Оценка эффективности пероральных холерных вакцин в RITARD модели на этапе доклинических испытаний тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Лоцманова, Екатерина Юрьевна

• Лоцманова, Екатерина Юрьевна
• кандидат медицинских наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Лоцманова, Екатерина Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ С ОРГАНИЗМОМ КАК ОСНОВА РАЗВИТИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА И СТАНОВЛЕНИЯ ПРОТИВОХОЛЕРНОГО ИММУНИТЕТА.

1.1. Антигены холерного вибриона, их роль в пато- и иммуногенезе холеры.

1.2. Особенности функционирования органов иммунной системы, ассоциированных с желудочно-кишечным трактом, и их роль в формировании резистентности к холере.:.

Глава 2. ПРИМЕНЕНИЕ МОДЕЛИ RITARD ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ПАТОГЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ДИАРЕЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ И ЭФФЕКТИВНОСТИ СРЕДСТВ ИХ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.2. Экспериментальные животные.

3.2. Методы.

3.2.1. Микробиологические методы.

3.2.1.1. Моделирование холерной инфекции методом RITARD.

3.2.1.2. Подготовка штаммов V. cholerae для моделирования холерной инфекции методом RITARD.

3.2.1.3. Определение адгезивной и колонизирующей способности холерных вибрионов при моделировании холерной инфекции методом RITARD.

3.2.1.4. Иммунизация взрослых кроликов.

3.2.2. Иммунологические методы.

3.2.2.1. Определение содержания Т- и В-лимфоцитов в крови кроликов.

3.2.2.2. Определение поликлональной активации В-лимфоцитов.

3.2.2.3. Исследование иммунореактивносги на гетерологичньтй антиген.

3.2.2.4. Определение апоптотических и пролиферирующих эукариотических клеток с применением метода проточной цитофлюориметрии.

3.3.3. Серологические методы.

3.3.3.1. Определение вибриоцидных антител в сыворотке крови.

3.3.3.2. Определение копроаптител.

3.3.4. Гистологические исследования.

3.3.5. Статистические методы.

Глава 4. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХОЛЕРНОЙ

ИНФЕКЦИИ МЕТОДОМ RITARD.

4.1. Разработка унифицированной технологии моделирования холерной инфекции методом RITARD.

4.1.1. Подготовка экспериментальных животных.

4.1.2. Анестезиологическое пособие.

4.1.3. Технология выполнения модели RITARD.

4.1.4. Возможные послеоперационные осложнения.

4.1.5. Подготовка штаммов V. cholerae к использованию в методе RITARD.

4.2. Технология мониторинга инфекционного процесса процесса в модели RITARD при заражении эпидемически значимыми штаммами холерного вибриона.

4.2.1. Анализ течения холерной инфекции у кроликов, зараженных штаммами V. cholerae 01 и К cholerae 0139 методом RITARD.

4.2.1.1. Определение диареегенности штаммов V. cholerae 01 и V. cholerae 0139 в RITARD модели.

4.2.1.2. Определение колонизации кишечника взрослых кроликов штаммами V. cholerae 01 и К cholerae 0139 в RITARD модели.

4.2.3. Сезонные особенности холерного инфекционного процесса в RITARD модели.

4.2.4. Морфологические изменения у кроликов, зараженных штаммами V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 и V. cholerae 0139 Р-16064.

Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПЕРОРАЛЬНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ХОЛЕРНЫХ ВАКЦИН НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ НА МОДЕЛИ RITARD.

5.1.1. Мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях иммунизации кроликов авирулентным рекомбинантным штаммом V. cholerae eltor InabaKM 184.

5.1.2. Исследование уровня вибриоцидных антител, копроантител у взрослых кроликов в условиях однократной иммунизации V. cholerae eltor Inaba KM 184.

5.2. Мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях иммунизации кроликов препаратами «теней» клеток V. cholerae 01 и 0139.

5.2.1. Мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях иммунизации кроликов препаратами «теней» клеток V. cholerae Ol (VCG/01) с пилями адгезии TCP.

5.2.2. Мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях иммунизации кроликов препаратами «теней» клеток V. cholerae 01 (VCG/Ol) без пилей адгезии TCP.

5.2.3. Мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях иммунизации кроликов препаратами «теней» клеток V. cholerae 0139 (VCG/0139) с пилями адгезии TCP.

5.2.4. Мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях иммунизации кроликов препаратами «теней» клеток V. cholerae 0139 (VCG/0139) без пилей адгезии TCP.

5.2.5. Мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях одновременной иммунизации кроликов препаратами «теней» клеток V. cholerae Ol и V. cholerae 0139 серогрупп.

5.2.6. Исследование уровня вибриоцидных антител в сыворотке крови кроликов после иммунизации препаратами «теней» клеток V. cholerae (VCG).

5.3. Мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях иммунизации кроликов коммерческой холерной вакциной Cholera-Impstoff.

5.4. Мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях иммунизации кроликов оральной химической бивалентной таблетированной холерной вакциной.

Глава 6. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ КРОЛИКОВ ПРОТИВОХОЛЕРНЫХ ВАКЦИНИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ.

6.1. Определение влияиия рекомбинантного штамма V. cholerae eltor Inabа КМ-184 и коммерческой холерной бивалентной таблетированной вакцины на иммунную систему кроликов в условиях пероральной иммунизации.

6.2. Мониторинг процессов апоптоза и пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток взрослых кроликов методом проточной цитофлюориметрии при холерном инфекционном (RITARD) и вакцинальном процессах.

6.3. Характеристика эффективности экспериментальных и коммерческих вакцин против холеры по результатам морфологического исследования.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оценка эффективности пероральных холерных вакцин в RITARD модели на этапе доклинических испытаний»

Актуальность проблемы. Необходимость создания более современных и надежных национальных средств и методов профилактики особо опасных инфекционных заболеваний обусловлена реально существующей вероятностью их завоза из стран ближнего и дальнего зарубежья, угрозой применеиия биологических агентов в террористических актах, возникновения стихийных бедствий и катастроф, способных привести к эпидемическим осложнениям чрезвычайного характера. На основании оценки эпидемиологической обстановки по холере в мире, странах СНГ и России прогноз по этой инфекции на ближайший период остается неблагоприятным [Москвитипа Э.А. и др., 2005; Онищснко Г.Г., 2002, 2004; Онищенко Г.Г. и др., 2005].

Официальная стратегия ВОЗ предполагает использование холерных вакцин в качестве дополнительных мер предотвращения возникновения эпидемий холеры вне эндемичных территорий и рекомендует их применение для вакцинации контингента с повышенным риском заражения (население лагерей беженцев, лиц без определенного места жительства и т.д.), а также путешественников и туристов [International Travel and Health, WHO, 2000; Weekly Epidemiological Record, 2001]. Вакцинация против холеры при определенных ситуациях включена в календарь профилактических прививок по эпидемическим показаниям (Приказ Минздрава России от 27.07.2001 №229).

С внедрением в практику современных биотехнологий появилась возможность конструирования холерных вакцин нового поколения перорального применения, для оценки иммунологической эффективности и безопасности которых на этапе доклинических испытаний требуется адекватная биологическая модель.

Наиболее подходящей моделью холерной инфекции с диареей, по своей интенсивности и продолжительности близкой к развивающейся в организме человека, является метод заражения взрослых кроликов RITARD (removable intestinal tie adult rabbit diarrhea). Данный метод основан на внутрикишечном заражении вирулентными штаммами V. ,cholerae 01 взрослых кроликов с предварительным наложением постоянной лигатуры на слепую кишку и особой скользящей временной лигатуры на подвздошную кишку в области мезоаппендикса на срок, необходимый для адгезии и ранней колонизации тонкого кишечника холерными вибрионами, и последующем мониторинге инфекционного процесса [Spira W.M. et al., 1981].

Взрослые кролики, зараженные методом RITARD, по своей инфекционной чувствительности к вирулентным холерным вибрионам становятся аналогичными кроликам-сосункам в модели холерной инфекции Датта и Хаббу (Dutta N.K, Habbu М.К., 1955]. Использование же взрослых животных со зрелой иммунной системой и окончательно сформированным желудочно-кишечным трактом позволяет наиболее полно оценить как вирулентность испытуемых штаммов холерного вибриона, так и напряженность поствакципального противохолерного иммунитета, индуцированного пероральными холерными вакцинами нового поколения.

Подавляющее большинство работ с применением модели RITARD посвящено изучению возбудителей, вызывающих заболевания с диарейным синдромом, таких как Campylobacter jejuni [Pang Т. et al., 1987; Burr D.H. et al., 1988; Logan S.M. et al., 1989; Pavlovskis O.R. et al., 1991; Guerry P. et al., 1994], E. coli [Ahren C.M. et al., 1985; Lopez-Vidal Y. et al., 1987; Sack R.B. et al., 1988; Svennerholm A.-M. et al., 1988, 1990, 1992; Greenberg R.N. et al., 1991; Mynott T.L. et al., 1991; Tickoo S.K. et al.,1992; Elliott S.J. et al., 1998], Aeromonas [Pazzaglia G. et al., 1990; Kirov S.M. et al., 2000], Providencia alcalifaciens [Mathan M. et al., 1993], Enterobacteriaceae [Penny M.E., 1992], Hafnia alvei [Albert M.J. et al., 1991], Plesiomonas shigelloides [Herrington D.A. et al., 1987].

В отечественной и зарубежной литературе имеются лишь единичные сообщения о применении модели RITARD для оценки действия вирулентных штаммов холерного вибриона на макроорганизм |Глянько Е.В., Король В.В., 1994; Бугоркова С.А. и др., 2000; Spira W. et al., 1982; Richardson К. et al., 1991; Russel R.G. et al., 1992], исследования протективных свойств рекомбинантных штаммов V. cholerae 01 [Lycke N. et al, 1986; Tocunaga E. et al., 1984; Pierce N. et al., 1988]. Отсутствуют сведения о проведении сравнительного анализа мониторинга инфекционного процесса и состояния иммунной системы в условиях моделирования холерной инфекции методом RITARD на фоне иммунизации.

Одним из показателей, характеризующих изменения, происходящие в иммунной системе организма при воздействии инфекционного агента, является соотношение количества иммупокомпетентных клеток, находящихся на разных стадиях клеточного цикла, включая программируемую гибель клеток (апоптоз). Индукция гибели клеток бактериальными патогенами может приводить к нарушению баланса между процессами пролиферации и апоптоза, развитию вторичных иммунодефицитиых состояний и инфекционных осложнений [Зигангирова Н.А., Гинцбург Л.Л., 2004].

Современным высокотехнологичным методом, позволяющим выявлять клетки на всех стадиях клеточного цикла, является метод проточной цитофлюориметрии, применяющийся в мировой практике как для научных исследований, так и в клинической лабораторной диагностике [Telford W. et al., 1994; Carulli G., 1996; Alvarez- Barrientos A. et al., 2000].

В настоящее время в доступной нам отечественной и зарубежной литературе отсутствуют сведения об унификации и детализации технологии моделирования холерной инфекции методом RITARD и информативности этой модели в схеме оценки иммунологической эффективности пероральных живых и неживых холерных вакцин нового поколения, а также для мониторинга инфекционного процесса, вызываемого эпидемически значимыми штаммами холерного вибриона 01 и 0139 серогрупп с использованием современных автоматизированных (проточно-цитофлуориметрических) методов цитологического анализа.

Кроме того, в соответствии с методическими указаниями «Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона» (1995), на стадии доклинических испытаний штамма - кандидата в живую холерную вакцину, необходима титрация LD50 заражающего высоковирулентного токсигенного штамма V. cholerae 01 методом RITARD на больших группах контрольных и вакцинированных взрослых кроликов с применением восьми заражающих доз, что требует значительных экономических и временных затрат, повышает трудоемкость данного этапа доклинических испытаний. За рубежом используют одну стандартную большую заражающую дозу вирулентных штаммов холерных вибрионов и других возбудителей диарейных инфекций (10 000 ЛД50 или 109-10и КОЕ в 1 мл) [Cray W.C. et al., 1983; Russel R.G. et al., 1992; Elliott S. J. et al., 1998]. С учетом этих сведений и с целью снижения экономических затрат на этапе доклинических испытаний необходимо провести оптимизацию заражающих доз и количества биомодельных животных.

На основании вышеизложенного изучение информативности и адекватности оценки эффективности пероральных холерных вакцин нового поколения в RITARD модели на этапе доклинических испытаний является актуальным и имеет большое научно-практическое значение.

Цель исследования. - Оценка эффективности пероральных холерных вакцин нового поколения в RITARD модели на этапе доклинических испытаний.

Основные задачи исследования.

1) Разработать в соответствии с требованиями биологической безопасности унифицированную технологию моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели, обеспечивающую высокую воспроизводимость и информативность.

2) Изучить в RITARD модели патогенные свойства штаммов V. cholerae eltor Ogawci Р-3122, V. cholerae eltor Ogawa M-698, V. cholerae eltor Inaba M-899, V. cholerae 0139 P-16064 по их способности индуцировать развитие диарсйного синдрома и гибель биомодели, колонизировать кишечник взрослых кроликов. Изучить влияггис сезонности па воспроизводимость холерной инфекции в RITARD модели.

