Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат медицинских наук Тучков, Игорь Витальевич

• Тучков, Игорь Витальевич
• кандидат медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Тучков, Игорь Витальевич

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13 Современное состояние лабораторной диагностики сибирской язвы

1.1. Генетическая организация В. anthracis

1.2. Лабораторная диагностика сибирской язвы

1.2.1. Характеристика классических методов диагностики

1.2.2. Молекулярно-генетические методы в диагностике возбудителя сибирской язвы

1.2.3. Условия проведения Г1ЦР и способы подготовки проб исследуемого материала

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы

2.2. Реактивы и питательные среды

2.3. Экспериментальные животные

2.4. Культивирование микроорганизмов

2.5. Подготовка проб из биологического материала к исследованию в ПЦР 55 2.5.1 .Подготовка проб крови 55 2.5.2. Подготовка проб из органов лабораторных животных

2.5.3. Подготовка проб из объектов окружающей среды

2.6. Определение концентрации ДНК в пробах исследуемого материала

2.7. Определение размеров фрагментов ДНК

2.8. ПЦР-анализ

2.8.1. Синтез олигонуклеотидных праймеров

2.8.2. Выбор праймеров

2.8.3. Постановка полимеразной цепной реакции

2.8.4. Гель-электрофорез

Глава 3. СОЗДАНИЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПЦР ТЕСТ

СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

3.1. Конструирование и изучение штаммов сибиреязвенного микроба с различным плазмидным профилем

3.2. Выбор олигонуклеотидных праймеров и ДНК- матрицы на основе анализа генома

3.3. Разработка оптимальных условий ПЦР

3.4. Разработка способов обеззараживания материала, содержащего спорообразующую культуру В. anthracis и схемы подготовки проб для ПЦР

3.4.1. Отработка условий обеззараживания материала, содержащего возбудитель сибирской язвы

3.4.2. Разработка схемы подготовки проб для ПЦР

3.5. Характеристика тест-системы для выявления

В. anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции

3.6. Разработка мультиплексной ПЦР для детекции

В. anthracis

Глава 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК BACILLUS ANTHRACIS РХОГ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

4.1. Программа комиссионных испытаний

4.1.1. Подготовка проб и постановка Г1ЦР

4.1.2. Исследование чистых культур микроорганизмов

4.1.3. Исследование биологического материала, искусственно инфицированного В. anthracis рХ01+

4.1.4. Исследование объектов окружающей среды, искусственно инфицированных В. anthracis рХО 1+

4.1.5. Специфичность ПЦР тест-системы

4.1.6. Воспроизводимость результатов

4.2. Оценка ПЦР тест-системы для выявления ДНК

В. anthracis рХ01+ по результатам комиссионных 111 испытаний

Глава 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК BACILLUS ANTHRACIS РХО Г МЕТОДОМ ПЦР В ОЧАГЕ

СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ

5.1. Эпидемиологическая обстановка по сибирской язве в Республике Мордовия и результаты оперативного эпидемического анализа

5.2. Лабораторное исследование биологического материала и объектов окружающей среды в очаге сибирской язвы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы»

Актуальность проблемы. В настоящее время сибирская язва продолжает представлять серьезную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства многих стран мира, включая Россию. Вспышки сибирской язвы у сельскохозяйственных животных наносят значительный экономический ущерб и представляют собой реальную угрозу заболевания людей. На территории России учтено более 35 тыс. стационарно-неблагополучных пунктов, где существуют почвенные очаги, обусловливающие эпидемический потенциал инфекции [Онищенко Г. Г. с соавт., 1999; Черкасский Б. JI., 2002]. Определенную опасность заноса инфекции представляет расширение импорта сельскохозяйственной продукции из неблагополучных по сибирской язве стран [Абакаримов. С. Г. с соавт., 1997; Онищенко Г. Г. с соавт., 1999; Dragon D. С. et al., 1995; Xudong L. et al., 1995J.

Заболевания людей сибирской язвой на территории Российской Федерации регистрируются постоянно. С 1990 по 2000 год средний уровень составил 40 случаев в год или 0,026 на 100 тыс. населения [Черкасский Б. Л., 2002]. При этом за период 1999-2003 г. было зарегистрировано 76 случаев заболевания людей сибирской язвой в 8 субъектах Российской Федерации [Онищенко Г.Г., 1999-2003 гг.], а за 9 месяцев 2004 года - 14 случаев [Здоровье населения и среда обитания, 2004].

По мнению ряда авторов эпидемиологическую обстановку в России по сибирской язве можно оценить как напряженную и не имеющую тенденции к стабилизации [Монисов А. Н. с соавт., 1997; Черкасский Б. Л., 2002]. Кроме того, Bacillus anthracis рассматривается в качестве одного из наиболее вероятных агентов бактериологического оружия и средств биологического терроризма, что подтвердили события в США в октябре-ноябре 2001 г. [Онищенко Г.Г. с соавт., 2000; Воробьев с соавт., 2002; Jernigan J.A. et al., 2002; Онищенко Г.Г., Дроздов И.Г., 2004].

В обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия по сибирской язве особая роль отводится качественной и своевременной диагностике. Традиционная схема лабораторного анализа с использованием биопробных животных и выделением чистой культуры занимает до 10 дней [Бургасов П. Н., Рожков Г. И.,

1984; Маринин Л.И. с соавт., 1999]. Для обнаружения В. anihracis используются экспресс-методы, включающие иммунологические и генодиагностические тесты. Общим для всех иммуносерологических методов, направленных на выявление сибиреязвенного микроба, является их недостаточная чувствительность, составляющая 1 х 104 - 1 х 106 м.к./мл [Буравцсва Н. П. с соавт., 1989; Абалакин В.А., 1990].

В последнее время достигнуты значительные успехи в области познания структуры и функций генетического аппарата сибиреязвенного микроба [Strettons S., Goodman A. F., 1998; Okinaka R. Т. et al., 1999; Dai L. et al., 1995; Guidi-Rontani C. et al., 1999; Qi Y. et al., 2001; Wilson W.J. et al., 2002]. Определена полная нуклеотидная последовательность двух собственных плазмид (pXOl и рХ02), проведена серия работ по генотипированию [Kaspar R.L. et al., 1987; Okinaka R.T. et al., 1999; Keim P. et al., 2000]. Это явилось предпосылкой разработки новых молекулярно-генетических методов детекции и идентификации В. anthracis.

Из генодиагностических методов наиболее широкое распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), ставшая в последние годы стандартной лабораторной методикой, регламентированной МУ 1.3.-1794-03 "Организация и проведение генодиагностических исследований биологического материала, пищевых продуктов и объектов окружающей среды, зараженных бактериями I-II групп патогенности". ПЦР-апализ характеризуется высокой чувствительностью (100 - 1000 м.к./мл), специфичностью и быстротой выполнения анализа, а также возможностью выявлять микроорганизмы с измененным фенотипом. Специфичность ПЦР определяется подбором праймеров. В литературе описано достаточно много праймеров для амплификации разных областей генома сибиреязвенного микроба, что позволяет не только выявлять возбудителя сибирской язвы, но и дифференцировать штаммы по ряду признаков [Carl М. et al., 1992; Turnbull Р.С. В. et al., 1991; Reif Т. С. et al., 1994; Fellows P. F., 1996; Bohm R. et al., 1998; Robertson D. L. et al., 1999; Qi Y. et al., 2001].

Однако этот эффективный метод индикации и диагностики сибирской язвы до недавнего времени не был внедрен в практику здравоохранения Российской

Федерации из-за отсутствия стандартных алгоритмов ПЦР-анализа и тест-систем, прошедших государственную регистрацию.

Вышеуказанные обстоятельства делают актуальным создание и практическое внедрение тест-системы для детекции возбудителя сибирской язвы, разработки схем генодиагностического анализа при лабораторной диагностике сибирской язвы и индикации возбудителя инфекции в объектах окружающей среды.

