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (симпозиум «Современные лабораторно-диагностические 9 возможности в клинической инфнектологии") (Москва, 2000 г.), 9 Международном симпозиуме по Микробной Экологии (Амстердам, 2001 г.), X Интернациональном Конгрессе по Бактериологии и Прикладной Микробиологии (Париж, 2002 г.), научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (секция "Применение молекулярных методов в клинико-эпидемиологических исследованиях") (Москва, 2002 г.).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ФОРМЫ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ И МЕТОДЫ ИХ ОБНАРУЖЕНИЯ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Аляпкина, Юлия Сергеевна

1. Разработаны два варианта количественного анализа результатов полимеразной цепной реакции, основанные на иммобилизации ПЦР-продуктов на твердом носителе с последующим количественным определением иммобилизованного материала, которые могут быть использованы для идентификации бактерий в образцах любой природы.2. Методы включают следующие этапы: 1) введение молекулярной метки в амплифицированный фрагмент; 2) специфическое связывание амплифицированного фрагмента с целью отделения его от компонентов реакционной смеси; 3) количественную детекцию метки; и характеризуются разным решением стадий анализа. К преимуществам первого метода относится дополнительный контроль специфичности за счет гибридизации со специфическим зондом, к преимуществам второго метода относятся повышение чувствительности за счет прямой детекции флуоресцентной метки и упрощенная процедура стандартизации анализа.3. С помощью разработанных методов на моделях Yersinia pseudotuberculosis и Salmonella typhimurium количественно оценена динамика перехода патогенных бактерий в некультивируемое состояние в условиях, моделирующих природные, и количественно выявлены Yersinia pseudotuberculosis в субстратах внешней среды.4. Разработан и осуществлен химический синтез аминолинкера фосфорамидита, способного включаться в состав олигонуклеотида по 5'-концу. Отработан метод эффективного введения аминолинкера в олигонуьслеотид на последней стадии твердофазного автоматического синтеза.5. Оптимизированы способы синтеза модифицированных праймеров, позволяющие получать амплифицированный фрагмент ДНК с различными нерадиоактивными молекулярными метками на противоположных концах. Введенные молекулы маркеры служат одновременно для идентификации фрагмента ПЦР и для выделения его из реакционной смеси.6. С помощью разработанного метода количественного анализа, включающего последовательные реакции обратной транскрипции и количественной полимеразной цепной реакции, впервые показана дифференцированная экспрессия генов в процессе перехода и длительного существования бактерий в некультивируемом состоянии.7. Показана активность гена pqi, кодирующего трансмембранный белок, в некультивируемых формах бактерий, что свидетельствует о необходимости продуктов некоторых генов для поддержания жизнеспособности бактерий в некультивируемом состоянии. На примере гена stn, кодирующего сальмонеллезный токсин, показано, что экспрессия генов патогенности может быть подавлена в некультивируемых формах бактерий.8. На модели Salmonella typhimurium показано, что метод ОТ-ПЦР с количественной оценкой продуктов амплификации можно использовать для выявления жизнеспособных некультивируемых форм различных бактерий в окружающей среде.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Аляпкина, Юлия Сергеевна, 2003 год

1. Аксенов М.Ю., Гинцбург A.J1.// Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции. // Молекул. Генетика - 1993. - №4. - С.3-8.

2. Аксенов М.Ю., Гаровникова Ю.С., Левина Г.А. и др. Использование полимеразной цепной реакции для изучения перехода клеток Salmonella typhimurium в некультивируемое состояние // Молекул. Генетика, 1994.-№2.- С. 17-21.

3. Аксенов М.Ю., Мисуренко Е.Н., Шустрова Н.М. и др. Выявление и изучение динамики численности некультивируемых форм Yersinia pseudotuberculosis во внешней среде при использовании полимеразной цепной реакции // ЖМЭИ. 1995. - № 2. - С. 80-84.

4. Белохвостов А.С. Полимеразная цепная реакция и лигазные реакции, принципы, традиционные методики и нововведения // Молекул. Генетика 1995. - № 2. - с. 21-26.

5. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Ковалев Ю.Н., Аляпкина Ю.С., Чегаева Е.В. Механизм действия и природа факторов, индуцирующих образование некультивируемых форм у Salmonella typhimurium П ЖМЭИ 1999. - № 6. - С. 3-8.

6. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. - с. 94-104.