3) Оценить в RITARD модели эффективность ряда вакцинирующих против холеры препаратов (как конструируемых, так и коммерческих): авирулентного рекомбинантного штамма V.cholerae eltor KM-184, продуцирующего протективные антигены (В-субъединицу холерного токсина и адгезии CFA1); препарата "теней" клеток V. cholerae 01 eltor - (VCG/01) с пилями адгезии - (TCP); препарата VCG/01 без TCP; препарата "теней" клеток V. cholerae 0139 (VCG/0139) с TCP; препарата VCG/0139 без TCP; таблетированной бивалентной холерной химической вакцины производства РосНИПЧИ «Микроб; холерной вакцины Cholera-Impstoff (Институт сывороток, Швейцария);

4) Провести цитофлюориметрический мониторинг баланса пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток в динамике холерной инфекции на модели RITARD у ингактных и вакцинированных против холеры биомодельных животных.

Научная новизна. Впервые с применением разработанной унифицированной технологии моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели проведено сравнительное изучение эффективности ряда как имеющихся, так и вновь конструируемых пероральных холерных вакцин нового поколения: таблетированной бивалентной холерной химической вакцины; холерной вакцины Cholera-Impstoff; препаратов «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) с пилями адгезии (TCP) и без них, V. cholerae 0139 (VCG/0139) с TCP и без них; авирулентного рекомбипантного штамма V. cholerae eltor KM-184.

Показана высокая информативность, адекватность и перспективность использования модели RITARD в схеме оценки эффективности пероральных живых и неживых холерных вакцин нового поколения па этапе доклинических испытаний. Установлено отсутствие влияния сезонности на воспроизводимость и течение холерного инфекционного процесса в RITARD модели. Показана целесообразность применения четырех заражающих доз вместо восьми, рекомендованных ранее [«Основные критерии оценки вакциниых штаммов холерного вибриона», 1995], что значительно сокращает временные и материальные затраты при проведении доклинических испытаний.

Впервые в результате проведенного цитофлуориметрического мониторинга апоптоза и пролиферативной активности иммунекомпетентных клеток определены параметры данных показателей в зависимости от исхода холерного инфекционного процесса в вакцинированном и невакцинированпом организме. Обнаружено, что увеличение в крови инфицированных V. cholerae животных относительного количества апоптозных клеток свыше 40% является неблагоприятным прогностическим признаком.

Установлена возможность использования показателей изменения баланса процессов апоптоза и пролиферации для оценки степени повреждающего действия вакцин на организм.

Впервые с использованием модели RITARD и больших заражающих доз (2 х 109 КОЕ) вирулентного штамма V. cholerae eltor Ogawa P-3J22 (ctxA+, tcp A+, tox R+) показано, что отечественная коммерческая холерная бивалентная таблетировапная вакцина при иммунизации per os защищает 100% взятых в опыт животных при отсутствии развития у них диарейного синдрома и колонизации кишечника V.cholerae, способствует формированию устойчивости клеток костного мозга, селезенки к развитию индуцированного возбудителем холеры апоптоза, в отличие от вакцины Cholera-Impstoff (защита 33,3% животных).

Практическая значимость. Результаты исследований были использованы при проведении Государственных доклинических испытаний штамма V. cholerae eltor KM 184 - кандидата в живые вакцины против холеры и включены в МУ 3.3.1.

Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона», которые рекомендованы комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека к утверждению (Протокол № 3 от 06.10.05r).

По материалам работы составлено пособие для врачей, научных работников «Моделирование холерной инфекции методом RITARD», которое утверждено директором РосНИПЧИ «Микроб» 01.02.02г. и используется в пракгической деятельности лаборатории иммунологии с сектором патоморфологии, лаборатории патогенных вибрионов РосНИПЧИ «Микроб», лаборатории препаратов против чумы и особо опасных инфекций ГИСК им. Л.А.Тарасевича.

Получено положительное решение по заявке №2002118939/20 о выдаче свидетельства РФ на полезную модель «Устройство для регулируемой подачи жидких препаратов для ингаляционного наркоза лабораторным животным».

Материалы исследований используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и усовершенствования врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб».

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Штаммы V. cholerae eltor Ogawa Р-3122, V. cholerae eltor Ogawa M-698, V. cholerae 0139 P-16064, имеющие основные струкгурные гены вирулентности tcpA, ctxA и гены-регуляторы toxR и toxT, в дозе 2 х 109 м.к. вызывают у 100% взрослых кроликов развитие холерной инфекции в RITARD модели.

2. Унифицированная технология моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели обеспечивает её высокую воспроизводимость и информативность. Сезонность не влияет на воспроизводимость и течение холерного инфекционного процесса в RITARD модели.

3. Показана высокая информативность, адекватность и перспективность использования модели RITARD в схеме оценки эффективности пероральных живых и неживых холерных вакцин нового поколения на этапе доклинических испытаний.

4. Установлено, что увеличение в крови инфицированных V. cholerae животных относительного количества апоптозных клеток свыше 40% является неблагоприятным прогностическим признаком. Показатели изменения баланса процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпегентных клеток отражают уровень защитного действия холерных вакцин от развития при холерной инфекции индуцированного апоптоза.

Апробация работы.

Исследования проведены в рамках плановых НИР: 025-99 «Изучение иммунобиологических свойств потенциально вакцинных рекомбинаптных штаммов холерного вибриона, несущих гетерологические антигены» № госрегистрации 01.99.0008392; 006-3-01 «Разработка и усовершенствование унифицированных метод оценки безопасности вакцинирующих иммунобиологических препаратов против особо опасных инфекций» № госрегистрации 01.200.111501; 21-4-4 «Патоморфологические аспекты изучения нейроэндокринных механизмов в становлении противохолерного иммунитета» № госрегистрации 0120.0504666; МНТП «Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего», НИОКР «Разработка, испытания рекомбинантной живой холерной вакцины и её совершенствование» 1998-2000; Исследование иммуногенных и протективных свойств препаратов «теней» клеток V.cholerae 01 eltor с пилями адгезии (VGG/01 с TCP) и VGG/01 без TCP, VGG/139 с TCP и VGG/139 без TCP, убитой холерной вакцины (Швейцария) по Договору РосНИПЧИ «Микроб» с Институтом микробиологии и генетики, Университета Вены, Австрия (1999-2000); ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы, Блок I «Ориентированные фундаментальные исследования», раздел «Технологии живых систем», подраздел «Защита от патогенов», НИР "Изучение роли биомолекул возбудителей особо опасных инфекционных заболеваний (чумы и холеры) в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток", являющейся составной частью ПИОКР "Изучение роли биомолекул возбудителей опасных инфекционных заболеваний в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток" (ОФИ-6).

Материалы диссертационной работы были доложены и представлены на: Ш-ем съезде иммунологов и аллергологов СНГ, 17-21 сентября 2000 г., Сочи, Дагомыс; Международном симпозиуме «New Approaches in Molecular Biotechnology for Biomedicine» (NAMBB 2001), 24-27 мая 2001, Вена, Австрия; Международной конференции «Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine IV», 1-4 октября 2002, Саратов; VI Всероссийской научной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Г1етербур1 е 2002», 20-23 мая 2002, Санкт-11е1ербург; Всемирном конгрессе по клинической и иммунной патологии 2-6 декабря, 2002, Сингапур; VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера», 4-5 июня 2003, Ростов-на-Дону; Проблемной комиссии 50.04. «Холера и паюгенные для человека вибрионы» Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (50.00). 2001 - 2005г.г.;

- Научно-практических конференциях «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» 2001-2004 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 18 работ, из них статей в рекомендованных ВАК изданиях — 3, в зарубежной печати - 2.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 99 отечественных и 225 зарубежных источников. Объем диссертации составляет 165 страниц машинописного текста. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 22 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Лоцманова, Екатерина Юрьевна

Выводы

1. Штаммы V. cholerae eltor Ogawa Р-3122, М-698, V. cholerae eltor Inaba M-899, V. cholerae 0139 P-16064, имеющие основные структурные гены вирулентности tcpA, ctxA и гены-регуляторы toxR и toxT, патогенны для взрослых кроликов в RITARD модели (вызывают гибель в период до 30 часов с момента заражения, индуцируют развитие диареи, колонизируют кишечник). Значения заражающих доз вирулентных штаммов V. cholerae, которые вызывают холерную инфекцию в RITARD модели у 100 % взрослых кроликов, составляют от 2 х 108 м.к. до 2 х 10п м.к.

2. Унифицированная технология моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели обеспечивает её высокую воспроизводимость и информативность. Сезонность не влияет на воспроизводимость и течение холерного инфекционного процесса в RITARD модели, что позволяет рекомендовать применение модели RITARD в течение всего календарного года.

3. Выявленные различия в развитии и течении холерного инфекционного процесса при RITARD моделировании у контрольных (получивших плацебо) и иммунизированных конструируемыми пероральными холерными вакцинами нового поколения (рекомбинантным штаммом V. cholerae eltor KM-184; препаратами «теней» клеток V. cholerae 01 eltor с пилями адгезии (TCP) и без них, V. cholerae 0139 с TCP и без них), коммерческими холерными вакцинами (таблетированной бивалентной холерной химической вакцины, холерной вакцины Cholera-Impstoff) позволяют дать объективную оценку протективной эффективности вакцинирующих против холеры препаратов.

4. Для определения в RITARD модели LD50 вирулентных штаммов V.cholerae 01 и 0139 серогрупп у контрольных, получивших плацебо, и иммунизированных холерными вакцинами нового поколения животных

6 8 10 1 ^ предложено использование четырех заражающих доз (10, 10, 10 , 10" м.к.) вместо применяемых восьми, что значительно сокращает временные и материальные затраты при проведении доклинических испытаний.

5. В результате проточноцитофлуориметрического мониторинга апоптоза и пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток в RITARD модели установлено, что увеличение в крови инфицированных V. cholerae животных относительного количества апоптозных клеток свыше 40% является неблагоприятным прогностическим признаком. Показатели изменения баланса процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток отражают уровень защитного действия холерных вакцин от развития при холерной инфекции индуцированного апоптоза.

6. Однократная внутрижелудочная иммунизация кроликов одной человеко-дозой коммерческой бивалентной таблетированной холерной вакциной в условиях заражения 2 х 109 м.к. V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 (ctxA+, tcp A+, tox R+) методом RITARD защищает 100 % биомодельных животных от гибели при отсутствии развития у них диарейного синдрома и колонизации кишечника V. cholerae, способствует формированию устойчивости клеток костного мозга, селезенки к развитию индуцированного возбудителем холеры апоптоза, в отличие от убитой коммерческой вакцины Cholera-Impstoff (защита 33,3 % животных).

7. Внутрижелудочная иммунизация кроликов рекомбинантным штаммом V. cholerae eltor Inaba КМ-184, коммерческой бивалентной таблетированной холерной вакциной по изучаемым показателям (количество Т- и В-лимфоцитов, уровень пролиферации и апоптоза иммунокомпетентных клеток, поликлональная стимуляция В-лимфоцитов, иммунореактивность на гетерологичный антиген) не вызывает формирование вторичного иммунодефицитного состояния, индуцирует развитие положительной сероконверсии и напряженного противохолерного иммунитета, определяемого в RITARD модели.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В связи с сохраняющейся в мире сложной эпидемической ситуацией по холере специфическая профилактика данной инфекции продолжает оставаться актуальной, а создание пероральных холерных вакцин нового поколения на основе новых биотехнологий против эпидемически значимых штаммов V. cholerae, в том числе 0139 серогруппы, совершенствование оценки их эффективности имеет важное научно-практическое значение [International Travel and Health, WHO, 2000; Weekly Epidemiological Record, 2001; Кутырев B.B., Куличенко A.H., 2004].

Одной из основных качественных характеристик медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП), предназначенных для специфической профилактики, является их специфическая активность. Получение объективной информации о специфической активности МИБП возможно лишь при наличии достаточно информативных лабораторных методов оценки этого показателя, позволяющих получить данные, коррелирующие с результатами применения их у людей.

Программа испытаний новых вакцин включает доклиническое изучение препарата на лабораторных животных и исследование на ограниченной и расширенной группах людей на основе существующих нормативных документов: СП 3.3.2.561-96 «Государственные испытания регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов»; «Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. РД 42-28-10-90»; «Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения. РД 42-28-8-89» и других.

Информация о специфической активности новых препаратов, получаемая в опытах на лабораторных животных, является достаточно надежной и достоверной. При выборе вида лабораторных животных и методов их заражения необходимо стремится к тому, чтобы степень восприимчивости животных к инфекционному агенту и патогенез инфекционного процесса были максимально близки к таковым у человека [Медуницын Н.В., 2004]. В этой связи, для оценки иммунологической эффективности холерных вакцин нового поколения на этапе доклинических испытаний требуется адекватная биологическая модель [Щуковская Т.Н. и др., 2003].

