Научно-методические основы оценки влияния возбудителей холеры, чумы и туляремии на адаптационно-компенсаторные реакции биомоделей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, доктор медицинских наук Бугоркова, Светлана Александровна

• Бугоркова, Светлана Александровна
• доктор медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Бугоркова, Светлана Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА I МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1.1. Объекты исследования

1.2. Материалы

1.3. Методы исследования

ГЛАВА II ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ НА ОРГА

НИЗМ БИОМОДЕЛИ

2.1. Аналитический обзор

2.2. Изучение влияния штаммов V. ско1егае 01 серогруппы на 37 адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма

2.2.1. Фенотипическая и генотипическая характеристика 37 штаммов холерных вибрионов 01 серогруппы

2.2.2. Морфометрический анализ изменений в организме 43 крольчат-сосунков, зараженных холерными вибрионами 01 серогруппы

2.3. Структурно-функциональный анализ изменений у кроль- 55 чат-сосунков, зараженных холерными вибрионами 0139 серогруппы

2.3.1. Характеристика штаммов холерных вибрионов 55 0139 серогруппы

2.3.2. Морфофункциональная характеристика апудоци- 57 тов и клеток эффекторной зоны иммунной системы кишечника у крольчат-сосунков, зараженных холерными вибрионами 0139 серогруппы

2.4. Совершенствование схемы оценки влияния холерных виб- 60 рионов на организм крольчат-сосунков

2.5. Воспроизведение экспериментальной холерной инфекции 64 на модели взрослых кроликов

2.5.1. Характеристика штаммов V.cholerae, используе- 64 мых для воспроизведения экспериментального инфекционного процесса и его мониторинг

2.5.2. Методические основы комплексной оценки тяже- 74 сти течения экспериментальной инфекции на модели взрослых кроликов

ГЛАВА III РЕКОМБИНАНТНЫЕ ШТАММЫ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА

КАНДИДАТЫ В ЖИВЫЕ ХОЛЕРНЫЕ ВАКЦИНЫ. ХАРАКТЕРИСТИКА ИХ БЕЗОПАСНОСТИ (БЕЗВРЕДНОСТИ) И ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ

3.1. Аналитический обзор

3.2. Комплексное исследование влияния рекомбинантного 86 штамма холерного вибриона 01 серогруппы на организм биомодели

3.2.1. Характеристики рекомбинантного штамма Vibrio 86 cholerae eltor Inaba KM

3.2.2. Морфофункциональная характеристика клеток 88 APUD-системы у взрослых кроликов при введении

V. cholerae КМ

3.2.3. Изменения, вызываемые V.cholerae КМ 184 у 95 крольчат-сосунков

3.2.4. Оценка эффективности защиты эксперименталь- 99 ных животных, иммунизированных V cholerae КМ184, от холерной инфекции

3.3. Анализ изменений у биомоделей при введении рекомби- 108 нантного штамма холерного вибриона 0139 серогруппы

3.3.1. Характеристика рекомбинантного штамма 108 V.cholerae КМ

3.3.2. Особенности реакций функциональных систем 109 биомодели на внутрикишечное введение холерных вибрионов штамма V.cholerae КМ

3.3.3. Инфекционный процесс у биомоделей, предвари- 110 тельно иммунизированных холерными вибрионами штамма V.cholerae КМ

3.3.4. Ультрамикроскопический анализ реакций макро- 116 организма на холерные вибрионы рекомбинантных штаммов 01 и 0139 серогрупп

ГЛАВА IV КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ВИРУЛЕНТНЫХ 120 ШТАММОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ОРГАНИЗМА ПРЕДВАРИТЕЛЬНО ИММУНИЗИРОВАННЫХ ПРОТИВ ХОЛЕРЫ БИОМОДЕЛЕЙ

4.1. Аналитический обзор

4.2. Исследование клеток нейроэндокринной системы организ- 128 ма для характеристики эффективности защиты лабораторных животных от экспериментальной холерной инфекции

4.3. Характеристика инфекционного процесса у биомоделей, 137 предварительно иммунизированных противохолерными препаратами на основе «теней! клеток холерных вибрионов

01 -серогруппы

4.4. Морфометрический анализ изменений у животных, пред- 143 варительно иммунизированных противохолерными препаратами на основе «теней» клеток холерных вибрионов 0139 серогруппы

ГЛАВА V ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЬЮТЕРНЫХ СИСТЕМ В КОМПЛЕКС- 150 НОЙ ОЦЕНКЕ БЕЗОПАСНОСТИ (БЕЗВРЕДНОСТИ) И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОХОЛЕРНЫХ ВАКЦИН НА ЭТАПАХ ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 5.1. Предпосылки для формирования научно-методической ос- 151 новы комплексных доклинических исследований противохолерных вакцин

5.2. Усовершенствование схемы оценки качества противохо- 154 лерных вакцин

ГЛАВА VI МОРФОМЕТРИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕН

ТАЛЬНОГО ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА, ОБУСЛОВЛЕННОГО ВОЗБУДИТЕЛЯМИ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ

6.1. Аналитический обзор

6.2. Изучение влияния Y. pestis на адаптационно- 173 компенсаторные процессы в организме лабораторных белых мышей

6.2.1. Характеристика штаммов Y. pestis, используемых в 173 исследовании

6.2.2. Морфометрический анализ изменений в организ- 177 ме биомодели при экспериментальной чуме

6.3 Отбор морфометрических маркеров тяжести течения пато- 185 логического процесса при чуме на модели морских свинок

6.4 Характеристика течения чумного инфекционного процесса 193 на фоне предварительной иммунизации биомоделей против этой инфекции

6.5 Возможность применения морфометрического анализа для 195 оценки степени тяжести течения экспериментальной ту-ляремийной инфекции

6.6 Оценка влияния вирулентных культур F. tularensis на ха- 200 рактер изменений у предварительно иммунизированных против туляремии биомоделей

ГЛАВА VII РЕАКЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СТРУКТУР ОРГАНИЗМА

БИОМОДЕЛЕЙ НА ВВЕДЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЧУМЫ И ТУЛЯРЕМИИ

7.1. Аналитический обзор

7.2. Влияние вакцинного штамма Yersinia pestis EV линии 213 НИИЭГ на клетки APUD-системы ряда функционально значимых органов биомоделей

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Научно-методические основы оценки влияния возбудителей холеры, чумы и туляремии на адаптационно-компенсаторные реакции биомоделей»

Актуальность проблемы. Инфекционные болезни, и в их числе особо опасные инфекции, занимают значительное место в структуре заболеваемости и смертности населения многих стран мира, включая Россию [Информ. сборник статистических и аналитических материалов. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации в 2003-2004 г.г., 2005; Оншценко Г.Г., 2006; ЕИКЗР, 2007].

Необходимость получения новых знаний о пато- и иммуногенезе инфекционного и вакцинного процессов, связанная с реальной; потребностью создания современных, надежных средств профилактики и лечения особо опасных инфекционных болезней, обусловливает интерес исследователей к всестороннему рассмотрению проблемы взаимодействия микро- й макроорганизма [Smith Н., 2000; Бухарин О.В. и др., 2002; Туйгунов М.М. и др., 2003; Железнйкова Г.Ф., 2006]:

Молекулярно-бйологический анализ возбудителей особо опасных инфекций значительно опережает исследования в области изучения различных сторон взаимодействия патогенных бактерий с макроорганизмом. Но данных о внутривидовом и генетическом разнообразии возбудителей; холеры, чумы, и туляремии [Farugue S.M., Nair G.B. et al., 2004; Zhou D., Han Y., Yang R., 2006; Смирнова Н.И., Кутырев B.B., 2006], являющихся основой для получения знаний о ключевых факторах их патогенности и вирулентности, недостаточно для адекватного решения вопросов, связанных с разработкой новых и совершенствованием уже имеющихся средств и методов эффективной борьбы с особо опасными инфекционными болезнями.

Инфекционный процесс, рассматриваемый как результат взаимодействия микро- и макроорганизма, отражает состояние нарушенного баланса между уровнями экспрессии детерминант вирулентности первого и адекватностью функционирования защитных барьеров второго [Атауллаханов Р.И., Гинцбург A.JL, 2005; Portnoy D., 2005; Bradley С., Griffiths N., Rowe H. et al., 2005]. В этом аспекте определенный интерес представляют экспериментальные исследования особенностей взаимодействия организма биомоделей с возбудителем инфекции, основанные на выяснении роли молекулярных механизмов патогенности микроорганизма, приводящих к разбалансировке функционирования систем реагирования и контроля макроорганизма. / \ '.-'"Л' * ' ю7 ^ ' ' ' • '. ;

Решение этой задачи невозможно без расширения методической базы традиционного экспериментального исследования инфекционного и вакцинного процессов при работе с возбудителями особо опасных инфекционных болезней за счет внедрения мррфофункционального и морфометрического анализа адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма на патоген. Так, для объективного суждения о состоянии функциональных систем макроорганизма при моделировании экспериментального инфекционного процесса в количественной оценке нуждаются: выраженность воспалительных и иммунных реакций, интенсивность регенеративных и некротических процессов^ особенности и интенсивность гистохимических и иммуногистохимических характеристик клеток нейроэндокринной системы, элементов мукозального гомеостаза и ряд других параметров.

Эксперименты на лабораторных животных являются важным этапом при доклиническом испытании вккцин. При этом научные основы оценки качества вакцин, несмотря на большой фактический материал, накопленный в этой области, только начинают формироваться. В то же время имеющиеся вакцины против особо опасных инфекционных болезней не лишены недостатков [Медуницын Н.В., 2004; КаЫг Б., 2005], а поиск диагностических и прогностических критериев их безопасности является актуальной научной проблемой, требующей всестороннего изучения.

Важное место в перечне методов доклинической оценки вакцин занимает морфологическое исследование изменений, выявляемых с помощью целого ряда морфологических, гистоэнзимологических, иммуногистохимических приемов [Ширанович М.П., 1987; Назарова Л.С., 1995; Исупов И.В. и др., 2004], которое позволяет получать достаточно информативные данные обо всех структурных изменениях в клетках и тканях макроорганизма. Но в существующих нормативных документах [РД 42-28-8-89; РД 42-28-10-90; СП 3.3.2.561-96; МУ 3.3.1.1113-02; МУ 3.3.1.2075-06; МУ 3.3.1.2161-07] основное внимание при проведении морфологического исследования уделяется верификации тканевых изменений, что в определенной степени нивелирует их связь с функциональными расстройствами отдельных систем, участвующих в реализации защиты подопытных животных.

Оценка степени выраженности изменений в органах и тканях биомоделей при экспериментальном ващинном процессе, базирующаяся на применении тезиса оптимального морфофункционального соотношения" элементов системы для ее эффективной работы [Труфакин В.А., Шурлыгина A.B., 2002], подразумевает широкое использование методов морфометрического анализа. Но многие структурные и функциональные взаимосвязи в работе системы реагирования и контроля макроорганизма (нейроэндокринной, иммунной) при вакцинном процессе, обусловленном препаратами для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии, остаются мало изученными.

В связи с недостаточным изучением проблемы взаимодействия микро- и макроорганизма in vivo, комплексное исследование влияния возбудителей Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Fransiceila tularensis с определенным набором детерминант вирулентности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма особенно актуально для расширения представлений о патогенезе этих заболеваний. Разработка алгоритма проведения патоморфологического исследования экспериментального инфекционного и вакцинного процессов направлена на формирование научно-методической основы для информативной и объективной оценки качества вакцинных препаратов против холеры, чумы и туляремии на этапах их разработки и доклинического испытания.

Цель исследования. Совершенствование научно-методической основы оценки качества вакцинирующих препаратов против особо опасных инфекций, базирующейся на комплексном исследовании влияния возбудителей холеры, чумы и туляремии с различным набором детерминант вирулентности и иммуногенности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма. Задачи исследования: ¡.Осуществить подбор штаммов возбудителей V. cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой для воспроизведения экспериментального инфекционного процесса и изучить их влияние на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма, определяемые по ряду мор-фометрических параметров. 2. Разработать алгоритм патоморфологической оценки тяжести течения экспериментального инфекционного процесса при холере, чуме и туляремии. Определить возможность его применения при использовании аппаратно-программных компьютерных комплексов.

3. Предложить морфометрические критерии для отбора штаммов У.скоЫгае, используемых в качестве контрольных в морфологических и иммунологических исследованиях.

4. Выявить особенности влияния холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп на клетки АР1Ю-системы кишечника и другие элементы кишечного «барьера» биомоделей.

5. Охарактеризовать течение инфекционного процесса в организме биомоделей, используя природные штаммы чумного и туляремийного микробов с различной вирулентностью. Сопоставить данные морфологического и морфо-метрического анализа изменений во внутренних органах подопытных животных с генетическими особенностями этих штаммов.

6. Провести морфофункциональный и морфометрический анализ адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма при моделировании вакцинного процесса с использованием коммерческих вакцин и экспериментальных пре паратов.

7. Оценить реакцию «барьерных» структур (желудочно-кишечного тракта, лимфоидных органов, дыхательной системы) макроорганизма при введении живых коммерческих вакцин, атгенуированных и рекомбинантных штаммов возбудителей холеры, чумы и туляремии.

8. Изучить реакцию апудоцитов функционально значимых систем организма, клеток мукозального эпителия, образований эффекторной зоны иммунной системы желудочно-кишечного тракта и легких, лимфоидной системы при моделировании инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации биомоделей коммерческими и экспериментальными препаратами для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии.

Научная новизна и теоретическая значимость.

Впервые при изучении влияния на макроорганизм штаммов возбудителей V. ско1егае, У. реяШ и .Р. 1и1агет1$ с различной генетической характеристикой разработан алгоритм проведения патоморфологических исследований экспериментального инфекционного и вакцинного процессов и определены морфометрические параметры, объективно характеризующие тяжесть течения патологического процесса у биомоделей. Впервые оценена реакция нейроэндокринных клеток

НЭК) лимфоидных органов, лимфатических структур в легких и кишечнике при особо опасных инфекциях и вакцинации против них. Подобраны морфометриче-ские параметры для характеристики адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма при моделировании инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации против холеры, чумы и туляремии. Обоснована необходимость проведения комплексных исследований при оценке безвредности, реактогенности и иммунологической эффективности вакцин против холеры, чумы и туляремии и показаны возможности применения для этого аппаратно-программных компьютерных комплексов с целью получения стандартизированных объективных результатов. Усовершенствована научно-методическая основа оценки экспериментальных препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии.

Впервые показана возможность применения морфометрических характеристик состояния апудоцитов кишечника, клеток эффекторной зоны иммунной системы и слизеобразующих элементов мукозального эпителия желудочно-кишечного тракта для оценки качества противохолерных вакцин и степени выраженности холерного инфекционного процесса (патент на изобретение № 2301075 «Способ оценки качества вакцинных препаратов против холеры»). Впервые предложены морфометрические критерии для отбора штаммов холерного вибриона, используемых в качестве контрольных в морфологических и иммунологических исследованиях (патент на изобретение № 2254371 «Авирулентный тест-штамм бактерий Vibrio cholerae биовара eltor серовара Ogawa (ctxA~, tcpA', toxR', zof), используемый в иммунологических, генетических исследованиях и учебном процессе»).

Практическая ценность. Предложенный алгоритм патоморфологического исследования был применен при проведении Государственных доклинических испытаний рекомбинантного штамма V. cholerae eltor КМ184 - кандидата в живые противохолерные вакцины (Протокол №5 от 15.01.2001 г.)

Результаты исследований использованы в следующих документах:

- Методические указания МУ 3.3.1.2075-06 «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко и введенные в действие с 11.07.06 г. взамен методических указаний «Основные критерии оценки вакцинных. штаммов холерного вибриона», утвержденных Госкомсанэпиднадзором России от 17.10.1994 г. № 01 -19/48-11 ;

- Методические указания МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам. туляремийного микроба», утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации F.F. Онищенко и введенные в действие впервые с 01.04.07 г.;

- Методическое пособие «Моделирование холерной инфекции методом RITARD», одобренное Ученым советом (протокол № 1 от 01.02.02 г.) и утвержденное директором РосНИПЧИ «Микроб» (05.02.02 г:); ,

- Методические рекомендации «Оценка эффективности противохолерных вакцин по ряду морфофункциональных показателей адаптационно-приспособительной реакции: биомодели к холерной инфекции», одобренные Ученым советом (протокол № 5 от 11.05.06 г.) и утвержденные директором Pocl 1ИП-ЧИ«Микроб» (12.05.06 г.); . ■"";.■ ' '' / ■ ; - Методические рекомендации. «Тёжика и прядок забора гистологического материала . для морфометрических исследований от биомоделей, зараженных возбудителями I-II групп патогепности», одобренные Ученым советом (протокол № 3 от 17.06.08 г.) и утвержденные директором РосИИПЧИ «Микроб» (18.06.08 г.).

Научные и практически значимые результаты работы используются в лекционном курсе первичной специализации и усовершенствования врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».

Опубликованные материалы исследования явились основой для написания монографий:

- «APUD-система кишечника животных при холерной инфекции, интоксикации и вакцинальном процессе».- Деп. ВИНИТИ, 2000;

- «Патоморфологические подходы к доклинической оценке холерных вакцин».- Деп. ВИНИТИ, 2002;

- «Патоморфологические аспекты доклинических испытаний вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры».- Саратов: ЗАОПЦ «ИППОЛиТ-99», 2004.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Введение штаммов возбудителей V.cholerae, Y. pestis, F. tularensis с различной генетической характеристикой вызывает в организме биомоделей изменение морфометрических показателей, степень выраженности которых находится в зависимости от полноты набора детерминант вирулентности микроорганизма.

2. Разработанные алгоритмы проведения комплексных исследований влияния возбудителей У.ско1егае, У. резШ, Р. Шагепв{8 на адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей при моделировании инфекционного и вакцинного процессов повышают информативность экспериментального патоморфо-логического исследования.

3. Предложенные морфометрические параметры позволяют отбирать штаммы У.ско1егае для использования в качестве контрольных при проведении морфологических и иммунологических исследований.

4. Применение разработанных коэффициентов и индексов для учета состояния трех групп клеточных элементов в слизистой оболочке кишечника объективизирует и стандартизирует оценку качества противохолерных вакцинных препаратов на доклиническом этапе исследований

5. Морфометрические и морфофункциональные эквиваленты адаптационно-компенсаторных и иммунопатологических реакций у биомоделей характеризуют направленность процессов иммуногенеза при первичном и вторичном иммунных ответах.

6. Реакция апудоцитов функционально значимых органов биомоделей при инфекционном и вакцинном процессах отражает уровень вовлечения АР1Л> системы макроорганизма в процесс поддержания его гомеостаза.

7. В основе повышения объективности оценки безвредности, реактогенно-сти и иммунологической эффективности препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии на этапах их доклинического изучения лежит широкое применение возможностей базовых аппаратно-программных компьютерных комплексов для денситоморфометрической характеристики состояния клеток и тканей макроорганизма.

