Направленные изменения спектральных свойств флуоресцентных белков в живой клетке как инструмент изучения функционирования белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Чжан Лицзюань

• Чжан Лицзюань
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чжан Лицзюань

Используемые сокращения.

I. ВВЕДЕНИЕ.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

11.1. Фотоактивируемые флуоресцентные белки.

П.1.1. РА-СЕР.

П.1.2. РБ-СЕР.

П.1.3. РА-ш1*ЕР1.

П.1.4. РАтСЬеггу1, РАтСЬеггу2 и РАтСИеггуЗ.

П.1.5. ЮРТ1.

П.1.6. КвСЬеггу и геСИеггуКеу.

П.1.7. Бгопра.

П.1. 8. Мутантные варианты белка Бгопра.

II. 1.9. тТЕР0,7.

П.1.10. Кае(1е.

П.1.11. Kaede-пoдoбныe белки.

П.1.12. ЫвЕР.

11.1.13. Свойство фотопереключения красных флуоресцентных белков.

11.2 Флуоресцентная микроскопия со сверхвысоким разрешением.

П.2.1. Разрешающая способность микроскопа.

П.2.2. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия.

П.2.3. 4Р1 и 15М микроскопия.

П.2.4. 8ТЕР микроскопия.

П.2.5. ЫЕЭОЬЕТ.

IL2.6. Методы флуоресцентной микроскопии высокого разрешения на уровне одной молекулы.

11.2.7. PALM.

11.2.8. Многоцветное изображение с высоким разрешением.

II.3. Убиквитин - протеасомная система.

11.3.1. Система убиквитинирования.

11.3.2. Строение 268-протеасомы.

11.3.3. Регуляторные субкомплексы протеасомы.

11.3.4. Внутриклеточная локализация протеасом.

11.3.5. Сигналы деградации.

11.3.6. Методы определения времени полужизни белков in vivo.

П.4. Флуоресцентный резонансный перенос энергии.

П.4.1. Способы измерения FRET.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

III.1. Оборудование.

111.2. Реактивы.

111.3. Использованные методы.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

IV. 1. Разработка метода мониторинга деградации целевых белков с использованием необратимо фотоактивируемых флуоресцентных белков.

IV. 1.1. Описание предлагаемого метода.

IV.1.2. Подбор условий для визуализации, фотопереключения и наблюдения за белком Dendra2 в клетках млекопитающих.

IV.1.3. Влияние PEST-мотивов и убиквитина на время жизни белка Dendra2 в клетке.

IV.1.4. Определение времени полужизни белка 1кВа при помощи Dendra2.

1У.2. Получение и использование мономерных обратимо фотоактивируемых красных флуоресцентных белков.

1У.2.1. Получение мономерного обратимо фотопереключаемого красного флуоресцентного белка КРР-НС.

1У.2.2. Спектральные свойства КГР-НС.

1У.2.3. Фотоконверсия КПР-НС в культуре клеток млекопитающих

1У.2.4. Получение обратимо фотопереключаемого красного флуоресцентного белка rsTagRFP.

1У.2.5. Характеристика выделенного rsTagRFP в растворе.

IV 2.6. Применение rsTagRFP для изучения белок-белковых взаимодействий в живой клетке.

V. ВЫВОДЫ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Чжан Лицзюань

V. выводы

1. Разработан метод мониторинга деградации целевых белков на уровне отдельных клеток в режиме реального времени, основанный на использовании необратимо фотоактивируемых флуоресцентных белков.

2. Получены обратимо фотоактивируемые варианты мономерного красного флуоресцентного белка TagRFP с различными механизмами фотоконверсии: изменением квантового выхода флуоресценции в случае белка КБР-НС, и изменением спектра поглощения при неизменном квантовом выходе флуоресценции в случае белка rsTagRFP. Показано, что аминокислотные позиции 148, 165 и 181 (нумерация относительно зеленого флуоресцентного белка ОБР) играют определяющую роль в проявлении свойств фотоактивируемости.