7. Дебабов В.Г. Жизнь бактерий за стенами лаборатории // Молекулярная биология 1999. - том 33, № 6. - с. 1074-1084.

8. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан ПИ. Образование покоящихсяформ Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология 2000. - Том 69. - С. 383-388.

9. Литвин В.Ю., Гинцбург А. Л., Пушкарева В.И. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М., 1998.

10. Максименкова И.А. Популяционная динамика псевдотуберкулезного микроба в почве // Аторев. дисс. канд. биол. наук. -М., 1987.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984.

12. Милич М.В. Эволюция сифилиса. М.: Медицина, 1987. - 259 с.

13. Романова Л.В., Мишанькин Б.Н., Пичурина Н.Л. и др.Некультивируемые формы Fransicella tularensis II Журнал микробиол. — 2000а.-№ 2. С. 11-15.

14. Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Есть ли сходство в механизмах образования "некультивируемых форм" у грамотрицательных бактерий и спор у бацилл? // Молекул. Генетика 1993. - № 6. - С. 34-37.

15. Романова Ю.М., Терехов А. А., Гинцбург A.JI. Выделение и характеристика мутантов Salmonella typhimurium с нарушенным процессом образования некультивируемых форм // Генетика 1995. Том 31, №8.-С. 1073-1078.

16. Романова Ю.М., Кириллов М.Ю., Терехов А.А., Гинцбург A.J1. Идентификация генов, контролирующих переход бактерий Salmonella typhimurium в некультивируемое состояние // Генетика 1996. - Том 32, №9.-С. 1184-1190.

17. Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Гинцбург A.JI. Некультивируемое состояние у патогенных бактерий на модели Salmonella typhimurium: феномен и генетический контроль // Журнал микробиол. 1997. - № 4. -С. 35-41.

18. Романова Ю.М., Гинцбург A.J1. Цитокины возможные активаторы роста патогенных бактерий // Вестник РАМН - 20006. - № 6. - С. 13-17.

19. Саики Р., Гилинстен У., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция // Анализ генома. Методы. -М.: Мир, 1990. с. 176-190.

20. Сучков Ю.Г., Худяков И.В., Емельяненко Е.Н. и др. О возможности сохранения возбудителя чумы в почве в покоящейся (некультивируемой) форме // ЖМЭИ 1997. - № 4. - с. 42-46.

21. Четина Е.В., Гинцбург А.Л. и др. Исследование эпидемической значимости некультивируемых форм холерных вибрионов методомполимеразной цепной реакции // ЖМЭИ 1992. - № 3. - с. 21 -24.

22. Шубин Ф.Н., Гинцбург А.Л., Китаев В.М. и др. // Мол. генетика. 1989. - № 6. - С. 20-25.

23. Agrawal S., Christodoulou С., Gait M.J. Efficient methods for attaching nonradioactive labels to the 5' ends of synthetic oligodeoxyribonucleotides // Nucleic Acids Res. 1986.- Y. 14, No. 15. - P. 6227-6244.

24. Alvarez A.J., Buttner M.P. et al. Use of solid-phase PCR for enhanced detection of airborne microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. 1994. -V. 60, No. 1.-P. 374-376.

25. Alves A.M., Holland D., Edge M.D. A chemical method of labelling oligodeoxyribonucleotides with biotin: a single step procedure using a solid phase methology // Tetrahedron Letters 1989. - V. 30. - P. 3089-3092.

26. Ansorge W., Sproat B.S., Stegemann J., Schwager C. A non-radioactive automated method for DNA sequnce determination // J. Biochem. Biophys. Methods- 1986.-Y. 13.-P. 315-323.

27. Balaguer P., Terouanne В., Boussioux A-M., Nicolas J-C. Quantification of DNA sequences obtained by polymerase chain reaction using a bioluminescent adsorbent // Analytical biochemistry 1991. - V. 195. - P. 105-110.

28. Barcina J., Gonzales J.M., Iriberri J. et al. Survival strategy of Escherichia coli and Enterococcus fecalis in illuminated fresh and marine systems // J. Appl. Bacteriol. 1990. -V. 68. - P. 189-198.

29. Bej A.K., Mahbubani M.H., Atlas R.M. Detection of viable Legionella pneumophila in water by polymerase chain reaction and gene probe methods // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57, No. 2. - P. 597-600.

30. Bej A.K., Ng W.Y., Morgan S., Jones D, Mahbubani M.H. Detection of viable Vibrio cholerae by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) // Mol. Biotechnol. 1996. - Y. 5. - P. 1-10.

31. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping // -Analytical biochemistry 1999. - V. 273. - P. 221-228.

32. Berndt C., Bebenroth M., Oehlschlegel K., Hiepe F., Schobler W. Quantitative polymerase chain reaction using a DNA hybridization assay based on surface-activated microplates // Analytical biochemistry 1995. - Y. 225. - P. 252-257.

33. Brauns I.A., Hudson M.C., Oliver J.D. Use of polymerase chain reaction in detection of culturable and nonculturable Vibrio vulnificus cells // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V. 57. - P. 2651-2655.

34. Brayton P.R., Tamplin M.L., Huq A. et al. Enumeration of Vibrio cholerae 01 in Bangladesh waters by fluorescent antibody direct viable count // Appll. Environ. Microbiol. - 1987. - V. 53, No. 12. - P. 2862-2865.

35. Bunthof C.J., Bloemen K., Breeuwer P., Rombouts F.M., Abee T. Flow cytometric assessment of viability of lactic acid bacteria // Appll. Environ. Microbiol. 2001. - V. 67, No. 5. - P. 2326-2335.

36. Byrd J.J., Xu H-S., Colwell R.R. Viable but nonculturable bacteria in drinking water. // Appll. Environ. Microbiol. 1991. - V.57. - P.875-878.

37. Cappelier J.M., Magras C., Jouve J.L., Federighi M. Recovery of viable but non-culturable Campylobacter jejuni cells in two animal models // Food Microbiol. 1999a. - V. 16. - P. 375-383.

38. Caro A., Got P., Lesne J., Binard S., Baleux B. Viability and virulence of experimentally stressed nonculturable Salmonella typhimurium II Appl. Environ. Mirobiol. 1999. - V. 65, No. 7. - P. 3229-3232.

39. Catenrich C.E., Makin K.M. Characterization of the morphologic conversion of Helicobacter pylori from bacillari to coccoid forms // Scand. J. Gastroenterol. 1991. - V. 26. - P. 58-64.

40. Chelly J., Kaplan J.C., Maire P., Gautron S., Kahn A. Transcription of the dystrophin gene in human muscle and non-muscle tissues // Nature — 1988. -V. 333.-P. 858-860.

41. Chien A., Edgar D.B., Trela J.M. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus II J. Bacteriology 1976. - V. 127, No. 3.-P. 1550- 1557.

42. Cho J.C., Kim S.L. Green fluorescens protein-based direct viable count to verify a viable but non-culturable state of Salmonella typhi in environmental samples // J. Microbiol. Methods 1999. - V. 63, No. 3. - P. 227-235.

43. Choi Y., Kotzin В., Herron L., Callahan J. et al. Interaction of Staphylococcus aureus toxin "super antigens" with human T cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. - V. 86. - P. 8941-8945.

44. Chopra A., Houston C., Peterson G. et al. Cloning and expression of the Salmonella enterotoxin gene // J. Bacteriology 1987. - V. 169. - P. 50955100.

45. Coallier J., Prevots M., Rompre A. The optimization and application of two direct viable count methods for bacteria in distributed drinking water // Can. J. Microbiol. 1994. - V. 40. - P. 830-836.

46. Colwell R.R., Brayton P.R., Grimes D.J. et al. Viable but nonculturable Vibrio cholerae and related pathogens in the environment: implication for the release of genetically engineered microorganisms // BioTechnology 1985. -V. 3.-P. 817-820.

47. Colwell R.R., Brayton P.R., Herrington D. et al. Viable but non-culturable Vibrio cholerae revert to a culturable state in the human intestine I I World J. Microbiol. Biotechnol. 1996. - V. 12. - P. 28-31.

48. Connell C., Fung S. et al. Automated DNA sequence analysis // BioTechniques 1987. - V. 5. - P. 342-348.

49. Connoly B.A.// Ibid. 1987.- V. 15. - P. 3131-3139.

50. Cornelis G., Boland A., Boyd A. et al. The virulence plasmid of Yersinia, an antihost genome // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62, No. 4. - P. 1315-1352.

51. Costa K., Bacher G., Allmaier G. et al. The morphological transition of Helicobacter pylori cells from spiral to coccoid is preceded by a substantial modification of the cell wall // J. Bacteriology 1999. - V. 181. - P. 37103715.