Апробация работы.

Исследования проведены в рамках плановых НИР РосНИПЧИ «Микроб» в период 1999 - 2008 г.г.: 025-99 «Изучение иммунобиологических свойств потенциально вакцинных рекомбинантных штаммов холерного вибриона, несущих гетеро-логические антигены» № госрегистрации 01.99.0008392; 006-3-01 «Разработка и усовершенствование унифицированных методов оценки безопасности вакцинирующих иммунобиологических препаратов против особо опасных инфекций» № шсрегистрации 01.200.11150Í; 21-4г04.х<Патоморфологические аспекты изучения нейроэндокринных механизмов в становлений противохолерного иммунитета» № госрегистрации 0120.0504666; 32-3-08 «Изучение взаимодействия возбудителей чумы, туляремии с организмом хозяина при. инфекционном и вакцинальном процессе». Исследованиё иммуногенных и протективных свойств препаратов «теней» клеток холерных вибрионов OI и 0139 серогрупп (VCG/01 с TCP и VCG/01 без TCP; VCG/0139 с TCP и VCG/0139 без TCP) выполняли в рамках договора Рос-НИПЧИ «Микроб» с институтом микробиологаи и генетики, Универстйтета г. Вены, Австрия (1999-2000); ФЦНТЦ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы,: Блок I «Ориентированные фундаментшгьные исследования», раздел «Технологии живых систем», подраздел «Защитаотпатогёнов». .:.'• .'•' y"''''

Основные результата диссертационно .

•.: - Всероссийской научно-практической конференции "Новые технологии в медицине", 13-14 апреля 2001 г., Саратов;

- Общероссийской конференции с международным участием "Проблемы морфологии", 14-16 мая 2002 г., г. Сочи;

- Vin Российской, научно-практической конференции по проблеме "Холера", 4-5 июня 2003 г., г. Ростов-на-Дону;

- XIX съезде физиологического общества им. И. П. Павлова, 19-24 сентября 2004 г., г. Екатеринбург;

- Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье", 19-22 мая 2005 г., г. Суздаль;

- XXI Российской конференции по электронной микроскопии, 5-10 июня 2006 г., г.Черноголовка;

- VII Российском съезде врачей-инфекционистов "Новые технологии в диагностике и лечении инфекционных болезней", 25-27 октября 2006 г., город Нижний Новгород;

- VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в рамках Санкт-Петербургского саммита «Групп восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств», 3-5 октября 2006 г., г. Оболенск;

- проблемной комиссии 50.04 «Холера и патогенные для человека вибрионы» Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (50.00) 2000-2006 г.г.;

- IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26-27 апреля 2007 г., г. Москва;

- VIII конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии", 27-29 июня 2007 г., г. Москва;

- VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ», 25-26 сентября 2007 г., г. Саратов;

- на научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований» в институте «Микроб» 2000-2008 г.г.

Публикации результатов исследований Основные положения диссертации изложены в 46 печатных работах, опубликованных в период с 1999 г. по 2008 г., из них 15 статей в рекомендованных ВАК изданиях.

Структура работы

Диссертация изложена на 337 листах машинописного текста, состоит из введения, 7-ми глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 201 отечественный и 182 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 89 таблицами и 47 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Бугоркова, Светлана Александровна

выводы

1. В-ответ на введение штаммов У.ско1егае, У. резНэ, Р. Ш1агепз1з с различной генетической характеристикой, рекомбинантных штаммов У.сНо1егае, экспериментальных и коммерческих препаратов для специфической профилактики холеры, чумы и туляремии выявлены особенности изменения ряда морфометриче-ских параметров, характеризующих адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей, дополняющие имеющиеся представления о пато- и иммуногенезе указанных инфекций.

2. Введение штаммов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп с генотипом с£сА+ го? асе+ ¿срА+приводит к развитию выраженных морфологических изменений в желудочно-кишечном тракте и внутренних органах биомоделей, вызывая функциональное напряжение клеток 1АР1Ш-системы кишечника с увеличением индекса активности апудоцитов по отношению»к контактному контролю в 24-14 раз соответственно. Изменения в тонком кишечнике биомоделей на введение культур холерных вибрионов штаммов с генотипом. сЬсА~ ^рА+ и ОхА1срА' носят однонаправленный характер, не имеют достоверных отличий между собой и свидетельствуют об умеренном напряжении морфофункционального состояния апудоцитов с увеличением их индекса активности в 3 раза. По предложенным морфометриче-ским параметрам отобран штамм У.ско1егае биовара еЫог, серовара О^алуа (с/хА~, гоЮхК), предлагаемый в качестве контрольного для морфологических и иммунологических исследований.

3. Установлены различия в течении экспериментальной холерной инфекции у биомоделей, зараженных холерными вибрионами 01 и 0139 серогрупп, касающиеся особенностей морфофункционального состояния клеток кишечника, выполняющих барьерные функции: межэпителиальных лимфоцитов, апудоцитов, бокаловидных клеток, клеток собственной пластинки слизистой оболочки кишечника. Изменение соотношения между различными клеточными популяциями, нарушение интенсивности обменных процессов в них отражают уровень повреждающего действия холерных вибрионов на функциональные системы макроорганизма.

4. При испытанииэффе1сгивности.эксперименггальны?си^коммерлеаких^про-тивохолерных вакцин и рекомбинантных штаммов- У.сНо1егае 01 и 0139 серогрупп обнаружены изменения числа и морфофункционального состояния апудоцитов кишечника, клеток эффекгорной зоны иммунной системы желудочно-кишечного тракта и нейроэндокринных клеток в лимфоидных органах, в том числе в лимфоидной ткани, ассоциированной с. кишечником биомоделей, в.зависимости от используемого препарата, способа и кратности его введения; степени выраженности иммунологической перестройки в органах иммунной системы на момент за-. ■ ражения. ■ ■ >; .' • '• •■':■ ■•.';•• "'■•,/■■"■'■• '■'■■■■••'. "'

5. Разработан способ оценки качества вакцинных препаратов против холеры,. включающий морфологическое исследование гистологического материала от биопроб с использованием мор фометрической характеристики трех групп клеточных элементов в слизистой оболочке кишечника и математическую обработку количественных, показателей. Применение предложенных коэффициентов и индексов учета результатов; способствует объективизации и унификации оценки качества противохолерных вакцин. ' . - .

6. При заражении беспородных белых мышей культурами Штаммов Y.pestis pFra+, pPst+, pCad-, Pgm+ и- Y.pestis pFra+, pPst+, pCacT, Pgmr выявлены, отличия в состоянии функционально значимых систем! макроорганизма по изменению мор-фометрических параметров, характеризующих размер?органа, число и,площадь его функционально. активных структур (фолликулов лимфоидных органов, почечных телец и сосудистых клубочков, легочных альвеол и капилляров), количество клеток разных видов, отвечающих на антигены возбудителя, в том числе апудоцитов, клеток ретикулоэндотелиальной системы, гепатоцитов.

7. Об эффективности защиты морских свинок, предварительно иммунизированных вакцинными штаммами Y.pestis EV линии НИИЭГ и F.tularensis 15 линии НИИЭГ, при введении вирулентных культур этих микроорганизмов свидетельствует отсутствие выраженных изменений морфометрических параметров, отражающих функциональное состояние печени, почек, аэрогематического барьера легких, клеток нейроэндокринной системы макроорганизма.

8. . Выявлен фазный; характер изменений количества и морфофункциональ-ного состояния нейроэндокринных клеток в лимфоидных органах и легких при подкожном и аэрогенном способах иммунизации биомоделей вакциной Y.pestis EV, отражающий направленность процессов иммуногенеза и выраженность стресс-реакции макроорганизма.

9. Для повышения объективности характеристики безвредности, реактоген-ности и иммунологической эффективности живых вакцин против чумы и туляремии с помощью экспертной системы предложен алгоритм оценки степени тяжести экспериментальной инфекции и адаптационно-компенсаторных реакций у биомоделей при моделировании вакцинного процесса, основанный на применении мор-фометрических показателей: ядерно-цитоплазматического индекса светлых гепато-цитов, деструктивного индекса, перфузионно-вентиляционного отношения, количества и морфофункционального состояния нейроэндокринных клеток (в лимфо-идных органах, легких, надпочечниках) и клеток ретикулоэндотелиальной системы, определяемых с использованием аппаратно-программных компьютерных комплексов. i . . " 304 '

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Ежегодно в мире инфекционные болезни регистрируются более чем у двух миллиардов человек [WER; 2007;. ЕЩСЗР, 2007]. В. результате роста и развития экономической деятельности, открытия границ, миграции населения, увеличения объемов международных сообщений и торговли тенденция к глобализации инфекционных болезней- будет сохраняться. Одним из стратегических, направлений в борьбе с инфекционными, в том числе и с особо опасными, болезнями является • совершенствование мер и средств их профилактики. Иммунопрофилактика" особо, опасных 6äKTepHajibHbix инфекций проводится в рамках Российского национального календаря? прививок по эпидемическим показаниям [Приказ. Минздрава России от 27.07.2001 № 229; Медуницын F I.В., 2004]. Но все имеющиеся на настоящий момент вакцины против холеры, чумы и туляремии,не лишены недостатков.

Совершенствование средств для специфической профилактики; холеры, чумы и туляремии связано с формированием адекватной системы их доклинической оценки. На решение этой задачи направлены исследования по раскрытию ранее неизвестных сторон, патогенеза особо опасных инфекционных болезней. Знание .каждого-этапа взаимодействия?микро- и макроорганизма, основанное.на выяснении взаимосвязи; конкретного морфологического описанияшатологического или адаптационно-компенсаторного процесса в макроорганизме, обусловленного особенностями защитных механизмов конкретной биомодели, с характеристикой факторов патогенности и их генетическим контролем у микроорганизма, позволит расширить.представления о сути инфекционного процесса.

Взаимоадаптация патогена; и хозяина определяет динамику развития взаимоотношений, й системе паразит-хозяин: и, соответственно, исход инфекционного процесса [Бухарин 0;В:, 2000; Бухарин О .В. и др;, 2005]. Результатом таких взаимоотношений является выработка возбудителем активных молекул-лигандов, способных к узнаванию комплементарных структур (специфических рецепторов) макроорганизма, связьшанию с ними и последующему воздействию на различные мишени в; его клетках и тканях с нарушением их функционирование. При этом свойства., бактерий; определяемые .в опытах im vitro, отличаются от свойств, проявляемых ими in vivo в: силу способности патогена адаптироваться к организму чувствительного хозяина [Smith Н, 2000]. Процессы адаптации затрагивают и макроорганизм. Огромная нагрузка ложится на системы реагирования, контроля и защиты макроорганизма - иммунную, нейроэндокринную, в том числе АР1Ю-систему. Разбалансировка в работе этих систем приводит к негативным последствиям, вызывая структурные изменения, порой несовместимые с жизнью.

В" этой связи приобретает все большую актуальность вопрос научно-методического обеспечение исследований, связанных с детальной характеристикой инфекционного и вакцинного процессов. Нами была поставлена цель - провести комплексное изучение влияния возбудителей холеры, чумы и туляремии с различным набором детерминант вирулентности и иммуногенности на адаптационно-компенсаторные реакции макроорганизма, что считали необходимым для совершенствования научно-методической основы оценки качества вакцинирующих препаратов против этих инфекций.

Острые инфекционные диарейные заболевания различной этиологии остаются одной из главных проблем здравоохранения всего мира. Седьмая пандемия холеры поставила перед специалистами ряд серьезных задач, решение которых связано с интенсивным и широкоплановым изучением различных аспектов; патогенеза холерной инфекции и родственных ей диарейных заболеваний. Поэтому в первой части работы рассмотрены вопросы, касающиеся оценки влияния холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп с различным набором детерминант вирулентности на организм биомоделей, а также рекомбинантных штаммов холерного вибриона, разрабатываемых в качестве кандидатов в живые вакцины. Дан сравнительный анализ изменений у биомоделей, зараженных вирулентными холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации коммерческими и экспериментальными препаратами для специфической профилактики холеры. Это позволило сформулировать основные направления для совершенствования оценки качества противохолерных вакцин.

Сведения о выделении от больных с холероподобной симптоматикой с1хА~ штаммов холерного вибриона [Ратникова Л.И., Кузьмина Н.Я. 2002; Безсмертный В.Е., Иванова С.М., Титов Г.В. и др., 2003], позволяют считать, что у этого патогена есть целый ряд других, в том числе и еще неизвестных, факторов вирулентности, экспрессия которых обусловливает инфекционный процесс [Монахова Е.В. и др., 2005]. Но экспериментальные животные не являются полностью адекватной моделью для воспроизведения этой инфекции, поэтому и клинические проявления патологического процесса у них имеют свои особенности, в том числе обусловленные полнотой фенотипического проявления присутствующих в микроорганиз- , ме генетически детерминированных факторов: вирулентности.

Основным показателем проявления функционирования тех или иных генов холерного вибриона в макроорганизме являются нарушения, возникающие в, ответ на инокуляцию микроба, морфологическими эквивалентами которых можно считать развитие различных патологических или адаптационно-компенсаторньтх реакций; ЖКТ биомоделей обеспечивает первую линию защиты от патогена, будучи местом: тесного, взаимодействия функциональных систем макр.оорганизма - пищеварительной, иммунной, АРТЛЗ. Последняя: объединяет клетки; характерным признаком которых считается способность поглощать и накапливать предшественники полипептидных гормонов и биогенных аминов. Процессы синтеза и секреции пептидных гормонов, и биогенных аминов-апудоцитами лежат в основе взаимосвязанг ной деятельности различных органов и систем* организма [Райхлин Н.Т. и др., 1993]. Следует подчеркнуть,, что клетки АР1Ю-системы, располагаясь пракгически во всех органах и продуцируяжизненно'важные гормоны и БАВ; выступают в роли регуляторов; гомеостаза, конечным полезным результатом: деятельности которых является, контроль за,течением метаболических и других процессов на определенном уровне.

Для= исследований были отобраны типичные по родовым и видовым свойствам штаммы У.сНо1егае 01 серогруппы, культуры которых при внутрикишечном введении крольчатам-сосункам приводили к развитию холерогенной (вирулентные), энтеропатогенной (слабо вирулентные) реакции или вообще не вызывали видимых изменений со стороныОККТ биомодели (авирулентные). Определив методом ПЦР в геноме отобранных штаммов наличие основных генов, связанных с вирулентностью (с/х и гср), и дополнительных. (гоГ и асе), провели морфометриче-ский анализ гистологических изменений, выявляемых у зараженных ими крольчат-сосунков, и сопоставили полученные: количественные параметры с особенностями генетической характеристики цггаммов'Кс/го/егае 01 серогруппы.

Для объективной оценки выраженности патологического воздействия холерных вибрионов, штаммов с различной генетической характеристикой (с£сА+№рА+\ ctxÄ tcpA+; ctxA'tcpA') определяли следующие параметры: количество и функциональное состояние апудоцитов, бокаловидных клеток, энтероцитов и МЭЛ в ЖКТ подопытных животных, а также реакцию клеток и тканей- органов, обеспечивающих детоксикацию организма (печень, почки).

Холерные вибрионы 01 серогруппы при внутрикишечном введении их биомоделям вызывали изменение морфофункционального состояния апудоцитов кишечника. Реакция клеток APUD-системы у подопытных животных находилась в зависимости, с одной стороны, от отдела кишечника, а с другой - от особенностей фено- и генотипической характеристики штаммов холерного вибриона, используемых для заражения, и коррелировала со степенью выраженности морфологических изменений в ЖКТ и внутренних органах биомоделей. Для удобства оценки степени функциональной активности апудоцитов использовали разработанный нами индекс функциональной активности (Иап). Так, Иап в тонком кишечнике крольчат, зараженных холерными вибрионами, содержащими полный набор генов патогенности, в 24 раза превышал аналогичный показатель у интактных контрольных животных. При этом наибольшее изменение Иап было характерно для введения холерных вибрионов классического биовара вирулентного штамма V. cholerae 569В. Введение холерных вибрионов штаммов, лишенных гена ctxA, также влияло на изменение Иап у крольчат, но в этом случае показатель не более чем в 3 раза превышал Иап у интактных контрольных животных.

Штаммы с полным набором основных генов, обусловливающих их вирулентность, вызывали у подопытных животных почти 3-х кратное превышение учитываемых морфометрических параметров в почках по сравнению с интакгными крольчатами, изменение в большей степени, чем в других группах, показателей функционального состояния печени. При этом внутри группы у животных, зараженных культурами этих штаммов, имел место определенный разброс величин определяемых показателей, позволяющий выделить среди отобранных культур штаммы, вызывающие максимально выраженные изменения у биомодели. Для ctxA" штаммов холерного вибриона характерным было отсутствие развития типичной холерогенной реакции в кишечнике биомодели, но наличие умеренных изменений учитываемых параметров преимущественно у животных, зараженных культурами штаммов V. cholerae, в геноме которых определялись гены zot и асе, кодирующие продукцию соответствующих токсинов. Наши результаты согласуются с данными Н.И. Смирновой (2007) о незначительном вкладе токсинов Zot и Асе в патогенез холеры.

Таким образом, по результатам морфометрического анализа был выявлен ряд особенностей в реакции функциональных систем макроорганизма на внутри-кишечное введение различных по набору детерминант вирулентности холерных вибрионов. На основании этого были отобраны морфометрические параметры, позволяющие с большей долей достоверности характеризовать морфофункциональ-ное состояние работы систем организма биомодели.

Несмотря на схожесть экспрессируемых факторов патогенности (подвижность, колонизирующая способность, токсические субстанции) у холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп, последние имеют целый ряд особенностей [Ерошен -ко Г.А., 2004]. Но основным фактором патогенности у вибрионов Ol39 серогруп-пы, вызывающим развитие диареи с тяжелой дегидратацией, также является холерный токсин (CT) [Карагозова A.B., Сальникова О.И., 2000]. Аналогичным образом, отобрав штаммы холерных вибрионов 0139 серогруппы, провели анализ морфо-функциональных изменений апудоцитов и клеток эффекторной зоны иммунной системы у подопытных животных, зараженных ими.

Общая направленность ответной реакции APUD-системы кишечника биомоделей на инокуляцию холерных вибрионов заключалась в дегрануляции клеток, то есть в высвобождении того или иного количества БАВ, принимающих непосредственное участие в патогенезе холерной инфекции. Для APUD-системы кишечника подопытных животных, зараженных холерными вибрионами 0139 серогруппы, характерным было снижение количества апудоцитов и увеличение их функционального напряжения. Так, Иап на введение ctxA+ штаммов холерных вибрионов 0139 серогруппы в 14 раз превышал аналогичный показатель у контрольных животных. Реакция клеток APUD-системы у крольчат, зараженных авирулентными холерными вибрионами штаммов, лишенных ctxA гена, сводилась к умеренному функциональному напряжению элементов системы, пропорциональному развивающимся адаптационно-компенсаторным процессам в органах.