Цель работы - конструирование тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции и внедрение препарата в практику здравоохранения.

Основные задачи исследования :

1. Провести анализ генома возбудителя сибирской язвы с целью выбора видоспецифичных праймеров .

2. Подобрать параметры ПЦР для детекции штаммов В. anthracis.

3. Сконструировать тест-систему для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР.

Определить ее диагностическую ценность (чувствительность, специфичность, f воспроизводимость результатов).

4. Разработать нормативную документацию на созданную тест-систему для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР. Представить разработанную тест-систему для проведения Государственных приемочных испытаний в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

5. Разработать универсальный способ подготовки проб, обеспечивающий инактивацию спорообразующей культуры и последующую очистку ДНК-мишени.

6. Разработать параметры ПЦР с праймерами, выбранными на основе плазмид (pXOl, рХ02) для детекции штаммов В. anthracis, с различным плазмидным профилем.

7. Провести апробацию тест-системы в очаге сибирской язвы при исследовании клинического материала и объектов окружающей среды.

Научная новизна работы. Впервые сконструирована тест-система для выявления В. anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции. На основании проведенного анализа генома возбудителя сибирской язвы определены видоспецифичпые фрагменты ДНК, соответствующие нуклеотидным последовательностям генов pag (плазмида pXOl) и сарВ (плазмида рХ02). На их основе подобраны олигонуклеотидные затравки для ПЦР, обеспечивающие эффективную амплификацию ДНК-мишеней. Определена диагностическая ценность разработанной тест-системы и показана возможность ее использования для исследования биологического материала (кровь, суспензии органов) и объектов1 окружающей среды (почва, смывы).

Разработан универсальный способ подготовки проб, обеспечивающий обеззараживание спорообразующей культуры и последующую экстракцию ДНК, показана его высокая эффективность при работе с различными объектами (кровь, суспензии органов, почва).

Продемонстрирована эффективность использования разработанной тест-системы для диагностики кожной формы сибирской язвы у людей, сельскохозяйственных животных, а также детекции В. anthracis в объектах окружающей среды при проведении эпидемиологического расследования вспышек инфекции в очаге сибирской язвы (Республика Мордовия, 1999 г.).

Показана возможность дифференциации штаммов В. anthracis по плазмидному профилю методом мультилокусной ПЦР.

Практическая значимость работы. По результатам работы разработана нормативная документация (фармакопейная статья предприятия (ФСП), экспериментально-производственный регламент (ЭПР) и регламент производства (РП), инструкция по применению) на тест-систему для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР.

Разработанный способ подготовки проб для ПЦР-анализа при работе со спорообразующими штаммами сибирской язвы представлен в методических указаниях "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями 1-IV группы патогенности, при работе методом ПЦР".

Проведены Государственные приемочные испытания "Тест-системы для выявления ДНК Bacillus anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции". Результаты Государственных испытаний одобрены на Ученом Совете ГИСК им. JI. А.

Тарасевича (протокол № 8 от 25.05.98 г.). Получено разрешение комитета МИБП на внедрение "Тест-системы для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции" в практику здравоохранения (протокол № 3 от 18.06.98 г.). ФСП на препарат (№ 42-0020178501) прошла экспертизу в Фармакологическом Комитете Российской Федерации и утверждена 12.11.2001 г., утверждены ЭПР №560-00 и РП № 1504-04. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 4.01.2004 г. утверждена инструкция по применению "Тест-системы для выявления ДНК Bacillus anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции".

Сконструированы и депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" моно- и бесплазмидные варианты вирулентных штаммов В. anthracis 81/1 и М28, использованы при проведении Государственных приемочных испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Праймеры на основе нуклеотидной последовательности гена pag плазмиды pXOl обеспечивают видоспецифическую детекцию штаммов Bacillus anthracis методом ПЦР.

2. Сконструированная тест-система для выявления ДНК Bacillus anthracis рХ01+ методом ПЦР характеризуется чувствительностью - 10 - 1000 м. к./мл, специфичностью - 100 %, позволяет обнаружить ДНК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды.

3. Способ подготовки проб, включающий этап инактивации спорообразующей культуры и последующую экстракцию ДНК с использованием в качестве лизирующего агента гуанидинтиоцианата, обеспечивает обеззараживание исследуемого материала и не влияет на чувствительность ПЦР-анализа.

4. Метод ПЦР эффективен для лабораторной диагностики сибирской язвы у людей и сельскохозяйственных животных, индикации В. anthracis в объектах окружающей среды, а также при эпидемиологическом расследовании вспышек инфекции.

5. Разработанный вариант ПЦР с праймерами на основе репликонов pXOl и рХ02 позволяет дифференцировать атипичные по плазмидному профилю штаммы В. anthracis .

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены па Российских научных конференциях "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992) и "Актуальные вопросы дезинфекции, стерилизации, дезинсекции, дератизации" (Москва, 1992); Межгосударственной научно-практической конференции "Актуальные вопросы чумы и других инфекционных заболеваний", посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); Юбилейной научной конференции "Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария", посвященной 70-летию НИИ микробиологии Минобороны России (Киров, 1998); Международной научно-практической конференции "Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории СНГ" (Саратов, 1998); на 3-ей Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 2000); 1-ой Всероссийской паучно-практической конференции "Генная диагностика особо опасных инфекций" (Саратов, 2000); итоговых научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб"; 4-ой Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" (Москва, 2002); 4-ой Межгосударственной научно-практической конференции "Современные технологии в диагностике особо опасных болезней"(Саратов, 2003).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 23 научных публикациях.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Общий объем диссертации 160 страниц. Текст иллюстрирован 11 таблицами и 17 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Тучков, Игорь Витальевич

ВЫВОДЫ

1. На основании анализа генома возбудителя сибирской язвы подобраны праймеры, соответствующие нуклеотидной последовательности гена pag (плазмида pXOl), кодирующего протективный антиген сибиреязвенного токсина, которые обеспечивают специфичную амплификацию ДНК сибиреязвенного микроба.

2. Разработаны оптимальные параметры реакции амплификации нуклеиновых кислот: состав реакционной смеси, температура и продолжительность циклов ПЦР, обеспечивающие специфичную детекцию штаммов Bacillus anthracis\ сконструирована тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР в биологическом материале и объектах окружающей среды.

3. Разработана нормативная документация на тест-систему для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР: фармакопейная статья предприятия, эксперементально-производственный регламент, регламент производства и инструкция по применению.

4. Проведенные Государственные комиссионные испытания подтвердили диагностическую ценность тест-системы для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР: чувствительность - 10-1000 м.к./мл при исследовании чистых культур В. anthracis; 100-1000 м.к./мл при анализе биологического материала и объектов окружающей среды, искусственно инфицированных В. anthracis; специфичность составила 100 %; воспроизводимость результатов ПЦР - 95 %.

5. Предложен эффективный способ инактивации спорообразующей культуры В. anthracis, который не повреждает ДНК-мишень и не снижает чувствительности анализа. Способ заключается в предварительном подращивании спор с последующей обработкой их пенициллином в концентрации 1000 ед./мл 15 мин, прогревании при 100 °С - 10 мин и обработкой гуанидинтиоционатом (6М) при 65 °С в течение 15 мин.

6. Разработаны параметры мультилокусной ПЦР для одновременной детекции фрагментов ДНК двух плазмид В. anthracis гена pag плазмиды pXOl и гена сарВ плазмиды рХ02. Применение данной модификации ПЦР-анализа дает возможность одновременной детекции и характеристики по признакам вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба.