52. Coull J.M., Weith H.L., Bischoff R. A novel method for the introduction of an aliphatic primary amino group at the 5'terminus of synthetic oligonucleotides // Tetrahedron Letters 1986. - V. 27, No. 34. - P. 39913994.

53. Daley R.J., Hobbie J.E. Direct counts of aquatic bacteria by modified epi-fluorescent technique // Limnol. Oceanogr. 1975. - V. 20. - P. 875-882.

54. Desmonts C., Minet J., Colwell R., Cormier M. Fluorescent-antibody method useful for detecting viable but nonculturable Salmonella spp. In chlorinated wastewater // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56, No. 5.P. 1448-1452.

55. Diaper J.P., Edwards C. Survival of Staphylococcus aureus in lakewater monitored by flow cytometry // Microbiology 1994. -V. 140(Pt.l).-P. 35-42.

56. Diviacco S., P. Norio, L. Zentilin, S. Menzo, M. Clementi et al A novel procedure for quantitative polimerase chain reaction by coamplification of competitive templates // Gene. 1992. - V. 122. P. 313-320.

57. Donelli G., Matarrese P., Fiorentini C. et al. The effect of oxygen on the growth and cell morphology of Helicobacter pylori // FEMS Microbiol. Lett. 1998.-Y. 168.-P. 9-15.

58. Duncan S., Glover L.A., Killham H. et al. Luminescence-based detection of activity of starved and viable but nonculturable bacteria // Appl. Environm. Microbiol. 1994. - Y. 60, No. 4. - P. 1308-1316.

59. Eren J., Pramer D. Application of immunofluorescent staining to studies of the ecology of soil microorganisms // Soil Sci. 1966. - V. 101. - P. 39-45.

60. Farr S.B., Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium II Microbiol. Rev. 1991. - Y. 55. - P. 561-585.

61. Finlay B.B., Falkow S. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. - V. 61. - P. 136-169.

62. Fliermans C.B., Schneider C., Schmidt E.L. Direct measurement of bacterial stratificacion in Minnesota lakes // Arch. Hydrobiol. 1975. - V. 76. - P. 248255.

63. Francois J.C., Saison-Behmoaras Т., Chassignol M. et al. Sequence-targetedcleavage of single- and double-stranded DNA by oligothymidylates covalently linked to 1,10-phenanthroline // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. -P. 5891-5898.

64. Fransisco D.E., Mah R.A., Rabin A.C. Acridine orange epifluorescent technique for counting bacteria in natural waters // J. Trans. Am. Microsc. Soc. 1973. - V. 92. - P. 416-421.

65. Gilliland G., Perrin S., Blanchard K., Bunn H. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990. - V. 87. - P. 2725-2729.

66. Goelz S.E., Hamilton S.r., Volgenstein B. Purification of DNA from formaldehyd fixed and paraffin embedded human tissue // BBRC 1985. - V. 130, No. l.-P. 118-126.

67. Goodchild J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties // Bioconjugate Chemistry 1990. -V. 1, No. 3.-P. 165-187.

68. Hahn M., Dorsam V., Friedhoff P., Fritz A., Pingoud A. Quantitative polymerase chain reaction with enzyme-linked immunosorbent assay detection of selectively digested amplified sample and control DNA // Anal, biochemistry 1995. - V. 229. - P. 236-248.

69. Heid C.A. Real-time quantitative PCR // Genome Res. 1996. - V. 6. - P. 986-994.

70. Hengge-Aronis R. Survival of hunger and stress: the role of rpoS in stationary phase gene regulation in Escherichia coli II Cell 1993. - V. 72. -P.165-168.

71. Hill I., Gray T. Application of fluorescent antibody technique to an ecological study of bacteria in soil // J. Bacteriology 1967. - V. 93. - P.1888-1896.

72. Hobbie J.E., Daley R.J., Jasper S. Use of nucleopore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy // Appl. Environ. Microbiol. 1977. - V. 33,No. 5.-P. 1225-1228.

73. Hoff K.A. Survival of Vibrio anguillarum and Vibrio salmonicida at different salinities // Appl. Environm. Microbiol. 1989. - V. 55. - P. 1775-1786.

74. Holland P., Abramson R., Watson R., Gelfand D. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing th 5 '-3' exonuclease activity of Thermus aquaticus II Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. - V. 88. - P. 7276-7280.

75. Holodniy M., Winters M.A., Merigan T.C. Detection and quantification of gene amplification products by a nonisotopic automated system // BioTechniques 1992. - V. 12., No. 1. - P. 37-39.