Холерные вибрионы 0139 серогруппы штаммов с генотипом ctxA+ zot* асе tcpA+ приводили к быстрой гибели подопытных животных и развитию выраженных изменений во внутренних органах, близких к патологическим процессам, вызываемым вирулентными холерными вибрионами 01 серогруппы. Но в отличие от холерных вибрионов 01 серогруппы в кишечнике подопытных крольчат наблюдали проявления воспалительного характера с превалированием пролиферативно-инфильтративных процессов над явлениями отека и дистрофического поражения энтероцитов. Эти изменения в ЖКТ протекали на фоне выраженных токсических повреждений паренхиматозных органов. Не исключено, что развитие такого рода патологических реакций в макроорганизме на введение холерных вибрионов 0139 серогруппы обусловлено особенностями строения самого микроорганизма: наличием полисахаридной капсулы, нового соматического антигена 0139, некоторыми отличиями в строении ЛПС микроба [Waldor М.К. et al., 1994; Чеховская Г.В., 1996; Ерошенко Г.А., 2004].

Таким образом, возможность сравнения определяемых количественных параметров позволила выявить среди отобранных штаммов холерных вибрионов как культуры, вызывающие у биомоделей наиболее выраженные типичные для холерной инфекции патоморфологические изменения', так и штаммы, не приводящие к развитию таковых. На основании этого был предложен принцип выбора контрольных штаммов для выполнений экспериментальных исследований по поиску и отбору кандидатов в противохолерные вакцины. Внедрение морфометрического анализа, проводимого с применением новых компьютерных технологий, для такого рода исследований было направлено на повышение информативности и качества морфологических заключений.

Использование метода R1TARD для воспроизведения холеры у взрослых кроликов позволило провести мониторинг инфекционного процесса: наблюдать и оценивать у животных диарею по ее интенсивности и длительности, регистрировать выделение холерных вибрионов в окружающую среду и характеризовать их жизнеспособность. Степень выраженности клинической картины болезни у животных коррелировала с интенсивностью гистологических изменений в ряде функциональных систем макроорганизма и подтверждалась результатами морфометрического анализа, причем изменения учитываемых морфометрических параметров находились в зависимости от серогруппы холерных вибрионов, используемых для воспроизведения инфекции, и носили дозозависимый характер. Так, была отмечена прямая корреляционная связь между количеством апудоцитов тонкого кишечника и величиной отека подслизистой оболочки (г =0,8) у животных, зараженных холерными вибрионами 01 серогруппы.

Для полноценной характеристики выявленных гистологических изменений и оценки состояния эффекторной зоны иммунной системы ЖКТ у взрослых кроликов, зараженных вирулентными холерными вибрионами, исследовали клеточный состав СПС оболочки, состояние секреторного аппарата, МЭЛ и апудоцитов кишечника.

Было отмечено, что содержание клеток в СПС оболочки во всех отделах кишечника у животных, зараженных холерными вибрионами 01 серогруппы, было ниже, чем в контроле, что отражало величину выраженности у них отека слизистой и подслизистой оболочек. На введение же холерных вибрионов 0139 серогруппы регистрировали увеличение плотности клеточного инфильтрата в тонком кишечнике и снижение числа клеток в толстом кишечнике. Следовательно, ответная реакция макроорганизма на введение холерных вибрионов 0139 серогруппы характеризовалась преимущественно экссудативным характером изменений в толстом кишечнике на фоне воспалительной реакции в тонком кишечнике, что подтверждалось и присутствием в слизистой оболочке ПМЯЛ. Холерные вибрионы 0139 серогруппы вызывали более выраженную активацию МЭЛ в тонком кишечнике подопытных животных по сравнению с У.ско1егае 01 серогруппы и оказывали значительное влияние на изменение функционального состояния бокаловидных клеток. Так, у всех животных этой группы имела место тенденция к увеличению числа клеток, содержащих КМПС, в то время как число клеток с секретом, представленным НМПС, резко снижалось, что указывало на снижение защитной функции слизи. Общие закономерности в реакции апудоцитов кишечника на введение холерных вибрионов как 01 серогруппы, так и 0139 серогруппы сохранялись и заключались в уменьшении их количества во всех отделах кишечника на фоне их резкого опустошения и некоторого снижения синтетической активности. В целом реакция апудоцитов зависела от интенсивности развития диареи и тяжести течения заболевания у подопытных животных.

Таким образом, был сделан вывод, что основные направления по экспериментально-морфологическому исследованию патогенеза холеры на современном этапе должны базироваться на поиске морфологических эквивалентов - маркеров заболевания и состояний реактивности организма и быть связаны с оценкой клеточных систем защиты организма биомоделей - иммунной, нейроэндокринной и других.

Препараты для специфической профилактики холеры на основе живых холерных вибрионов, по мнению ряда исследователей, лучше убитых [Резников Ю.Б и др., 2000; Calain Р. et al., 2004; Viret J.F. et al., 2004]. Долгие годы разработка живых противохолерных вакцин признавалась перспективным направлением исследований. Но ключевым являлся вопрос учета возможных нежелательных реакций у биомоделей, связанных с введением холерных вибрионов рекомбинантных штаммов - кандидатов в вакцины.

Расширение арсенала методов морфологического исследования, применяемых для учета влияния рекомбинантных штаммов холерных вибрионов на организм биомоделей, за счет введения информативных и доступных к определению параметров адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма, позволило провести комплексную оценку: штамма Vibrio cholerae eltor КМ184, не имеющего гена, кодирующего синтез холерного токсина (СТ), и несущего гены, детерминирующие экспрессию иммуногенной В-субъединицы СТ и фактора колонизации CFAI E.coli; штамма Vibrio cholerae OI 39 КМ182, содержащего рекомби-нантные плазмиды с протективными антигенами - В-субъединицей холерного токсина и адгезином CFAI.

В результате проведенных исследований по изучению рекомбинантных штаммов холерных вибрионов, разрабатываемых в качестве живых холерных вакцин, были получены новые знания о механизмах нейроэндокринной регуляции процессов иммуногенеза. С применением современного компьютерного комплекса для анализа фотоморфометрических параметров клеток в диагностике заболеваний МЕКОС-Ц с программным приложением "Денситоморфометрия" (МЕКОС-ДММ) впервые определены количественные показатели состояния нейроэндокринной системы кишечника и лимфоидных органов, в том числе и в лимфоидной ткани, ассоциированной с ЖКТ.

Динамика изменений морфофункционального состояния апудоцитов кишечника у взрослых кроликов, иммунизированных Vibrio cholerae eltor KM 184, заключались в последовательной смене фаз функциональной активности и покоя клеток. На первом этапе (первые 3-е суток) апудоциты реагировали на стресс, обусловленный способом и характером "обработки биомоделей. Затем, на- фоне становления иммунологических реакций, максимальная функциональная активность апудоцитов. кишечника была отмечена . на 14-е сутки (на высоте иммунологической перестройки), но с . возвратом клеток к исходному состоянию физиологического функционального покоя после 21-х суток: Прослеживалась средней силы корреляционная'связь (как прямая, так и обратная) между количеством апудоцитов в кишечнике и иммунологическими показателями в крови подопытных животных. Наблюдали:обратную средней силы корреляционную связь (р = -0,5) между количеством НЭК в лимфоидных органах и уровнем агглютининов к V. с!ю1егае с1ю1егае и прямую средней силы связь (р = 0,5) между количеством НЭК и уровнем агглютининов к V. ско1егае еЫог. Прямая высокой силы корреляционная связь (р = 1) была.отмечена^между количеством-НЭК и титрами антитоксинов. Реакцию НЭК в мезентериальньтх лимфатических узлах и нарастание титров вибриоцидных антител характеризовала обратная- высокой, силы корреляционная связь (р = -1). Четкая средней силы прямая корреляционная связь (р — 0,5) прослеживалась между количеством НЭК в надпочечниках и уровнем агглютининов. к: V. ско1егае ско1егае и вибриоцидных антител к V. скокгае еЫог.

Подтверждала иммунологические процессы, происходящие у иммунизированных биомоделей,, отмеченная динамика активации пролиферирующих лимфоцитов (клеток в 8 и С+М фазах клеточного цикла) в пейеровых бляшках тонкого кишечника в период с 3-х по 14-е сутки, с возвратом к контрольным показателям на 21-е сутки.

Таким образом, в результате анализа динамики морфофункциональных изменений апудоцитов кишечника и лимфоидных органов взрослых кроликов в ответ на введение холерных вибрионов испытуемого рекомбинантного штамма и характера иммунологических реакций в эффекторном звене иммунной системы биомодели была обоснована возможность использования выбранных морфомет-рических показателей в качестве морфологических эквивалентов; отражающих характер и направленность иммунологических реакций при противохолерном вакцинном процессе. v' . .281 • : ■ .■■ ■ . ■ • ;

В" организме крольчат-сосунков холерные вибрионы штамма. КМ184 при 10-кратном пассировании, не вызывая гибели подопытных животных и развития у них холерогенного синдрома, по результатам морфометрического анализа, приводили к некоторому функциональному напряжению апудоцитов кишечника. Так, на фоне относительного уменьшения? числа апудоцитов регистрировали ' более, чем трехкрат ное превышение Иап у иммунизированных крольчат по отношению' к контрольным животным; что подтвервдало-выводы государственной комиссии по доклинической оценке штамма Vibrio choíeraé eltor КМ184 о необходимости . его дополнительных исследований в модельных опытах. Реакция, со стороны APUD-системы ■ соответствовала, описанной1 нами ранее, при изучении влияния ctxA"tcpA+ штаммов холерного вибриона на макроорганизм.

Для оценки эффективности защиты предварительно иммунизированных, испытуемым штаммом биомоделей заражали вирулентными холерными- вибрионами, а результаты оценивали по: разработанной; схеме, включающей оценку: выживаемости подопытных животных к учетному сроку (5-е сутки) и (или) средней продолжительности жизни (в; часах); клинико-патологоанатомических проявлений инфекционного процесса;-гистологических,характеристик-изменений во внутренних органах; • количества и функционального состояния клеток желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и иммунокомпетентных органов биомодели (клеток нейроэндокрин-ной системы — апудоцитов, клеток эффекторной зоны иммунной системы ЖКТ -МЭЛ, се1феторного аппарата кишечника - бокаловидных клеток, НЭК лимфоид-ных органов); процессов пролиферации и апоптоза клеток в крови и селезенке.

Регистрировали активацию МЭЛ и апудоцитов у животных, зараженных вирулентными- холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации испытуемым штаммом. Не отмечали резкого изменения профиля секрета, образующегося в бокаловидных клетках кишечника: В противоположность этому у ин-тактных зараженных кроликов наблюдали уменьшение количества МЭЛ и резкое опустошение, апудоцитов кишечника; происходящие на фоне снижения количества бокаловидных клеток и изменения их секреторного профиля за счет повышения числа клеток, содержащих КМПС.

Введение вирулентных холерных вибрионов интактным кроликам: вызывало резкую активацию процессов пролиферации и апоптоза клеток крови и селезенки.

Аналогичное заражение предварительно иммунизированных испытуемым штаммом биомоделей протекало на фоне сохранения исходного уровня пролифератив-ной активности этих клеток, а., количество клеток в состоянии апоптоза не более чем двукратно1 превышало контрольные показатели. По результатам морфо-метрического анализа испытуемый, пггамм, введенный однократно в дозе 5x109 м.к. обладал достаточной: протективной активностью и защищал биомоделей от контрольного заражения 1х109 м.к. вирулентного штамма F. cholerae eltor Ogawa рз 1221 ;

Исследование, холерных вибрионов 0139 серогруппы- рекомбинантного штамма,)^ cholerae КМ182 проводили по.аналогичной схеме. Несмотря на отсутствие гибели/ и развития характерного патологического симптомокомплекса у иммунизированных- крольчат-сосунков, при морфометрическом исследовании был выявлен определенный; срыв < в. работе ряда функциональных систем биомоделей. Тем;не: менее, иммунизация культурами этого штамма взрослых кроликов защищала животных от последующего заражения- вирулентнымихолерными-вибрионами.

Несмотря на общую схожесть и относительную доброкачественность, изменений, выявляемых после введения биомоделям; рекомбинантных штаммов- холерных. вибрионов как 01, так 0139 серогрупп, которые по результатам ультрамикроскопического анализа можно отнести к компенсаторным реакциям макроорганизма, нельзя не отметить некоторые особенности, связанные с инокуляцией холерных вибрионов рекомбинантного штамма V. cholerae КМ182. Это касалось длительного обнаружения единичных микробных клеток на поверхности слизистой оболочки тонкого кишечника животных, принадлежность которых к холерным вибрионам была подтверждена при люминесцентной микроскопии;, выявления- в составе фагоцитированных включений в гистиоцитах микробных клеток, по морфологии идентичных холерным вибрионам. Факт длительного пребывания холерных вибрионов 0139 серовара (14-е сутки после инокуляции) в слое кишечной слизи у подопытных животных, возможно, объясняет инфильтрацию слизистой и СПС оболочки кишечника значительным количеством эозинофильных гранулоцитов в стадии, активного синтеза. Длительное:пребывание бактерий и последующая их гибель в кишечнике привитых животных - это основная причина риска развития эндоток-сикоза [Holmgren J., Svennerholm А,-М., 1990; Левкович A.A. и др., 1994]. Не исключено, что с этим связано умеренное мембраноповреждающее действие реком-бинантного штамма холерных вибрионов 0139 серогруппы. Накопление иммунных лимфоцитрв, активация больших гранулярных лимфоцитов в пейеровых бляшках у этих животных может свидетельствовать о начале формирования реакций гиперчувствительности замедленного типа при использовании двукратной схемы иммунизации. Преобладание среди клеток СПС оболочки кишечника этих кроликов лимфоцитов по отношению-к зрелым плазматическим клеткам наводит на мысль о несколько ином механизме формирования иммунного ответа при использовании рекомбинантных холерных вибрионов 0139 серогруппы или его временной отсрочке.

По результатам ультраструктурного анализа у кроликов, иммунизированных рекомбинантными штаммами холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, в клетках, несмотря" на усиление активности функциональных систем, сохранялось равновесие между процессами синтеза и распада, что свидетельствует о доброкачественности происходящих в них изменений и, следовательно, об определенной клеточной адаптации'к.воздействию этими агентами.

Таким образом, применение ультрамикроскопического анализа изменений в клетках подопытных животных на этапах авторского- изучения рекомбинантных штаммов холерных вибрионов, направленное на уточнение значимости тех или иных адаптационно-компенсаторных процессов, выявляемых при световой микроскопии, повышает информативность проводимых исследований.

Ключевым моментом в оценке качества любой вакцины является вопрос о возможности прогнозирования нежелательных последствий ее применения. В основе гомеостатических реакций при вакцинации, в том числе и противохолерной, лежат нейроэндокринные механизмы, которые координируют общую направленность процессов иммуногенеза [Кветной И.М., Ярилин A.A., 2005; Щуковская Т.Н., 2000, 2008]. Зная особую заинтересованность систем реагирования, контроля и защиты (иммунной; нейроэндокринной, пищеварительной и др.) в развитии холерной инфекции, в том числе и на фоне имеющейся специфической иммунологической активности, оценивая морфофункциональное состояние апудоцитов-и клеток эф-фекторной зоны иммунной системы ЖКТ, мы смогли охарактеризовать эффективность экспериментальных и коммерческих средств для специфической профилактики холеры.

От полноценной работы функционально активных клеток ЖКТ зависит t степень защиты организма биомодели от холерной инфекции. В системе мукозаль-ного гомеостаза особое место отведено эпителиоцитам, выступающим в роли реактивного барьера, являющегося мишенью для стимулов, исходящих как из просвета кишечника, так и из внутренней среды организма. Энтероциты, секретируя ци-токины, поддерживающие иммуногомеостаз слизистой оболочки ЖКТ, выступают в роли эффектора, выполняющего медиаторные функции в реакциях воспаления и иммунитета [Kinoshita N. et al., 2002]. Не последнюю роль в нормальном функционировании местной иммунной системы ЖКТ играют клетки СПС оболочки (lamina propria) - лимфоциты, плазматические клетки, эозинофилы, тучные клетки, ней-трофилы [Ипатов Ю.П. и др., 1997; Хаитов Р.М^, Пинегин Б.В., 1997]. Особо следует отметить роль МЭЛ, представляющих большую гетерогенную популяцию лимфоцитов, расположенных в эпителиальном пласте, способных активно покидать эпителий и возвращаться назад в СПС оболочки кишечника, обладающих функцией естественных киллеров и регулирующих работу эпителия, тучных и ' плазматических клеток [Козырева Л.А. и др., 1993; Ипатов Ю.П. и др., 1997].

В отличие от живых, убитые вакцины в больших дозах не вызывают грубых морфологических изменений во внутренних органах подопытных животных [Назарова Л.С. 1981; Исупов И.В. и др. 2004]. Наиболее выраженному воздействию, особенно при энтеральном поступлении препарата, подвергается именно стенка кишечника и местная лимфоидная ткань. Морфологически это может выражаться в качественном и (или) количественном изменении клеточного состава СПС оболочки. В то же время в действующих нормативных документах [МУ 3.3.1.2075-06] морфологические методы не являются ключевыми при оценке протективных свойств создаваемых противохолерных вакцин на этапах их доклинического изучения. Имеющиеся разрозненные сведения о морфологических изменениях, выявляемых при оценке реакций у биомоделей, инфицированных вирулентными холерными вибрионами на фоне предварительной иммунизации против холеры, отличаются разнообразием определяемых оценочных критериев и не позволяют адекватно сопоставлять полученные результаты.

Было проведено исследование особенностей течения инфекционного процесса у биомоделей, предварительно иммунизированных коммерческими (холерной химической бивалентной таблетированной вакциной производства РосНИПЧИ «Микроб», коммерческой вакциной Cholera-Impstoff) и экспериментальными препаратами (препараты «теней» V.cholerae 01 и0139 с токсинкорегулируемыми пи-лями адгезии (VCG-TCP) и без них, полученные путем контролируемой экспрессии гена Е фага PcpiXl74, кодирующего синтез мембранного протеина Е).

Оценку протективных свойств коммерческой холерной вакцины производства РосНИПЧИ «Микроб» проводили с использованием 2-х биомоделей: половозрелых лабораторных мышей (модель - «запечатанные мыши») [Richardson S.H., et al., 1984] и взрослых кроликов (RITARD) [Spira W.M. et al., 1981] по представленной ранее схеме.

Независимо от используемой» биомодели (лабораторные мыши или взрослые кролики) общие тенденции в реакции этих клеток отличались от той, что развивается при инфекционном процессе в интактном организме. У предварительно иммунизированных животных вирулентные холерные вибрионы, вызывали умеренное функциональное напряжение апудоцитов,кишечника-в виде незначительного увеличения их количества и относительного опустошения клеток.