Как известно, холера является антропонозной инфекцией, вызываемой эпидемически значимыми штаммами V.cholerae 01 и 0139 серогрупп. Вследствие этого экспериментальное моделирование холерной инфекции представляет определенную сложность. Все биомодели, применяемые в настоящее время с целью изучения вирулентности штаммов V.cholerae, механизмов патогенеза холеры, подразделяют на новорожденных и взрослых животных различных видов. При изучении патогенных свойств V. cholerae для моделирования холерной инфекции на новорожденных животных используют кроликов-сосунков массой 10-12 г [Dutta N.K., Habbu М.К., 1955], мышей в возрасте 5-7 дней [Bougoudogo F. et al., 1995; Crean T.I. et al., 2000; Faruque S.M. et al., 2003], «опечатанных» 5- дневных мышей [Angelichio M.J. et al., 1999], 4-9 дневных гнотобиотических мини-поросят [Назарова JT.C. и др., 1986], 15-20 дневных поросят [Платонов А.И. с соавт, 1978]. Способность к развитию холерного инфекционного процесса у новорожденных животных связана с отсутствием сформировавшейся микрофлоры кишечника, функциональной и морфологической незрелостью слизистой тонкого кишечника. Иммунная система у новорожденных биомоделей также является функционально неполноценной, что делает непригодным их применение для оценки эффективности холерных вакцин.

Моделирование холерного инфекционного процесса на взрослых животных с развитой иммунной системой и полноценно функционирующим желудочно-кишечным трактом позволяет оценить формирование постинфекционной резистентности при заражении вирулентными и сконструированными штаммами V.cholerae [Бугоркова С.А. с соавт., 2000; Lycke N. et al., 1986; Pierce N.F. et al., 1988; TokunagaE. et al., 1984].

Многие исследователи для изучения колонизации и факторов вирулентности V.cholerae используют модель лигированных петель кишечника взрослых кроликов, модель взрослых «опечатанных» мышей [Richardson К., 1991; Ryan Е.Т. et al., 1999; Faruque S.M. et al., 2003; Liang W. et al., 2003].

Наиболее подходящей моделью холерной инфекции с диареей, по своей интенсивности и продолжительности близкой к развивающейся в организме человека, является RITARD (removable intestinal tie adult rabbit diarrhea) метод заражения взрослых кроликов [Spira W.M. et al., 1981]. Взрослые кролики, зараженные методом RITARD, по своей инфекционной чувствительности к вирулентным холерным вибрионам становятся аналогичными кроликам-сосункам в модели холерной инфекции Датта и Хаббу [Dutta N.K, Habbu М.К.,1955]. Использование взрослых животных со зрелой иммунной системой и окончательно сформированным желудочно-кишечным трактом позволяет наиболее полно оценить как вирулентность испытуемых штаммов холерного вибриона, так и напряженность поствакцинального противохолерного иммунитета, индуцированного пероральными холерными вакцинами нового поколения, изучить возможность развития и особенности течения инфекционного процесса в иммунном организме.

В настоящее время нет сведений об информативности и адекватности применения RITARD модели в схеме оценки иммунологической эффективности пероральных холерных вакцин нового поколения. Отсутствуют данные об унификации и детализации технологии моделирования холерной инфекции методом RITARD, а также мониторинге инфекционного процесса, вызываемого эпидемически значимыми штаммами холерного вибриона с использованием современных автоматизированных (проточно-цитофлуориметрических) методов цитологического анализа.

Цель настоящей работы состояла в оценке эффективности живых и неживых пероральных холерных вакцин нового поколения в RITARD модели на этапе доклинических испытаний.

Одним из условий качественной оценки эффективности вакцин в условиях моделирования инфекционного процесса на лабораторных животных является высокая воспроизводимость и информативность используемой биомодели, обеспечиваемая в первую очередь стандартной технологией моделирования, доступной для выполнения большинству исследователей.

Важным этапом в моделировании холерной инфекции методом RITARD является отбор и подготовка ш таммов V. cholerae к использованию для заражения.

Нами, в отличие от оригинального метода W.M Spira с соавторами (1981), который предусматривает заражение 4-х часовой бульонной культурой V. cholerae, выращенной при температуре 37±1°С, и пе подходит для одновременного выполнения в течение рабочего дня большого количества операций в блоке для работы с инфицированными животными, обосновано применение в RITARD модели агаровой культуры холерных вибрионов, полученной при культивирования па щелочном агаре рН 8,0 при температуре 37±0,5°С в течение 16±0,5 часов, для внутрикишечного заражения кроликов.

Принимая во внимание, что в соответствии с Фармакопейной статьей предприятия ФСГ1 42 0020-0020-00 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетировапную и Регламентом производства № 479-94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетировапную штамм V. cholerae Ol eltor Ogawa P-3122 используется при определении иммуногенной активности в тесте активной защиты белых беспородных мышей, нами впервые в условиях моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели охарактеризованы штаммы V. cholerae eltor Ogawa P-3122, а также V. cholerae 0139 P-16064, имеющие основные структурные гены вирулентности tcpA, ctxA и ген-регуляторы toxR и toxT, по их способности индуцировать развитие диарейпого синдрома и гибель биомодели, колонизировать кишечник взрослых кроликов.

Установлено, что гибель кроликов при заражении V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 в дозе n х 109 м.к., n х 10м м.к., V. cholerae 0139 Р-16064 в дозе n х 109 м.к. методом RITARD наступает в пределах 30 часов. Объем суммарного количества жидкого содержимого тонкого и толстого кишечника достигает 300-400 мл у зараженных V. cholerae eltor Ogawa P-3122, V. cholerae 0139 Р-16064 биомодельных кроликов, что свидетельствует о высокой вирулентности и диареегенности данных штаммов в RITARD модели. Определено значительное количество жизнеспособных о холерных вибрионов, прикрепившихся к стенке тонкого кишечника (n х 10° КОЕ/г ткани кишечника).

Проведенный нами мониторинг длительности выделения из ректального материала холерных вибрионов инфицированными кроликами показал, что продолжительность выделения холерных вибрионов в RITARD модели свидетельствует о колонизации кишечника кроликов V. cholerae и согласуется с исследованиями S.M. Faruque с соавторами [2003].

Важным результатом работы является оптимизация заражающих доз V. cholerae. Показана целесообразность применения для определения LD50 вирулентных штаммов V. cholerae четырех заражающих доз вместо восьми (104 - 10й м.к.), рекомендованных ранее [«Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона, 1995»], что значительно сокращает временные и материальные затраты при проведении доклинических испытаний. Предложенные дозы V. cholerae 01 и 0139 серогрупп (106, 108, 10ю, 1012 м.к.) для внутрикишечпого заражения взрослых кроликов в RITARD модели включены в новые МУ 3.3.1. «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона», которые рекомендованы комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека к утверждению (Протокол № 3 от 06.10.05г).

Нами впервые проведено изучение влияния сезонности на воспроизводимость и течение холерного инфекционного процесса в RITARD модели. Установлено, что время года не влияет на развитие и проявления моделируемой у взрослых кроликов методом RITARD холерной инфекции в условиях заражения V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 , V. cholerae 0139 P-16064.

Таким образом, показана перспективность применения штаммов V. cholerae eltor Ogawa Р-3122, V. cholerae 0139 Р-16064 в качестве заражающих при оценке в RITARD модели эффективности пероральных холерных вакцин нового поколения.

Нами также проведена стандартизация и унификация приемов при воспроизведении модели RITARD на взрослых кроликах.

Показано, что особенностями работы при моделировании холерной инфекции методом RITARD являются соблюдение требований биологической безопасности при работе с инфекционным материалом в сочетании с требованиями асептики и антисептики, необходимыми для выполнения полостной хирургической операции, определение топографии внутренних органов кролика, основ оперативной хирургии и анестезиологии.

Разработано анестезиологическое пособие, модернизирован аппарат для дозированной подачи эфира (свидетельство РФ по заявке № 2002118939/20 на полезную модель «Устройство для регулируемой подачи жидких препаратов для ингаляционного наркоза лабораторным животным»). Обезболивание рекомендовано проводить комплексно препаратом рометар (2 % раствор в/м из расчета 0,2-0,3 мл/кг) с введением в/к 2-3 мл 1 % раствора лидокаина по линии будущего кожного разреза.

В связи с отсутствием в оригинальном описании метода [Spira W.M. et al., 1981] способа наложения легко развязывающегося узла лигатуры нами разработаны: последовательность завязывания нити при наложении временной лигатуры на подвздошную кишку, способ снятия временной лигатуры с подвздошной кишки у зараженных животных в соответствии с требованиями биологической безопасности, способ завершения хирургического вмешательства, облегчающие выполнение метода RITARD и предупреждающие развитие осложнений после его проведения. Преимуществами предложенного подхода являются: отсутствие необходимости повторного наложения швов на кожу и брюшину, минимальная контаминация брюшной полости и щадящее отношение к поверхности кишечника.

При правильном выполнении технологии метода RITARD кролики без какого-либо антигенного или лекарственного воздействия, которым вместо культуры холерных вибрионов внутрикишечно введен 0,9 % раствор натрия хлорида, имеют продолжительность жизни свыше 120 ч (5 суток). У них отсутствуют клинические (в том числе диарея) и патоморфологические проявления холерного инфекционного процесса.

Унифицированная технология моделирования холерной инфекции методом RITARD в соответствии с требованиями биологической безопасности при работе с инфекционным материалом включена в пособие для врачей, научных работников «Моделирование холерной инфекции методом RITARD», утвержденное директором РосНИПЧИ «Микроб» 01.02.02г., и в МУ 3.3.1. «Основные требования к вакцинным штаммам холерного вибриона», которые рекомендованы комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека к утверждению (Протокол № 3 от 06.10.05г).

В соответствии с поставленной целыо, следующим этапом нашей работы было изучение с применением разработанной унифицированной технологией моделирования и мониторинга холерной инфекции в RITARD модели эффективности ряда конструируемых пероральных холерных вакцин нового поколения (рекомбинапгного штамма V. cholerae eltor KM-184, продуцирующего протективные антигены В-субъединицу холерного токсина и адгезин CFA1; препаратов «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) с пилями адгезии (TCP) и без них, V. cholerae 0139 (VCG/0139) с TCP и без них в сравнении с коммерческими (таблетированной бивалентной холерной химической вакцины; холерной вакцины Cholera-Impstoff).

При определении в RITARD модели на этапе доклинических испытаний профилактической эфективности рекомбипантного штамма V. cholerae КМ-184, ЛД50 заражающего штамма V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 для кроликов, иммунизированных 5 х 109 м.к. V. cholerae КМ-184, имела значение 1 х Ю10 м.к., для конрольных - 5,6 х 109.

Гибель от холерной инфекции в RITARD-модели была зарегистрирована у 21,0±1,0% кроликов, иммунизированных V. cholerae КМ-184. У павших животных наблюдались проявления диареи отнезначигельной, до средней степени выраженности, сопровождающейся выделением клеток V. cholerae eltor Ogawa, использованного для заражения в RITARD-модели. Средняя продолжительность жизни этих кроликов составила 40+5,9 часов при средней продолжительности жизни в группе контрольных (плацебо) биомодельных кроликов 26,2+3,4 часов.

Доля выживших животных, иммунизированных испытуемым штаммом V. cholerae КМ-184 в дозе 5 х 109 м.к. V. cholerae eltor Ogawa Р-3122, составила 79,5+1,1%.

Среди выживших животных лишь только у 20,0±5,0 % кроликов наблюдали проявления холерного инфекционного процесса в легкой форме. У этих животных продолжительность экскреции холерных вибрионов, как правило, не превышала в среднем 53±3,4 часов при сроке наблюдения 120 часов.

Индекс иммунитета, обеспечиваемого рекомбинантным штаммом V. cholerae eltor Inaba KM 184, имел значение 17,8, что свидетельствовало о формировании антибактериального иммунного ответа у иммунизированных животных [Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона, 1995].

Моделирование холерной инфекции методом RITARD у иммунизированных взрослых кроликов рекомбинантным штаммом V. cholerae eltor Inaba KM 184 в дозе 5 х 109 м.к. проводилось на фоне выраженнной иммунобиологической перестройки, что подтверждено наличием положительной сероконверсии: увеличение титров вибриоцидных антител в сыворотке крови в 2,3-2,6 раза и секретируемых антител в кишечном содержимом.

Показано также, что иммунизация взрослых кроликов авирулентным рекомбинантным штаммом V. cholerae eltor Inaba KM-184 не индуцировала развитие вторичного иммунодефицитного состояния: отсутствие уменьшения относительного содержания в крови Т- и В-лимфоцитов; повышение индекса поликлональной стимуляции и иммунного ответа на гетерологичпый антиген по сравнению с контролем, нормализация которых наблюдалась па 28 сутки после вакцинации, что соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам холерных вибрионов [Методические указания «Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона», 1995].

Таким образом, выявленные различия в развитии и течении холерного инфекционного процесса при моделировании RITARD у интактных и иммунизированных рекомбинантным штаммом V. cholerae eltor Inaba KM 184 экспериментальных животных, позволяют дать объективную оценку протективной эффективности кандидатов в живые вакцины против холеры.