7. Впервые тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР была использована в очаге сибирской язвы для экспресс-диагностики инфекции у людей и сельскохозяйственных животных, а также при индикации возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды (Республика Мордовия, 1999 г.); доказана эффективность использования ПЦР-анализа для решения задач эпидемиологического расследования случаев сибирской язвы; показана возможность применения ПЦР для диагностики кожной формы сибирской язвы при исследовании клинических образцов: содержимого карбункулов и струпов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сибирская язва представляет серь1зную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства многих стран мира, включая Россию. Эпидемиологическую обстановку в России многие авторы оценивают как напряженную и не имеющую тенденции к стабилизации [Монисов А.Н. с соавт., 1997; Черкасский Б.Л., 2002]. Анализ штаммов В. anthracis различного происхождения с помощью молекулярно-генетических методов показал, что осложнения вызывают культуры, содержащие две высокомолекулярные плазмиды pXOl и рХ02, кодирующие основные факторы вирулентности - синтез трехкомпонеитиого экзотоксина и капсулы [Uchida J. et al., 1985; Lepplas S., 1991; 1995]. Плазмид с электрофоретической подвижностью характерной для pXOl и рХ02 у близкородственных бацилл не обнаружено [Ахмедзянов Ю. А. с соавт., 1989; Little S. F. et al., 1984]. ПроведШ полный ДНК-секвснс плазмид pXOl и рХ02. [Kaspar R.L. et al., 1987; Okinaka R. Т. et al., 1999]. Содержание ГЦ пар этих плазмид (33 %) сходно с таковыми на хромосоме.

Достигнуты значительные успехи в области познания структуры и функций генетического аппарата сибиреязвенного микроба. [Okinaka R.T. et al., 1999; Qi Y. et al., 2001; Wilson W.J. et al.,2002].

Главные достижения последних лет в разработке способов обнаружения микроорганизмов обусловлены успехами молекулярной биологии и созданием диагностических методов, основанных на анализе генома [Tenover F.C., 1998; Кутырев В.В., Куличепко А.Н. и др., 2000]. Из генодиагностических методов наиболее широкое распространение получила полимеразная цепная реакция, ставшая в последние годы стандартной лабораторной методикой. В основу данной работы положена разработка и внедрение в практику здравоохранения тест-системы для выявления возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды.

Поиск уникальных ДНК-матриц вели на основе нуклеотидных последовательностей генов В. anthracis, кодирующих основные факторы вирулентности. Проанализировав отечественную и зарубежную литературу, используя компьютерную базу данных Jen Bank и программу Jene Ranner, нами был подобран ряд праймеров для детекции плазмид вирулентности сибиреязвенного микроба. Проведенные исследования позволили выбрать для создания тест-системы праймеры ВА1-ВА2 (внешние), фланкирующие участок гена pag, локализованного на плазмиде pXOl, размером 409 п.и. и ВАЗ-ВА4 (внутренние), приводящие к амплификации фрагмента ДНК, размером 154 п.н. Праймеры обладали специфической комлементарностью с pag-геном В. anthracis и отсутствием таковой с В. cereus, В. subtilis и Е. coli.

В серии экспериментов установлен оптимальный состав реакционной смеси и программа амплификации. На основании результатов, полученных при разработке стандартных параметров реакций, нами была сконструирована ПЦР тест-система для выявления ДНК В. anthracis pXOl4, состоящая из 8 компонентов: праймеры ВА1-ВА2 и ВАЗ-ВА4 - водные растворы; Taq-полимсраза - термостабильная ДНК-полимераза; дНТФ - водный раствор дезоксинуклеозидтрифосфатов; К - водный раствор ДНК В. anthracis СТИ-1 в концентрации 1нг/мкл; 10ХБ - 10-кратный буферный раствор; Mg С12 - 2,5 мМ раствор магния хлорида; масло вазелиновое стерильное; вода деионизоваиная стерильная.

Важной характеристикой диагностического препарата является его стабильность. В результате лабораторных испытаний установлено, что разработанная тест-система сохраняет свою чувствительность - 1000-100 м.к./мл при исследовании проб, содержащих В. anthracis, 100 % специфичность и воспроизводимость в течение 6 месяцев при условии хранения минус 20 °С.

Определение диагностической ценности разработанной ПЦР гест-системы осуществляли в процессе комиссионных испытаний на базах специализированных лабораторий ГИСК им. JI.A. Тарасевича (чистые культуры), Волгоградского НИПЧИ (объекты окружающей среды), ГНЦПМ (Оболенск) (биологический материал). Исследования проводили по программе, утвержденной комитетом МИБП (протокол №3 от 17.03.98 г.), на чистых культурах В. anthracis с различной генетической характеристикой (рХОГ рХ02+; рХ01+ рХ02"; pXOl" рХ02+; pXOl" рХ02"), В. cereus, В. subtilis, В. megaterium, В. thuringiensis, Е. coli; в биологическом материале (кровь, органы животных) и объектах окружающей среды (почва), искусственно инфицированных возбудителем сибирской язвы или гетерологичными микроорганизмами. В качестве методов сравнения применяли бактериологический анализ и люминесцентную микроскопию.

В результате комиссионной проверки показан ряд положительных свойств ПЦР тест-системы для выявления В.anthracis рХ01+:

• продолжительность метода составляла 6 ч против 24 ч. при бактериологическом исследовании;

• на результаты анализа не влияет присутствие посторонней микрофлоры, которая при бактериологическом исследовании затрудняет получение чистой культуры.

Диагностический препарат обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

С помощью разработанной ПЦР тест-системы выявлено 100 % проб биологического материала, содержащего В. anthracis, в концентрации 1x103 м.к./мл и 100 % проб из объектов окружающей среды (почва, смывы), искусственно инфицированных В. anthracis, в концентрации 8,2x10 м.к./мл. Специфичность тест-системы при исследовании проб, искусственно инфицированных В. anthracis и гетерогенными микроорганизмами, составила 100 %. Воспроизводимость метода ПЦР -95 %.

На основании результатов комиссионных испытаний получено разрешение комитета МИБП па внедрение "Тест-системы для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции" в практику здравоохранения (протокол № 3 от 18.06.98 г.).

Одним из этапов нашей работы было определение возможных путей совершенствования ПЦР-анализа для выявления В. anthracis. В последнее время для идентификации возбудителей инфекционных болезней начали применять мультиплексную ПЦР, которая позволяет проводить быстрый многофакторный анализ образца одновременно по нескольким параметрам. В случае с В. anthracis мультиплексная ПЦР позволит детектировать штаммы с измененным плазмидным профилем, и уже на этапе индикации возбудителя сибирской язвы проводить первичный анализ патогенноети выделенных штаммов, не увеличивая продолжительности анализа.

В качестве ДНК-мишени нами были выбраны структурные гены pag и сарВ. Ген pag расположен на плазмиде pXOl, а ген сарВ на плазмиде рХ02. Наличие у штамма двух плазмид свидетельствует о патогенноети культуры. В результате проведенного анализа были отобраны две пары праймеров PAI-PA2 и CAI-CA2, обеспечивающую специфичную амплификацию участка размеров 214 п.н. (pag гена) и участка размером 104 п.н. (сарВ гена) соответственно.

В ходе серии экспериментов установлен оптимальный состав реакционной смеси и программа амплификации. Чувствительность реакции составила 100 м.к./мл.

Сконструированная мультиплексная ПЦР тест-система была нами протестирована с би-, моно- и бесплазмидными штаммами В. anthracis. В качестве отрицательного контроля использовали микроорганизмы близкородственных видов: В. cereus и В. subtilis.