Анализ морфометрических показателей, характеризующих изменения у зараженных на фоне предварительной иммунизации кроликов, выявил определенную зависимость между количеством НЭК в лимфоидных органах биомоделей и степенью их иммунологической перестройки. В частности, имела место средней силы прямая корреляционная связь (г = 0,4) между количеством АГ клеток и величиной гиперплазии фолликулов в мезентериальных лимфатических узлах животных. Описанные изменения количества и морфофункционального состояния апу-доцитов в этих органах отчасти отражали регуляторные свойства синтезируемых ими гормонов (серотонин, гистамин). Под действием этих медиаторов в селезенке и других лимфоидных органах происходит активное антителообразование [Цепе-лев В Л. и др., 2003]. Мобилизация нейроэндокринного окружения иммунокомпе-тентных органов, привитых животных, заключающаяся в достоверном (р < 0,05) увеличении числа апудоцитов по отношению к контролю, свидетельствовала об усилении синтеза ими БАВ и характеризовала стадию ограничения интенсивности иммунопатологических реакций при введении вирулентных холерных вибрионов, что укладывалось в общую закономерность изменений апудоцитов при вторичном иммунном ответе [ Райхлин Н.Т. и др., 1993; Щуковская Т.Н., 2000].

Известно, что избыточное поступление продукта секреции НЭК - серотонина - подавляет иммунологические реакции в организме подопытных кроликов [Смо-лягин А.И. и др., 1990]. Истощение продукции серотонина НЭК в остром периоде ' инфекции в дальнейшем приводит к сенсибилизации макроорганизма, и не исключено, что в комплексе причин развития патологического статуса биомодели лежит именно низкое число выявляемых серотонинпродуцирующих клеток. Другой продукт секреции НЭК - гистамин - сам по себе обладает способностью стимулировать иммунный ответ и путем активации фагоцитоза, и за счет прямого активирующего действия на лимфоциты [Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н., 1981], но он может выступать и своеобразным ограничителем иммунологической перестройки опосредованно, активируя выброс серотонина [Кветной И.М. и др., 1983]. Аналогичные изменения были характерны и для развития инфекционного процесса в организме кроликов, предварительно иммунизированных коммерческой вакциной Chol era-Impstoff.

Таким образом, вирулентные холерные вибрионы в организме предварительно иммунизированных коммерческими препаратами биомоделей, вызывая развитие минимальных изменений со стороны внутренних органов, в ЖКТ сталкивались с функционирующим вследствие иммунизации «защитным барьером» из плазматических клеток, МЭЛ, активных зон в лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником, и клеток APUD-системы.

При испытании эффективности экспериментальных препаратов были выявлены определенные закономерности в изменении числа, морфофункционального состояния апудоцитов кишечника и НЭК в лимфоидных органах в зависимости от используемого препарата, способа и кратности его введения, степени выраженности иммунологической перестройки в органах иммунной системы на момент заражения, характера последующей обработки биомоделей. Впервые было показано, что оценка состояния апудоцитов кишечника в совокупности с другими морфомет-рическими показателями изменений ЖКТ является достаточно информативным критерием для характеристики инфекционного процесса у предварительно иммунизированных животных.

На основании этого была разработана система оценки показателей морфо-функционального состояния- клеток АРШЭ-системы организма подопытных животных при первичном и вторичном иммунном ответе. Проведено сравнение двух групп экспериментальных препаратов, полученных на основе холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, и показаны преимущества первых перед вторыми.

К применению был предложен способ оценки качества противохолерных вакцин, заключающийся в использовании минимального набора хорошо воспроизводимых гистологических и гистохимических методик в сочетании с морфометри-ческим анализом. Полученные количественные характеристики, отражающие характер и направленность адаптационно-компенсаторных реакций у биомоделей при вакцинации и при развитии инфекционного процесса на фоне предварительной иммунизации животных, было предложено представлять в виде ассоциаций показателей (коэффициентов, индексов), что значительно упрощало дальнейшую трактовку результатов по выявлению преимуществ тех или иных вакцинирующих препаратов. Предложенный способ оценки в целом повышал информативность и обеспечивал объективность доклинических исследований новых противохолерных препаратов.

Исследования во второй части работы касались количественной оценки изменений в организме биомоделей, обусловленных влиянием чумного и туляре-мийного микробов штаммов с различной генетической характеристикой, реакции функциональных систем экспериментальных животных, зараженных вирулентными культурами указанных возбудителей на фоне приобретенной резистентности к чуме и туляремии, возможностей комплексного исследования противочумного и противотуляремийного вакцинного процессов.

Одним из направлений научных исследований является поиск маркеров болезни до наступления ее клинических симптомов [СЬготу В.А. е! а1., 2005]. В этом аспекте характеристика реакций клеток АР1Ю-системы и ряда морфометри-ческих^показателей,"15предёШющйх "работу основных"" систем" жизнеобеспечения макроорганизма в экспериментальных исследованиях инфекционного и вакцинного процессов при чуме и туляремии, направлена на выяснение роли и значения дополнительных морфологических маркеров для оценки степени тяжести течения патологического процесса или уровня формирования адаптационно-компенсаторных изменений в организме биомоделей.

В связи с циркуляцией в природе штаммов Yersinia pestis с атипичными свойствами, отличающими их от характерного для конкретного очага варианта возбудителя, был проведен анализ вызываемых ими изменений у биомоделей, основанный на сопоставлении ряда морфометрических параметров, характеризующих функцию ключевых систем жизнеобеспечения макроорганизма.

Для. сравнительного морфометрического исследования были взяты культуры штаммов Ypestis 231 (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm+), Y pestis (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm") -штаммов, выделенных в 2006 г. на территории Прикаспийского природного очага чумы и Ypestis ЕV (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm") линии НИИЭГ. Для природных штаммов характерным было отсутствие в их геноме, по данным генетического анализа, hms- и уЫ-локуса. Отсутствие гибели мышей, зараженных этими штаммами, укладывалось в общую картину течения инфекции у данной биомодели. До последнего времени продукты хромосомного локуса, обозначаемого HPI (high-pathogenicity island) чумного микроба относили к числу «обязательных» факторов его патогенности [Кокушкин A.M., 1995; Кутырев В.В., 1992; Петровская В.Г., Бондаренко В.М., 1994], а потеря HPI приводила к значительному снижению вирулентности HPI" мутантов в отношении мышей [Анисимов А.П., 2002]. В то же время избирательная потеря способности к экспрессии только генов, локализованных в составе HPI и отвечающих за признак пигментсорбции, не приводит к снижению вирулентности Hms" - мутантов возбудителя чумы [Kutyrev V.V. et al., 1992; billard J.W. Jr. et al., 1999]. Заражение мышей культурами чумного микроба, штаммов Y.pestis (pFra+, pPst+, pCad+, Pgm") 770, 6205, 6215 в РЛУ вызывало изменение числа и активности фолликулов в срезе на фоне умеренной активации НЭК, в то время как в группе ОЛУ гиперпластические процессы в фолликулах были незначительными и не касались реактивного состояния НЭК. Относительная активация фолликулов в селезенке сопровождалась реакцией со стороны НЭК, носящей обратный характер по отношению к лимфатическим узлам. Также были отмечены« отклонения и ряда других морфометрических параметров, отражающих функциональное состояние систем жизнеобеспечения организма биомодели, но от ' - ■. '' V 289 • " V-''"; •-•:"•■' личающих эти штаммы по характеру, вызываемых ими изменений как от Y.pestis 231, так ж Y.pestis EV. Несмотря на отсутствие гибели . мышей при подкожном введении им культур Y.pestis 770, 6205, 6215, регистрируемые умеренные изменения морфометрических параметров; свидетельствовали о формировании адаптационно-компенсаторных реакций в организме бйомоделей. При одинаковом наборе известных факторов вирулентности, эти штаммы отличались между собой по степени вызываемых в макроорганизме изменений, при этом фенотипическая и гено-типическая- схожесть штаммов и штамма обусловливает интерес к дальнейшему углубленному их изучению: •. .• • Цо литературным данным, хотя НРГ содержит кластер генов, ассоциированных с «высокой летальностью» для мышей, в то же время на «острове» не выявлено ни одной детерхМинанты, напрямую связанной с патогенностью; Гены, входящие в HEI; кодируют продукцию иерсиниабактина, который хелатирует железо, связанное с белками эукариотических клеток, и транспортирует эти соединения в микробную клетку [Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2006]. Эти гены в большей мере отвечают за размножение патогенов в макроорганизме, чем за прямое повреждение эукариотических клеток [Анисимов А.П1, 2002]. В условиях нарушенной адаптации; чумные микробы таких штаммов в организме теплокровного хозяина лишены возможности безудержного размножения, поэтому развитие определенных адаптационно-компенсаторных сдвигов в работе функциональных систем макроорганизма, по-видимому, обусловлено гибелью бактерий с высвобождением биологически активных токсических субстанций патогена.

В результате учета и сравнения ряда морфометрических характеристик для оценки направленности адаптационно-компенсаторных процессов в организме лабораторных мышей при изучении влияния различных культур чумного микроба среди определяемых морфометрических параметров были выбраны наиболее информативные, апробацию применения которых провели в последующих исследованиях на морских свинках.

Чумные микробы вирулентного штамма Y.pestis 231 при подкожном, введении морским свинкам вызывали в печени двукратное; увеличение ЯЦИ гепатоци-тов, в 4,5 раза повышение ДИ, резкие инволютивные процессы со стороны клеток РЭС на фоне формирования крупных инфильтратов из ПМЯЛ. В то же время у животных, обработанных Y.pestis вакцинного штамма EV, поддерживался определенный адаптационный потенциал функциональных структур.

Вакцинный штамм достоверно не изменял ПВО, а вирулентные культуры чумного микроба в легких влияли на ПВО, понижая этот показатель в 10 раз из-за развития гемодинамических нарушений и воспалительных изменений в органе.

На срыв адаптации у биомоделей, инфицированных Y.pestis 231, указывали: инверсия зон коркового вещества надпочечников и изменение Истресс более чем на 0,5 по отношению к показателю у интакгных животных.

Мерой резистентности организма биомодели является его способность к адаптации, в основе которой лежит активация его защитных сил, поэтому на следующем этапе были охарактеризованы адаптационно-компенсаторные реакции, развивающиеся у зараженных Y. pestis 231 в дозе 200 Del биомоделей на фоне предварительной противочумной вакцинации ЖЧВ в дозе 5x103 м.к.

Защитно-иммунологические реакции, проявляющиеся в специфическом ан-тителообразовании, следует рассматривать как комплекс биологических реакций гомеостатического порядка, протекающих в целостном организме и подчиняющихся основным общефизиологическим закономерностям, морфологическим маркером которых можно считать- формирование защитных адаптационно-компенсаторных реакций в организме биомодели.

У биомоделей, зараженных Y. pestis 231 на фоне предварительной иммунизации, регистрировали взаимосвязь между выраженностью количественных параметров, определяющих степень токсического повреждения функциональных структур макроорганизма, и уровнем иммунологических процессов в лимфоидных органах. Так, ключевые морфометрические параметры, отражающие функциональное состояние систем макроорганизма у этих животных в ответ на введение вирулент-ньту. Y.pestis 231, не выходили за допустимые пределы и были близки к показателям у интакгных контрольных животных. Это позволило считать обоснованным и эффективным применение отобранных морфометрических параметров для характеристики направленности адаптационно-компенсаторных процессов при моделировании инфекции у предварительно иммунизированных биомоделей.

Развитие инфекционного процесса при туляремии определяется способностью микроба к преодолению гуморального и клеточного барьеров неспецифической защиты макроорганизма [Цимбалистова М.В. и др:, 1996]. Вирулентные и. авирулентные штаммы туляремийного микроба; способны распространяться в организме лабораторных животных и достигать специфических тканей - мишеней (печень и селезенка), наиболее благоприятных для их размножения. Но динамика этих процессов для культур разной степени вирулентности отлична. Вирулентные культуры.Р.Ыагепш 503/840 уже через 24 ч локализовались в печени и селезенке, а к моменту гистологического исследования (12 -е сутки) обнаруживались в крови подопытных морских свинок. Возбудитель вызывал гнойно-некротические изменения в коже места его введения, в РЛУ,. О ЛУ, в селезенке и формирование в этих органах, особенно в селезенке, эпителиоидноклеточных гранулем. Во внутренних органах имели место: изменение ЖЩ гепатоцитов и семикратное увеличение ДИ в печени, формирование преимущественно эпителиоидноклеточных гранулем; превышение ДИ для; эпителия извитых канальцев почек почти в 9 раз; снижение ПВО' в 13; раз. О срыве адаптации у биомоделей, инфицированных У7.НйагепаЬ 503/840, свидетельствовал Истресс.= 1,97 (интактный контроль Истресс:-- 1,25). Гра-нулематозный характер воспаления в органах, присутствие в. очагах воспаления лимфоидных элементов и макрофагов указывали на формирование иммунного воспаления (ГЗТ), играющего важную роль в патогенезе туляремии;

• Таким образом, принципиальная схема патоморфологического исследования с морфометрическим анализом изменений, отработанная для изучения чумной инфекции, может быть применима и для оценки степени тяжести течения экспериментальной туляремийной инфекции.

Известно, что ЖТВ вызывает стойкую защиту лабораторных животных от последующей гибели при заражении вирулентным штаммом, туляремийного микроба, но при этом нет сведений о процессах, происходящих в органах и системах выживших животных.- Был проведен морфометрический анализ обнаруженных изменений у морских свинок, зараженных 5x103 м.к. вирулентного штамма Р. Ы-\arensis 503/840 на фоне их предварительной иммунизации 2x108 м.к. вакцинного штамма Р. Шагеушь 15 НИИЭГ.

При; практически, полном отсутствии на 30-е сутки после заражения видимых патоморфологических измененищ морфометрический-анализ выявил напряжение в работе функциональных систем макроорганизма в виде умеренной активации РЭС и элементов APUD-системы. Так, в легких 1ШО было в 4 раза ниже,.чем у животных из группы интактного контроля, а количество AT. клеток увелйчива- ' лось. Это вызвало интерес потому, что эндокринный аппарат органов, дыхания представлен как одиночными НЭК — апудоцитами, диффузно. расположенными средиКлеток бронхиального эпителия, так и групповьши скоплсния'ми (нейроэпи-телнальные тельца. -НЭТ). 1 продуцируемые ими. серотонин, бомбсзин, дофамин • .: способны воздействовать на гладкомыпючные элементы бронхиальной стенки, ре-: гулируя воздухораспрсдсление. В то же время подчеркивается особая роль клеток • альвеолярного эпителия; не только в поддержании легочного гомеостаза, но и в . . . запуске механизмов врожденного иммунитета при контакте с патогеном [Johnson M.D: et al., 2002]. F. tularensis,взаимодействуя с клетками альвеолярного эпителия, индуцирует каскад реакций, связанных с продукцией/ секретируемых цитокинов, результатом чего является миграция; в очаг иммунокомпетентных клеток [Gentry -М., Taormina J. et al., 2007]. 11ри этом изменение морфофункционального состояния НЭК в легких влечет за собой локальное нарушение газообмена и может осложнять течение патологическогоилиадаптивного процесса. . . ; В надпочечниках , регистрировали умеренную активация НЭК; на фоне гиперпластических процессов в лимфатических узлах имела место, активация; AT элементов при относительном покое: АГ клеток. В селезенке же, напротив, реагировали АР клетки, AT элементы оставались в покос.

Актуальность исследований в: области создания современных и надежных национальных средств и методов; профилактики и лечения чумы и туляремии [Онищенко Г.Г. , 2006] обусловливает необходимость адекватной и объективной оценки качества препаратов для специфической профилактики этих болезней.

Многолетними исследованиями Т.Н. Щуковской с соавторами [1978-2008] установлено большое значение рецепции иммунокомпетентными клетками нейро-медиаторов - гистамина, серотонина, аденозина - в реализации регуляторных механизмов, контролирующих направленность и интенсивность процессов иммуногенеза при холере, чуме, туляремии и других инфекциях.

Важнаяроль мобилизации иммунной системы и тесно связанной с ней пей-роэндокринной или APUD-системы- при вакцинном? процессе объясняет интерес к выяснению участия апудоцитов в иммуногенезе [Акмаев И.Г., 2001; Пальцев М.А. и др., 2003; Toni D.R., 2004].

Изучение реакции клеток APUD-системы ряда функционально значимых органов биомоделей на Y.pestis вакцинного штамма EV линии НИИЭГ и F. tularen-sis вакцинного штамма 15 линии НИИЭГ, расширяющее представления о механизмах нейроиммуноэндокринных взаимоотношений в макр'оорганизме, было направлено на совершенствование методов оценки безопасности и эффективности вакцин против чумы и туляремии.

В ответ на введение вакцинного штамма Y. pestis EV выявлены изменения реакции апудоцитов в лимфоидных органах, происходящие в соответствии с ролью регуляторных свойств синтезируемых этими клетками биологически активных веществ (БAB) и пептидов. Активность НЭК тимуса в период с 3-х по 7-е сутки, коррелирующая с процессами активации лимфоидных элементов в нем, согласуется с данными о роли этого органа как координатора молекулярных и клеточных нейроэндокринных взаимодействий [Manley N.R., 2000; Maroder М. et al., 2000]. Способность тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) секретировать такие БАВ, как серотонин, мелатонин, гистамин и другие [Акмаев И.Г., 1997], и продуцировать сигнальные молекулы - цитокины, играющие важную роль в дифференцировке и пролиферации тимоцитов [Кветной И.М. и др., 2005], позволяет предположить участие НЭК не только в иммуномодулирующих процессах при противочумной вакцинации, но и в ограничении аллергизирующих и общетоксических реакций макроорганизма. Известно, что максимальная экспрессия мышиных рецепторов для интерлейкина-2 на Т-лимфоцитарном клоне [Wagher D.K., et al., 1986], подавляющем образование неспецифических Т-супрессоров, происходит на ранних стадиях иммуногенеза (к 3-м суткам). Вероятно и серотонин может снимать тормозное влияние интерлейкин-2 зависимого Т-клона клеток путем подавления пролиферации антигеннеспецифических супрессоров [Hellstand К., Hermodsson S., 1987]. В периферических органах иммунной системы первоначально регистрируемое снижение количества апудоцитов, направленное на стимуляцию иммунной реакции, в последующем сменяется увеличением их числа, способствуя ограничению интенсивности процесса. С увеличением дозы Y. pestis EV развивающиеся явления острого лимфаденита в РЛУ, по-видимому, сопровождались более ранней (до 3-их суток) активацией апудоцитов, в первую очередь - AT клеток, а к 7-м суткам активность этих элементов резко уменьшалась. К 14-м суткам, когда явления острого воспаления::стихали, число НЭК' начинало нарастать, что являлось отражением ре-гуляторного влияния , продуктов; секреции этих клеток на различные компоненты или фазы воспалительного процесса: Таким образом, активация АГ клеток оказывала; влияние на 'регуляторные механизмы ранней фазы иммуногенеза, «запуская» значительный клон антигеннеспецифических супрсссоров тимуса, что в конечном итоге и определяло количественную основу неспецифической регуляции иммунного ответа. Ранее было установлено, что максимальные изменения пула иммуно-компетенгных клеток с рецепторами для серотонина. и гистамина происходят в ранние сроки после противочумной вакцинации. Этот процесс предшествует развитию невосприимчивости лабораторных животных к : заражению вирулентным штаммом чумного микроба, а отмечаемая разнонаправленность колебаний показателей, как по амплитуде, так и по'вектору, носит дозозависимый и фазный характер [Щуковская Т.Н. и др., 1992].