За рубежом разработана технология получения так называемых «теней», то есть пустых клеток грамотрицатсльпых бактерий путем контролируемой экспрессии гена Е фага срХ174, кодирующего синтез мембранного протеина Е. Протеин Е формирует в бактериальной клетке трансмембранный туннель, что приводит к последующему выходу всего цигоплазматического содержимого и образованию «теней» (пустых) клеток с полностью сохраненными поверхностными структурами, в том числе пилями адгезии [Lubitz W. et al., 2001; Jelinger W. et al., 2002]. Препараты «теней» клеток V. cholerae рассматриваются в качестве кандидатов в холерные вакцины [Eko F.O. et al., 2002].

В следующей серии экспериментов нами проводился мониторинг инфекционного процесса на модели RITARD в условиях иммунизации кроликов препаратами «теней» клеток V. cholerae (VCG).

С целью снижение экономических затрат скрининг профилактической эффективности большого числа иммунизирующих против холеры препаратов, как усовершенствованных, так и вновь конструируемых, на этапе доклинических испытаний возможно проводить при использовании одной большой заражающей дозы высоковирулентных эпидемически значимых штаммов холерных вибрионов. Этот подход был нами использован в данной серии экспериментов для заражения в RITARD модели.

Изучение протективных свойств нежизнеспособных препаратов «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) с пилями адгезии (TCP) и без них, V. cholerae 0139

VCG/0139) с TCP и без них проводили путем двухкратной иммунизации кроликов перорально с интервалом 2 недели в дозах 4 мг, 20 мг и внутримышечно в дозе 4 мг. Иммунизацию препаратом, состоящим из «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) с TCP и «теней» клеток V. cholerae 0139 (VCG/0139) с TCP (по 2 мг каждого), а также препаратом, состоящим из «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) без TCP и «теней» клеток V. cholerae 0139 (VCG/0139) без TCP (по 2 мг каждого) проводили двухкратно внутрижелудочно.

Через 2 недели после введения бустерной дозы имупизирующего препарата, кроликов заражали внутрикишечно методом RITARD эпидемически значимыми штаммами V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 и V. cholerae 0139 Р-16064 в дозе 2 х 109 м.к., вызывающей выраженную диарею и летальный исход у 100 % нсиммунпых кроликов.

Препараты теней клеток V. cholerae (VCG), примененные для внугрижелудочной иммунизации, защищали большинство биомодсльных взрослых кроликов от впутрикишечного заражения вирулентными штаммами V. cholerae в RITARD модели.

Высокий уровень защиты от холерной инфекции был отмечен при внутрижелудочной иммунизации кроликов в дозе 20 мг препаратом VCG Olc TCP (100 % животных при продолжительности жизни свыше 120 ч), препаратами VCG 01 без TCP и VCG 0139 с TCP (60 % животных при средней продолжительности жизни 96 ч) по сравнению с зараженными кроликами, получившими в качестве плацебо 0,9% раствор натрия хлорида и имевшими продолжительность жизни менее 30 ч. В опытных группах животных (кроме группы кроликов, иммунизированных смесью препаратов VCG 01 без TCP и VCG 0139 без TCP по 2мг каждого) не было отмечено значительных проявлений диареи.

Различные препараты VCG (кроме препарата из смеси VCG 01 без TCP и VCG 0139 без TCP) ингибировали колонизацию кишечника вирулентными штаммами V. cholerae, примененными для заражения и предотвращали экскрецию вибрионов в окружающую среду. Отмечали пложительную сероконверсию.

Несмотря на то, что имеются сведения о слабой иммуногенности TCP для человека [Hall R. et al., 1991], было высказано предположение, что включение их в состав вакцины может повысить эффективность вакцинных препаратов [Attridge S. et al., 2000; Herrington D. et al., 1988; Sun D. et al., 1990; Taylor R. et al., 1987].

Полученные нами результаты свидетельствуют о положительном влиянии присутствия TCP в изученных препаратах «теней» клеток холерных вибрионов на их иммунологическую эффективность, которое было наиболее выражено при иммунизации биомодельных кроликов дозой 20 мг.

Таким образом, иммунизация различными препаратами нежизнеспособных препаратов «теней» клеток V. cholerae 01 eltor (VCG/01) с пилями адгезии (TCP) и без них, V. cholerae 0139 (VCG/0139) с TCP и без них защищала кроликов от гибели после заражения штаммами V. cholerae eltor Ogawa P-3122 и V. cholerae 0139 Р-16064 в RITARD модели, увеличивала продолжительность жизни инфицированных животных, ингибировала процесс колонизации кишечника V. cholerae и предотвращала экскрецию холерных вибрионов, индуцировала развитие положительной ссрокопвсрсии.

Нами впервые с использованием модели RITARD и больших заражающих доз (2 х 109 КОЕ) вирулентного штамма V. cholerae eltor Ogawa P-3122 (ctxA+, tcp A tox R+) показано, что в отличие от вакцины Cholera-Impstoff (Швейцария) отечественная коммерческая холерная бивалентная таблетированная вакцина при иммунизации per os защищает 100% взятых в опыт животных при отсутствии развития у них диарейного синдрома и колонизации кишечника V. cholerae, способствует формированию устойчивости клеток костного мозга, селезенки к развитию индуцированного возбудителем холеры апоптоза.

Впервые в результате проведенного цитофлуориметрического мониторинга апоптоза и пролиферативной активности иммунокомпетентных клеток определены параметры данных показателей в зависимости от исхода холерного инфекционного процесса в вакцинированном и невакцинированном организме. Обнаружено, что увеличение в крови холерных инфекционных животных относительного количества апоптозных клеток свыше 40% является неблагоприятным прогностическим признаком.

Установлена возможность использования показателей изменения баланса процессов апоптоза и пролиферации для оценки степени повреждающего действия вакцин на организм.

По результатам морфологического исследования показано, что заражение 2 х 109 м.к. V. cholerae eltor Ogawa Р-3122 методом RITARD иммунизированных против холеры животных, не вызывало у них развития клинико-морфологических проявлений болезни, пе приводило к формированию грубых гистологических изменений во внутренних органах, что свидетельствовало о достаточной эффективности изучаемых препаратов.

Сочетанное использование иммунологических методов исследования с технологией моделирования холерной инфекции методом RITARD позволяет с большей объективностью оценить формирование специфического иммунитета в организме иммунизированных животных.

Таким образом, в результате выполненных исследований нами показана высокая информативность, адекватность и перспективность использования модели RITARD в схеме оценки эффективности пероральных живых и неживых холерных вакцин нового поколения на этапе доклинических испытаний.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Лоцманова, Екатерина Юрьевна, 2006 год

1. Ада Г., Рамсей А. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ: Пер. с англ. М.: «Медицина», 2002. - 344 с.

2. Адамов А.К. Иммунология холеры. Саратов, 1981. - 319 с.

3. Адамов А.К. Метаболические и иммунологические аспекты патогенности микроорганизмов // Российск. н.-и. противочумн. ин-т «Микроб». — Саратов, 1994.- 10 с.

4. Алексеева J1. П., Сальникова О.П. Исследование структуры ЛПС S- и R-холерных вибрионов на основе моноклональных антител: Матер. VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. — М„ 1997.-Т. 1.-С. 284-285.

5. Ашмарин И.П., Воробьева А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. — 180 с.

6. Бардых И.Д., Мишанькин Б.Н. Связь гипокалиемии и чувствительности крольчат к заражению холерой // Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера». Ростов-н/Д, 2003. - С. 259-263.

7. Бектемиров Т.А., Горбунов М.А., Никитюк Н.М. и др. Принципы оценки иммунологической эффективности вакцин // Биопрепараты. 2001. - №1. - С. 14-16.

8. Белокрылов Г.А., Туровский B.C. Влияние различных субклеточных фракций из коры сингенного головного мозга на клеточные и гуморальные показатели иммунитета у взрослых тимэктомированных людей и интактных мышей // Иммунология. 1982. - №5. - С. 37-41.

9. Бляхер М. С., Федорова И. М., Лопатина Т. К. и др. Цитокиновый статус часто болеющих детей и влияние на него пробиотика Ацилакта // Цитокины и воспаление. — 2002. №2. - С. 24.

10. Болезни кроликов. Гос. из-во сельскохоз. Литературы. М., 1959 - 220 с.

11. И.Бугоркова С.А., Исупов И.В., Бугоркова Т.В., Майоров Н.В., Кутырев В.В.

12. Состояние APUD-системы кишечника и морфологические изменения во внутренних органах взрослых кроликов, зараженных токсигенными холерными вибрионами // ЖМЭИ. 2000. - №3. - С. 11-14.

13. Бугоркова Т.В., Елисеев Ю.Ю. Амилазная активность холерных вибрионов различной вирулентности // Актуал. вопр. микробиол., лаб. диагн. и профилакт. холеры. Тез. всесоюз. научн. конф. (Ростов-н/Д; 16-17 ноября 1988 г.) Ростов-н/Д, 1988.-С. 98-100.

14. Васильев Н.В., Луцюк Н.Б., Палий Г.К., Смирнова О.В. Биохимия и иммунология микробных полисахаридов — Томск: Изд-во Томского университета, 1984. 303 с.

15. Вертисв Ю.В., Езепчук Е.В. Комбинированный эффект бактериальных токсинов и нейраминидазы в условиях in vitro // Молекул, структура бакгер. Токсинов и генетический контроль их биосинтеза. Тезисы 1 всесоюзн. конф. — М., 1985.-С. 27-29.

16. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. 2-е изд. М., Медицина, 1982.-304 с.

17. Гайдар Ю.А. Электронно-цитохимическое исследование абсорбции некоторых белковых макромолекул и холерогена эпителием пейеровой бляшки морской свинки: Автореф. дис. . канд. мед. наук. М., 1980. - 20 с.

18. Гайдар Ю.А. Абсорбция холерного экзоэнтеротоксина эпителием пейеровой бляшки морской свинки // Вестн. АМН СССР. 1981. - №6. - С. 52-54.

19. Глянько Е.В., Король В.В. Модель RITARD и аспекты ее применения при экспериментальной холере // Сб. научн. трудов. Вып.1. Новороссийск, 1994. -С. 175-177.

20. Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунобиологических препаратов СП 3.3.2.561-96. М., 1998. - 127 с.

21. Громова О.В. Изучение О-антигена холерного вибриона и биохимические аспекты снижения токсичности: Дис. канд. мед. наук. Саратов, 1995. — 154 с.

22. Громова О.В., Полунина Т.А., Балашова Е.В. и др. Применение реакции коагглютипации для контроля синтеза О-антигенов вакцинных штаммов Vibriocholerae при глубинном культивировании // Проблемы особо опасных инф. — Саратов.- 2003.-№89.-С. 148-153.

23. Димитрова Н.И., Уралева B.C., Трубникова В.А. Хемотаксис холерных вибрионов: методика изучения и отношения к различным веществам // ЖМЭИ. 1983.-№9.-С. 24-28.

24. Джапаридзе М.Н., Наумов А.В., Никитина Г.П. и др. Оральная химическая вакцина из гипертоксигенных штаммов КМ-76 Инаба и КМ-68 Огава возбудителя холеры // ЖМЭИ. 1991. - №4. - С. 31-33.

25. Джапаридзе М.Н., Мартене Л.Л., Дертева И.И. и др. Изучение нейраминидазы в вакцине холероген-анатоксин // Генетика и биохимия особо опасных инфекций. Саратов, 1980. С. 48-52.

26. Доклинические испытания новых медицинских иммунобиологических препаратов. Основные положения. РД 42-28-8-89. М., 1989.- 31 с.

27. Донская Т.Н. Ферментативная активность холерных вибрионов // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 1978.-Вып. З.-С. 59-63.

28. Елисеев Ю.Ю., Адамов А.К., Бугоркова Т.В. Значение секреции белков холерных вибрионов в микробиологических и иммунологических исследованиях // Всес. конф. Регуляция микроб, метаболизма, Пущино, 12-14 июня, 1989. Пущино, 1989. - С. 78-79.

29. Елисеев Ю.Ю. Усовершенствование пероральной таблетированной холерной вакцины: Дис. . д-ра мед. наук. В форме науч докл. — Саратов, 1994. — 70 с.

30. Иванов К.К. Структура холерного, коклюшного, ботулинического, столбнячного токсинов и механизмы АДФ-рибозилирования в клетках эукариот // Успехи современной биол. — 1991. №5. — С. 667-682.

31. Карсонова М.И., Пинегин Б.В. Лимфоидные образования слизистых оболочек: принципы топической иммунизации // Иммунология. — 2003. -Т. 24. №6. — С. 359-365.

32. Кобринский Г.Б., Гайлонская И.Н., Мазрухо Б.И. Использование фермента нсйраминидазы для усиления иммуногенности противохолерной вакцины // Иммунол. и профилактики чумы и холеры: Тезисы докл. Всесоюзн. конф. — Саратов, 1980. С. 225-226.

33. Козипец Г.И., Погорелов В.М., Шмаров Д.А. и др. Клетки крови современные технологии их анализа. - М.: Триада-фарм, 2002. - 200 с.

34. Козырева Л.Л., Голотина Н.Б., Терновой В.И., Глянько Е.В. Электронно-микроскопическое исследование тонкого кишечника при экспериментальной холере // ЖМЭИ. 1978. - № 8. - С. 76-79.