В результате проведения ПЦР наблюдали при электрофоретическом разделении фрагментов, полученных после амплификации ДНК биплазмидных штаммов В. anthracis, две дискретные полосы, по величине пробега соответствующие молекулам ДНК размером 214 и 104 п.н., что свидетельствовало о наличии pXOl и рХ02. При ПЦР анализе моноплазмидных штаммов возбудителей сибирской язвы осуществлялся синтез только одного фрагмента размером 214 п.н. у штаммов рХ01+ и 104 п.н. при тестировании культур рХ02+. У всех проверенных штаммов ложноотрицательных результатов не было зарегистрировано. У культур близкородственных сапрофитов, а также бесплазмидных штаммов штаммов В. anthracis реакции амплификации зарегистрировано не было.

Таким образом, нами разработана мультиплексная ПЦР тест-система для выявления ДНК В. anthracis (рХ01+, рХ02+), позволяющая с высокой л специфичностью (100 %) и чувствительностью (1x10 м.к./мл) детектировать штаммы В. anthracis.

Полученные результаты по конструированию мультиплексной ПЦР тест-системы позволяют отметить большие перспективы использованной технологии в диагностике сибирской язвы, значительное снижение трудоемкости исследования при внедрении их в практику.

Важным этапом наших исследований на модели возбудителя сибирской язвы была разработка оптимального способа обеззараживания культуры сибиреязвенного микроба, который с одной стороны обеспечивал бы полную инактивацию спор В. anthracis, а с другой не оказывал отрицательного влияния на ДНК-матрицу и на ферментативную полимеразную реакцию. Анализ полученных данных позволил нам предложить новую схему обработки материала, содержащего спорообразующую культуру В. anthracis, соответствующую СП 1.3.1285-03 Санитарные правила "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

Суть указанной разработки заключается в подращивании исследуемого материала, содержащего культуру В. anthracis, на бульоне в условиях аэрации при 37 °С в течение 2,5 часов, в обработке проб после подращивания пенициллином в конечной концентрации 1000 ед/мл с инкубированием 37 °С в течение 15 мин, а также последующее кипячение при 100 °С в течение 10 мин. Выполнение разработанной нами схемы обработки проб в общей сложности занимает 2 часа 55 мин и не требует сложных манипуляций с материалом. При постановке ПЦР не отмечено ингибирования реакции или разрушения ДНК.

Важное значение при ПЦР-исслсдовании нативного материала имеет этап подготовки проб. Нами был проведен сравнительный анализ двух методов выделения ДНК из образцов биологического материала (кровь, суспензии органов животных) и объектов окружающей среды (смывы с поверхностей, почва). Первый разработанный нами метод заключался в обработке проб пенициллином 1000 сд./мл и прогревании при 100 °С в течение 10 мин и второй - дополнительно к первому добавляли 30 мкл нуклеосорбента, выдерживали при комнатной температуре 10 мин, пробы центрифугировали на микроцентрифуге 30 сек. Полученный осадок отмывали буфером. Пробы подготовленные вторым способом можно хранить при температуре 4 °С в течение недели, а при хранении при температуре минус 20 °С в течение 6 месяцев.

Показана высокая эффективность двух использованных подходов подготовки проб к исследованию.

Результаты использованы при составлении методических указаний МУ 3.5.5,1034-01 "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV группы патогенности, при работе методом ПЦР.

Разработанная тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХ01+, использована в очаге сибирской язвы. С помощью этого препарата в 1999 году проведены исследования в очаге сибирской язвы в Республике Мордовия, где в селе

Русское Байманово Рузаевского района были зарегистрированы групповые заболевания сибирской язвой людей и сельскохозяйственных животных.

Нами методом ПЦР с использованием разработанной тест-системы было проанализировано 14 клинических проб от леченных антибиотиком в течение 5-6 дней больных людей и находившихся в стадии выздоровления, а также 38 проб объектов окружающей среды. Проведенные исследования позволили подтвердить методом ПЦР у 4 из 6 больных клинический диагноз сибирской язвы, в то время как после лечения больных людей антибиотиками обнаружить возбудителя бактериологическими методами не представлялось возможным.

В материале от двух павших коров при ПЦР-анализе обнаружена ДНК возбудителя сибирской язвы, что подтвердили и результаты бактериологического исследования. Из 38 проб объектов окружающей среды в 20 методом ПЦР обнаружен В. anthracis. Полученные результаты позволили быстро установить вероятный источник инфицирования животных. При целенаправленном отборе проб с мест определенных после проведения ПЦР во всех случаях бактериологическими методами выделен возбудитель сибирской язвы.

Таким образом, применение нового методического подхода - ПЦР-анализа с разработанной ПЦР тест-системой для выявления ДНК В. anthracis рХ01+, оказалось максимально оперативным и результативным, что позволило в течение двух дней установить механизм эпизоотии и локализовать очаг сибирской язвы.

Разработанная ПЦР тест-система обладает необходимой надежностью, специфичностью и может быть использована как эффективный тест для индикации и экспресс-диагностики сибирской язвы при работе в очагах инфекций

132

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Тучков, Игорь Витальевич, 2005 год

1. Абакаримов С.Т., Баатырбеков Э.Ш., Шевченко В.П. О состоянии заболеваемости и мерах профилактики в Кыргызской Республике // Матер. Межрегиои. рабочего совещ. ВОЗ/ФАО по сибирской язве. Алматы, 1997. -С. 26-27.

2. Абалкин В.А. Закономерности врожденного и приобретенного иммунитета // ЖМЭИ. 1990. - № 12.- С. 78-83.

3. Абалкин В.А., Сергеева J1.B. Оценка клеточного иммунитета in vitro у привитых вакциной СТИ людей // Профилактика природно-очаговых инфекций: Тез. докл. Всесоюз. пауч-практ. конф. Ставрополь, 1983. - С. 365366.

4. Абгарян А.Г. Совершенствование методов индикации возбудителя сибирской язвы Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ставрополь, 2001. - 19 с.

5. Абгарян А.Г., Еременко Е.И., Рязанова А.Г. Молекулярно-генетические и другие современные методы в индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы // Карантинные и зоонозпые инф. в Казахстане Алматы, 2001. - N 4. - С. 12-17.

6. Ахмедзянов Ю.А., Найманов П.И., Сорокин Ю.И. // Использование плазмидного скренинга для дифференциации штаммов Bacillus anthracis от близкородственных видов почвенных бацилл Журн. микробиол. 1989. - № 11 -С. 26-28.

7. Балахонов С.В. Геномные маркеры возбудителей чумы, псевдотуберкулеза, холеры, бруцеллеза (эпидемиологическое и диагностическое значение):

8. Автореф. дис. . докт. мед. наук. Иркутск, 2000. - 33 с.

9. Ю.Бенедиктене В.Г., Рюзанс А.А., Юодка Б.А. // 13-е Риж. совсщ. по магнит, гидродипам. Рига, 1990, - Ч. 3. Тез. докл. - Саласпилс, - 1990. - С. 1987-188.

10. П.Биргер О.Г. Сибирская язва. В кн.: Микробиологические методы исследования при инфекционных заболеваниях М.: Медицина, 1975, С. 77-93.

11. Бургасов П.II., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. М.: Медицина, 1984. -212 с.

12. Бургасов П.Н., Черкасский Б.Л., Марчук Л.М., Щербак Ю.Ф. Сибирская язва М.: Медицина, 1970. 128 С.

13. Буровцева Н.П., Ярощук В.А. Ускоренный метод обнаружения возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале. Методические рекомендации. Москва. 1987.- 7 с.

14. Ворбьев А.А., Боев Б.В.,Бондаренко В.М., Гинзбург А.Л. Проблема биотерроризма в современных условиях. // ЖМЭИ 2002. - № 3. - С. 3-12.

15. П.Гавенский С.Д., Ефременко В.И., Климова И.М. и др. // Сб. научных работ "Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей". Волгоград, 1989. - Вып. 5. - С.81-89.

16. Гавенский С.Д., Ефременко В.И., Климова И.М. и др. // Сб. научных работ "Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей". Волгоград, 1990. — Вып. 4. - С. 23-27.