3. Предложен метод изучения взаимодействия целевых белков в живой клетке в режиме реального времени с использованием красного обратимо фотоактивируемого флуоресцентного белка rsTagRFP в качестве акцептора для резонансного переноса энергии, модулируемого светом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Протеолиз является одним из существенных регуляторных механизмов в клетке. Время жизни многих белков может существенно меняться в зависимости от клеточного цикла или в ответ на внешний стимул. В настоящей работе разработан новый метод мониторинга времени жизни целевых белков в живой клетке в реальном времени с использованием ФАФ-белка Бепс1га2. Показано, что ФАФ-белок Оепс1га2 не влияет на время жизни целевого белка и способен к протеасомной деградации при слиянии Бепс1га2 с ранее описанными в литературе деградационными мотивами. В качестве модельной системы был выбран хорошо изученный белок 1кВа. Время полужизни 1кВа, определенное с помощью предложенного нами метода, совпало с данными, описанными в литературе и результатами, полученными классическим методом. Нам удалось показать существенное изменение скорости деградации 1кВа в одной и той же клетке до и после добавления форболового эфира. Получение таких данных при помощи классических методов определения времени полужизни белков является исключительно трудоемкой, а иногда и невозможной задачей. Таким образом, предложенный метод позволяет не только определять время полужизни белка, но и измерять скорость деградации целевого белка в различных условиях культивирования клеток в режиме реального времени на уровне отдельных клеток. Полученные нами результаты показывают, что предложенный метод удобен в применении и должен дополнить арсенал современных методов молекулярной и клеточной биологии.

В данной работе получены и охарактеризованы два обратимо фотоактивируемых флуоресцентных белка: КБР-НС и rsTagRFP с эмиссией в красной области спектра. Показана возможность прижизненного мечения клеток белком КБР-НС. Был получен белок rsTagRFP, у которого при фотопереключении изменяется спектр поглощения. Это уникальное свойство позволило использовать rsTagRFP в качестве модулируемого светом акцептора для резонансного переноса энергии в паре с ЕУБР. Использование такой РЯЕТ-пары дает возможность многократного определения белок-белковых взаимодействий в живых клетках при продолжительном наблюдении и/или при разных условиях культивирования клеток, поскольку не сопровождается необратимым обесцвечиванием флуорофора акцептора. С помощью предложенного метода удалось показать отсутствие и появление взаимодействия белков вгЬ2 и ЕОБЯ до и после стимуляции БОБ, соответственно.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чжан Лицзюань, 2010 год

1. Ando R., Flors C., Mizuno H., Hofkens J. and Miyawaki A. (2007). Highlighted generation of fluorescence signals using simultaneous two-color irradiation on Dronpa mutants. Biophys J 92 (12), L97-99.

2. Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Mizuno H. and Miyawaki A. (2002). An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc Natl Acad Sci U S A 99 (20), 12651-12656.

3. Andresen M., Stiel A. C., Trowitzsch S., Weber G., Eggeling C., Wahl M. C., Hell S. W. and Jakobs S. (2007). Structural basis for reversible photoswitching in Dronpa. Proc Natl Acad Sci U S A 104 (32), 13005-13009.

4. Asher G., Bercovich Z., Tsvetkov P., Shaul Y. and Kahana C. (2005). 20S proteasomal degradation of ornithine decarboxylase is regulated by NQOl. Mol Cell 17 (5), 645-655.

5. Belousov V. V., Fradkov A. F., Lukyanov K. A., Staroverov D. B., Shakhbazov K. S., Terskikh A. V. and Lukyanov S. (2006). Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nat Methods 3 (4), 281-286.

6. Berntsson P. S., Aim K. and Oredsson S. M. (1999). Half-lives of ornithine decarboxylase and S-adenosylmethionine decarboxylase activities during the cell cycle of Chinese hamster ovary cells. Biochem Biophys Res Commun 263 (1), 13-16.

7. Bhat R. A., Lahaye T. and Panstruga R. (2006). The visible touch: in planta visualization of protein-protein interactions by fluorophore-based methods. Plant Methods 2 12.

8. Birbach A., Gold P., Binder B. R., Hofer E., de Martin R. and Schmid J. A. (2002). Signaling molecules of the NF-kappa B pathway shuttle constitutively between cytoplasm and nucleus. J Biol Chem 277(13), 10842-10851.

9. Bonifacino J. S. and Weissman A. M. (1998). Ubiquitin and the control of protein fate in the secretory and endocytic pathways. Annu Rev Cell Dev Biol 14 19-57.