35. Королев Ю.С., Кюрегян А.А., Калошина Л.А. и др. Опыт использования комплекса иммунологических тестов при обследовании переболевших холерой и контактных с ними // Карантинные и зоонозные инф. в Казахстане Алматы, 2001.-№4.-С. 180-184.

36. Коршунов В. М., Володин Н. И., Агафонова С. А., Коршунова О. В. Влияние пробиотиков и биотерапевтических препаратов на иммунную систему организма-хозяина // Педиатрия. 2002. - №5. - С. 92—100.

37. Кравцов А.Л., Щуковская Т.Н., Шмелькова Т.П. и др. Проточная цитометрия как новая технология современной клинической микробиологии // Медицинская микробиология XXI век: Матер. Всерос. науч.-практ. конф. /

38. Под. ред. докт. мед. наук, проф. В.В.Кутырева. Саратов: ОАО «Приволжское книжное издательство», 2004,— С. 125-126.

39. Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология. М.: Высшая школа, 1985. - 287 с.

40. Лабораторная диагностика холеры: Методические указания (МУ 4.2.1098 02). -М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002. — 95 с.

41. Лазарева Д.Н., Алехин Е.К. Стимуляторы иммунитета. М.: Медицина, 1985. -256 с.

42. Лившиц Ю.И. Требования к качеству лабораторных грызунов и условия их содержания. // Руководство по вакцинному и сывороточному делу. -М.:Медицина, 1978. С.24-36.

43. Лобанов В.В., Сухарь В.В., Мазрухо Б.Л. Исследование Vibrio cholerae 0139 в реакциях вибриолиза и агглютинации // Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера». Ростов-н/Дону , 2003. -С.181-183.

44. Лыкова Е. А., Воробьев А. А., Боковой А. Г., Мурашова А. О. Нарушения интерферонового статуса у детей с острой респираторной инфекцией и его коррекция бифидумбактерином-форте // ЖМЭИ. 2001. - №2. - С. 65-—67.

45. Ляшенко В. А. Мукозальные вакцины // Иммунология 1997. - №6. - С. 4-7.

46. Маянский Н.А., Заславская М.И., Маянский A.II. Апоптоз экссудативных нейтрофилов человека //Иммунология. 2000. - №2. - С. 11-13.

47. Медицинские лабораторные технологии. Т.1. Справочник / Под ред. А.И.Карпищева — СПб.: Интермедика, 2002. — 408 с.

48. Медуницын Н.В. Вакцинология. Изд. 2-е, перераб. и доп. М.: Триада-Х, 2004. -448 с.

49. Мелихов В.И., Юркив В.А. Влияние холерного энгеротоксина на содержание цАМФ в слизистой тонкой кишки кролика // Циклические нуклеотиды: Тез. докл. науч. конф. Минск, 1982. - С. 93-94.

50. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. М.: Медицина, 1969. - 423 с.

51. Монцевичютс Эрингене Е.В. Упрощенные математико-статистические методы в медицинской исследовательской работе // Патол. физиол. и эксперимсп. терапия. - 1964. - № 4. - С. 71-78.

52. Москвитипа Э.А., Ломов Ю.М., Федоров Ю.М. и др. Оценка эпидемиологической ситуации по холере в мире, странах СНГ и России в XXI веке. Прогноз // Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на -Д, 2004. - Вып. 17. - С.9-13.

53. Мохин К.М., Шанина Р.Я., Хинц И.В. Электрофоретический анализ белков сыворотки крови и иммупоглобулиновый спектр у кроликов, вакцинированных холерогеном анатоксином // Профилактика особо опасных инфекций Саратов, 1976. Вып.2. - С. 100-105.

54. Назарова Л.С., Исупов И.В., Павлова Л.П. и др. Влияние микрофлоры кишечника на патогенез холерной интоксикации // ЖМЭИ. — 1986. №10. - С. 96-98.

55. Наумшина М.С., Элькина А.В. Использование вибриоцидного теста для обнаружения копроантитсл у морских свинок, иммунизированных холерной вакциной // Пробл. особо опас. инф. Саратов, 1970. - Вып. 3. - С. 37-39.

56. Онищенко Г.Г. Контроль за инфекционными заболеваниями стратегическая задача здравоохранения России в XXI веке // Эпидемиология и инф. болезни. -2002,-№6-С. 4-16.

57. Онищенко Г.Г. Об эпидемиологической обстановке по особо опасным природпо-очаговым и другим инфекциям на территории Южного федерального округа // Ж. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2004. — №3. - С. 23-30.

58. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Москвигина Э.А. и др. Эпидемиологический надзор за холерой: обоснования и оценка его эффективности // Проблемы особо опасных инф.: Сб. науч. тр. / Под ред. В.В.Кутырева. Саратов: "Слово", 2005. -№9. - С. 5-9.

59. Основные критерии оценки вакцинных штаммов холерного вибриона: Методические указания. — Саратов, 1995. 28 с.

60. Першин Б.Б., Гелиев А.Б., Толстов Д.В., Ковальчук Л.В. Система лимфоцитов ткани пищеварительного тракта животных и перорально индуцированная иммунная толерантность // Иммунология. 2001. - №6. — С. 10-19.

61. Платонов А.И., Колесник Р.С., Тюменцев С.Н. и др. Поросята как экспериментальные животные для изучения холерной инфекции // Эпидемиол. и профилактика особо опасных инфекций в МНР и СССР. Улан-Батор, 1978. -С. 196-199.

62. Попеско П. Атлас топографической анатомии сельскохозяйственных животных. 2-е изд., перераб. - Братислава: Природа, 1978.

63. Порядок и методы контроля иммунологической безопасности вакцин. Общие методические принципы. РД 42-28-10-90. М., 1989. - 49 с.

64. Правила проведения работ и использования экспериментальных животных // «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных»: Приказ МЗ СССР №755 от 12.08.77.

65. Приказ Минздрава России от 27.07.2001 №229 «О национальном календаре профилактических прививок и календаре прививок по эпидемическим показаниям»

66. Приказ Минздрава России от 12.11.97 № 330 «О мерах по улучшению учёта, хранения, выписывания и использования наркотических лекарственных средств»

67. Регламент производства № 479-94 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную.

68. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология / Пер. с англ. М.: Мир, 2000 -592 с.

69. Савельев В.В., Ефременко В.И., Савельева И.В. и др. Состояние и перспектива серологической диагностики холеры // Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера». Ростов-н/Дону , 2003. -С.193-195.

70. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» СП 1.3.1285-03 // Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. 2003. - Вып.З (13). - N.9. - С. 61-44.

71. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогеппости и гельминтами» СП 1.2.731-99. Изд. официальное. - М.: Минздрав России, 1999. - 107 с.

72. Сапии М.Р., Никитюк Д.Б. Иммунная система, стресс и иммунодефицит. М.: АПП «Джапар», 2000. 184 с.

73. Смирнова Н.И. Адгезины Vibrio cholerae: фенотипнческий анализ и генетический контроль синтеза // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1995.- N. 3.-С. 18-26.

74. Смирнова Н.И., Ливанова Л.Ф., Чеховская Г.В. и др. Штаммы Vibrio cholerae серогрупп 01 и 0139 — продуценты основных иротективпых антигенов // ЖМЭИ. 2000. - №3. - С. 47-52.

75. Соловьев В.Д., Кобринский Г.Д., Гальцева Г.В., Саямов P.M. О роли нейрамипидазы холерных вибрионов в патогенезе экспериментальной холеры // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1975. - №5. - С. 94 -99.

76. Сумароков А.А., Иванов Н.Р., Джапаридзе М.Н. и др. Определение оптимальной прививочной дозы оральной холерной химической бивалентной вакцины в контролируемом опыте //ЖМЭИ. 1990. - №12. - С.55-56.

77. Тихонов Н.Г. Роль некоторых ферментов холерного вибриона в обеспечении жизнеспособности микробной клетки и развитии инфекционного процесса при холере // Генетика и биохимия вирулент. возбудит, особо опасн. инф.: Тез. докл. Волгоград, 1992. - С. 136.

78. Фармакопейная статья предприятия ФСП 42 0020-0020-00 на вакцину холерную бивалентную химическую таблетированную.

79. Хаитов М. Р. Роль респираторных вирусов в патогенезе бронхиальной астмы // Иммунология. 2003. -№1. - С. 58-65.

80. Хаитов Р. М., Пинегии Б. В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта. Особенности строения и функционирования в норме и при патологии // Иммунология. 1997. - №5. - С. 4-7.

81. Черкасский Б.Л. Руководство по общей эпидемиологии. М.: Медицина, 2001. - 560 с.

82. Щелканова ЕЛО. Генетический анализ хромосомной области Vibrio cholerae 0139, несущей гены капсулы // Матер, науч.- практ. конф., поев. 100-летию образов, противочум. службы России (16-18 сент. 1997 г.). Саратов, 1997. - Т.2 -С. 155.

83. Щуковская Т.Н., Дятлов И.А., Смирнова Н.И. Основы иммунологической эфективности и безопасности холерных вакцин нового поколения // Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера». -Ростов-н/Дону , 2003. С. 219-223.

84. Abrams W.R., Diamond L.W., Kane А.В. A flow cytometric assay of neutrophil degranulation // J. Histochemistry and Cytochemistry. -1983. -V.31. -N.6. P.734-744.

85. Ahmed Z.U., Hoque M.M., Rahman A.S., Sack R.B. Thermal stability of an oral killed-cholera-whole-cell vaccine containing recombinant B-subunit of cholera toxin // Microbiol. Immunol. 1994. - V.38, N.l 1. - P. 837-842.

86. Ahren C.M., Svennerholm A.-M. Experimental enterotoxin-induced Escherichia coli diarrhea and protection induced by previous infection with bacteria of the same adhesin or enterotoxin type // Infect, and Immun. 1985. - V.50, N.l. -P. 255-261.

87. Alam M., Mijoshi S., Tomochika K., Shinoda S. Hemagglutination is a novel biological function of lipopolysaccharide (LPS), as seen with the Vibrio cholerae 0139 LPS // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1997. - V.4. - P. 604-606.

88. Albert, M. J., Ansaruzzaman M., Bardhan P. K. et al. Large epidcmic of choleralike disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet. 1993. - V.342. - P. 387-390.

89. Albert M.J., Alam K., Hamidur R. et al., Lack of cross-protection against diarrhea due to Vibrio cholerae Ol after oral immunization of rabbits with V. cholerae 0139 Bengal // J. Infect. Dis. 1994. - V.169. - P. 709-710.

90. Albert M.J., Alam K., Ansaruzzaman M. et al. Pathogenesis of Providencia alcalifaciei75-induced diarrhea // Infect, and Immun. 1992. - V.60, N.2. - P. 50175024.

91. Albert M.J., Alam K., Islam M. et al. Hafnia alvei, a probable cause of diarrhea in humans//Infect, and Immun. 1991. - V.59, N.4. - P. 1507-1513.

92. Alvarez-Barrientos A., Arroyo J., Canton R et al. Application of flow cytometry to clinical microbiology // Clin. Microbiol. Rev. 2000. - V.13, N.3. - P. 167-195.

93. Angclichio M.J., Spector J., Waldor M.K., Camilli A. Vibrio cholerae Intestinal Population Dynamics in the Suckling Mouse Model of Infection // Infect, and Immun. 1999. - V.67, N.8. - P. 3733-3739.

94. Asahi Y., Yoshikawa Т., Walanabe I. Protection against influenza virus infection in polymeric Ig receptor-knockout mice immunized intranasally with adjuvant-combine vaccinc // J. Immunol. 2002. - V. 168. - P. 2930-2938.

95. Attridge S.R., Voss E., Manning P.A. Pathogenic and vaccine significance of toxin-coregulated pili of Vibrio cholerae El Tor // J. Biotechnol. 1999. - V.73. - P. 109-117.

96. Attridge S.R. et al. Susceptibility of Vibrio cholerae 0139 to antibody-dependent, complement-mediated bacteriolysis // Clin. Diag. Lab. Immunol. 2000. - V.7,N.3. - P. 444-50.

97. Balish E., Warner T. Enterococcus faecalis induces inflammatory bowel disease in interleukin-10 knockout mice // Am. J. Pathol. 2002. - V.160. - P. 22532257.

98. Barlogie В., Spidzer G., Hart G.S. et al. DNA histogram analysis of human hemopoetic cells // Blood. 1976. - V.48, N.2. - P. 245-257.

99. Bellamy J.E.C., Knop J., Steele E.J. et al. Antibody cross-linking as a factor in immunity to cholera in infant mice//J. Infect. Dis. 1975.-V. 132.-P. 181-188.

100. Benenson A, Saad A, Mosely W. Serological studies in cholera. 2. The vibriocidal antibody response of cholera patients determined by a microtechnique // Bull WHO. 1968. - V.38. - P. 277-285.

101. Berin M.C., Yang P.C., Ciok L. et al. Role for IL-4 in macromolecular transport across human intestinal epithelium // Am. J. Phisiol. 1999. — V.276 (Cell. Phisiol. V.45). - P. CI046-1052.

102. Berin M.C., Dwinell M.B., Eckmann L., Kagnoff M.F. Production of MDC/CCL22 by human intestinal epithelial cells // Am. J. Phisiol. Gastrointest. Liver Phisiol. 2001. - V.280. - P. G1217-1226.