76. Huq A., Col well R.R., Rahman R., AH A. et al. Detection of Vibrio cholerae 01 in the aquatic environment by fluorescent-monoclonal antibody and culture methods // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56, No. 8. - P. 2370-2373.

77. Inouye S., Hondo R. Microplate hybridization of amplified viral DNA segment// J. Clin. Microb. 1990. -V. 28, No. 6. - P. 1469-1472.

78. Islam M.S., Rahim Z., Alam M.J. et al. Association of Vibrio cholerae 01 with the cyanobacterium, Anabaena sp., elucidated by polymerase chain reaction and transmission electron microscopy // Trans. R. Trop. Med. Hyd. -1999.-V. 93, No. l.-P. 36-40.

79. Ivinson A.J., Taylor G.R. PCR in genetic diagnosis // PCR. A Practical approach (ed. M.J. Mc Pherson), Oxford University Press, Oxford-N.Y.Tokyo. 1991. - P. 15-27.

80. Jalava Т., Lehtovaara P., Kallio A., Ranki M., Soderhmd H. Quantification of Hepatitis В virus DNA by competitive amplification and hybridization on microplates//BioTechniques- 1993.-V. 15,No. l.-P. 134-139.

81. Jarvi K., Lacroix J.M. et al. Polymerase chain reaction-based detection of bacteria in semen // Fertil. Steril. 1996. - V. 66, No. 3. - P. 463-467.

82. Jones J.G., Simon B.M. An investigation of errors in direct counts of aquatic bacteria by epi-fluorescence microscopy, with reference to a new method for dyeing membrane filters // J. Appl. Bacterid. Baltimore 1984. - V. 1.

83. Jones D., Sutcliffe E., Curry A. Recovery of viable but non-culturableCampylobacter jejuni II J. Gen. Microbiol. 1991. - V. 137, No. 10. - P. 2477-2482.

84. Joux F., Le Baron P. Ecological implications of an improved direct viable count method for aquatic bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63, No. 9. - P. 3643-3647.

85. Katz E.D., Joseph L., Picozza E., Anderson M.S. general aspects of PCR quantitation // Amplifications (Perkin-Elmer) 1993. - 10. - P. 7-8.

86. Keller G.H., Huang D-P., Shih J.W., Manak M.M. Detection of Hepatitis В virus DNA in serum by polymerase chain reaction amplification and microtiter sandwich hybridization // J. Clin. Microbiol. 1990. - V. 28, No. 6.-P. 1411-1416.

87. Kemp D., Smith D., Foote S., Samaras N., Peterson G. Colorimetric detection of specific DNA segments amplified by PCR // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989. -V. 86. P. 2423-2427.

88. Khorana H. G. Total synthesis of a gene // Science 1979. - V. 203. - P. 614-625.

89. Klein P.G., Juneja V.K. Sensitve detection of viable Listeria monocytogenes by reverse transcription-PCR // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63. -P. 4441-4448.

90. Kogure K., Simidu U., Taga N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria // Can. J. Microbiol. 1979. - V. 25. - P. 415420.

91. Kogure K., Simidu U., Taga N. An improved direct viable count method for aquatic bacteria // Arch. Hydrobiol. 1984. - V. 102. - P. 117-122.

92. Kohler Th. General aspects and chances of nucleic acid quantitation byPCR // Quantitation of mRNA by polymerase chain reaction: nonradioactive PCR methods. Berlin, 1995. - P.3-14.

93. Kon Y.S., Roe J.J. Isolation of a Novel Paraquat-Inducible (pqi) Gene Regulates by the soxRS Locus in Escherichia coli // J. Bacteriol. 1995. - V. 177.-№ 10.-P. 2673-2678.

94. Landgraf A., Reckmann В., Pingoud A. Quantitative analysis of polymerase chain reaction (PCR) products using primers labeled with biotin and a fluorescent dye // Analytical biochemistry 1991. - V. 193. - P. 231235.

95. Leser T.D. Quantification of Pseudomonas sp. Strain B13 (FR1) in a marine environment by competitive polymerase chane reaction // J. Microbiol. Methods 19956. -V. 22. - P. 249-262.

96. Li P., Medon P.P., Skingle D.C. et al. Enzyme-linked synthetic oligonucleotide probes: non-radioactive detection of enterotoxigenic Escherichia coli in faecal specimens // Nucleic Acids Res. 1987. — V. 15. -P. 5275-5287.