10. Breitschopf K., Bengal E., Ziv T., Admon A. and Ciechanover A. (1998). A novel site for ubiquitination: the N-terminal residue, and not internal lysines of MyoD, is essential for conjugation and degradation of the protein. EMBO J 17 (20), 5964-5973.

11. Brodsky J. L. and McCracken A. A. (1999). ER protein quality control and proteasome-mediated protein degradation. Semin Cell Dev Biol 10 (5), 507-513.

12. Brooks P., Fuertes G., Murray R. Z., Bose S., Knecht E., Rechsteiner M. C., Hendil K. B., Tanaka K., Dyson J. and Rivett J. (2000). Subcellular localization of proteasomes and their regulatory complexes in mammalian cells. Biochem J 346 Pt 1 155-161.

13. Brown K., Gerstberger S., Carlson L., Franzoso G. and Siebenlist U. (1995). Control of I kappa B-alpha proteolysis by site-specific, signal-induced phosphorylation. Science 267 (5203), 1485-1488.

14. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W. W. and Prasher D. C. (1994). Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263 (5148), 802-805.

15. Chudakov D. M., Belousov V. V., Zaraisky A. G., Novoselov V. V., Staroverov D. B., Zorov D. B., Lukyanov S. and Lukyanov K. A. (2003). Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nat Biotechnol 21 (2), 191-194.

16. Chudakov D. M., Feofanov A. V., Mudrik N. N., Lukyanov S. and Lukyanov K. A. (2003). Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. J Biol Chem 278 (9), 7215-7219.

17. Chudakov D. M., Verkhusha V. V., Staroverov D. B., Souslova E. A., Lukyanov S. and Lukyanov K. A. (2004). Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. Nat Biotechnol 22 (11), 1435-1439.

18. Ciechanover A., Breitschopf K., Hatoum O. A. and Bengal E. (1999). Degradation of MyoD by the ubiquitin pathway: regulation by specific DNA-binding and identification of a novel site for ubiquitination. Mol Biol Rep 26 (1-2), 59-64.

19. Corish P. and Tyler-Smith C. (1999). Attenuation of green fluorescent protein half-life in mammalian cells. Protein Eng 12 (12), 1035-1040.

20. Dantuma N. P., Lindsten K., Glas R., Jellne M. and Masucci M. G. (2000). Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat Biotechnol 18 (5), 538-543.

21. Day R. N. and Schaufele F. (2005). Imaging molecular interactions in living cells. Mol Endocrinol 19 (7), 1675-1686.

22. Dundr M., Hoffmann-Rohrer U., Hu Q., Grummt I., Rothblum L. I., Phair R. D. and Misteli T. (2002). A kinetic framework for a mammalian RNA polymerase in vivo. Science 298 (5598), 1623-1626.

23. Dunn G. A., Dobbie I. M., Monypenny J., Holt M. R. and Zicha D. (2002). Fluorescence localization after photobleaching (FLAP): a new method for studying protein dynamics in living cells. J Microsc 205 (Ptl), 109-112.

24. Dunn G. A., Holt M. R., Soong D. Y., Gray C. and Zicha D. (2004). Fluorescence localization after photobleaching (FLAP). Curr Protoc Cell Biol Chapter 21 Unit 21 22.

25. Fang S. and Weissman A. M. (2004). A field guide to ubiquitylation. Cell Mol Life Sci 61(13), 1546-1561.

26. Fehr M., Frommer W. B. and Lalonde S. (2002). Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors. Proc Natl Acad Sci U S A 99 (15), 9846-9851.

27. Flors C., Hotta J., Uji-i H., Dedecker P., Ando R., Mizuno H., Miyawaki A. and Hofkens J. (2007). A stroboscopic approach for fast photoactivation-localization microscopy with Dronpa mutants. J Am Chem Soc 129 (45), 13970-13977.

28. Gadella T. W., Jr., van der Krogt G. N. and Bisseling T. (1999). GFP-based FRET microscopy in living plant cells. Trends Plant Sci 4 (7), 287-291.

29. Ghoda L., Lin X. and Greene W. C. (1997). The 90-kDa ribosomal S6 kinase (pp90rsk) phosphorylates the N-terminal regulatory domain of IkappaBalpha and stimulates its degradation in vitro. J Biol Chem 272 (34), 21281-21288.