103. Berkes J., Viswanathan V.K., Savkovic S.D., Hccht G. Iintestinal epithelial responses to enteric pathogens: effects on tight juction barrier, ion transport, and inflammation// Gut. 2003. - V.52. - P.439-451.

104. Bienensiock J., Befus A. D., Mc Dermott M. Mucosal immunity. In: Monographs in allergy, 1980. - V. 16. - P. 1-18. (Karger. Basel).

105. Bik E.M., Bunschoten A.E., Gouw R.D., Mool F.R. Genesis of the novel epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide synthesis // The EMBO Journal. 1995. - V. 14, N. 2. -P. 209-216.

106. Bougoudogo F., Vely F., Nato F. et al. Protective activities of serum immunoglobulin G on mucosal surface to Vibrio cholerae 01 // Bull. Inst. Pasteur -1995.-V.93.-P. 273-283.

107. Bromander A., Holmgren J., Lycke N. Cholera toxin stimulates IL-1 production and enhances antigen presentation by macrophages in vitro // J. Immunol. 1991.-V.146.-P. 2908-2914.

108. Burr D.H., Caldwell M.B., Bourgeois A.L. et al. Mucosal and systemic immunity to Campylobacter jejuni in rabbits after gastric inoculation // Infect, and Immun. 1988.-V. 56,N. l.-P. 99-105.

109. Biittner D., Bonas U. Port of entry — the type III secretion translocon // Trends Microbiol. — 2002. V. 10. — P. 186-191.

110. Caamano J., Hunter C. A. NF-кВ family of transcription factors: central regulators of innate and adaptive immune functions // Clin. Microbiol. Rev. — 2002. -V.15. P. 414-429.

111. Carulli G. Applications of flow cytometry in the study of human neutrophil biology and pathology // Hematopathol. Mol. Hematol. 1996. - V.10 (1-2). - P. 3961.

112. Cash R. A., Music J., Libonati J.P. et al. Response of man to infection with Vibrio cholerae. II. Protection from illness afforded by previous desease and vaccine // J. Inf. Dis. 1974. - V.130, N.4. - P. 325-342.

113. Casola A., Garofalo R.P., Crawford S.E. et al. Interleukin-8 gene regulation in intestinal epithelial cells infected with rotavirus: role of viral-induced IkappaB kinase activation // Virology. 2002. - V.298. - P.8-19.

114. Chaicumpa W., Atthasisishtha N. Study of intestinal immunity against V. cholerae: role of antibody to V. cholerae haemoagglutinin in intestinal immunity // Southeast Asian J. Trap. Med. Public Health. 1977. - V.8. - P. 13-18.

115. Chaicumpa W., Boonthum A., Kalumbaheti T. et al. Cell-bound haemoagglutinin (СНА) of V. cholerae 01 as protective antigen // Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health. 1984,- V. 15. -P. 407-413.

116. Chen W., Jin W., Cook M. et al. Oral delivery of group A streptococcal cell walls augments circulating TGF-beta and suppresses streptococcal cell wall arthritis //J. Immunol — 1998.-V. 161. P. 6297-6304.

117. Chiang S.L., Mecalanos J.J. Use of signature-tagged transposon mutagenesis to identify Vibrio cholerae genes critical for colonization // Mol. Microbiol. — 1998. V. 27. - P. 797-805.

118. Chiang S.L., Mekalanos J.J. Rfb mutations in Vibrio cholerae do not affect surface production of toxin-coregulated pili but still inhibit intestinal colonization // Infect. Immun. 1999. - V.67, N 2. - P. 976-980.

119. Chitnis D.S., Sharma K.D., Koynat R.S. Role of somatic antigen of Vibrio cholerae in adhesion to intestinal mucosa // J. Med. Microbiol. 1982. - V. 15. - P. 43-51.

120. Clemens J.D., Sack D.A., Haas J. R. Field trial of oral cholera vaccines in Bangladesh // Lancet. 1986. - V.ii. - P. 124-127.

121. Clemens J.D., van Loon F., Sack D.A. et al. Biotype as determinant of natural immunising effect of cholera // Lancet. 1991. - V.337. - P. 883-884.

122. Comstock L.E., Maneval D., Panigrahi P. et al. The capsule and О antigen in Vibrio cholerae 0139 Bengal are associated with a genetic region not present in Vibrio cholerae 01 // Infect, and Immun. 1995. - V.63, N.l. - P. 317-323.

123. Cray W.C., Tokunaga E., Pierce N.F. Successful colonization and immunization of adult rabbits by oral inoculation with Vibrio cholerae 01 // Infect, and Immun. 1983. - V.41. - P. 735-741.

124. Crean T.I., John M., Calderwood S.B., Ryan E.T. Optimizing the germfree mouse model for in vivo evaluation of oral Vibrio cholerae vaccine and vector strains // Infect, and Immun. 2000. - V.68, N.2. - P. 977-981.

125. Czerkinsky C., Holmgren J. The mucosal immune system and prospects for anti-infectious and anti-inflammatory vaccines // Immunologist. 1995. - V.3. - P. 97-103.

126. Dahan S., Dalmasso G., Imbert V. et al. Saccharomyces boulardii interfers with enterohemorrhagic Escherichia coli-induced signaling pathways in T84 cells // Infect, and Immun. — 2003. V.71. - P. 766-773.

127. Das J., Chopra A.K., Cantu J.M., Peterson J.W. Antisera to selected outer membrane proteins of Vibrio cholerae protect against challenge with homologous and heterologous strains of V cholerae IIFEMS Microbiol. Lett. 1998. - V.22. - P. 303-308.

128. Dasgupta U., Bhadra R.K., Panda D.K. et al. Recombinant derivative of a naturally occurring non-toxinogenic Vibrio cholerae 01 expressing the В subunit of cholera toxin: a potential oral vaccine strain // Vaccine. 1994. - V. 12, N.4. - P. 359-364.

129. Davis J.A., Banks R.E. Modification to the RITARD surgical model // J. Invest. Surg. 1991. - V.4, N.4. - P. 499-504.

130. Denning T.L., Campbell N.A., Song F. et al. Expression of IL-10 receptors on epithelial cells from the murine small and large intestine // Intern. Immunol. — 2000. -V.12.-P. 133-139.

131. Dertzbaugh M.T., Peterson D.L., Macrina F.L. Cholera toxin B-subunit gene fusion: structural and functional analysis of the chimeric protein // Infect, and Immun. 1990. - V.58. - P. 70-79.

132. Dugas В., Mercenier A., Lenoir-Wijnkoop I. et al. Immunity and probiotics // Immunol. Today. — 1999. — V.20. — P. 387-390.

133. Dutta N.K., Panse M.V., Kulkami D.R. Role of cholera toxin in experimental cholera// J. Bacterid. 1959. - V.78. - P. 594-595.

134. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for chemotherapeutic investigation // Brit. J. Pharmacol. 1955. - V.10, N.2. - P. 18981899.

135. Eaves-Pyles Т., Szabo C., Salzman A. L. Bacterial invasion is not required for activation of NF-кВ in enterocytes // Infect, and Immun. 1999. ■— V.67. — P. 800804.

136. Eckmann L., Kagnoff M.F. Cytokines in host defense against Salmonella II Microbes Infect. 2001.-V.3.-P. 1191-1200.

137. Ehara M., Ishibashi M., Ichinose Y. et al. Purification and partial characterization of fimbriae of Vibrio cholerae 01 // Vaccine. 1987. - V.5. - P. 283-288.

138. Ehara M., Ichinose Y., Iwami M. Immunogenicity of Vibrio cholerae 01 fimbriae in animal and human cholera II Microbiol. Immunol. 1993. - V.37. - P. 679-688.

139. Eko F.O., Schukovskaya Т., Igietseme J.U., Lubitz W. Protective efficacy of Vibrio cholerae ghosts candidate vaccine // Georgia Journal of Science. — 2002. -V.60, N.l.-P. 25.

140. Elewaut D., DiDonato J.A., Kim J.M. et al. NF-kappa В is a central regulator of the intestinal epithelial cell innate immune response induced by infection with enteroinvasive bacteria//J. Immunol. 1999. — V.163. — P. 1457-1466.

141. Elliott S.J., Srinivas S., Albert M.J. et al. Characterization of the roles of hemolysin and other toxins in enteropathy caused by alpha-hemolytic Escherichia coli linked to human diarrhea // Infect, and Immun. 1998. - V.66, N.5. - P. 20402051.

142. Elson C.O., Ealding W. // Cholera toxin feeding did not induce oral tolerance in mice and abrogated oral tolerance to an unregulated protein antigen // J. Immunol. 1984. —V.133.-P. 2892.

143. Faruque S.M., Asadulghani Alim A.R., Albert M. et al. Induction of the lisogenic phage encoding cholcra toxin in naturally occuring strains of toxigenic Vibrio cholerae Ol and 0139 // Infect, and Immun. 1998. - V.6, N.8. - P. 37523757.

144. Faruque S.M., Kamruzzaman M., Meraj I.M. et al. Pathogenic potential of environmental Vibrio cholerae strains carrying genctic variants of the toxin-coregulated pilus pathogenicity island // Infect, and Immun. 2003. - V.71, N.2. - P. 1020-1025.

145. Fasano A. Toxins and the gut: role in human disease // Gut. — 2002. V.50. -P. 9—14.

146. Finkelstein R.A. Quo Vadis. Thirty years after the discoveries of cholera enterotoxin in India // Current Sience.- 1990. -V.59, N.13-14. P. 656-664.

147. Finkclstein R.A. Cholera cnterotoxin (eholcragen) a historical perspective, p. 155-187. In: D.Barua and W.B. Greenough, III (ed.), Cholera. Plenum Mcdical Book Co., New York. 1992.

148. Fleckenstein J.M., Kopecko D. J. Breaching the mucosal barrier by stealth: an emerging pathogenic mechanism for enteroadherent bacterial pathogens // J. Clin. Invest. —2001. —V. 107.-P. 27-30.

149. Francis M.L., Ryan J., Jobling M.G. et al. Cyclic AMP-independent effects of cholera toxin on В cell activation. II. Binding of ganglioside GMi induces В cell activation//J. Immunol. 1992. - V.148. - P. 1999-2005.

150. Freter R., Jones G.W. Adhesive properties of Vibrio cholerae: nature of the interaction with intact mucosal surfaces // Infect, and Immun. 1976. - V.14, N.l. -P. 246-256.

151. Freter R., OBrien C. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa chemotactic responses of Vibrio cholerae and discription of motile nonchemotactic mutants // Inf. Immun. 1981. - V.34. - P. 215-221.

152. Gewirtz А. Т., Navas T. A., Lyons S. et al. Bacterial flagellin activates basolaterally expressed TLR-5 to induce epithelial proinflammatory gene expression // J. Immunol. — 2001. — V.167. P. 1882-1885.

153. Gewirtz A.T., Rao A.S., Simon P.O. ct al. Salmonella typhimurium induced epithelial IL-8 expression of the NF-Kb pathway // J. Clin. Invest. 2000. - V.105. - P. 79-92.

154. Glass R.I., Svennerholm A.-M., Khan M.R. et al. Seroepidemiological studies of El Tor cholera in Bangladesh: association of serum antibody levels with protection //J. Infect. Dis. 1985.-V.151.-P. 236-242.

155. Godaly G., Bergsten G., Hang L. et al. Neutrophil recruitment, chemokine receptors, and resistance to mucosal infection // J. Leukoc. Biol. 2001. — V.69. - P. 899-906.

156. Greenberg R.N. Effects of somatostatin analog SMS 201-995 on enterotoxigenic diarrhea // Dig. Dis. Sci. 1991. - V.36, N.l2. - P. 1768-73.

157. Guerry P., Pope P.M., Burr D.H. et al. Development and characterization of recA mutants of Campylobacter jejuni for inclusion in attenuated vaccines // Infect, and Immun. 1994. - V.62, N.2. - P. 426-432.

158. Gupta R.K., Taylor D.N., Bryla D.A. et al. Phase 1 evaluation of Vibrio cholerae 01, serotype Inaba, polisaccharide-cholera toxin coniugates in adult volunteers // Infect, and Immun. 1998. - V.66, N.7. - P. 3095-3099.

159. Gutierrez 0., Pipaon C., Inohara N. et al. Induction of Nod2 in myelomonocytic and intestinal epithelial cells via nuclear factor-kappa В activation // J. Biol. Chem. 2002. - V.277. - P. 41701-41705.

160. Hall R.H., Losonsky G., Silveira A.P. et al. Immunogenicity of Vibrio cholerae Ol toxin-coregulated pili in experimental and clinical cholera // Infect, and Immun. 1991.-V.59, N.7.-P. 2508-2512.

161. Haller D., Bode C., Hammes W.P. et al. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures // Gut. 2000. - V. 47. - P. 79-87.

162. Hanne L.F., Finkelstein R.A. Characterization and distribution of the hemagglutinins produced by Vibrio cholerae II Infect, and Immun. 1982. - V.36. -P. 209-214.