97. Linder K., Oliver J.D. Membrane fatty acid and virulence changes in the viable but nonculturable state of Vibrio vulnificus I I Appl.Environ. Microbiol. 1989. - V. 55. - P.2837-2842.

98. Lleo M.M., Tafi M.C., Signoretto C., Dal Сего C., Canepari P. Competitive polymerase chain reaction for quntification of nonculturableEnterococcus faecalis cells in lake water // FEMS Microbiol. 1999. - V. 30, No. 4. - P. 345-353.

99. Lomel H., Tyagi S., Pritchard C.G., Lizardi P.M, Kramer F.R. Quantitative assays based on the use of replicatable hybridization probes // Clin. Chem. 1989. - V. 35,No. 9.-P. 1826-1831.

100. Lowe Т., Sharefkin J., Yang S.Q., Dieffenbach C.W. A computer program for selection of oligonucleotide primers for polymerase chain reactions II Nucleic Acids Res.-1989.-V. 18, No. 7.-P. 1757-1761.

101. MacKay I.M., Arden K.E., Nitsche A. Real-time PCR in virology // Nucleic Acids Res. 2002. - V. 30, No. 6. - P. 1292-1305.

102. Manahan S.N., Steck T.R. The viable but nonculturable stste in Agrobacterium tumefaciens and Rhizobium meliloti. // FEMS Microb. Ecol. 1997. - V. 22. - P. 29-38.

103. Martin P., MacLeod R. Observations on the distinction between oligotrophic and eutrophic marine bacteria // Appl. Environ. Microbiol. -1984.-V. 47.-P. 1777-1782.

104. McKay A.M. Viable but non-culturable forms of potentially pathogenic bacteria in water // Lett. Appl. Microbiol. 1992. - V. 14. - P. 129-135.

105. Medema G.J., Schets F.M., Van de Giessen A.W., Havelaar A. Lack of colonization of one day old chicks by viable, non-culturable Campylobacter jejuni // J. Appl. Bacteriol. 1992. - V. 72. - P. 512-516.

106. Misiura K., Durrant I., Evans M.R., Gait M.J. Biotinyl and phosphotyrosinyl phosphoramidite derivatives useful in the incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides // Nucleic Acids Res. 1990.-V. 18, No. 15.-P. 4345-4354.

107. Moller A., Jansson J.K. Quantification of Genetically Tagged Cyanobacteria in Baltic Sea Sediment by Competitive PCR // BioTechniques. -1997.-V. 22.-P. 512-518.

108. Morgan J.A., Winstanley C., Pickup R.W. et al. Direct phenotypic and genotyping detection of a recombinant pseudomonad population released into lake water // Appl. Environ. Microbiol. 1989. - V. 55. - P. 3537-2544.

109. Morgan J.A., Rhodes G., Pickup R.W. Survival of nonculturable Aeromonas salmonicida in lake water // Appl. Environ. Microbiol. -1993. -No. 3.-P. 874-880.

110. Mori K., Subasinghe C., Cohen J.S. Oligodeoxynucleotide analogs with 5'-linked anthraquinone // FEBS Letters 1989. - V. 249. - P. 213-218.

111. Muller S., Losche A., Bley Т., Scheper T. A flow cytometric approach for characterization and differentiation of bacteria during microbial processes // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 43. - P. 93-101.

112. Mullis K.B., Paloona E.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction // Med. Enzymol. 1987. - V. 155. - P. 335-350.

113. Nebe-von-Caron G., Stephens P.J., Hewitt C.J. et al. Analysis of bacterial function by multi-color fluorescence flow cytometry and single cell sorting // J. Microbiol. Methods 2000. - Y. 42. - P. 97-114.

114. Nelson P.S., Sherman-Gold R., Leon R. A new and versatile reagent for incorporating multiple primary aliphatic amines into synthetic oligonucleotides //Nucleic Acids Res. 1989. - V. 17. - P. 7179-7186.

115. Nielson J., Dahe O. // Nucleic Acids Res. 1987. - V. 15, No. 8. - P. 3626.

116. Nilsson L., Oliver J., Kjelleberg S. Resusciation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state // J. Bacteriology 1991. - V. 173, No. 16. -P. 5054-5059.

117. Nogva H.K., Bergh A., Hoick A., Rudi K. Application of the 5'-nuclease PCR assay in evaluation and development of methods for quantitative detection of Campylobacter jejuni II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66, No. 9. - P. 4029-4036.