17. Гавенский С.Д., Ефременко В.И., Климова И.М. и др. // Современные методы диагностики особо опасных инфекций и способы их применения: Методическое пособие. Саратов, 1991. - С. 213-219.

18. Гаранина С.Б. Конструирование тест-системы, основанной на полимеразной цепной реакции, для детекции возбудителя бруцеллеза: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1996. - 19 с.

19. Дентовская С.А. Бруцеллез в Саратовской области : клинико-эпидемиологические аспекты совершенствования лабораторной диагностики: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2000. — 19 с.

20. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М., Медицина, 1985. -240с.

21. Еременко Е.И. Биологические и популяционные аспекты патогенности Bacillusanthracis Автореф. дис. . докт. мед. наук. — Ставрополь, 1997 38 с.

22. Еремин С.А., Костюкова Т.А., Ежов И.Н., Тучков И.В., Дроздов И.Г. Получение стерильных бактериальных лизатов клеток сибиреязвенного микроба. // Методическое пособие по генетике возбудителя сибирской язвы. — Саратов, 1991.-С. 3.

23. Ефремепко В.И., Пушкарь В.Г., Трофимов Е.Н., Перов В.Ю. // ЖМЭИ. 1989. -№2.-С. 100-105.

24. Жарикова И.В., Брыкалов А.В., Тюменцева И.С. // Материалы межгос. научн,-практ. Конф. "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний", посвящ. 100-летию открытия возбудителя чумы. Ставрополь, 1994. - С. 40-41.

25. Здоровье населения и среда обитания. Информационный бюллетень. М. 2004. -№11. С. 49.

26. Куличенко А.Н. Конструирование молекулярно-генетических систем для детекции возбудителей особо опасных инфекций: чумы, бруцеллеза и сибирской язвы: Автореф. дис. . докт. мед. паук. — Саратов, 1995. — 38 с.

27. Малецкая О.В., Буларгина Т.В., Лопаткин О.II. Опыт получения моноклональных антител к протективиому антигену сибиреязвенного микроба.// Особо опасные инфекции на Кавказе,- Ставрополь, 1987. С. 239241.

28. Масленникова В.Н., Нарбутович Н.И., Пушкарь В.Г. // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Актуальные вопросы лабораторной диагностики и профилактики холеры".-Ростов-на-Дону, 1988.-С. 173-175.

29. Монисов А.А. Федоров Ю.М., Жилина Н.Я., Ходарцев О.С. Эпидемиологическая обстановка по сибирской язве в Российской Федерации // Матер. Межрегион, рабочего совещ. ВОЗ/ФАО по сибирской язве. Алматы, 1997.-С. 27-29.

30. Монисов А.А., Федоров Ю.М., Жилина Н.Я. и др. // Матер, межрег. рабоч. совещ. ВОЗ/ФАО по сибирской язве. Алмааты, 1997. - С.27-29.

31. Онищенко Г.Г., Дроздов И.Г. Актуальные аспекты проблемы противодействия биологической опасности // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. М. Медицина - 2004. - С. 14-20.

32. Онищенко Г.Г., Сандакчиев Л.С., Китаев С.В., Щелкунов С.В. Биотерроризм как глобальная угроза // ЖМЭИ 2000. № 6. - С. 83-85.

33. Осина Н.А. Конструирование тест-системы для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакции: Автореф. дис. . канд. биол. наук. -Саратов, 2001. 21 с.

34. Пушкарь В.Г., Ефременко В.И., Климова И.М. и др. // ЖМЭИ. 1985. - № 12. -С. 30-35.

35. Пушкарь В.Г., Климова И.М., Ефременко В.И. и др. // Приготовление и применение магнитных сорбентов для изучения антигенов микроорганизмов: Методические рекомендации. Волгоград, 1984. - 16 с.

36. Соркин Ю.И., Радзиковский Л.В. Экология сибиреязвенного микроба в естественных биоцинозах почв различных природных зон СССР. // Экология возбудителей сопронозов. М., 1988, С. 65-79.

37. Степанов А.С. Разработка основ генетического анализа возбудителя сибирскойязвы // Дисс. док. мед. наук. Саратов, 1992. - С. 230.

38. Тимошин В.Б., Замараев B.C., Антонов В.А., Липницкий А.В. Видоспецифичный ДНК-зонд для идентификации токеигенных штаммов возбудителя сибирской язвы.// Журн. мол. генетика, микробиология и вирусология.-1994,- N1.- С 30-33.

39. Тюменцева И.С., Ефременко- В.И., Афанасьев Е.Н. и др. Индикация возбудителей особо опасных инфекций с помощью компазиционных магноиммупосорбентов. -Деп. в ВИНИТИ 25.01.95, № 221 -В. 95.

40. Федоров Н.А. с соавт. Методическое пособие по генетике возбудителя сибирской язвыю — Саратов, 1991. 39 с.

41. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Брюханов А.Ф., Абгарян А.Г., Ефременко В.И., Рязанова А.Г. Генотипирование штаммов сибиреязвенного микроба, изолированных на территории стран СНГ // ЖМЭИ. 2003. - N 6, - С. 51-56.

42. Черкасский Б,Л. Критерии оценки эпизоотологической и эпидемиологической активности стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов. Журн. микробиол., 1969 М. - С. 132-136.

43. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. - Москва: "Интерсэн", 2002. - С. 384.

44. Черкасский Б.Л Закономерности территориального распространения и проявления активности стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов. Журн. Эпидемиология и инфекционные болезни. 1999. №1. - С. 48-52.

45. Черкасский Б.Л., Жанузаков Я.Ж. Сибирская язва. Алма-Ата: Кай-нар, 1980.-191.с

46. Черкасский Б.Л., Иванова А.А. // Эпидемиология и инфекц. болезни, 1996. - № 2.-С. 12-15.

47. Черкасский Б.Л., Савиных А.И., Марков В.Ю. Особенности современной эпидемиологии сибирской язвы в СССР и пути усовершенствования вакцинопрофилактики у людей. Журн, микробиол., 1978. -№11.-С. 130-134.

48. Шарова И.Н. Совершенствование тест-системы для выявления возбудителя бруцеллеза методом ПЦР: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2001. -19 с.

49. Шляхов Э.Н., Шварц С.А. Химический антраксин. Некоторые биологические, биохимические и иммуиохимические данные. В кн.: Антракс. Кишенев, 1964, с. 97-116.

50. Яковлев А.Т., Зыкин Л., и др. Использование иммунофсрментного метода диагностики некоторых природноочаговых инфекций. В кн.: Профилактика прродноочаговых инфекций. Тез докл. к Всесоюзной науч-практ. конф., декабрь 1983. Ставрополью - С. 361-362.

51. Ahokas П., Erkkila M.J. Interference of PCR amplification by the polyamines, spermine and spermidine. // PCR Meth. Appl. 1993. - Vol. 3. - P. 65-68.

52. Ask C., Farrow J.A.E., Darsch M. Comparative analysis of B.anthracis, В cereus and related species on the basis of reverse transcriptase seguencing of 16S RNA.// Inf.J.Syst. Bacteriol.-1991.-V41.- P 343-346.

53. Baillie L., Moir A., Manchce R. The expression of the protective antigen of Bacillus anthracis in Bacillus subtilis. // J. Appl. Microbiol. 1998. - Vol. 84, N 5. - P. 741746.

54. Baillie L.W., Jones M.N., Turnbull P.C., Manchee R.J. Evolution of the Biolog system for the identification of Bacillus anthracis // Let. Appl. Microbiol. 1995 Apr; 20(4) P. 209-211.

55. Bej A.K., Mahbubani M.H., Dicesare J.L., Atlas R.M. Polymerase chain reaction -gene probe detection of microorganisms by using filter-concentrated samples // Appl.Environ.Microbiol.- 1990. V.57.- P.3529-3534.