163. Herrington D.A., Hall R.H., Losonsky G. et al. Toxin, toxin-coregulated-pili and the ToxR regulon are essential for Vibrio cholerae pathogenesis in humans // J. Exp. Med. 1988.-V. 168.-P. 1487-1492.

164. Herrington D.A., Tzipori S., Robins-Browne R. et al. Plesiomonas shigelloides in vitro and in vivo studies of pathogenicity // Infect, and Immun. — 1987.-V.55.-P. 979-985.

165. Hildebrant C. Biologische Rhythmen und ihre Bedeutug fur die Bader und Klimaheilkunde. In: Handbuch der Bader und Klimaheilkunde. Stuttgart: Friedrich-Karl Schattauer-Verl. 1962. - S. 730-785.

166. Hiraoka S., Miyazaki Y., Kitamura S. et al. Gastrin induces CXC chemokine expression in gastric epithelial cells through activation of NF-kB // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. —■ 2001. V.281. - P. G735-G742.

167. Holmgren J., Svennerholm A.-M. Mcchanism of disease and immunity in cholera: a review // J. Infect. Dis. 1977. - V. 136 (Suppl.). - P. S105-S112.

168. Holmgren, J., Lycke N., Czerkinsky C. Cholera toxin and cholera В subunit as oral-mucosal adjuvant and antigen vector systems // Vaccine. 1993. - V. 11. - P. 1179-1184.

169. Hranitsky K.W., Mulholland A., Larson A.D. et al. Characterization of flagellar sheath protein of Vibrio cholerae II Infect, and Immun. 1980. — V.27. — P. 597-603.

170. International Travel and Health, WHO, 2000.

171. Islam M.S., Hasan M.K., Miah M.A. et al. Isolation of Vibrio cholerae 0139 Bengal from water in Bangladesh // Lancet. 1993. - V.342. - P. 430.

172. Isolauri E., Kirjavainen P.V., Salminen S. Probiotics: a role in the treatment of intestinal infection and inflammation? // Gut. 2002. - V.50. - P. Ш54-Ш59.

173. Iwanaga M. Characteristics of the infantile mice with reference to the pathogene of experimental cholera // Trop. Med. (Nagasaki). 1971. - V. 12, N.4. -P. 179-209.

174. Jacob A., Sinha V.B., Sahib M.K. et al. Identification of a 33 kDa antigen associated with an adhesive and colonizing strain of Vibrio cholerae El Tor and its role in protection // Vaccine. 1993. - V.l 1. - P. 376-382.

175. Janeway C.A., Tavers P., Hunt S., Walport M. Immunobiology. The Immune system in health and disease. 3-d Ed. New York, London, 1997

176. Jalajakumari M.B., Manning P.A. Nucleotide sequence of the gene, ompW, encoding a 22kDa immunogenic outer membrane protein of Vibrio choleae I I Nucleic Acids Res. 1990.-V.l 8. - P. 2180.

177. Jechlinger W., et al. Bacterial ghosts as carrier and targeting systems for antigen delivery. In: Dietrich G, Goebel W, editors. Vaccine delivery strategies. Wymondham: Horizon Scientific Press; 2002. P. 163-184.

178. Jobin Ch., Sartor R.B. The IkB/NF-kB system: a key determinant of mucosal inflammation and protection // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2000. - V.278. - P. C451-C462.

179. Jonson G., Lebens M., Holmgren J. Cloning and sequencing of Vibrio cholerae mannose-sensitive haemagglutinin pilin gene: localization of mshA within a cluster of type 4 pilin genes //Mol. Microbiol. 1994. - V.13. - P. 109-118.

180. Jonson G., Svennerholm A.-M., Holmgren J. Analysis of expression of toxin-corregulated pili in classical and El Tor Vibrio cholerae 01 in vitro and in vivo // Infect, and Immun. 1992. - V.60. - P. 4278-4284.

181. Johnson J.A., Salles C.A., Panigrahi P. et al. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal is closely related to Vibrio cholerae El Tor but has important differences // Infect, and Immun. 1994. - V.62. - P. 2108-2110.

182. Jung H.C., Eckmann L., Yang S.K. et al. A distinct array of proinflammatory cytokines is expressed in human colon epithelial cells in response to bacterial invasion//J. Clin. Invest. 1995. - V.95. - P. 55-65.

183. Kabir S. Characterization of the lipopolysaccharide from Vibrio cholerae 395 (Ogawa) // Infect, and Immun. 1982. - V.38. - P. 1236-1272.

184. Kabir S. Immunochemical properties of major outer membrane protein of Vibrio cholerae II Infect, and Immun. 1983. - V.39. - P. 452-455.

185. Kabir S. Composition and immunochemical properties of the cell surface protein of Vibrio cholerae II J. Med. Microbiol. 1987. - V.132. - P. 2235-2242.

186. Kabir S., Mann P. Immunological properties of the ceil envelope components of Vibrio cholerae I I Gen. Microbiol. 1980. -V.l 19, N.2. - P. 517-525.

187. Kaetzel C.S., Robinson J.K., Lamm M.E. Epithelial transcytosis of monomeric IgA and IgG cross-linked through antigen to polymeric IgA // J. Immunol. 1994. -V.152.-P. 72-76.

188. Kagnoff M. F., Eckmann L. Epithelial cclls as sensors for microbial infection //J.Clin. Invest. 1997. - V.100. —P. 6-10.

189. Kaper J.B., Morris J.B., Levine M.M. Cholera II Clin. Microbiol. Rev. 1995. - V.8, N.l. - P. 48-89.

190. Kelly D., Conway S. Genomics at work: the global gene response to enteric bacteria // Gut. 2001. - V.49. - P. 612-613.

191. Kinoshita N., Hiroi Т., Ohta N. et al. Autocrine IL-15 mediates intestinal epithelial cell death via the activation of neighboring intraepithelial NK cells // J. Immunol. 2002. - V.169. - P. 6187-6192.

192. Kirov S.M., Barnett T.C., Pepe C.M. et al. Investigation of the role of Type IV Aeromonas Pilus (Tap) in the pathogenesis of Aeromonas gastrointestinal infection // Infect, and Immun. 2000. - V.68, N.7. - P. 4040-4048.

193. Lang H.A., Jonson G., Svennerholm A.M., Palva E.T. The maltosa-inducible 43 kDa major outer membrane protein in Vibrio cholerae is immunogenic and common to different isolates // Microb. Pathog. 1988. - V.5. - P. 169-175.

194. Lee C.A., Silva M., SiberA.M. et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V.97. - P. 2283-12288.

195. Lee C.K., Weltzin R., Soman G. et al. Oral administration of polymeric immunoglobulin A prevents colonization with Vibrio cholerae in neonatal mice // Infect, and Immun. 1994. - V 62. - P. 887-891.

196. Levine M.M., Nalin D.R., Graig J.P. et al. Immunity of cholera in man: relative role of antibacterial versus antitoxic immunity // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1979. - V.73, N.l. - P. 3-9.

197. Levine M.M., Young C.R., Hughes T.P. et al. Duration of serum antitoxin response following Vibrio cholerae infection in North Americans: relevance for seroepidemiology // Am. J. Epidemiol. 1981. - V.l 14. - P. 348-354.

198. Levine M.M., Kaper J.В., Black R.E., Clemens M.L. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infection as applied to vaccine development // Microbiol. Rev. 1983,- V.47. - P. 510-550.

199. Levine M.M., and Pierce N.F. Immunity and vaccine development, p.285-327. In: D. Bama and W. B. Greenough, 111 (ed.), Cholera. Plenum Mcdical Book Co., New York, 1992.

200. Levine M.M. Immunity to cholera as evaluated in volunteers, p. 195-203. In: O. Ouchterlony and J. Holmgren (ed.), Cholera and related diarr-heas. Karger, Basel, 1980.

201. Liang W., Wang S., Yu F. et al. Construction and evaluation of a safe, live, oral Vibrio cholerae vaccine candidate, IEM108 // Infect, and Immun. 2003. - V.71, N.10. - P. 5498-5504.

202. Logan S.M., Guerry P., Rollins D.M. et al. In vivo antigenic variation of Campylobacter flagellin // Infect, and Immun. 1989. - V.57, N. 8. - P. 2583-2585.

203. Lubitz W. Bacterial ghosts as carrier and targeting systems // Expert. Opin. Biol. Ther. 2001. - V. 1, N.5. - P. 765-771.

204. Lycke N., Strobcr W. Cholera toxin promotes В cell isotype differentiation // J. Immunol. 1989. - V.142. - P. 3781-3787.

205. Lycke N., Karlsson U., Sjolandcr A., Magnusson K.-E. The adjuvant action of cholera toxin is associated with an increased intestinal permeability for luminal antigens// Scand. J. Immunol. 1991. - V.33.-P. 691-698.

206. Lycke N.V., Svennerholm A.-M. Presentation of immunogens at the gut and other mucosal surfaces. In: G.C. Woodrow and M.M. Levine (ed.), New generation vaccines. Marcel Dekker, Inc., New York. 1990. - P. 207-227. .

207. Lycke N., Svennerholm A.-M., Holmgren J. Strong biotype and serotype cross-protective antibacterial and antitoxic immunity in rabbits after cholera infection //Microb. Pathog.- 1986. -V.1,N.4.- P. 361-371.

208. Manning P.A., Brown M.H., Heuzenroeder M.W. Cloning of the structural gene (hly) for the haemolisin of Vibrio cholerae El Tor strain 017 // Gene. 1984. -V.31.-P. 225-231.

209. Manning P.A. Involvement of cell envelope components in the pathogenesis of Vibrio cholerae: targets for cholera vaccine development // Vaccine. — 1987. -V.5.-P. 83-87.

210. Mathan M., Mathan V.I., Albert M.J. Electron microscopic study of the attachment and penetration of rabbit intestinal epithelium by Providencia alcalifaciens II Pathol. 1993. - V. 171, N. 1. - P. 67-71.

211. Matsuzaki Т., Chin J. Modulating immune responses with probiotic bacteria // Immunol. Cell Biol. — 2000. — V.78. — P. 67-73.

212. May M. J., Ghosh S. Signal transduction through NF-kB // Immunol. Today. -1998. —V. 19.-P. 80-88.

213. McCutcheon M.J., Miller R.G. Fluorescence intensity resolution in flow system // J. Histochemistry and Cytochemistry. 1979. - V.27. - P. 246-249.

214. Mellitis K.H., Mullen J., Wand M. et al. Activation of the trancription factor NF-kB by Campylobacter jejuni II Microbiology. 2002. - V. 148. - P. 2753-2763.

215. Morris J.G., Losonsky G.E., Jonson J.A. et al. Clinical and immunologic characteristics of Vibrio cholerae 0139 Bengal infection in North American volunteers//J. of Infectious Diseases. 1995. -V.171. - P. 171-191.

216. Mukhopadhyay S., Nandi В., Ghose A.C. Antibodies (IgG) to lipopolysaccharide of Vibrio cholerae mediate protection through inhibition of intestinal adherence and colonization in a mouse model // FEMS Microbiol. Lett. -2000.-V. 185.-P. 29-35.

217. Munoz E., Zubiaga A. M., Merrow M. et al. Cholera toxin discriminates between T helper 1 and T helper 2 cells in T cell receptor mediated activation: role of cAMP in T cell proliferation // J. Exp. Med. 1990. - V.172. - P. 95-103.

218. Mynott T.L., Chandler D.S., Luke R.K. Efficacy of enteric-coated protease in preventing attachment of enterotoxigenic Escherichia coli and diarrheal disease in the RITARD model // Infect, and Immun. 1991. - V.59, N.10. - P. 3708-3714.

219. Nair G.B., Ramamurthy J., Bhattacharya S.K. et al. Spread of Vibrio cholerae 0139 Bengal in India//Infec. Dis.- 1994. V.169. - P. 1029-1034.

220. Nakasone N., Iwanaga M. Cell-associated hemagglutinin of classical Vibrio cholerae 01 with reference to intestinal adhesion // FEMS Microbiol. Lett. 1993. -V.l 13.-P. 67-70.

221. Neoh S.H., Rowley D. Quantitative assay of a protein antigen of Vibrio cholerae involved in the vibriocidal action of antibody and complement // Austr. J. exp. Biol. med. Sci.- 1971. V.49. - P. 605-612.

222. Neutra M. R., Pringault E., Kraehenbuhl J. P. Antigen sampling across epithelial barriers and induction of mucosal immune responses // Ann. Rev. Immunol. 1996. - V.14. - P. 275-300.

223. Noriki H. Evaluation of toxoid field trial in the Phillipines, p. 302-310. In: Proceedings of the 12th Joint Conference on Cholera, U.S.-Japan Cooperative Medical Science Program. Fuji, Tokyo. 1976.

224. Ogawa H., Fukushima K., Sasaki I., Matsuno S. Identification of genes involved in mucosal defense and inflammation associated with normal enteric bacteria // Am. J. Phisio. Gastrointest. Liver Phisiol. 2000. - V.279. - P. G492-G499.

225. Ogierman M.A., Manning P.A. TCP pilus biosynthesis Vibrio cholerae 01: gene sequence of tcpC encoding an outer membrane lipoprotein // FEMS Microbiol. Lett. 1992.-V.97.-P. 179-184.