30. Gordon G. W., Beriy G., Liang X. H., Levine B. and Herman B. (1998). Quantitative fluorescence resonance energy transfer measurements using fluorescence microscopy. Biophys J 74 (5), 2702-2713.

31. Gray C. W., Slaughter C. A. and DeMartino G. N. (1994). PA28 activator protein forms regulatory caps on proteasome stacked rings. J Mol Biol 236 (1), 7-15.

32. Groll M., Ditzel L., Lowe J., Stock D., Bochtler M., Bartunik H. D. and Huber R. (1997). Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature 386 (6624), 463-471.

33. Gurskaya N. G., Fradkov A. F., Terskikh A., Matz M. V., Labas Y. A., Martynov V. I., Yanushevich Y. G., Lukyanov K. A. and Lukyanov S. A. (2001). GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett 507 (1), 16-20.

34. Haas A. L. and Rose I. A. (1982). The mechanism of ubiquitin activating enzyme. A kinetic and equilibrium analysis. J Biol Chem 257 (17), 10329-10337.

35. Habuchi S., Ando R., Dedecker P., Verheijen W., Mizuno H., Miyawaki A. and Hofkens J. (2005). Reversible single-molecule photoswitching in the GFP-like fluorescent protein Dronpa. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (27), 9511 -9516.

36. Habuchi S., Tsutsui H., Kochaniak A. B., Miyawaki A. and van Oijen A. M. (2008). mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One 3(12), e3944.

37. Hatakeyama S., Yada M., Matsumoto M., Ishida N. and Nakayama K. I. (2001). U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. J Biol Chem 276 (35), 33111-33120.

38. Hayashi S., Murakami Y. and Matsufuji S. (1996). Ornithine decarboxylase antizyme: a novel type of regulatory protein. Trends Biochem Sci 21 (1), 27-30.

39. Hein B., Willig K. I. and Hell S. W. (2008). Stimulated emission depletion (STED) nanoscopy of a fluorescent protein-labeled organelle inside a living cell. Proc Natl Acad Sci U S A 105 (38), 1427114276.

40. Henderson J. N., Ai H. W., Campbell R. E. and Remington S. J. (2007). Structural basis for reversible photobleaching of a green fluorescent protein homologue. Proc Natl Acad Sci U S A 104 (16), 6672-6677.

41. Henkel T., Machleidt T., Alkalay I., Kronke M., Ben-Neriah Y. and Baeuerle P. A. (1993). Rapid proteolysis of I kappa B-alpha is necessary for activation of transcription factor NF-kappa B. Nature 365 (6442), 182-185.

42. Hershko A. and Ciechanover A. (1998). The ubiquitin system. Annu Rev Biochem 67 425-479.

43. Hershko A., Heller H., Elias S. and Ciechanover A. (1983). Components of ubiquitin-protein ligase system. Resolution, affinity purification, and role in protein breakdown. J Biol Chem 258 (13), 8206-8214.

44. Hicke L. (1999). Gettin' down with ubiquitin: turning off cell-surface receptors, transporters and channels. Trends Cell Biol 9 (3), 107-112.

45. Hink M. A., Bisselin T. and Visser A. J. (2002). Imaging protein-protein interactions in living cells. Plant Mol Biol 50 (6), 871-883.

46. Ho S. N., Hunt H. D., Horton R. M., Pullen J. K. and Pease L. R. (1989). Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene 77 (1), 51-59.

47. Hofmann M., Eggeling C., Jakobs S. and Hell S. W. (2005). Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy at low light intensities by using reversibly photoswitchable proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (49), 17565-17569.

48. Hoyt M. A. and Coffino P. (2004). Ubiquitin-free routes into the proteasome. Cell Mol Life Sci 61 (13), 1596-1600.

49. Huang B., Bates M. and Zhuang X. (2009). Super-resolution fluorescence microscopy. Annu Rev Biochem 78 993-1016.

50. Jiang X., Coffino P. and Li X. (2004). Development of a method for screening short-lived proteins using green fluorescent protein. Genome Biol 5 (10), R81.