56. Bell C.A., Uhl J.R, Hadfield T.L., David J.C., Meyer R.F, Smith T.F., Cockerill F.R. Detection of Bacillus anthracis DNA by LightCycler PCR //J. Clin. Microbiol. -2002. Vol. 40, № 8. - P. 2897-2902.

57. Beyer W., Glockner P., Otto J., Bohm R. A nested PCR and DNA-amplifacation-fingerprinting method for detection and identification of Bacillus anthracis in soil samples from former tanneries //Salisbury Med. Bull. 1996. - № 87. - P. 47-49.

58. Beyer W., Glockner P., Otto J., Bohm R. A nested PCR metod for the detection of Bacillus anthracis in envirjnmental samples collected from formed tannery sites. // Microbia. Res. 1995.-Vol. 150.-P. 179-186.

59. Blownstein R.O., Koehler T.M., Cooler R.J., Finkelstein A. Antrax Toxin: Channelforming activity of protective antigen in planar phospholipid bilayers I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989/- Vol. 86.-Р/2209-2213.

60. Bohm R., and Spath G. The taxonomy of Bacillus anthracis according to DNA-DNA-hybridization and G+C content // Salisbury Medical Bulletin.- № 68, Special Supplement, 1990-P. 29-31.

61. Bohm R., Pocivalsek S., Beyer W. PCR-Elisa for detection of B. anthracis in environmental samples/ // Abstract Book/ 3r-d International Conference on Antrax, Plymouth, England. 7-10th September 1998 P. 11.

62. Bradaric N., Punda-Polic V. Cutaneous anthrax due to penicillin-resistcnt Bacillus anthracis, transmitted by an insect bite/ // Lancet, 1992. 340. - P. 306-307.

63. Brightwell G., Pearse M., Leslie D. Development of internal control for PCR detection of Bacillus anthracis. II Mol. Cell. Probes 1998 Dec; 12(6) P. 367-377.

64. Brumlik M.J., Szymajda U., Zakowska D., Liang X., Redkar R.J., Patra G., Del Vecchio V.G. Use of long-range repetitive element polymorphism-PCR to differentiate Bacillus anthracis strains //Appl. Environ. Microbiol. 2001. - Vol. 67, №7.-P. 3021-3028.

65. Carl M., Harkins R., Coulson N., Lowe J. et al. Detection of spores of Bacillus anthracis using the polymerase chain reaction. // J. Infect. Dis. 1992. - V.165. - P. 1145-1148.

66. Cataldi A., Labruyere E., Mock M. Construction and characterization of a protective antigen-deficient Bacillus anthracis strain // Mol. Microbiol. 1990. - Vol. 4, N 7. -P. 1111-1117.

67. Cole Ii.B., Ezzell J.W., Keller K.F., Doyle R.J. Differentiation of Bacillus anthracisand others Bacillus species by lectins // J. Clin. Microbiol. 1984. Jan. 19(1) P. 4853.

68. Conge R., Stares N.E., Jones M.N., Bowen J.E., Turnbull P.C.B. and Boeufgras J.M. Identificacion of Bacillus anthracis using the API 50 CHB system // Proc. Inter. Workshop on anthrax. Winchester, England. September 19-21, 1996. - №87. - P. 34-36.

69. Dai Z., Sirard J.-C., Mock M., Koehler T.M. The atxA gene product activates transcription of the anthrax toxin genes and is essential for virulence //Mol. Microbiol. 1995.-Vol. 16, N6.-P. 1171-1181.

70. Dixon T.S., Meselson M., Guillemin J., and Hanna, P.S. Antrax : Review Article in Mcdical Progress.- The New England Jornal of Medicine.- 1999. Vol/ 304. - № 11 -P. 815-826.

71. Dodin A., Gould В/ // Bull. Sjc. Pathol. Exot. 1983. - Vol. 76 - P. 646-651.

72. Doganay M., Aydin N. Antimecrobial susceptibity of Bacillus anthracis. II J Infect. Dis., 1991 Vol. 23.-P. 333-335.

73. Dragon DC, Rennie RP. 1995. The ecology of anthrax spores: tough but not invincible. Can. Vet. J. 36:295-301

74. Ezzell J.W., Abshire Т., Ibrahim S., Teska J., Coyne S., Knauert F., Allen C., Nash D. Identification of Bacillus anthracis-. an overview // Abstract Book/ 3r-d International Conference on Antrax, Plymouth, England. 7-10th September 1998 P. 47.

75. Ezzell J.W., Abshire T.G. Immunological analysis of cell-associated antigens of Bacillus anthracis // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, N 2. - P. 349-356.

76. Fellows P.F. A survey of worldwide starins of Bacillus anthracis.// Proc. Inter. Workshop on anthax. Winchester, England. September 19-21, 1996. - N 87. - P. 33.

77. Fellows P.F.A. A survey of worldwide strains of Bacillus anthracis. // Proc. Inter. Workshop on anthrax. Winchester, England. September 19-21, 1996. - №87. - P. 33.

78. Finkelstein A., Channel formed in phospholipid bilayer membranes by difteria, tetanus, botulinum and anthrax toxin // J. Physiol. (Paris). 1990. - V. 84. - № 2. - P. 188-190.

79. Fluck R., Bohm R., Stranch D. Fluoreszenzserologishe untersuchungen von kreuzreaktion zwischen sporen von B.anthracis und sporen aerober sporenbildner& // Zentralbaltfur Veterinarmedizin Series B.-1977.-H.24.-S.497-507.

80. Fluit A.C., Widjojatmodjo M.N., Box А.Т.Л. et al. Rapid detection of salmonellae in poultry with the magnetic immuno-polymerase chain reaction assay. // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 1342-1346.

81. Fouet A, Sirard JC, Mock M. Bacillus anthracis pXOl virulence plasmid encodes a type 1 DNA topoisomerase. // Mol. Microbiol. 1994 - V. 11 - P. 471-79

82. Fouet A., Mesnage S., Tosi-Couture E., Gounon P., Mock M. Bacillus anthracis S-layer //3rd International Conference on Anthrax. 7-10-th September 1998. Plymouth, England. 1998. - P. 16.

83. Friedlander A.M. Macrophages are sensitive to anthrax lethal toxin through an acid-dependent process //J. Biol. Chem. 1986. - Vol. 261, N 16. - P. 7123-7126.

84. Green B.D., Battisti L., Koehler T.M., Thorne C.B., Ivins B.D. Demonstrationof a capsule plasmid in Bacillus anthracis //Infect. Immun. 1985. - Vol. 49, N 2. - P. 291-297.

85. Guidi-Rontani C., Pereira Y., Ruffle S., Sirard J.C., Weber-Levy M., Mock M. Identification and characterization of a germination operon on the virulence plasmid pXOl of Bacillus anthracis //Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 33, N 2. - P. 407-414.

86. Hailing P.J., Dunnill P. // Enzyme Microb. Tecnol. 1980. - Vol. 2. - P. 2-10.

87. Hanna P. 1998. Anthrax pathogenesis and host response. // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 225:13-35

88. Helgason E, Okstad OA, Caugant DA, Johansen HA, Fouet A, et al. Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis-—one species on the basis of genetic evidence. // Appl. Environ. Microbiol. -2000. -V. 66. P. 2627-30

89. Hutson R.A., Duggleby C. DNA probes for anthrax detection // Proc.Int.Workshop on Anthrax. Winchester, England, April 11-13, 1989. Salisbury Med.Bull., P.C.B.Turnbull, Ed. 1990,-N.68. - Spec.Splt. - P.27-29.

90. Hutson R.A., Duggleby C.J., Lowe J.R., Manchee R.J., Turnbull P.C.B. The development and assessment of DNA and oligonucleotide probes for the specific detection of Bacillus anthracis. // J. Appl. Bacteriol. 1993. - Vol. 75, № 5. - P. 463472.