226. Osek J., Svennerholm A.-M., Holmgren J. Protection against Vibrio cholerae El Tor infection by specific antibodies against mannoscbinding hemagglutinin pili // Infect, and Immun. 1992. - V.60. - P. 4961-4964.

227. Osek J., Jonson J., Svennerholm A.-M., Holmgren J. Role of antibodies against biotype-specific Vibrio cholerae pili in protection against experimental classical and El Tor cholera // Infect, and Immun. 1994. - V.62, N.7. - P. 29012907.

228. Pal S., Sasmal D., Guhathakurta B. et al. Electrophoretic mobility and immune response of outer membrane proteins of Vibrio cholerae II FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996,-V. 15.-P. 143-148.

229. Palaszynski S., Pinkner J., Leath S. et al. Systemic immunization with conserved pilus-associated adhesions protects against mucosal infections // Dav. Biol. Stand. 1988. - V.92. - P. 117-122.

230. Pang Т., Wong P.Y., Puthucheary S.D. et al. In vitro and in vivo studies of a cytotoxin from Campylobacter jejuni II J. Med. Microbiol. — 1987. V.23, N.3. — P. 193-198.

231. Parsot C., Taxman E., Mekalanos J.J. ToxR regulates the production of lipoproteins and the expression of serum resistance in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1991.-V.88.-P. 1641-1645.

232. Pavlovskis O.R., Rollins D.M., Haberberger R.L. et al. Significance of flagella in colonization resistance of rabbits immunized with Campylobacter spp. // Infect, and Immun. 1991. - V.59, N.7. - P. 2259-2264.

233. Pazzaglia G., Sack R.B., Bourgeois A.L. et al. J. Diarrhea and intestinal invasiveness of Aeromonas strains in the removable intestinal tie rabbit model // Infect, and Immun. 1990. - V.58, N.6. - P. 1924-1931.

234. Penny M.E. The role of the duodenal microflora as a determinant of persistent diarrhoea // Acta Paediatr. Suppl. 1992. - V.381. - P. 114-120.

235. Perdue M.H. Mucosal immunity and inflammation. III. The mucosal antigen barrier: cross talk with mucosal cytokines // Am. J. Phisiol. Gastrointest. Liver Phisiol. 1999. - V.277. - P. G1-G5.

236. Pessi Т., Sutas Y., Hurme M., Isolauri E. Interleukin-1 generation in atopic children following oral Lactobacillus rhamnosus GG // Clin. Exp. Allergy. - 2000. -V.30. - P. 1804-1808.

237. Peterson J.W., Hejtmanecik K.E., Markel D.E. et al. Antigenic specificity of neutralizing antibody to cholera toxin // Infect, and Immun. 1979. - V.24. - P. 774-779.A.

238. Pierce N.F., Cray W.C., Kaper J.B., Mekalanos J.J. Determinants of immunogenicity and mechanisms of protection by virulent and mutant Vibrio cholerae 01 in rabbits // Infect, and Immun. 1988. - V.56, N. 1. - P. 142-148.

239. Pohlner J., Meyer T. F., Jalajakumari M.B., Manning P.A. Nucleotide sequence of ompV, the gene for a major Vibrio cholerae outer membrane protein // Met. Gen. Genet. 1986. - V.205. - P. 494-500.

240. Pritts Т., Hungness E., Wang Q. et al. Mucosal and enterocyte IL-6 production during sepsis and endotoxemia role of transcription actors and regulation by the stress response // Am. J. Surg. - 2002. - V.183. - P. 372-383.

241. Rastogi D., Rather A. G., Prince A. Host-bacterial interactions in the initiations of inflammation // Paediatr. Respir. Rev. -— 2001. V.2. - P. 245-252.

242. Rath H. C. Role of commensal bacteria in chronic experimental colitis: lessons from the HLA-B27 transgenic rat // Pathobiology. 2002. - V.70. - P. 131-138.

243. Rcnegar К. В., Small P.A. Immunoglobulin A mediation of murine nasan anti-influenza virus immunity//J. Virol. 1991.-V.146.-P. 1972-1978.

244. Richardson K. Roles of motility and flagellar structure in pathogenicity of Vibrio cholerae: analysis of motility mutants in three animal models // Infect, and Immun. 1991.-V.59, N.8.-P. 2727-2736.

245. Rudzik O., Clansy R.L., Perey D.Y.E. et al. Rcpopulation with IgA-containing cells of bronchial and intestinal lamina propria after transfer of gomologous Pcycr's patches and bronchial lymphocytes // J. Immunol. 1975. - V.l 14. - P. 1599-1604.

246. Russell R.G., Tall B.D., Morris J.G. Non-Ol Vibrio cholerae intestinal pathology and invasion in the removable intestinal tie adult rabbit diarrhea model // Infect, and Immun. 1992. - V.60, N.2. - P. 435-442.

247. Ryan E.T., Crean T.I., John M. et al. In vivo expression and immunoadjuvancy of a mutant of heat-labile enterotoxin of Escherichia coli in vaccine and vector strains of Vibrio cholerae II Infect, and Immun. 1999. - V.67, N.4. - P. 1694-1701.

248. Sack R.B., Kline R.L., Spira W.M. Oral immunization of rabbits with enterotoxigenic Escherichia coli protects against intraintestinal challenge // Infect, and Immun. 1988. - V.56, N.2. - P. 387-394.

249. Sanchez J., Johansson S., Lowenadler B. et al. Recombinant cholera toxin В subunit and gene fusion proteins for oral vaccination // Res. Microbiol. 1990. -V.141.-P. 971-979.

250. Schodel F., Will H., Johansson S. et al. Synthesis in Vibrio cholerae and secretion of hepatitis В virus antigens fused to Esherichia coli heat-labile enterotoxin subunit В // Gene. 1991. - V.99. - P. 255-259.

251. Sciortino C.V. Protection against infection with Vibrio cholerae by passive transfer of monoclonal antibodies to outer-membrane antigens // J. Infect. Dis. — 1989.-V.160.-P. 248-252.

252. Sears S.D., Richardson K., Young C. et al. Evaluation of the human immune response to outer membrane proteins of Vibrio cholerae II Infect, and Immun. — 1984. -V.44.- P. 439-444.

253. Sellon R.K., Tonkonogy S., Schultz M. et al. Resident enteric bacteria are necessary for development of spontaneous colitis and immune system activation in Interleukin-10-deficient mice // Infect, and Immun. 1998. - V.66. - P. 5224-5231.

254. Sengupta D.K., Sengupta Т.К., Ghose A.S. Major outer membrane proteins of Vibrio cholerae and their role in induction of protective immunity through inhibition of intestinal colonization // Infect, and Immun. 1992. - V.60. - P. 4848-4855.

255. Sinha V.B., Jacob A., Srivastava R. et al. Identification of the flagellar antigens of Vibrio cholerae El Tor and their role in protection // Vaccine. 1993. -V.ll.-P. 372-375.

256. Sperandio V., Giron J.A., Silveira W.D. et al. Characterization of the outer membrane protein OmpU of Vibrio cholerae, p. 248. In: Abstracts of the 94th

257. General Meeting of the American Society for Microbiology 1994. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 1994.

258. Sperandio V., Giron J.A., Silveira W.D., Kaper J.B. The OmpU outer membrane protein, a potential adherence factor of Vibrio cholerae II Infect, and Immun. 1995.-V.63.-P. 4433-4438.

259. Spira W.M., Sack R.B. Kinetics of early cholera infection in the removable intestinal tie-adult rabbit diarrhea model // Infect, and Immun. 1982. - V.35, N.3. -P. 952-957.

260. Spira W.M., Sack R.B., Froehlich J.L. Simple adult rabbit model for Vibrio cholerae and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhea // Infect, and Immun. — 1981. -V.32, N.2.-P. 739-747.

261. Sun D.X., Lafferty M.J., Peek J.A., Taylor R.K. Domains within the Vibrio cholerae toxin coregulated pilin subunit that mediate bacterial colonization 11 Gene. — 1997.-V. 192.-P. 79-85.

262. Sun D.X., Mekalanos J.J., Taylor R.K. // Antibodies directed against toxin-coregulated pilus isolated from Vibrio choleras provide protection in the infant mouse experimental cholera model // J. Infect. Dis. 1990. - V.l61, N.6. - P. 12311236.

263. Svennerholm A.-M., Hanson L.A., Holmgren J. et al. Different secretory immunoglobulin A antibode responses to cholera vaccination in Swedish and Pakistan Women // Infect, and Immun. 1980. - V.30, N.2. - P. 427-430.

264. Svennerholm A.-M., Jonson G., Holmgren J. Immunity to Vibrio cholerae infection, p. 257-271. In: I.K. Wachsmuth, P.A. Blake, 0. Olsvik (ed.), Vibrio cholerae and cholera: molecular to global perspectives. ASM Press, Washington, D.C. 1994.

265. Svennerholtn A.-M., McConnell M.M., Wiklund G. Roles of different putative colonization factor antigens in colonization of human enterotoxigenic Escherichia coli in rabbits I I Microb. Pathog. 1992. - V.13, N.5. - P. 381-389.

266. Swerdlow D.L., Ries A.A. Vibrio cholerae non-Ol the eighth pandemic? // Lancet. - 1993. - V.342. - P. 382-383.

267. Tacket C.O., Forrest В., Morona R. et al. Safety, immunicity and efficacy against cholera challenge in humans of typhoid-cholera hybrid vaccine derived from Salmonella typhi Ty21a // Infect, and Immun. 1990. - V.58, N.6. - P. 1620-1627.

268. Taylor R.K., Miller V.L., Furlong D.B., Mekalanos J.J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84. - P.2833-2837.

269. Telford W., King L., Fraker P. Rapid quantitation of apoptosis in pure and heterogeneous cell populations using flow cytometry // J. Immunol. Meth. V.172. -1994,- P. 1-16.

270. Thelin K.H., Taylor R.K. Toxin-coregulated pilus, but not mannose-sensitive hemagglutinin, is required for colonization by Vibrio cholerae 01 El Tor biotype and 0139 strains // Infect, and Immun.- 1996. V.64, N.7. - P. 2853-2856.

271. Tickoo S.K., Bhan M.K., Srivastava R., Dass B.K., Shariff M., Saini S., Kumar R. Intestinal colonization and production of diarrhoea by enteroadherentaggregative Escherichia coli II Indian J. Med. Res. 1992. - V.95, N.l 1. - P. 278283.

272. Tokunaga E., Cray W.C., Pierce N.F. Compared colonizing and immunizing efficiency of toxinogenic (A+ B+) Vibrio cholerae and an A- B+ mutant (Texas Star-SR) studied in adult rabbits // Infect, and Immun. 1984. - V.44, N.2. - P. 364-369.

273. Trach D.D., Cam P.D., Ke N.T. et al. Investigations into the safety and immunogenicity of a killed oral cholerae vaccine developed in Viet Nam // Bull. World Health Organ. 2002. - V. 80, N.l. - P. 2-8.

274. Vaccine Delivery Strategies / G.Dietrich, W. Goebel (ed). Wymondham: Horizon Scientific Press - 2002. - 404 p.

275. Vimr E.R., Lawrisuk L., Galen J.E., Kaper I.B. Cloning and expression of the Vibrio cholerae neuraminidase gene nan H in Escherichia coli II J. Bacterid. -1988. -V.170, N.4. P. 1495- 1504.

276. Voss E., Manning P.A., Attridge S.R. The toxin-coregulated pilus is a colonization factor and protective antigen of Vibrio cholerae El Tor // Microb. Pathog. 1996. - V.20, N.3.-P. 141-153.

277. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Emcrgcnsc of a new cholera pandemic molecular analysis of virulence determinants in Vibrio cholerae 0139 and development of a live vaccine prototype // J. Infect. Dis. 1994. - V.170, N.2. - P. 278-283.

278. Wang W., Uzzan S., Goldblum S.E., Fasano A. Human zonulin, a potencial madulator of intestinal tight junctions // J. Cel. Sci. 2000. - V. 113. - P. 1916019165.

279. Weekly Epidemiol. Record. Cholera vaccines. 2001. - V. 76, N. 16. - P. 117124.

280. WHO/VSQ/97.04. Manual of laboratory methods for testing vaccines used in the WHO Expanded Programme on Immunization. - 1997. - 221 p.

281. Yancey R.J., Willis D.L., Berry L.J. Flagella-induced immunity against experimental cholera in adult rabbits // Infect, and Immun. 1979. - V.25. - P. 220228.

282. Yeliseev Yu.Yu. Adamov A.K. Inhibiting capacity conjugates choleric exoenzymes as for the grows and division of Vibrio cholerae II Second Asia-Pacific Congress on Animal, Plant and Microbial Toxins. Barnas Hindu Univ. February 1922, 1990. India, 1990.

283. Yuasa H., Sheinberg D. A., Houghton A.N. Gangliosides of T-lymphocytes: Evidens for role in T-cell activation // Tissue Antigenes. 1990. - V.36, N.2. - P. 4756.

284. Zhang G., Ghosh S. Toll-like receptor-mediated NF-kB activation: a phylogenetically conserved paradigm in innate immunity // J. Clin. Invest. 2001. -V.107. - P. 13-19.