Извест но, что подкожное введение ЖЧВ далеко йе всегда защищает о т аэрогенного заражения [Самойлова Л.В., 1968]:, а- в свете новых данных: о роли; муко-. зальной системы иммунитета возрастает интерес к альтернативным схемам доставки антигенного материала на слизистые оболочки вакцинируемым: [Jones Т. et al., 2006; Alvarez M.L. et al., 2006; Elvin S.J. et al., 2006]. В то же время литературные данные [Белжеларская С.Н., Саттон Ф., 2003] о разнообразии продуктов секреции, расположения клеток, функциональной значимости апудоцитов в лимфоидных органах и в органах дыхания обусловили интерес к выяснению роли и участия элементов APUD-системы при аэрогенном способе введения ЖЧВ.

На фоне изменения ПВО у морских свинок при аэрогенной иммунизации Y. pestis EV регистрировали снижение числа апудоцитов в легких за счет их опустошения. В РЛУ и ОЛУ реакция НЭК находилась в четкой прямой зависимости от выраженности воспалительного компонента: отмечали снижение числа AT клеток вплоть до 21-х суток, а количество АГ элементов несколько превышало контрольные показатели в первые сутки: и на 14-е сутки, когда активизировались гиперпластические процессы- К 45-м суткам количество НЭК в ОЛУ практически возвращалась к контрольным значениям. Морфометрические показатели активации гиперпластических процессов в селезенке подопытных животных коррелировали с умеренной активацией НЭК, начинающейся с 3-х суток, максимум которой со стороны АТ клеток приходился на 14-е сутки, а АГ - на 21-е сутки.: Выявленные изменения морфофункционального состояния.апудоцитов. в легких-й иммуноком-петентных органах свидетельствовали , о заинтересованности элементов АР.1Ю-системы при ингаляционном способе поступления антигенного материала,: а динамика; их: носил а; фазный характер. •

Вслед за характеристикой5 реакции макроорганизма на различные способы введения ЖЧВ* была предпринята попытка сравнения ревакцинирующего эффекта ЖЧВ и препарата ХЧВ. В результате проведенного морфометрического исследования были выявлены более выраженные проявления:вторичного иммунного, ответа к Г4-м:. суткам-наблюдения со стороны иммунекомпетентных органов! морских свинок, ревакцинированных препаратом ХЧВ; по сравнению с. ЖЧВ. В РЛУ при ревакцинации ХЧВ гиперплазия лимфатических фолликулов выражалась в увеличении их площади в 2 раза по сравнению с йнтактным контролем: Отмечали в-: 1,3 раза чаще, чем у свинок, реващиниррванных ЖЧВ"; увеличение числа, лимфатических фолликулов со светлыми центрами, характеризующими-процессы активации этих структур. Чуть слабее была реакция со стороны ОЛУ, где гиперпластические процессы в виде увеличения ПКЗ и размеров фолликулов наблюдались с 14-х суток у животных, ревакцинированных как ЖЧВ, так и ХЧВ. Увеличение средней площади лимфатических фолликулов в селезенке животных, иммунизированных ХЧВ, было в 1,7 раза больше, чем после введения ЖЧВ и в 1,3 раза чаще среди них встречались фолликулы с активными светлыми центрами, а ширина Т-зон в органе была в 1,2 раза больше.

Выраженности иммунологической перестройки в лимфоидных органах подопытных животных, регистрируемойшо результатам морфометрического исследования к 14-м суткам после ревакцинации указанными препаратами, соответствовало максимальное накопление антител к Б! у морских свинок? иммунизированных ЖЧВ и ревакцинированных ХЧВ или ЖЧВ. При этом после ревакцинации ХЧВ этот показатель почти в 2 раза превышал аналогичный у свинок ревакцинирован-ных ЖЧВ: ,

Известно, что уровень специфической перестройки у морских свинок, имму- ' визированных ЖЧВ; определяется характером «нестерильной» фазы-иммунитета [Самойлова Л.В1964, 1984]. При повторном, спустя 6 месяцев, введении в организм ЖЧВпроисходит резкое сокращение сроков выделения живых клеток чумного микроба [Дальвадянц С.М., 1990; Овсянников-В;И:, 1991]. Поэтому ревакцина-. ция препаратом ЖЧВ; не способствует быстрой и эффективной вторичной иммунологической перестройке организма биомодели. Повторное введение ЖЧВ в острый период (2-е. сутки) приводило; к развитию умеренных альтеративных и. экссу-дативных изменений в тканях места введения.препарата. и РЛУ^разрешающихся к 21-м суткам без грубых некротических изменений и очагов расплавления тканей, вовлеченных в,воспалительный?процесс: В то же время введение препарата ХЧВ лишь в большой дозе (1000 мкг - приблизительно 10 ч/д) и только в. остром периоде вызывало развитие иммунного воспаления в тканях места введения препарата и у отдельных животных - в РЛУ. Однако развитие такого рода изменений, в острый иериод можно считать допустимым;с точки зрения- безвредности препаратов-[Исупов:; ИШ- и др:, 2004;: МУ ЗЗЖ1ИЗ-02]; а эффективность применения ХЧВ-в качестве ревакцинируютцего препарата обоснованной: ■ • Далее разрабатываемый; принцип и схему оценки изменений в макроорганизме, обусловленных введением вакцинных штаммов чумного микроба, проверили на архивном материале (архив комиссионных: испытаний 1986-1987 г.), проведя сравнительное, изучение аттенуированного штамма У.резйз 1217М с эталонным вакцинным, штаммом У.ревНв ЕУ линии НИИЭГ. Выбранный для- исследования штамм У.рехШ 1217М по результатам комиссионных испытаний был отклонен от внедрения в качестве вакцинного, а нами был взят для проверки правильности выбора наиболее значимых параметров, характеризующих адаптационно-компенсаторные реакции у биомоделей.

Анализ выявляемых изменений проводили по стандартной схеме, предусмотренной действующим нормативным* документом [МУ 3.3.1.1113-02], параллельно выполняя морфометрическое исследование. обосновать

При общем- сходстве, в. направленности: иммунологических процессов в лимфатических узлах и селезенке подопытных животных, иммунизированных чумными микробами штаммаУ.реяШ 1217М в сравнении с эталонным, регистриро ' ' ■ • .•297. 1 '•.■;'■ \ ; ' \ • ; ' .■■ вали ряд особенностей в; количественной характеристике, описьшаемых. изменений. Введение УрезШ 1217М в дозе 1x107 м.к. вызывало на фоне наблюдаемых явлений умеренного серозного, иногда серозно-гнойного процесса в лимфоидных органах . гиперплазию фолликулов в РЛУ и ОЛУ, регистрируемую, морфометриче-скими методами, без активации бластической реакции в них вплоть до 14-х суток. С увеличением иммунизирующей: дозы до 2x109 м.к. нарастал воспалительный. компонент при введении культур как эталонного штамма,. так и испытуемого, а разница; между определяемыми: морфометрическими параметрами в группах нивелировалась. Адаптационно-компенсаторные реакции во внутренних органах характеризовали состояние функционального напряжения в работе систем жизнеобеспечения биомодели. Введение испытуемого штамма; в дозе 100 м.к. и 1х107 м.к. вызывало; в ранние сроки умеренную активацию клеток РОС в печени. С увеличением- иммунизирующей дозы до 2x109 м.к. наблюдали относительное, истощение РЭС. Эти изменения проходили на фоне; усиления деструктивных процессов в: гепатоцитах с изменением ДИ, значение которого вплоть до 45-х сут ок наблюдения отличалось от аналогичного у интактного контроля и превышало показатели, определяемые в группе.животных, иммунизированных культурами;эталонно-. го штамма; Аналогичная, закономерность, была установлена и для морфомётриче-ских параметров, характеризующих функциональное состояние почек. В легких инфильтративные процессы при введении культур испытуемого штамма в дозах

7 9

1x10 м.к. и 2x10 м.к. приводили к изменению ПВО, понижая этот показатель более чем в 8 раз по отношению к интактному контролю, без достижения контрольного значения к 45-м суткам. В тоже время на введение культур эталонного штамма достоверное изменение ПВО регистрировали лишь при иммунизации в дозе 2х109 м.к. и только в ранние сроки. Если стресс-реакцию организма на введение культур эталонного штамма У.реБйзЕУ в дозах 1х107 м.к. и 2x109 м.к. характери-. зовали незначительные отклонения Истресс. до 7-х суток, что согласуется с литературными! данными о стрессорном действии ЖЧВ, характеризуемом по изменению концентрации 11-оксикортикостероидов? в; плазме крови подопытных животных [Анисимова Т.И. и др., 2005], то введение культур испытуемого штамма в аналогичных, дозах приводило к заметному изменению Истресс.> вызывало гиперплазию коркового вещества надпочечников на фоне резкой инверсии его слоев, причем учитываемые морфометрические параметры лишь по отдельным позициям к 45-м суткам возвращались к контрольным значениям.

Таким образом, по полученным данным пггамм У.резйз 1217М чаще вызывал патологические изменения в органах и тканях подопытных животных, эти изменения по продолжительности были более длительными, а процесс формирования адаптационно-компенсаторных реакций макроорганизма не всегда укладывался во временной промежуток до 45-х суток наблюдения.

ЖТВ, обладая высокой иммуногенностью, является достаточно реактоген-ным препаратом, поэтому не ослабевает интерес к поиску совершенного препарата для специфической профилактики туляремии. Что касается нормативной базы по отбору штаммов-кандидатов в противотуляремийные вакцины, то к настоящему моменту впервые введены в действие Методические указания «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба» [МУ 3.3.1.2161-07]. Но в силу высокой остаточной реактогенности аттенуированных культур Е.ш1агет1з для биомоделей сохраняются определенные трудности с оценкой их безвредности. Границы традиционного патоморфологического исследования биомоделей при введении РЛиХагетш 15 НИИЭГ были расширены за счет введения характеристики реакций клеток нейроэндокринной (АР1ГО) системы функционально значимых органов и морфометрического анализа изменений, отражающих характер адаптационно-компенсаторных процессов в макроорганизме, обусловленных иммуногенезом.

Реакция НЭК в РЛУ заключалась в некоторой активации АТ клеток, особенно на введение вакцинного штамма в дозе 5x107 м.к., в то время как реакция АГ элементов практически не отличалась от аналогичных показателей у интактного контроля. В ОЛУ НЭК реагировали резкой активацией, как АТ, так и АГ клеток на введение культуры вакцинного штамма в дозе 5x109 м.к. и умеренной активацией АГ элементов на иммунизацию 5х107 м.к. Количество НЭК в селезенке достоп верно увеличивалось на введение культур вакцинного штамма в дозе 5x10 м.к.

По результатам морфометрического анализа были отмечены умеренные деструктивные изменения на введение вакцинного штамма, но без резких инволю-тивных процессов со стороны РЭС. Если на введение вирулентных культур регистрировали снижение ПВО в 13 раз по отношению к интактному контролю, то у иммунизированных животных этот показатель отличался лишь в 1,5-1,6 раза. Реакция апудоцитов в легких на 5-е сутки после иммунизации лишь при введении 5x109 м.к. культур вакцинного штамма заключалась в умеренной активации в них синтетических процессов. Меньшая доза вакцинного штамма способствовала умеренному опустошению клеток. АТ клетки АР1ГО-системы в надпочечниках претерпевали дегрануляцию, а в АГ элементах усиливались синтетические процессы.

На введение вакцинного штамма отмечено снижение числа НЭК кишечника морских свинок в 1,3-4 раза, в то время как на вирулентные туляремийные микробы кишечник биомодели реагировал увеличением количества клеток АР1ГО-системы в 1,5-2 раза по отношению к показателю у интакгных животных. Преимущественно реагировали аргентаффинные - ЕС-клетки, продуцирующие серо-тонин и мелатонин. Несмотря на различную направленность процессов активации апудоцитов кишечника у вакцинированных и зараженных биомоделей, Ист как в той, так-и в другой группах изменялся однотипно.

Изменения, возникающие в организме хозяина в результате воздействия бактериального агента, свидетельствуют об их адаптационно-приспособительном характере, направленном на срочную мобилизацию защитных механизмов макроорганизма [Пак С.Г. и др., 2008]. Поэтому ключевой задачей экспериментальных исследований особо опасных инфекций остается дальнейший поиск интегральных показателей оценки морфофункционального состояния регуляторных систем организма биомодели при моделировании конкретного инфекционного или вакцинного процессов.

В результате реализации возможностей комплексного морфометрического анализа полученных данных для характеристики чумного, туляремийного инфекционных процессов и оценки реакций макроорганизма на введение культур вакцинных штаммов этих микроорганизмов намечены перспективы создания экспертных систем (ЭС), направленных на решение проблем, связанных с отбором штаммов - кандидатов в живые вакцины, и задач экспериментальной морфологии.

Алгоритм оценки влияния испытуемых экспериментальных и коммерческих препаратов для специфической профилактики чумы и туляремии разрабатывали таким образом, чтобы количественно оценить: повреждающее действие вакцины остаточную вирулентность) и возможные побочные реакции макроорганизма на нее; стресс-реакцию макроорганизма; роль клеток АРТЮ-системы как системы реагирования и контроля в реализации защитного потенциала макроорганизма при вакцинном процессе; изменения морфометрических параметров, определяющих специфическую активность вакцины по анализу устойчивости функционально значимых систем организма биомодели к повреждающему действию конкретно- -го возбудителя.

Для оценки был отобран ряд формализованных признаков: определение функционального состояния паренхиматозных элементов и характера инфильтра-тивных процессов в печени, отражающих степень нарушения дезинтоксикацион-ной, синтетической и защитной функций органа; учет количества НЭК в легких, обеспечивающих местную-регуляцию функций дыхательной системы - приспособление кровотока к вентиляции легких и изменение ПВО; характер микроцир-куляторных нарушений в ренальном звене - функциональное состояние почечных телец и эпителия канальцев, обеспечивающих адекватную работу выделительной системы; анализ морфофункционального состояния НЭК лимфоидных органов, выступающих в роли неспецифических регуляторов иммунологических процессов; количественная характеристика изменений в надпочечниках - органе, ответственном за формирование адаптационных реакций.

Таким образом, применение в экспериментальной морфологии особо опасных инфекций аппаратно-программных компьютерных комплексов и стандартных схем морфологического анализа по представленным алгоритмам упростило доклиническую характеристику создаваемых препаратов против холеры, чумы и туляремии, позволило нивелировать зависимость качества конечного результата исследования от субъективизма оценки экспериментатора. Применение морфометрическо-го анализа при изучении патогенеза особо опасных инфекционных болезней направлено на расширение возможностей для совершенствования стратегии профилактики и методов лечения холеры, чумы и туляремии. Важно подчеркнуть необходимость дальнейшего углубленного комплексного изучения различных аспектов нейроэндокринных взаимосвязей в организме биомоделей при экспериментально-морфологических исследованиях особо опасных инфекционных болезней.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Бугоркова, Светлана Александровна, 2009 год

1. Автандилов Г.Т/Медицинская морфоме1рия:- М.:'Медицина,1990.- 379 с. "'3. • :. Адамов А.К. Иммунология холеры.- Саратов: Изд-во Саратовского университета, 1981. 319 с. ' .;'

2. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы.- Саратов, 1984.- 328 с.

3. Акмаев И.Г. Нейроиммуноэндокринология: факты и гипотезы //Пробл.эн-докринол. 1997. - Т. 43, №> 1. - С. 3-9. .

4. Акмаев И.Г'., Г'риневич В.В. От нейроэндокринологии. к нейроиммуноэндок-ринологии// Бюл. экспер. биол.;- 2001: Т; 131, №:1. - С. 22-32.

5. Анисимов А.П. Факторы Yersinia pestis, обеспечивающие циркуляцию и сохранение возбудителя чумы в экосистемах природных очагов // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 2002.-. № 3.- С. 3-23.

6. Анисимова Т.И., Сергеева Г.М., Саяпина Л.В. Стрессорное действие вакцинного и аттенуированного штаммов; чумного микроба в зависимости от степени их остаточной вирулентности //Биопрепараты^

7. Аронова Н.В. Липополисахариды бактерий рода Francisella как иммунодо-минантные антигены и их фазовые вариации в условиях in vivo: Автореф.дис. . канд. биол. наук.- Ростов-на Дону, 2005.- 21 с.

8. Артншевский A.A. Надпочечные железы. Строение, функции, развитие.-Минск.: Беларусь, 1977. 127 с.

9. Аруин Л.И., Григорьев П.Я., Исаков В.А. Яковенко Э.П. Хронический гастрит.- Амстердам, 1993. 362 с.

10. Атауллаханов Р.И., Гинцбург А.Л. Иммунитет и инфекция: динамичное противостояние живых систем // Детские инфекции.- 2005.- Т.4, № 1.- С. 11-21.

11. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях.- Ленинград, 1962.- 89 с.

12. Бабаева А.Г. Регенерация и система иммунитета,- М.: Медицина, 1985. С. 14-21.

13. Бардахчьян Э.А., Харланова Н.Г., Ломов Ю.М. Ультраструктурные изменения липофибробластов тонкой кишки кроликов-сосунков при экспериментальной холере // Бюл. эксперим. Биол. и мед. 2004. - № 8. - С. 191-195.

14. Белжеларская С.Н., Сатгон Ф. Роль серотониновой системы в реакции различных типов клеток на стрессорные сигналы // Молекулярная биология. -2003. Т. 37, № 3.- С. 452-457.

15. Белобородов P.A. Морфология вакцинального процесса при отборе вариантов чумного микроба со свойствами вакцинных штаммов / Автореф. дисс. . канд. мед. наук. Саратов, 1967.-27с.

16. Белов Л.Г. Патогенез функциональных и метаболических расстройств при холерной интоксикации и вакцинации / Автореф. дисс. . докт. мед. наук. -Саратов, 1994.-3 7с.

17. Бессмертный Б.С. Математическая статистика в клинической, профилактической и экспериментальной медицине.- М.: Медицина, 1967. 303 с.

18. Бонашевская Т.И., Беляева H.H., Кумпан Н.Б. Панасюк Л.В. Морфофункцио-нальны& исследования в гигиене.- М.: Медицина, 1984. С.95-99.

19. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий' и- их роль в развитии инфекционного процесса // Журн. микробиол:- 1999.- № 5.- С. 34-39.

20. Бородин Ю.И., ТруфакинВ.А., Летягин А.Ю., Шурлыгина А.В. Циркадные биоритмы иммунной системы.- Мовосибирск, 1992.- 175 с.

21. Бунин К.В., Гапочко К.Г. Прививочные реакции-при иммунизации живыми вакцинами;-М-: Медицина.г 1970.- 296 с.

22. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий: теория и практика // Журн. микробиол.- 2000. № 4 - С. 4-7.

23. Бухарин О.В., Немцсва Н.В. Система «лизоцим-антилизоцйм» и ее роль в обеспечении симбйотических связей гидробионгов // Усп.: соврем, биол.-2002.- Вып. 122, Л'о 4,- С. 326-333.

24. L Бухарин О.В., Немцева Н.В: Фермент-субстратные механизмы выживания бактерий.в водных биоценозах // Журн. микробиол. 2003.- № 4.- С. 27-31.

25. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выжмвания бактерий.- М.: Медицина, 2005.- 367 с.

26. Вайсфельд И.Л., Кассиль Г.Н. Гистамин в биохимии и физиологии.- М.: Наука, 1981. 277 с.

27. Васильева Г.И. Взаимодействие Y.pestis с клетками системы мононуклеарных фагоцитов в реализации вакцинного: и инфекционного процессов / Автореф. дис. . д-ра биол. наук.- Саратов, 1990. 40 с.

28. Воробьев A.A. Современные направления в разработке новых иммунобиологических препаратов // Журн. микробиол.- 1999.- № 5.- С. 16-21.

29. Воробьев A.A., Несвижский Ю.В., Липницкий Е.М. и др. Микробное сообщество пристеночного муцина различных отделов желудочно-кишечного тракта человека // Вестник РАМН.- 2004.- № 4.- С. 23-26.

30. Гайдар Ю.А. Абсорбция холерного экзоэнтеротоксина эпителием пейеровой бляшки морской свинки // Вестник АМН СССР.- 1981.- № 6,- С. 52-54.

31. Гаркави Л.Х., Квакина Е.В., Уколова М.А. Адаптационные реакции и резистентность организма. Ростов-на-Дону, 1990.- 224 с.

32. Голофеевский В.Ю. Введение в клиническую морфологию желудка и двенадцатиперстной кишки.- Санкт-Петербург: «ФОЛИАНТ», 2005,- 109 с.

33. Горькова A.B., Анисимова Т.И., Тихомирова Л.А. и др. Медиаторы, ферменты и кортикостероидные гормоны в процессе иммуногенеза // Актуальные вопросы иммунологии.- Саратов, 1981.- Т. 1.- С. 103-104.

34. Гордон Д.С., Сергеева В.Е., Смородченко А.Т. и др. Идентификация люми-несцирующих гранулярных клеток тимуса с дендритными макрофагами // Бюлл. экспер. биол. и мед.- 2001.- Т.132, № 7.- С. 118-120.

35. Гребцова H.H., Чернявская A.C., Лебедева С.А., Иванова B.C. Изучение фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов в отношении Yersinia pestis с дефектными и полноценными ira" генами // Журн. микробиол.- 1990.-№5.- С. 7-11.

36. Григорьев В.А. Динамика уровня постоянного потенциала гипоталамических структур кроликов в процессе развития иммунных реакций / Автореф. дис. . канд. мед. наук. Л., 1982. - 26 с.

37. Давыдова H.A., Куличенко А.Н., Федоров H.A., Бугоркова Т.В., Казакова Е.С., Кутырев В.В. Тест-система для выявления Vibrio cholerae (ctx.А+) методом полимеразной цепной реакции // Пробл. особо опасных инфекций.1999.-Вып. 79.-С. 72-77.

38. Дальвадянц G.M. Химическая чумная* вакцина: конструирование, экспериментальное. и клиническое; обоснование применения для ревакцинации людей: Автореф; дис. докг. мед. наук. — Саратов, 1990: - 34 с.

39. Ежемесячная информация о карантинных заболеваниях за рубежом (ЕИКЗР) . 2007. - № 6/7. - 6 с.

40. Ермолаева С.А., Романова Ю.М., Тартаковский И.С. Вклад системной регуляции экспрессии генов патогенности в вирулентность факультативных внутриклеточных паразитов // Вестник РАМН. 2005. - № 1. - С. 44-48.

41. Ерошенко Г.А. Молекулярно-генетический анализ штаммов Vibrio cholerae 0139 /Автореф.докт. биол. наук.- Саратов, 2004. 30 с.

42. Железникова Г.Ф. Механизмы взаимодействия возбудителя инфекции и иммунной системы хозяина // Инфекционные болезни.- 2006.- Т.4, № 3.- С. 6977.

43. Заднова С.П., Лозовский Ю.В. Механизмы секреции грамотрицательных бактерий // Пробл. особо опасных инфекций. 2005. - Вып. 2 (90). - С. 11-16.

44. Зербино Д.Д., Лукасевич Л.А. Методика для определения «возраста» фибрина при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови //Арх. патол.- 1984.- № 8.- С. 72-75.

45. Иванова И.А., Васильева Г.И., Киселева А.К. и др. Монокин-опосредованное влияние чумного микроба и его антигенов на экспрессию Fc-рецепторов на поверхности нейтрофилов // Биотехнология. 2006. - № 2. - С. 11-15.

46. Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля. М.: «Медицина».- 1987.472 с.

47. Инструкция по первичной обработке материала, зараженного или подозрительного на зараженность возбудителями чумы, холеры, туляремии, бруцеллеза и сибирской язвы при проведении гистоцитоэнзимохимических исследований,- Ставрополь, 1987. 17 с.

48. Информационный сборник статистических и аналитических материалов. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации в 2003-2004 г.г.- М., 2005.- Ч. 3.- 360 с.

49. Ипатов Ю.П., Комарова Л.Г., Переслегина И.А., Шабунина Е.И. Ключи к проблеме гастроэнтерологических заболеваний у детей.- Н. Новгород, 1997.217 с.

50. Исупов И.В., Бугоркова С.А., Кутырев В.В. Патоморфологические аспекты доклинических испытаний различных вакцин против чумы, сибирской язвы и холеры,- Саратов: ОАО «Приволжское книжное изд-во, 2004.- 180 с.

51. Каграманов B.C., Асеева Л.Е., Гончаров Е.К. Оценка гипоксического состояния у экспериментальных животных под влиянием антигенов Yersinia pestis II Журн. микробиол. 2002.- № 5.- С. 65-67.

52. КветнаяТ.В., Князькин И.В., Кветной И.М. Мелатонин-нейроиммуноэндо- : к.риннышмаркер;возрастной патологии.- Санкт-Иетербург, 2005. -'142 с.:

53. КветнойИ.М:,БалмасоваИ.П., Смородинов Л.П. Эндокринная функция any-. доцитов иммунокомпетентных органов при некоторых формах иммунного ответа // Бюл. экспер. биолог. • 1983. № 9. - С. 78-79.

54. Кветной- И.М., Балмасова, И.П. Патоморфологические аспекты взаимодействия 5 АРХЛЗ-системы и органов ^иммунитета // Тез. докл. VII Всесоюзного съез-; да патологоанатомов; -Ташкент, 1983:-С.178-180: ' ,

55. Кокушкин A.M. Социальные и биологические аспекты эпидемиологии чумы: Автореф. дис. . д-ра мед. наук.- Саратов, 1995.- 24 с.

56. Кологоров А.И., Федоров Ю.М., Васенин A.C. и др. Совеременное состояние вопроса иммунопрофилактики холеры // Пробл. . особо опасных инфекций. -2001,-Вып.81,-С. 136-140. .

57. Кормилицына М.И., Мещерякова И.С. Характеристика природного аттенуи-рованного изолята Fraricisellä tularensis /^ypH. микробиол. — 1996. № 2. - С. 3-6.

58. Костромитина Е.А. Молекулярно-генетические свойства штаммов холерноговибриона эльтор с различной эпидемической значимостью // Автореф. дис. . канд. мед. наук.- Саратов, 2004.- 22 с.

59. Кутырев В.В. Генетический анализ факторов вирулентности возбудителя чумы // Автореф. дис. . доктор, мед. наук.- Саратов, 1992.- 38 с.

60. Кутырев В.В., Девдариани З.Л., Саяпина Л.В. Современное состояние научных исследований в области вакцинопрофилактики особо опасных бактериальных инфекций // Пробл. особо опасных инфекций. 2006.- Вып. 2 (92).-С. 18-24.

61. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Эпидемически* опасные штаммы холерного вибриона: молекулярно-генетические аспекты, их происхождения и эволюции // Пробл. особо опасных инфекций. 2004.- Вып. 2 (88).- С. 5-9.

62. Кутырев П.А., Лебединский В.А., Огарков и др. Эффективность ингаляци-. онного метода иммунизации регидратированной вакциной в отношении аэрогенного заражения возбудителем чумы // Матер, межинст. конф. им. И.И.Мечникова.- М., 1967. С.39-40.

63. Левкович A.A., Квасов Е.М., Текнеджан В.Г. и др. Заболевания ОКИ, вызываемые холерными вибрионами не Ol-группы // Сб. науч. тр. Новороссийск, 1994.-Вып. 1.-С. 127-128.

64. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия.- М.: Мир, 1969.- 645 с.

65. Лоцманова Е.Ю. Оценка эффективности пероральных холерных вакцин в RITARD- модели на этапе доклинических испытаний / Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2006. - 22 с.

66. Любовцева Л.А. Люминесцентно-гистохимическое исследование амино-содержащих структур костного мозга, тимуса и крови при действии нейроме-диаторов и антигенов.- Чебоксары, 1993.- 192 с.

67. Ляшенко В.А. Мукозальные вакцины // Иммунология.- 1997.- № 6.- С. 4-7.

68. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ.- М.: Мир, 1984.- 480 с.

69. Марков Е.Ю., Урбанович Л .Я., Голубинский Е.П. и др. Получение высоко-иммуногенного препарата наружных мембран Vibrio cholerae eltor II Журн. микробиол.- 1998.- Т.5, № 4.- С. 42-48.

70. Маркушин С.Г. Молекулярные механизмы действия мукозоадгезивных адъ-ювантов // Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2004.- № 5 (18).- С. 4347.

71. Маянский А.Н., Маянская.И.В. Реактивность и медиаторные функции инте-стинальных эпителиоцитов в системе мукозального гомеостаза // Иммунология,- 2004,- Т. 25, № 3.- С. 185-192.

72. Медуницын Н.В. Вакцинология .- М.: «Триада-Х». 2-е изд., перераб. и до-пол.- 2004.- 448 с.

73. Международные медико-санитарные правила (ММПС). ВОЗ, 58-я сессия. Приложение 2.- Женева, 2005.

74. Меньшикова Е.А., Подосинникова Л.С. Сравнительная характеристика препаратов гемолизина СТХ^ и СТХ* штаммов Vibrio cholerae эльтор и Vibrio cholerae 0139 // Журн. микробиол.- 2006.- № 6.- С. 47-49.

75. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. М.: Медицина, 1969,423 с.

76. Методические рекомендации по определению вирулентности холерных вибрионов на модели кроликов-сосунков: Ростов-на-Дону, 1979. 5 с.

77. Методические указания (3.5.51034-01): Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности при работе методом ПНР.- М., 2001.- 42 с.

78. Методические указания (МУ 3.3.1.1113-02): Основные требования к вакцинным штаммам чумного микроба. — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002. 63 с.

79. Методические указания (МУ 1.3.1794-03): «Организация работы при исследовании методом ПЦР материала инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности». М.: Федеральный центр/ Госсанэпиднадзора Минздрава России; 2003.-31 с.

80. Методические указания (МУ 3.3:1.2075-06): Основные требования; к вакцин. ным штаммам холерного вибриона //Бюл. нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора.- 2006.- Вып. 3 (25).- С. 99-144.

81. Методические, указания (МУ 3.3.1.2161-07): Основные требования^ к вакцинным штаммам туляремийного микроба // Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора 2007.- Вып. 2(28).- G. 111-148.

82. Методические указания (МУК 4.2:2218-07): Лабораторная диагностика холеры. -Mf: Федеральный: центр гигиены и эпидемиологии Росиотребнадзора, 2007.-87 с. . /'•

83. Миронова A.B., Меньшикова Е.А., Подосинникова Л;С. Изучение энтеропа-тогенных свойств холерных вибрионов Ol и 0139 серогрупп // Пробл. особо опасных инфекций. 2002.- Вып. 1: (83).- С. 103-108.

84. Молдаван И.А. Экспериментальное обоснование преимуществ сочетанной специфической и экстренной .профилактики чумы: Автореф; дис. канд. биол. наук.-Ростов-на-Дону, 2005.-22 с.

85. Монахова Е.В;, Михась Н.К, Писанов Р.В. и др. Характеристика дополнительных диареегенных и цитотоксических факторов, продуцируемых холерными вибрионами // Пробл. особо опасных инфекций. 2004.- Вып 87.- G. 51-54.

86. Монахова Е.В, Писанов Р.В. Токсины холерных вибрионов // Молекул, генетика, микробиол. и вирусология:- 2005,- № 1.- G. 7-18;

87. Монахова Е.В, Писанов Р.В. Сравнительный анализ литературных и компьютерных данных о свойствах цитотоксического фактора NMDCY и гемагглютинин/протеаза холерных вибрионов // Пробл. особо опасных инфекций. -2006,-Вып. 1 (91).-С. 15-20. .

88. Назарова Л.С. Иммунопатоморфологические аспекты, энтеральной иммунизации против холеры в эксперименте / Автореф. дис. . канд. мед. наук. -Саратов, 1981.- 20 с. :

89. Никифоров В.В., Кареткина Г.Н. Туляремия: от открытия до наших дней-// Инфекционные болезни,- 2007.- Т.5, № Г.- С. 67-76.

90. Овсянников В .И. Экспериментальное обоснование коротких схем экстренной профилактики чумы в, динамике иммуногенеза после одно и многократных прививок: Автореф. дисканд. мед. наук. — Саратов, 1991. 21 с.

91. Онищенко Г.Г. Постановление от 1 апреля 2005 г. №*11 «Об усилении мероприятий по эпидемиологическому надзору за холерой // Сибирь-Восток.-2005.-№4:-С. 33-34.

92. Онищенко Г.Г. Борьба с инфекционными болезнями приоритетная тема• . . у. . 315 ' Упредседательства'; Российской Федерации на Саммите группы восьми в 2006 г.//Журн. микробиол.-2006.- Ж7.-С. 3-7.

93. Онищенко F.F., Ломов;Ю:М., Москвйтина,Э.А. и др: Холера, обусловленная Vibrio cholerae ctxAB' tcxA' И Журн. микробиол.- 2007.- № 1.- С. 23-30.

94. Пак С.Г., Грачев1 С.ВУ, Белая. 0;Ф:, Малов-В.А., Асташкин Е.И: Патогенетические аспекты синдрома интоксикации в ютинике инфекционных болезней // Вестник Российской АМН. 2008. - № 11. - С. 33-41.

95. Павлович Н.В:, Мипшнькин Б.Н., Кравцов А.Н., Динилевская F.H. Плазмиды у возбудителя туляремии // Болезни с природной очаговостью на Кавказе. -Ставрополь.-1983.-С. 109-110.

96. Павлович Н;В., Тынянова* В.И. Возможные.механизмы реализации токсического потенциала липополисахаридов патогенных бактерий // Молекул, ге-нет., микробиол. и вирусол. -2005.- № 2,- С. 9-13.

97. Пальцев М.А., Иванов: A.A., Северин С.Е. Межклеточные взаимодействия. -Mi, 2003".-217с.

98. Першин Б.Б., Гелиев А.Б., Толстов Д.В., Ковальчук Л.В. Система лимфоцитов ткани пищеварительного тракта животных и перорально индуцированнаяиммунная толерантность // Иммунология,- 2001,- № 6.- С. 10-19.

99. Печенкин Д.В., Бывалов A.A., Маракулин И.В. и др. Влияние капсулы Yersinia pestis на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов морских свинок // Пробл. особо опасных инфекций. 2005. - Вып. 2 (90). - С. 47-48.

100. Пинегин Б.В., Дамбаева С.В. NK-клетки: свойства и функции // Иммунология. 2007. - № 3. - С. 105-113.

101. Пирс Э. Гистохимия / Под ред. В.В. Португалова: перевод с англ.- М.: Изд-во Иностранная литература. 1962. - 962 с.

102. Покровский В.И., Малеев В.В., Адамов А.К. Клиника, патогенез и лечение холеры. — Саратов: из-во Саратовского университета.- 1988. 272 с.

103. Половцев Т.В. Понятие о структуре и функции иммунной системы // Гематология и трансфузиология.- 1993. № 3. - С. 7-12.

104. Понукалина Е.В. , Киричук В.В., Адамов А.К., Белов Л.Г. Состояние процессов липопероксидации в динамике экспериментальной холерной интоксикации // Бюл. экспер. биол. и мед.- 2000.- Т. 129, № 4. С. 399-401.

105. Попов Н.В., Безсмертный В.Е., Новиков Н.Л., Удовиков А.И., Кутырев В.В. Современное состояние и прогноз эпизоотической активности природных очагов чумы Российской Федерации на 2007 г. // Пробл. особо опасных инфекций. 2007. - Вып. 1 (93).-С. 11-15.

106. Приказ МЗ СССР № 755 от 12.08.77. «Правила проведения работ и использования экспериментальных животных».

107. Приказ МЗ России № 229 от 27.07.2001 г. «О национальном календаре профилактических привовок и календаре привовок по эпидемическим показаниям».

108. Райхлин И.Т., Кветной И.М., Осадчук М.А. APUD-система (общепатологические и онкологические аспекты).- Обнинск, 1993. Ч. 1-2. - 217 с.

109. Ратникова Л.И., Кузьмина Н.Я. Случай холеры в Челябинске // Эпидемиол.инфекционных болезней.- 2002.- № 2.- С. 53-54.

110. Резников Ю.Б., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. и др. Лабораторные доклинические испытания рекомбинантного штамма Vibrio cholerae кандидата в живую холерную вакцину // Пробл. особо опасных инфекций. 1999.- Вып. 79.-С. 107-114.

111. Резников Ю.Б., Щуковская Т.Н., Ледванов М.Ю.,и др. Отечественная реком-бинантная живая холерная вакцина разработка и доклинические испытания // Аллергология и иммунология.- 2000.- Т.1, № 3.- С. 86.

112. Родионова И.В., Захаренко В.И. Антигенный состав белков наружной мембраны туляремийного микроба // Молекулярная-генетика, микробиол. и виру-сол.- 1990.-№ 11.-С. 16-18.

113. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология.- М.: Мир, 2000. 582 с.

114. Руководство по профилактике чумьг/ Под ред. A.B. Наумова, Л.В. Самойловой. Саратов, 1992. - 278 с.