91. Ivins B.E., Welkos S.L. Cloning and expression of the Bacillus anthracis protective antigen gene in Bacillus subtilis. II Infect. Immun. 1986. - Vol. 54, N 2. -P. 537-542.

92. Jernigan J.A., Stephens D.S., Ashford D.A., Omenaca C., Topiel M.S. et al. Bioterrorism-related inhalational Antrax: the first 10 cases reported in the United States //Emerging Infectious Diseases. 2001. - Vol. 7, N 6. - P. 933-944.

93. John W., Ezzell Jr. The capsule of B. anthracis. II 3rd International Conference on Anthrax. 7-10-th September 1998. Plymouth, England. 1998. - P. 15.

94. Kaneko Т., Nozaki R., Aizawa K. Deoxiribonucleic acid relatedness between Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis// Microbiol.Iimmunol. -1978,-V. 22(10). -P.639-641.

95. Kaspar R.L., Robertson D.L. Purification and physical analysis of Bacillus anthracis plasmids pXOl and pX02. //Biochemical and Biophysical Research Communications. 1987. - Vol. 149, N 2. - P. 362-368.

96. Kearney J.F., Kushner N., Shu F. Monoclonal antibodies to Bacillus anthracis spores. // The 2-nd International Workshop on the molecular biology of B. anthracis, B. cereus, В .thuringiensis. Taos, New Mexico, USA, August 11-13. 1999 - P. 41.

97. Keim P., Kalif A., Schupp J.M., Hill K.K., Travis S.E., Richmond K., Adair D.M., Hugh-Jones M.E., Kuske C.R., Jackson P. Molecular evolution and diversity in

98. Bacillus anthracis as detected by amplified fragment length polymorphism markers //J. Bacteriol. 1997-Vol. 179.-P. 818-824.

99. Leppla S.H. Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenylate cyclase that increases cyclin AMP concentrations in eukaryotic cells //Proc. Natl. Acad. Sci. US. -1982,-Vol. 79. P. 3162-3166.

100. Leppla S.H. Anthrax toxins //In Bacterial toxins and virulence factors in disease, Moss J., Iglewski В., Vaughan M., Tu A.T., (Eds.), New York, Basel, Hong Kong. 1995.-P. 543-572.

101. Leppla S.H. Bacillus anthracis calmodulin-dependent adenylate cyclase: chemical and enzymatic propeties and interactions with eucaryotic cells //Adv. Cycl.

102. Nucl. and Protein phosphorilat: Res. New York, 1984. Vol. 17. - P. 189-198.

103. Leppla S.H. The anthrax toxins complex //In Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, Alouf J.E., Freer J., (Eds.), Academic Press Limited, Newk, NY. 1991. - P. 277-302.

104. Levi K., Highham J.L., Hamlyn P.F. Coates D. Molecular detection of Bacillus anthracis spores in commercial samples of wool and cashmere // Abstract Book/ 3r-d International Conference on Antrax, Plymouth, England. 7-10th September 1998-P. 58.

105. Lightfool N.F., Scott R.J.D., Turnbull P. С. B. Antimicrobial susceptibility of Bacillus anthracis. II Proc. Inter. Workshop on anthrax. Winchester, England, April 11-13, 1989 Salisbury Medical Bulletin. - № 68, Special Supplement, 1990. - P. 9596.

106. Little S.E., Leppla., Cora E. Production and characterization of monoclonal antibodies tothe protective antigene component of B.anthracis toxin.// Infect. Immun.-1988.- V56.- P.1807-1813.

107. Logan N.A. Carman J.A., Melling J. and Berkeley R.C.W. Identification of Bacillus anthracis by API tests. // J. Med. Microbiol. 1989 - Vol. 20. - P. 75-85.

108. Lowe J.R., Campbell J.R. Rapid detection of virulent Bacillus anthracis strains by the polymerase chain reaction // In Abst. 91st.Gen. Meet. Amer. Soc. Microbiol. Dallas. 5-9 May. 1991. - P. 85.

109. Makino S.-I., Sasakawa Ch., Uchida N., Terakado N., Yoshikawa M. Cloning and C02-dependent expression of the genetic region for encapsulation from Bacillus anthracis //Mol. Microbiol. 1988. - Vol. 2, N 3. - P. 371-376.

110. Makino S.-I., Uchida N., Terakado N., Sasakawa Ch., Yoshikawa M. Molecular characterization and protein analysis of the cap region which is essential for encapsulation in Bacillus anthracis //J. Bacteriol. 1989. - Vol. 171. - P. 722-730.

111. Makino SI, Iinuma-Okada Y, Maruyama T, Ezaki T, Sasakawa C, Yoshikawa M. Direct detection of Bacillus anthracis DNA in animals by polymerase chain reaction H J. Clin. Microbiol. 1993. Mar; 31(3): 547-551.

112. McDowell D.G., Mann N.H. Characterization and sequence analysis of a small plasmid from Bacillus thuringiensis var. kurstaki strain HD1-DIPEL //Plasmid. — 1991.-Vol. 25.-P. 113-120.

113. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D., Dreier Th.M. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis //Infect. Immun. 1983. - Vol. 39, N l.-P. 371-376.

114. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D., Dreier Th.M. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis //Infect. Immun. 1983. - Vol. 39, N l.-P. 371-376.

115. Miura K., Saito H. Preparation of bacterial DNA by the phenol-pH 9-Rnases Method. // Biochim. Biophis. Acta. 1963. -V. 72. - P. 543-545.

116. Mock M., Labruyere E., Glaser Ph., Danchin A., Ullmann A. Cloning and expression of the calmodulin-sensitive Bacillus anthracis adenylate cyclase in Escherichia coli //Gene. 1988. - Vol. 64. - P. 277-284.

117. Molday R.S., Ven S.P., Rembaum A. // Nature. 1977. - Vol. - 268. - P. 353367.

118. O'Brien J., Friedlander A., Dreier Т., Ezzell J., Leppla S. Effects of anthrax toxin components on human neutrophils //Infect. Immun. 1985. - Vol. 47. - P. 306310.

119. Olive D.M. Detection of enterotoxigenic Escherichia coli after polymerase chain reaction amplification with a termostable DNA polymerase. // J. Clin. Microbiol. 1989. - V. 27. - P. 261-265.

120. Ombui J.N., Mathenge J.M., Kimotho A.M., Macharia J.K., Nduhiu G. Frequency of antimicrobial resistance and plasmid profiles of Bacillus cereus strains isolated from milk //East. Afr. Med. J. 1996. - Vol. 73. - P. 380-384.

121. Patra G, Sylvestre P, RamisseV, Th.erasse J, Guesdon JL. 1996. Isolation of a specific chromosomic DNA sequence of Bacillus anthracis and its possible use in diagnosis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 15:223-31

122. Patra G, Sylvestre P, RamisseV, Th.erasse J, Guesdon JL. 1996. Isolation of a specific chromosomic DNA sequence of Bacillus anthracis and its possible use in diagnosis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 15:223-31

123. Patra G., Sylverste P., Ramisse V., Therasse J., Guesdon J.-L. Specific oligonucleotide primers for rapid iidentification of Bacillus anthracis strains // Proc. Inter. Workshop on Anthrax. Winchester, England. September 19-21, 1996. -N 87. -P. 45-46.

124. Phillips A.P. and Martin K.L. Investigating of spores surface antigen in the genus Bacillus by the use polyclonal antibodies in immunofluorescent tests // J. App. Bacteriology. 1988. - № 64. - P. 47-55.

125. Phillips A.P., Ezzell J.W. Identificationof B.anthracis by polyclonal antibodies against extracted vegetative cell antigene. // J. Appl. Bacterid.-1989.-Vol.66.-P.419-432.