118. Oliver J.D., Bockian R. In vivo resuscitation and virulence towards mice of viable but nonculturable cells of Vibrio vulnificus И Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 2620-2623.

119. Olson J.D., Panfili P.R., Zuk R.F., Sheldon E.L. Quantitation of DNA hybridization in a silicon sensor-based system: application to PCR // Molec. Cell. Prob. 1991. - V. 5. - P. 351-358.

120. Perkins S.E., Yan L.L. et al. Use of PCR and culture to detectHelicobacter pylori in naturally infected cats following triple antimicrobial therapy // Antimicrob. Agents Chemother. 1996. - V. 40, No. 6. - P. 14861490.

121. Pon R.T. A long chain biotin phosphoramidite reagent for the automated synthesis of 5'-biotinylated oligonucleotides // Tetrahedron Letters 1991. -V. 32, No. 14.-P. 1715-1718.

122. Patrone G., Puppo F. et al. Nuclear run-on assay using biotin labeling magnetic bead capture and analysis by fluorescence-based RT-PCR // BioTechniques. 2000. -V. 29. - P. 1012-1017.

123. Privitera O., Sisto F., Giuffrida V. et al. Reverse transcription polymerase chain reaction method for the detection of glycopeptide resistance in enterococci // J. Microbiol. Methods 1999. - V. 35, No. 2. - P. 95-100.

124. Rodriguez G.G., Phipps D., Ishiguro K., Ridgway H.F. Use of a fluorescent redox probe for direct visualization of actively respiring bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V. 58, No. 6. - P. 1801-1808.

125. Rollins D.M., Colwell R.R. Viable but nonculturable stage of Campillobacter jejuni and its role in survival in the natural aquatic environment // Appl.Environ.Microbiol. 1986. - V.52. - P. 531-538.

126. Roszak D.B., Grimes D.J., Colwell RR. Viable but nonrecoverable stage of Salmonella enteritidis in aquatic systems // Can. J. Microbiol., 1984.- V. 30.- P. 334-338.

127. Roszak D.B., Colwell R.R. Survival strategy of bacteria in the natural environment // Microbiol. Reviews 1987a - V. 51, No. 3. - P. 365-379.

128. Roszak D.B., Colwell R.R. Metabolic activity of bacterial cells enumerated by direct viable count // Appl. Environ. Microbiol. 19876. - V. 53. - P. 2889-2893.

129. Saha S.K., Saha S., Sanyal S.C. Recovery of injured Campylobacter jejuni cells after animal passage // Appl. Environ Microbiol. -1991. V. 57, No. 11.-P. 3388-3389.

130. Saiki R.K., Gelfand D.R., Stoffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase // Science -1988. V. 239, No. 4839. - P. 487-491.

131. Servis N.A., Nichols S., Adams J.C. Development of a direct viable count procedure for some gram-positive bacteria // Lett. Appl. Microbiol. 1995. -V. 20, No. 4. - P. 237-239.

132. Shahamat M., Mai U., Paszko-Kolva C. et al. use of autoradiography to assess viability of helicobacter pylori in water // Appl. Environ Microbiol. -1993.-V. 59.-P. 1231-1235.

133. Siebert P.D., Larrick J.W. Competitive PCR // Nature 1992. - V. 359. -P. 557-558.

134. Signoretto C., Lleo M.M., Tafi M.C., Canepari P. Cell wall chemical composition of Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state 11 Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66, No. 5. - P. 1953-1959.

135. Sinha N.D., Cook R.M. The preparation and application of functionalized synthetic oligonucleotides: III. Use of H-phosphonate derivatives of protected amino-hexanol and mercapto-propanol or hexanol // Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16. - P. 2659-2669.

136. Skurnik M., Wolt-Watz H. Analysis of the yopA gene encoding the Yopl virulence determinants of Yersinia spp. // Mol. Microbiol. 1989. - V. 3 - P. 517-529.

137. Soumet C., Ermel G., Boutin P., Boscher E., Colin P. Chemiluminescent and colorimetric enzymatic assays for the detection of PCR-amplified Salmonella sp. products in microplates // BioTechniques 1995. - V. 19. - P. 792-796.

138. Sproat B.S., Beijer В., Rider P., Neuner P. The synthesis of protected 5'-mercapto-2',5'-dideoxyribonucleoside-3'-0-phosphoramidates; uses of 5'-mercaptooligodeoxyribonucleotides // Nucleic Acids Res. 1987a. - V. 15. -P. 4837-4848.