115. Руководящий'документ по стандартизации (РД 42-28-8-89): Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. — М., 1989.-31 с.

116. Руководящий документ по стандартизации (РД 42-28-10-90): Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Методические принципы //Министерство здравоохранения.- 1990.- 49 с.

117. Рыбакина Е.Г., Корнева Е.А. Трансдукция сигнала интерлейкина-1 в процессах взаимодействия нервной и иммунной систем организма // Вестник Российской АМН. 2005. - № 7. - С. 3-8

118. Самойлова Л.В. Постинфекционный иммунитет к чуме в зависимости от интенсивности вакцинального процесса // Специфич. профилакт. особо опасных инф.-М., 1964.-С. 78-87.

119. Самойлова Л.В. Динамика развития иммунитета к чуме после прививки живой вакциной и особенности иммуногенеза при этой вакцинации / Автореф. дисс. . канд. мед. наук, Саратов. 1968. - 22 с.

120. Самойлова^ Л.В. Иммунопрофилактика чумы // Совр. асп. профилакт. зоо-нозн. инф,-Иркутск, 1984.-Ч. 1. С. 132-133.

121. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами 1-Й групп патогенности (опасности)» СП 1.3.1285-03 // Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. 2003. - Вып. 3 (13). - № 9. - С. 61-44.

122. Санитарные правила «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов» СП 3.3.2.561-96. М.: Информационно-издательский центр Минздрава России. - 1996. - 127 с.

123. Селье Г. ( Selye H.) На уровне целого организма / Пер. с англ.- М.: Наука, 1972.-122 с.

124. Сергеева В.Е., Гунин А.Г., Гордон Д.С. Сочетание свойств макрофагов и □ cíítok APUD-серии в моноаминосодержащих премедуллярных клетках ти-мусной дольки//Морфология.- 1994.-№ 1-3.- С. 159-162.

125. Симоненков А.П., Федоров В.Д. Серотонин и его рецепторы в генезе стресса и адаптации // Вестник РАМН. 2002. - № 8: - С. 9-13.

126. Смирнов В.М. Серотонинергическая регуляция моторики желудочно-кишечного тракта // Российский журнал Гастроэнтерологии, гепатологии, ко-лопроктологии.- М., 1996.- N 4 (Приложение N 3).- С. 288.

127. Смирнова Н.И., Костромитина Е.А., Топорков A.B., Кутырев В.В. Атипичные штаммы холерного вибриона ЭльТор, выделенные от людей // Эпидемиол. и инфекционные болезни.- 2005.- № 5.- С. 15-20.

128. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Сравнительный анализ молекулярно-генетических особенностей геномов и их эволюционных преобразований у возбудителей холеры, чумы и сибирской язвы // Молекул, генетика, микро-биол. и вирусол. 2006.- № 2,- С. 9-19.

129. Смирнова Н.И., Осин A.B., Нефедов К.С. и др. Вариабельность генома про-фага СТХф и ее роль, в изменении вирулентных свойств Vibrio cholerae биовара эльтор // Журн. микробиол.- 2007. № 6. — С. 20-26.

130. Смолягин А.И., Афонина С.Н., Бовбас Е.И., Анисимова.Т.И. Иммунный^ответ и уровень серотонина в динамике экспериментальной сальмонеллезной инфекции // «Взаимодействие нервной и иммунной систем». Ленинград -Ростов-на-Дону, 1990.-С. 189.

131. Струков А.И., Пауков B.C., Кауфман О.Я. Общая патология человека/ Под ред. Струкова А.И., Серова В.В., Саркисова Д.С.-М.: Медицина, 1990.-С. 374.

132. Томова A.C., Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Роль фактора некроза опухоли а во взаимодействии макро- и микроорганизма // Вестник Российской АМН.2005.-№ 1.- С. 24-29.

133. Труфакин В.А., Шурлыгина A.B. Проблемы гистофизиологии иммунной системы // Иммунология.- 2002.- № 1.- С. 4-8.

134. Труфакин В.А., Шурлыгина A.B. Проблемы центральной регуляции биоритмов иммунной системы. Роль мелатонина // Вестник Российской АМН.2006.-№9-10.- С. 121-127.

135. Туйгунов М.М., Габидуллин З.Г., Зурочка A.B., Бухарин О.В. Молекулярные механизмы взаимоотношений организма и патогенных энтеробактерий // Журн. микробиол.- 2003.- № 4,- С. 23-27.

136. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих / Под ред. В.Ю. Полякова: перевод с англ. М.: Мир, 1975. - 324 с.

137. Усвяцов Б.Я., Хуснутдинова Л.М., Паршута Л.И. и др. Роль факторов перси-стенции и вирулентности при микроэкологических изменениях в организме человека//Журн. микробиол.- 2006.- № 4.- С. 58-61.

138. Урбанович Л.Я., Саппо С.Г., Марков Е.Ю., Голубинский Е.П., Иванова Т.А.,320 . ,

139. Федорова В.А., Девдариани З.Л. Перспективы создания экспериментальных антиидиотипических вакцин противчумы // Иммунология. 2006. -№ 3. - С. 144-148;

140. Федорова В.А., Девдариани 3:Л: Механизм взаимодействияУег^'ш'а pestis с эритроцитами и его значение,для патогенеза чумы // Вестник РАМН:,- 2007. -№.11- С. 13-21., -,

141. Хаитов P.M., Пииегин Б.В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и при патологии // Иммунология.-1997.-№ 5.-С. 4-7.

142. Хаитов P.M. Роль респираторных вирусов в патогенезе бронхиальной астмы //Иммунология.- 2003,- № 1.- С. 58-65

143. Хлебников B.C., Головлев И.Р., Кулевацкий Д.П. и др. Изучение биохимических, антигенных; и протективных свойств внешней мембраны возбудителя туляремии // Молекул, генетика, микробиол. и виру со л: -1991.- № 7.-С. 1520. '

144. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю^, Воскресенская;Е.А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний// Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия:- 2002.- Т.4, № 3.- С. 248-266.

145. Цепелев B.Jl., Цепелев СЛ., Зиганшин Р.Х., Цыбиков H.H. Изучение иммуностимулирующей активности пептидов, выделенных из бурсы фабрициуса // Иммунология. 2003. - № 2. - С.89-92.

146. Цимбалистова М.В., Павлович Н.В., Сорокин В.М., Тынкевич Н.К. Способность авирулентных форм Francisella tularensis к диссеминации и пролиферации в организме хозяина // Журн. микробиол. 1996. - № 2. — С. 10-13

147. Черкасский Б.Л. Руководство по общей эпидемиологии. — М.: Медицина, 2001.-560 с.

148. Чеховская Г.В. Генетический анализ хромосомной области Vibrio cholerae Ol39, содержащей гены О-антигена / Автореф. дис. . канд. мед. наук.- Саратов, 1996.- 22 с.

149. Шеенков Н.В., Опочинский Э.Ф., Валышев A.B. и др. Факторы персистен-ции Francisella tularensis II Журн. микробиол.- 2006.- № 1.- С. 63-66.

150. Ширанович М.П. Морфогистоэнзимохимическое изучение некоторых механизмов приобретенной резистентности к чуме / Автореф. дис. . канд. мед. наук.- Ставрополь, 1987.- 22 с.

151. Щуковская Т.Н. Показатели медиаторного обмена в процессе формирования иммунитета к холере//Автореф. дис. .канд. мед. наук.- Саратов, 1978.- 19 с.

152. Щуковская Т.Н. Регуляция нейромедиаторами формирования специфической резистентности к особо опасным инфекциям //Аллергология и иммунология. -2000.-Т.1.-С. 110-111.

153. Щуковская Т.Н., Майскова Т.С., Анисимова Т.И. и др. Роль гистамина, серо-тонина в нейроиммуномодуляции формирования специфической резистентности к чуме и холере // Тез. докл. I съезда иммунологов.- Новосибирск, 1992.- С. 568-569.

154. Щуковская Т.Н., Дятлов И.А., Смирнова Н.И. Основы иммунологической эффективности и безопасности холерных вакцин нового поколения // Матер. VIII Российской научно-практической конференции «Холера».- Ростов-на-Дону, 2003.- С. 219-224.

155. Яковлев М.Ю. «Эндотоксиновая агрессия» как предболезнь или универсальный фактор патогенеза заболеваний человека и животных // Усп. соврем, биол. 2003. - № 1.-С. 31-40.

156. Albert М. Epidemiology and molecular biolodi of Vibrio cholerae 0139 Bengal // Indian J. Med. Res.- 1996.- V. 104.- P. 14-27.

157. Altantsetseg L., Batbold J. Retrospective analysis of human plague of Mongolia from 1964 to 1998: patho-anatomical characteristics // Scient. J.- 2000,- N 8,- P. 16-22.

158. Alvarez M.L., Pinyerd H.L., Crisantes J.D. et al. Plant-made subunit vaccine against pneumonic and bubonic plague is orally immunogenic in mice // Vaccine. -2006. V. 24, N 14. - P. 2477-2490.

159. Anisimov A.P., Lindler L.E., Pier G.B. Intraspecific Diversity of Yersinia pestis II J. Clin. Microbiol. Rev.- 2004.- V. 14, N 2.- P. 434-464.

160. Andrews C.P., Strachan S.T., Bennet G.E. et al. Protective efficacy of recombinant Yersinia outer proteins against bubonic plague caused by encapsulated and nonen-capsulated Yersinia pestis II Infect. Immun.- 1999.- V.67.- P. 1533-1537.

161. Attridge S.R., Voss E., Manning P.A. Pathogenic and vaccine significance of toxin-coregulated pili of Vibrio cholerae El Tor // J. Biotechnol. 1999. - V. 73, N 2-3.-P. 109-117.

162. Barlogie B., Spidzer G., Hart G.S. et al. DNA histogram analysis of human he-mopoetic cells // Blood.- 1976.- V. 48, N 2,- P. 245-257.

163. Baudry B., Fasano A., Ketley J., Kaper J.B. Cloning of a gene additional support for our new model describing production of (zot) encoding a new toxin produced by Vibrio cholerae II Infect. Immun.- 1992.- V. 60, N 2.- P.428-434.

164. Begier E.M. Pneumonic 'plague cluster, Uganda, 2004 // Emerg. Infect. Dis.- 2006.-V.12,N3.- P. 460-467.

165. Benitez J.J., Garcia L., Silva A. et al. Preliminarry assessment of the safety and immunogenicity of a New CTXcp-negative, hemagglutinin/protease-difective El Tor strain as a cholera vaccine candidate // Infect. Immun. 1999.- V. 67, n 2. — P. 539-545.

166. Benitez J.J., Silva A., Finkelstein A. Environvental signals controlling Production of hemagglutinin /protease in V. Cholerae II Infect. Immun. 2000.- V.10. - P. 6549-6553.

167. Berkes J., Viswanathan V.K., Savkove S.D., Hecht G. Intestinal epithelial responses to enteric pathogens: effects on tight junction barrier, ion transport and inflammation // Gut.- 2003,- V. 52.- P. 439-451.

168. Beutler B. Endotoxin, Toll-Like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity // Current Opinion in Microbiol.- 2000,- № 3.- P. 23-28.

169. Bialy H. Constaction of a live oral cholera Vaccine // BioTechnology.- 1984.- V. 2, N4.-P334.

170. Bik W., Wolinska-Witirt E., Chmielowska M. et al. Vasoactive intestinal peptide can modulate immune and endocrine responses during lipopolysaccharide-induced acute inflammation // Neuroimmunomodulation. 2004. - N 11. - P. 358-364.

171. Bhattachaiyya* S., Ghosh S., Shant J et al. Role of the W07-toxin on Vibrio chol-mze-induced diarhoea II Biochim. Biophys. Acta.- 2004.- V. 1670, N 1.- P. 69-80.

172. Brubaker R.R. Factors promoting acute and chronic disease caused by Yersinia II Clin. Microbiol. Rev. 1991. -V. 4. - P. 309-324.

173. Burkart V., Kim Y.E., Hartmann B! et al. Cholerae toxin B pretreatment of macrophages and monocytes dimishes their proinflammatory responsiveness to lipopoly-sacharide II J. Immunol.- 2002.- V.168, N 4.- P. 1730-1737.

174. Burrell R., Ye Shu-Hua, Toxic risks from inhalation of bacterial endotoxin // Brit. J. Ind. Med. 1990. - V. 47, N 10. - P. 688-691.

175. Calain P., Chaine J.P., Johnson E. et al. Can oral cholera vaccination play a role in controlling a cholera outbreak? II Vaccine.- 2004.- V. 22, N 19,- P. 2444-2451.

176. Calhoun L.N., Kwon Y.M. Salmonella-based plague vaccines for bioterrorism // J. Microbiol. Immunol. Infect. 2006. - V. 39, N 2. - P. 92-97.

177. Centers for Disease Control and Prevention (CVD). Cholera epidemic associated with raw vegetablts-Lusaka, Zambia, 2003-2004 II MMWR Morb. Mortal. Wkly Rep. 2004.- V. 53 (34), N 3.- P. 783-786.

178. Chatterjee S.N., Chaudhuri K. Lipopolysaccharides of Vibrio cholerae II. Genetics of biosynthesis // Biochim. Biophys. Acta.- 2004.- V. 1690, N 2.- P. 93-109.

179. Chattopadhyay K., Banerjee K.K. Unfolding of Vibrio cholerae hemolysin induces oligomerization of the toxin monomer // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278, N 40. -P. 38470-38475.

180. Chiang Su L., Holden D.W., Mekalanos J.J. Use of signature-tagged mutagenesis to identify V cholerae genes important for colonization 11 Thirty-third Joint Conference on Cholera and Related Diarrheal Diseases: Abstracts. -Clearwater Beach,

181. Florida, Dec.3-5, 1997.- P. 160-161.

182. Chiang Su L., Mekalanos J.J. Construction of a Vibrio cholerae vaccine candidate using transposon delivery and FLP recombinase-mediated excision // Infect. Immun. 2000. - V. 68, N 11. - P. 6391-6397.

183. Chowers Y., cahalon L., Lahav M. et al. Somatostatin through its spetific receptor inhibits spontaneous and TNF-a and bacteria-induced IL-8 and Il-lß secretion from intestinal epithelial cells // J. Immunol. 2000. - V. 165. - P. 2955-2961.

184. Chromy B.A., Choi M.W., Murphy G.A. et al. Proteomic characterization of Yersiniapestis virulence // J. Bacteriol.- 2005,- V. 187, N 23.- P. 8172-8180.

185. Coelho A., Andrade J.R., Vicente A.C., Dirita V.J. Cytotoxin cell vacuolating activity from Vibrio cholerae hemolysin // Infect. Immun.- 2000.- V. 68, N 3.- P. 1700-1705.

186. Cooke H.J. Hormones and neurotransmitters regulating ion transport / In M. Field (ed), Diarrheal diseases. Elsevier.- New York, 1991.- P. 23-48.

187. Cowan C., Jones H.W., Kaya Y. et al. Invasion of epithelial cells by Yersinia pestis: evidence for a Y.pestis-specific invasion // Infect. And Immun. 2000.- V. 68. -P. 4523-4530.

188. Dietrich G., Griot-Wenk M., Metcalfe J.C. et al. Experience with registered mucosal vaccines // Vaccine. 2003.- V. 21, N 7-8. - P. 678-683.

189. Domachowske J.B., Bonville C.A., Rosenberg H.F. Gene expression in epithelial cells in response to pneumovirus infection // Resper. Res.- 2001 .-V. 2\- P. 225-231.

190. Dopardenne M. Role of thymic peptides as transmitters between the neuroendocrine and immune systems // Ann. Med. 1999. - V. 31. - P. 34-39.

191. Duenas A.I., Aceves M., Orduna A. et al. Francisella tularensis LPS induces theproduction of cytokines in human monocytes and signals via Toll-like receptor 4 with much lower potency than E.coli LPS // Int. Immunol.-2006.-V.18.- P. 785795.

192. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbit: a metod for che-motherapeuticinvestigation //Brit. J. Pharmacol. 1955.-Y. 10.-P. 153-159.

193. Eckmann L., Kagnoff M.F. Cytokines in host defense against Salmonella II Microbes Infect. 2001. - V. 3. - P. 1191-1200.

194. Eko F.O., Schukovskaya T.N., Igiettseme J.U., Lubiz W. Protective efficacy of Vibrio cholerae ghosts candidate vaccine // Georgia Journal of Science -2002. V. 60, № 1.-P.25.

195. Ellis J., Oyston C.F., Grenn M., Titball R.W. Tularemia // Clin. Microbiol. Rev.-2002. Y. 15, № 4.- C 631-646.

196. Faruque S.M., Nair G.B., Mekalanos J.J. Genetics of stress adaptation and virulence in toxigenic Vibrio cholerae //DNA Cell. Biol. 2004. - V. 23, N 11.- P. 723-741.

197. Fasano A. Regulation of intercellular tight junctions by zonula occludens toxin and its activetic analogue zonulin // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2001. - N 915. - P. 214-232.

198. Fasano A. Toxins and the gut: role in human disease // Gut. 2002. - V. 50. - P. 9-14.

199. Feodorova V.A., Devdariani Z.I. An erythrocyte is the target cell for Yersinia pes-tis II 8th Intern. Symposium on Yersinia, September 4-8, 2002, Turku, Finland, 2002.- P. 94.

200. Feldman S.A., Eiden L.E. The chromogranins: their roles in secretion from neuroendocrine cells and as markers for neuroendocrine neoplasia // Endocr. Pathol. — 2003.-V. 14, № l.-P. 3-23.

201. Ferran I. Morphologien bacilla cholera and vaccination gegen cholera // Dtsch. Med. Leitung.- 1885.-N 15.-P. 4-6.

202. Feyrter G.L. Uber die peripheren endokrinen (parakrinen) Drusen des Menschen. -Wien-Dusseldorf. W.Maudrich, 1953.-231 s.

203. Figueroa-Arredondo P., Heuser J.E., Akopyants N.S. et al. Cell vacuolation caused by Vibrio cholerae hemolysin // Infect. Immun.- 2001,- V. 69.- N 3,- P. 1613-1624.

204. Finkelstein R.A. Quo vadis: thirty years after the discoveries of cholera enterotoxin in India // Curr. Sei. (India). 1990. - V. 59, N 13-14. - P. 656-664.

205. Fleckenstein J.M., Kopecko D.J. Breaching the mucosal barner by stealth: an emerging pathogenic mechanism for enteroadherent bacterial pathogens // J. Clin. Invest.-2001.-V. 107.-P. 27-30.

206. Fulop M., Webber T., Manchee R. Activation of the complement system by Francisella tularensis lipopolysaccharide // Microbiologica.- 1993.-V. 16.-P. 141-148.

207. Fulop M., Manchee R., Titball R. Role of two outer membrane antigens in the induction of protective immunity against Francisella tularensis strains of different virulence // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - V. 13. - P. 245-247.