126. Phillips A.P., Martin K.L. Comparission of direct and indirectimmunoradiometric assays (IRMA) for B.anthracis spores, immobilized on multispot microscope slides. // J. Appl. Bacteriol.-1983.-Vol.55.-P.315-324.

127. Ramisse V., Patra G., Garringuue H., Guesdon J-L., Mock M. Identification and characterization of Bacillus anthracis by multiplex PCR analysis of sequences on plasmids pXOl and pX02 and chromosomal DNA. // FEMS Microbiol. Leett.-1996.-VoI.145.-P.9-16.

128. Reif C., Johns M., Pillal S., Carl M. Identification of capsule- forming B.anthracis spores with the PCR a Novel dual-probe hybridization format.//Appl. Environ. Microbiol.-1994.-P.1622-1625.

129. Robertson D., Bragg T.S., Simpson S. et. al. Mapping and characterization of B. anthracis plasmids pXOl and pX02 //Salisbury.med. Bull. 1990. - V. 68 (Spec. Suppl.). - P. 55 -58.

130. Robertson D.L. Mapping and characterization of the Bacillus anthracis plasmids pXOl and pX02. // Inter. Workshop on anthrax. 11-13 april 1989. Winchester, England. 1989. - P. 58.

131. Robertson D.L., Leppla, S.H. Molecular cloning and expression in Escherichia coli of the lethal factor gene of Bacillus anthracis. II Gene. 1986. - Vol. 44. - P. 71-78.

132. Robertson D.L., Tippetts M.T., Leppla S.H. Nucleotide sequence of the Bacillus anthracis edema factor gene (cya); a calmodulin-dependent adenylate cyclase //Gene. 1988. - Vol. 73. - P. 363-371.

133. Rossen L., Norskov P., Holmstrom K., Rasmussen O.F. Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assay and DNA extraction solutions // Intern. J. Food Microbiol. 1992. - Vol. 17. - P. 37-45.

134. Ruhfel R.E. Robillard N.J. and Torne C.B. Interspecies transduction of plasmid among Bacillus anthracis, B. cereus and B. thuringiensis. // J. Bacteriol. — 1984-Vol 157/-№3.-P. 708-711.

135. Singh Y., Leppla S.H., Bhatnagar R., Friedlander A.M. Internalization and processing of Bacillus anthracis lethal toxin by toxin-sensitive and -resistant cells //J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264, N 19. - P. 11099-11102.

136. Stretton S., Goodman A.E. Carbon dioxide as a regulator of gene expression in microorganisms. // Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 1998. - Vol. 73, N 1. - P. 79-85.

137. Stretton S., Goodman A.E. Carbon dioxide as a regulator of gene expression in microorganisms. // Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 1998. - Vol. 73, N 1. - P. 79-85.

138. Tenover F.C. Diagnostic deoxyribonucleic acid probes for infectious diseases.// Clin.Microbiol.Rev. 1988. - V.l. -N. 1.

139. Thorne C.B. Biochemical properties of virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis. II Ann. N.Y. Acad. Sci. 1960. - Vol. 88. - № 6. - P. 1024-1033.

140. Tippetts M.T., Robertson D.L. Molecular cloning and expression of the Bacillus anthracis edema factor toxin gene: a calmodulin-dependent adenylate cyclase //J. Bacteriol. 1988. - Vol. 170, N 5. - P. 2263-2266.

141. Tsai Y-L., Olson B.H. Rapid method for separation of bacterial cells in soil and sediments by polymerase chain reaction. // Appl. and Environ. Microbiol. 1992. - Vol. 58. - P. 2292-2295.

142. Turnbull P.C.B., Hutson R.A., Ward M.J., Jones M.N., Quinn C.R., Finnie N.J., Duggleby C.J., Kramer J.M. and Melling J. Bacillus anthracis but not always antrax // J. Appl. Bacter. № 72. - P. 21-28.

143. Turnbull P.C.B., Kramer J.M. Bacillus // Manual of clinical microbiology. -Vl-th edition. A.Balaws Ed.- American Soc.Microbiol., Washington DC. - 1991. -P.296-303.

144. Turnbull PCB, Hutson RA, Ward MJ, Jones MN, Quinn CP, et al. 1992. Bacillus anthracis but not always anthrax. II J. Appl. Bact. 72:21-28

145. Uchida I, Makino S, Sasakawa C, Yoshikawa M, Sugimoto C, Terakado N. 1993. Identification of a novel gene, dep, associated with depolymerization of thecapsular polymer in Bacillus anthracis. Mol. Microbiol. 9:487-96

146. Uchida I., Hashimoto K., Makino S.-I., Sasakawa C., Yoshikawa M., Terakado N. Restriction map of a capsule plasmid of Bacillus anthracis //Plasmid. -1987. Vol. 18. P. 178-181.

147. Uchida I., Hashimoto K., Makino S.-I., Sasakawa C., Yoshikawa M., Terakado N. Restriction map of a capsule plasmid of Bacillus anthracis //Plasmid. -1987. Vol. 18.-P. 178-181.

148. Uchida I., Hashimoto K., Terakado N. Virulence and immunogenicity in experimental animals of Bacillus anthracis strains harbouring or lacking 110 MDa and 60 MDa plasmids //J. Gen. Microbiol. 1986. - Vol. 132. - P. 557-559.

149. Uchida I., Hornung J.M., Thorne C.B., Klimpel K.R., Leppla S.H. Cloning and characterization of a gene whose product is a /гаш-activator of anthrax toxin synthesis //J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175, N 17. - P. 5329-5338.

150. Uchida I., Sekizaki Т., Hashimoto K., Terakado N. Association of the encapsulation of Bacillus anthracis which a 60 megadalton plasmid //J. Gen. Microbiol. 1985. - Vol. 131. - P. 363-367.

151. Vietri N.J., Marrero R., Hoover T.A., Welkos S.L. Identification and characterization of a trans-activator involved in the regulation of encapsulation by Bacillus anthracis //Gene. 1995. - Vol. 152. - P. 1-9.

152. Vodkin M.H., Leppla S.H. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis. II Cell. 1983. - Vol. 34. - P. 693-697.

153. Warhurst D.C., Awad F.M., Karied E., Miles M.A. Simplified preparation of malarial blood samples for polymerase chain reaction. // Lancet. 1991. - P. 303.

154. Welkos SL. 1991. Plasmid-associated virulence factors of non-toxigenic (рХОГ) Bacillus anthracis. Microh. Pathog. 10: 183-98

155. Weyant R.S., Edmonds P., Swaminathan B. Effect of ionic- and non-ionicdetergents on the Taq-polymerase. // Bio. Techniques. 1990. - V. 9. - P 308309.

156. Wilde J., Eiden .!., Yolken R. Removal of inhibitory substances from human fecal specimens for detection of group A rotaviruses by reverse transcriptase and polymerase chain reaction. // J. Clin. Microbiol. 1990. - V. 28. - P. 1300-1307.

157. Wilson I.G. Inhibition and facilitation of nucleic acids amplification. // Appl. and Environ. Microbiol. 1997. - Vol. 63. - P. 3741-3751.

158. Wilson W.J., Stout C.L., DeSantis T.Z., Stilwell J.L., Carrano A.V., Andersen G.L. Sequence-specific identification of 18 pathogenic microorganisms using microarray technology //Mol. Cell. Probes. 2002. - Vol. 16, № 2. - P. 119-127.

159. Xudong L., Ma Fengging, Yu Dongzheng and Lin Tao. Plasmid and protein profiles of Bacillus anthracis strains isolated in China // Proc. Inter. Workshop on anthrax. Winchester, England. September 19-21, 1996. -№87. - P. 43-45.

160. Zheng J., Shang F., Ning Y. Monoclonal antibodies against protective antigens В.anthracis.//Acta genet.sin.-1984.-Vol.l 1. -N5.-P.348-354.