139. Sproat B.S., Beijer В., Rider P. The synthesis of protected 5'-amino-2',5'-dideoxyribonucleoside-3'-phosphoramidites; applications of 5'-amino-oligodeoxyribonucleotides //Nucleic Acids Res. 19876. - V. 15.-P. 61816196.

140. Stein C.A., Mori K., Loke S.L. et al. Phosphorothiate and normal oligodeoxyribonucleotides with 5'-linked acridine: characterization and preliminary kinetics of cellular uptake // Gene 1988. — V. 72. - P. 333-341.

141. Stern N.J., Jones D.M., Wesley I.V., Rollins D.M. Colonization of chicks by non-culturable Campylobacter spp.// Lett. Appl. Microbiol. 1994. - V. 18.-P. 333-336.

142. Syvanen A.C., Bengtstrom M., Tenhunen J., Soderlund H. Quantification of polymerase chain reaction products by affinity-based hybrid collection // Nucleic Acids Res. 1988. - V. 16, No. 23. - P. 11327-11338.

143. Tabor P.S., Neihof R.A. Direct determination of activities for microorganisms of Chesapeake Bay populations // Appl. Environ. Microbiol. 1984.-V. 48.-P. 1012-1019.

144. Theoretical and practical aspects of PCR // In: Quantitative RT-PCR. Methods and applications. Book 3. CLONTECH Laboratories, Inc. 1993. -P.5-11.

145. Thomson C.M., Chanter N., Watness C.M. Survival of toxigenic Pasteurella multocida in aerosols and aqueous liquids. // Appl. Environ. Microbiol. 1992. -V. 58. - P. 932-936.

146. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization // Nat. Biotechnol. 1996. - № 14. - P. 303-308.

147. Van de Giessen A.W., Heuvelman С J., Abee A., Hazeleger W.C. Experimental stydies on the infectivity of non culturable forms of Campylobacter spp. in chicks and mice // Epidemiol. Infect. 1996. - V. 117. - P. 463-470.

148. Van Overbeek L.S., Eberl L., Givskov M. et al. Survival of and induced stress resistance in carbon-starved pseudomonas fluorescens cells residing in soil // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 4202-4208.

149. Vary C.P.H. Triple-helical capture assay for quantification of polymerase chain reaction products // Clin. Chem. 1992. - V. 38, No. 5. - P. 687-694.

150. Wages J.M., Dolenga J.L., Fowler A.K. Electrochemiluminescent detection and quantitation of PCR-amplified DNA // Amplifications 1993. -I. 10. - P. 1-9. - Perkin Elmer.

151. Wang A.M., Doyle M.V., Mark D.F. Quantitation of mRNA by polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989. - V. 86. - P.9717-9721.

152. Watson S.P., Clements M.O., Foster S.J. Characterization of the starvation-survival response of Staphylococcus aureus II J. bacterial. 1998. -V. 180.-P. 1750-1758.

153. Whitesides M.D., Oliver J.D. Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state // Appl. Environ. Microbiol. 1997. - V. 63, No. 3. - P. 1002-1005.

154. Wiesner R.J. Direct qualification of picomolar concentrations of mRNAs by mathematical analysis of a reverse transcription/exponential polymerase chain reaction assay // Nucleic Acids Res. 1992. - V. 20. - P. 5863-5864.

155. Willams J.F. II BioTechniques 1989. -V. 7. - P. 762-768.

156. Wilson M., Lindow S.E. Relationship of total viable and culturable cells in epiphytic populations of Pseudomonas seringie // Appl. Environ. Microbiol. 1992. -V. 58. - P. 3908-3913.

157. Wolf P.W., Oliver J.D. Temperature effects on the viable but nonculturable state of Vibrio vulnificus // FEMS Microbiol. Ecol. 1992. -V. 101.-P. 33-39.

158. Xu H.-Sh., Roberts N., Singleton F.L. et al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment // Microb. Ecol. 1982. - No. 8. - P. 313-323.

159. Zimmerman R., Itturiaga R., Becker-Birck J. Simultaneous determination of the total number of aquatic bacteria and the number there of involved in respiration // Appl. Environ. Microb. 1978. - V. 36, No. 12. - P. 926-935.

160. Zimmerman K., Mannhalter J.W. Technical aspects of quantitative competitive PCR // BioTechniques 1996. -V. 21. - P. 268-279.