208. Gage K.L., Kosoy M.Y. Natural history of plague: perspectives from more than a century of research // Annu. Rev. Entomol.- 2005.- V. 50.- P. 505-528.

209. Gentry M., Taormina J., Pyls R.B. et al. Role of primary human alveolar epithelial cells in host defense against Francisella tularensis infection // Infect, and Immun. 2007. - V. 75, N 8. - P. 3969-3978.

210. Godaly G., Bergsten G., Hang L. et al. Neutrophil recruitment, chemokine resep-tors, and resistance to mucosae infection//J. Leukos. Biol.-2001.-V. 69.-P. 899-906.

211. Golovliov I., Sjostedt A., Mokrievich A., Pavlov V. A method for allelic replacement in Francis el la tularensis II FEMS Microbiol. Lett.-2003.- V. 222.- P. 273280.

212. Grimelius L. A silver nitrate stain for 12 cells in human pancreatic islets // Acta Soc. Med. upsaliensis. 1968,- V. 73. - P. 243-270.

213. Guan K., Dixon J.E. Protein tyrosine phosphatase activity of an essential virulence determinant in Yersinia .// Science .- 1990.- V. 249.- P. 553-556.

214. Haffkine W. Les vaccinations anticholeriques aux Index // Bull. Inst. Pasteur. -1906.- V. 4.-P. 635.

215. Hartley M.G., Green M., Choules G. et al. Protection afforded by heat shock protein 60 from Francisella tularensis is due to copurified lipopolysaccharide // Infect. Immun: 2004. - V. 72, N 7. - P: 4109-4113.

216. Hellstand K., Hermodsson S. Role of serotonin in the regulation of human natural killer cell cytotoxicity // J. Immunol. 1987. - V.139. - N3. - P.869-875.

217. Holmgren J., Svennerholm A.-M. Development of oral vaccines against cholera and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea // Scand. J. Inf. Dis. 1990. - V. 76. -p. 47-53.

218. Holmstrom A., Petterson J., Rosqvist R. et al. A YopK of Yersinia pseudotuberculosis controls translocation of Yop effectors across the eukaryotic cell membrane I I Mol. Microbiol. 1997. - V. 24. - P. 73-91.

219. Honda T., Finkelstein R. Selection and characteristics of a Jansen W.N., mutant lacking the A (ADP-ribosylating) proportion of the cholera enterotoxin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1979.- V. 76, N 4. P. 2052-2056.

220. Hullbert R.R., Taylor R.K. Mechanism of ToxT-dependent transcriptional ac-tivetion at the Vibrio cholerae tcpA promoter // J. Bacteriol.- 2002.- Vol. 184, N20,- P. 5535-5544.

221. Ihou X., Gao da Q., Michalski J. et al. Induction of interleukin-8 in T84 cells by Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2004. - V. 72, N 1. - P. 383-397.

222. Jackson S., Burrows T.W. The virulence enhancing effect of iron on non-pigmented mutants of virulent strains of P. pestis II Br. J. Exp. Pathol. 1956.

223. Jechlinger W., Haidinger W., Paukner S. et al. Bacterial Ghosts as Carrier and Targeting Systems for Antigen Delivery // In «Vaccine Delivery Strategies». G. Dietrich and W. Goebel (ed). - Horizon Scientific Press, Wymondham, UK. -2002.-P. 163-184.

224. Jermyn W.S., Boyd E.F. Characterization of novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates // Microbiology.- 2002. V. 148. - P. 3681-3693.

225. Jones S.M., Griffin K.F., Hodgson I., Williamson E.D. Protective efficacy of a fully recombinant plague vaccine in the guinea pig // Vaccine. 2003. — V. 21, N 25-26.-P. 3912-3918.

226. Jones T., Adamovicz J.J., Cyr S.L. et al. Intranasal Protollin/Fl-V vaccine elicits respiratory and serum antibody responses and protects mice against lethal aerosolized plague infection// Vaccine. -2006.- V. 24, N 10.-P. 1625-1632.

227. Kabir S. Cholera vaccines: the current stsatus and problems // Rev. Med. Microbiol.-2005.-V. 16.-P. 101-116.

228. Karlsen T.N., Sommerfelt H., Klomstad S. et al. Intestinal and systemic immune responses to an oral cholera toxoid B subunit wholl-cell vaccine administered during zinc supplementation // Inf. Immun.- 2003.- V. 71.- P. 3909-3913.

229. Kaper J.B., Levine M.M. Recombinant attenuated Vibrio cholerae strains used as live oral vaccines // Res. Microbiol. 1990. -V. 141, N 7-8. - P. 901-906.

230. Karaolis D.K., Johnson J.A., Bailey C.C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1998. V. 96, N 6. - P. 3154-3139.

231. Karaolis D:K., Lan R., Kaper J:B., Reeves P.R. Comparison of Vibrio cholerae pathogenicity islands in sixth seventh pandemic strains // Infect. Immun. 2001. -V. 69,N3.-P. 1947-1952 . . ' / .

232. Khlebnikov V.S., Golovliov I., kulevatsky D.P. et al. Outer membranes of lipopolysaccharidc-protein complex (LPS-17 kDa protein) as chemical tularemia vaccines // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. -V. 13. -P: 227-235. : .

233. Kinoshita N., Iliroi T., Ohta N. et al. Autocrine 11,-15 mediates intestinal epithelial cell death via the activation of neighboring intraepithelial NK cells // J. Immunol-2002.-Vol. 169.-P. 6187-6192.

234. Kim T.J:, Bose Taylor R.K. Secretion.of solüble colonization factor by the TCP • type:4 pilüs biogenesis-pathway in/Vibrio:ctioleraeII Moli Microbiol.-jV2003.r V.49, N1.- P. 81-92: '■"':•'' ■•"'/. '

235. Knirel Y.A., Dentovskaya S.V., Senchenkova S.N. et al. Structural features and structural variability of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis,. the cause of plague II J. Endotoxin. Res.- 2006.- V. 12, N.I .- P. 3-9.

236. Kutyrev V. , Filippov A.A., Oparina O.S. , Protsenko O.A. Analysis of Yersinia pestis chromosomal determinants Pgm+ and Pst+ essoliated with virulence // Mi-crob. Pathol.- 1992.-N10.-P. 177-186.

237. Lahteemaki K., Kuusela P., Korhonen T.K. Bacterial plasminogen activators and receptors // FEMS Microbiol. Rev.- 2001.- V. 25, N 5.- P. 531-532.

238. Lencer W.I.' Microbes and microbial-mucosal ,toxins cholera: invasion of the intestinal epithelial barrier by a stably folded protein toxin // Am. J. Physiol. Gastro-intest. Liver. Physiol.-2001.-V. 280, N 5.-P. 781-786.

239. Levine M.M., Kaper J.B. Live oral vaccines against cholera: an update // Vaccine.1993.-V. 11,-P. 207-212.

240. Liang W., Wang S., Yu F. et al. Construction and evalution of a safe, live, oral Vibrio cholerae vaccine candidate, IEM108 // Infect. Immun.- 2003.- V. 71, N 10.- P. 5498-5504.

241. Lillard J.W. Jr., Bearden S.W., Fetherston J.D. et al. The haemin storage (Hms+) phenotype of Yersiniapestis is not essential for the pathogenesis of bubonic plague in mammals // Microbiology. 1999. - V. 145. - P. 197-209.

242. Lubitz W. Bacterial1 ghosts as carrier and targeting systems // Expert. Opin. Biol. Ther. 2001. -V. 1, N 5. - P. 3781-3787.

243. Lucas M.E, Deen J.L., Von Seidlein L. et al. Effectiveness of mass oral cholera vaccination in Beira, Mozambique // N. Engl. L Med.-2005.rV. 352, N.8.-P/757-767.

244. Maestroni G, Conti A. Immuno-derived opioids as mediators of the immuno-enhancing and anti-srtess action of melatonin // Acta»Neurol. (Napoli). 1996. - V. 13, N4.-P. 356-360.

245. Majumdar A.S, Ghose A.C. Antibody dependent and independent cellular cytotoxicity to Vibrio cholerae // Indian J. Med. Res.-1982.-V. 75, May.- P. 633-637.

246. Manley N.R. Thymus organogenesis and molecular mechanisms of thymic epithelial cell differentiation // Semin. Immunol. 2000. - V. 12, № 5. - P. 421-428.

247. Marinaro M, Fasano A, De Magisrtis M.T. Zonula occludens toxin acts as an adjuvant through different mucosal routes and induces protective immune responses // Infect. Immun.- 2003.- V. 71, N 4,- P. 1897-1902.

248. Maroder M, Bellavista D., Vacca A. et al. The thymus at the crossroad of neuro-immune interactions // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000. - V. 217. - P. 741-747.

249. Mattoli S. Allgen-induced generation of mediators in the mucosa // Environ. Hlth. Perspect.- 2001.- V. 109.- P. 553-557.

250. McCardell B.A, Kothary M.H, Hall R.N, Sathyamoorthy V. Identification of a CHO-elongating factor produced by Vibrio cholerae 01 // Microb. Pathogen. -2000.-V. 29, N 1. P. 1-8.332. . .

251. Mitra RFiqueroa P., Mukhopadhyay A:K. et al; Cell vacuilation a manifestation of the El Tor hemolysion Vibrio cholerae // Infect. Immun:- 2000:- V. 68, N 4,- P: 1928-1933.

252. Monack D.M., Mecsas J., Ghori N., Falkow S. Yersinia signals macrophages to undergo apoptosis and YopJ iz necessary for cell; death // Proc. Natl. Acad Sei USA. 1997. - V. 94. - P. 10385-10390. .

253. Moser B: Silver stain for the detection of apoptosis at the light microscopy // Micr. Anat.- 1995.- V. 37.- P. 27-29.

254. Novel Vaccination strategies. Edited by S.H.E. Kaufinann -Wiley-VGH Verlag GmbH & Go. KgaA, Weinheim, 2004.-628 p.

255. Palmer L.E.S., Hobbie S., Galan J.E., Bliska J.B. YopJ of Yersinia pseudotuberculosis is reguired'for the inhibition of macrophages TNF-a production and down-regulation of the MAP kinase p3 8 and JNK // Mol. Microbiol. 1998.- V. 27. - P. 953-955.

256. Pappo I., Steger H.J., Owen R.L. Differential adherence of epithelium overlyinggut-associated lymphoid tissue. An ultrastructural study // Lab. Invest. 1988. - V. 5, N 1.-P. 692-697.

257. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague // Clin. Microbiol. Rev.- 1997.- V.10.- P. 35-66.N

258. Pichel M., Rivas H., Chimen I. Et al. Genetic diversity of Vibrio cholerae 01 in Argentina and emergence of a new variant // J. Clin. Microbiol. 2003. - V. 41, N l.-P. 124-134.

259. Pitisuttithum P., Cohen B., Phonrat B. et al. A human volunteer challenge model using frozen bacteria of the new epidemic serotype Vibrio cholerae 0139 in Thai volunteers // vaccine. -2002. V. 20, N 5-6. - P. 920-925.

260. Portnoy D. Manipulation of innate immunity by bacterial pathogens // Curr. Opin. Immunol.- 2005.- V. 17, N 1.- P. 25-28.

261. Prior J.L., Hitchen P.G., Williamson E.D. et al. Characterization of the lipopoly-saccharide of Yersinia pestis II Microbiol. Pathogenesis.- 2001.- V. 30.- P. 49-57.

262. Pritts T., Hungness E., Wang Q. et al. Mucosal and enterocyte IL-6 production during sepsis and endotoxemia -role of transcription actors and regulation by the stress response // Am. J. Surg. 2002. - V. 183. - P. 372-383.

263. Rastogi D., Rather A.G., Prince A. Host-bacterial interactions in the initiations of inflammation // Paediatr. Respir. Rev. 2001.- V. 2. - P. 245-252.

264. Reisner B.S., Straley S.C. Yersinia pestis IopM: thrombin binding and overexpression // Infect, and Immun.- 1992.- V. 60.- P. 5242-5252.

265. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopague stain in electron microscopy // J. Cell. Biol. 1963. - Vol. 17. - P. 208-212.

266. Richardson S.H., Giles G.C., Kruger K.S. Sealed Adult Mice: New model for Enterotoxin Evaluation II Infect, and Immun. 1984. - Vol. 43. - P. 482-486.

267. Rodriquez B.L., Rojas A., Campos J. et al. Differential interleukin-8 response of intestinal epithelial cell line to rectogenic and nonreactogenic candidate vaccine strains of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2001. - V. 69, N 1. - P. 613-616.

268. Rossi M., Maurano F., Luongo D. et al. Zonula occludens toxin (Zot) interfereswith the induction of nasal tolerance to gliadin // Immunol. Lett. 2002. — V. 81, N 3.-P. 217-221.

269. Saha P.K., Koley H., Nair G.B. Purification and characterization of an extracellular secretogenic non-membrane-demaging cytotoxin produced by clinical strains of Vibrio cholerae non-01 II Infect. Immun. 1996.- Vol. 64, N 8.- P. 3101-3108.

270. Samoilova S.V., Samoilova L.V., Yezhov I.N. et al. Virulence of pPst+ and pPst-strains of Yersinia pestis for guinea-pigs // Bacterial. Pathogenicity. — 1996. V. 45.-P. 440-444.

271. Sansonetti P.J., Phalipon A. M cells as ports of entry for enteroinvasive pathogens: mechanisms of interaction, consequences for the disease process // Semin. Immunol.- 1999.-V. 11.-P. 193-203.

272. Sears C.L., Kaper J.B. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkagev kto intestinal secretion // Microbiol. Rev.- 1996.- V.60.- P. 167-215.

273. Selye H. The evolution of the stress concept // Amer. Sci. 1973. - V. 61, № 6. - P. 692-699.

274. Shinoda S. Protein toxin produced by pathogenic vibrios // J. Nat. Toxins.- 1999.-V. 8, N 2.- p. 259-269.

275. Silva A.J., Pham K., Benitez J.A. Haemagglutinin/protease expression and mucin gel penetration in El Tor biotype Vibrio cholerae II Microbiology. 2003. - V. 149.-P. 1883-1891.

276. Silva A.J., Leitch G.J., Camilli A., Benitez J.A. Contribution of hemaaggluti-nin/protease and motility to the pathogenesis of El Tor biotype cholera II Infect. Immun. 2006. - V. 74, N 4. - P. 2072-2079.

277. Spangler B.D. Structure and function of cholera toxin and the related Escherichiacolliheast-labile.enterotoxih // Microbiol.Rev.- 1992.- V. 56.-P. 622-647. . .■

278. Spira W.M., Sack R.B., Frocnlich I.E. Simple adult rabbit model for: Vibrio Cholerae and enterop&thogemc Escherichia, Coli diarrhea // Infect, and Immun. 1981. - V. 32, № 2: - P. 739-747.

279. Stewart-Tull D.E., Bleakley C.R., Galloway T.S. Characteristics of Vibrio cholerae proteinases: potential; candidate vaccine- antigens // Vaccine.- 2004.- V. 22; N '2324.- P. 3026-3034. • ■ . . .

280. Stokes N:R:, Zhou X., Meltzer S J:, Raper J.B: Transcriptional responses of intestinal epithelial cells to infection with Vibrio, cholerae II Infect. Immun. — 2004,- V. 72, N 7. P. 4240-4248.

281. Svennerholm A.-M., Steele D. Microbiol-gut interactions in health and disease Progress in enteric vaccine development//Best. Pract. Res. Clin. Gastroenterol. -2004: -V. 18, N 2. -P. 421-445.

282. Tacket C.O., Losonsky G., Nataro J.P. et al. Initial clinical studies of CVD112 Vibrio cholerae 0139 live oral vaccine: safety and afficacy against experimental challenge // J. Infect. Dis. 1995. - V. 172. - P. 883-886.

283. Tarnvik^^A. Nature of protective immunity to Francisella tularensis 11 Rev. Infect. Dis. 1989. - V. 11, N 3. - P. 440-451.

284. V '/'336 / ■:■'■"':■•.■ , ■'

285. Titball R.W., Johansson A., Forsman M. Willthe enigma of Francisella tularensis virulence soon be solved? // Trends Microbiol. 2003. - V. 11. - P. 118-123.

286. Trucksis M., Mishalski J., Deng Y.K., Kaper J.B; Th& Vibrio cholerae genom contains two unigue circular chromosomes // Prec. Natl. Acad. Sci USA 1998. - V. 95. - P. 14464-14469.

287. Vaccine Delivery Strategies // G. Dietrich, W. Goebel (ed)- Wymondham: Horizon Scientific Pr-ess.-2002.-404 p.

288. Viboud G.I., Bliska J.B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis // Annu. Rev. Microbiol. 2005. - V. 59. -P. 69-89. .

289. Viret J.F., Dietrich G., Favre D. Biosafety aspects of the recombinant live oral Vibrio cholerae vaccine. 2004,- V. 22, N 19. - P. 2457-2469.

290. Waag D.M., Sandstrom G., England M J., Williams J.C. Immunogenecity of a new lot of Francisella tularensis live vaccine strain in human volunteers // FEMS Immunol. Med/ Microbiol. 1996.- V. 13.- P. 205-209.

291. Waldor M.K., Colwell R., Mckalanos J.J. The Vibrio cholerae. 0139 serogroup antigen includes an. O-antigen Capsula and lipopolysaccaride virulence determinants //Proc; Natl, Acad: Sei. USA.1-1994: V. 91. -P: 11388-11392!

292. Waldor M.K., Mekalanos J.1. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science.- 1996.- V. 272:- P. .1910-1924.

293. Weekly Epidemiological Reced. Cholera vaccines -2001.-V. 76^ N 16.-P.117-124.

294. Weekly Epidemiological Record; Releve epidemiologique hebdömadaire:.— 2007. -NN 24-31, 36-50; 273-280.

295. Wiedermann G., Kollaritsch H., Jeschko E. et al. Adverse events after oral vaccination against cholera with CVD103-HgR // Wien. Klin. Wochenschr. 1998. - V. 110.- P. 376-378.

296. Williams R.C., Gewürz H., Quie P.G. Effect of fraction I from Yersinia pestis on phagocytisis in vitro // J. Infect. Dis.- 1972,- V. 126.- P. 235-241.

297. Wright N.A. Aspects of the biology of regeneration and repair in the human gastrointestinal tract // Philos. Trans. R. Soc. Lound. B. Biol. Sei. 1998. - V. 29, N 353 (1370).-P. 925-933.

298. Wu Z., Nybon A., Magnusson K.E. Distinct effects of 'Vibrio cholerae hemaggluti-nin/protease on; the structure and localization of the tight junction-associated pro-teins:occluding and ZO-1 // Cell: Microbiol:- 2000.- V. 2.- P; 11-17.

299. Zhou D., Han Y., Yang R. Molecular and physiological insights into plague transmission, virulense and etiology // Microbes. Infect.-2006.-V. 8, N 1.- P. 273- 284.