51. Kim M. S., Kim Y. K„ Kim Y. S., Seong M., Choi J. K. and Baek K. H. (2005). Deubiquitinating enzyme USP36 contains the PEST motif and is polyubiquitinated. Biochem Biophys Res Commun 330 (3), 797-804.

52. Kisselev A. F. and Goldberg A. L. (2001). Proteasome inhibitors: from research tools to drug candidates. Chem Biol 8 (8), 739-758.

53. Kohler A., Cascio P., Leggett D. S., Woo K. M., Goldberg A. L. and Finley D. (2001). The axial channel of the proteasome core particle is gated by the Rpt2 ATPase and controls both substrate entry and product release. Mol Cell 7 (6), 1143-1152.

54. Kremers G. J., Hazelwood K. L., Murphy C. S., Davidson M. W. and Piston D. W. (2009). Photoconversion in orange and red fluorescent proteins. Nat Methods 6 (5), 355-358.

55. Kurucz E., Ando I., Sumegi M., Holzl H., Kapelari B., Baumeister W. and Udvardy A. (2002). Assembly of the Drosophila 26 S proteasome is accompanied by extensive subunit rearrangements. Biochem J 365 (Pt 2), 527-536.

56. Lam Y. A., Lawson T. G., Velayutham M., Zweier J. L. and Pickart C. M. (2002). A proteasomal ATPase subunit recognizes the polyubiquitin degradation signal. Nature 416 (6882), 763-767.

57. Leggett D. S., Hanna J., Borodovsky A., Crosas B., Schmidt M., Baker R. T., Walz T., Ploegh H. and Finley D. (2002). Multiple associated proteins regulate proteasome structure and function. Mol Cell 10 (3), 495-507.

58. Li X., Fang Y., Zhao X., Jiang X., Duong T. and Kain S. R. (1999). Characterization of NFkappaB activation by detection of green fluorescent protein-tagged IkappaB degradation in living cells. J Biol Chem 274 (30), 21244-21250.

59. Li X., Zhao X., Fang Y, Jiang X, Duong T., Fan C., Huang C. C. and Kain S. R. (1998). Generation of destabilized green fluorescent protein as a transcription reporter. J Biol Chem 273 (52), 34970-34975.

60. Lippincott-Schwartz J., Altan-Bonnet N. and Patterson G. H. (2003). Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells. Nat Cell Biol Suppl S7-14.

61. Lippincott-Schwartz J., Snapp E. and Kenworthy A. (2001). Studying protein dynamics in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol 2 (6), 444-456.

62. Lord J. M., Davey J., Frigerio L. and Roberts L. M. (2000). Endoplasmic reticulum-associated protein degradation. Semin Cell Dev Biol 11 (3), 159-164.

63. Lowe J., Stock D., Jap B., Zwickl P., Baumeister W. and Huber R. (1995). Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science 268 (5210), 533-539.

64. Lukyanov K. A., Chudakov D. M., Lukyanov S. and Verkhusha V. V. (2005). Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. Nat Rev Mol Cell Biol 6 (11), 885-891.

65. Mas P., Devlin P. F., Panda S. and Kay S. A. (2000). Functional interaction of phytochrome B and cryptochrome 2. Nature 408 (6809), 207-211.

66. McKinney S. A., Murphy C. S., Hazelwood K. L., Davidson M. W. and Looger L. L. (2009). A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat Methods 6 (2), 131-133.

67. Mishto M., Santoro A., Bellavista E., Bonafe M., Monti D. and Franceschi C. (2003). Immunoproteasomes and immunosenescence. Ageing Res Rev 2 (4), 419-432.

68. Miyawaki A., Llopis J., Heim R, McCaffery J. M., Adams J. A., Ikura M. and Tsien R. Y. (1997). Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature 388 (6645), 882-887.

69. Mizuno H., Mai T. K, Tong K. I., Ando R, Furuta T., Ikura M. and Miyawaki A. (2003). Photo-induced peptide cleavage in the green-to-red conversion of a fluorescent protein. Mol Cell 12 (4), 10511058.

70. Murakami Y., Matsufuji S., Hayashi S., Tanahashi N. and Tanaka K. (2000). Degradation of ornithine decarboxylase by the 26S proteasome. Biochem Biophys Res Commun 267 (1), 1-6.

71. Nienhaus K, Nienhaus G. U., Wiedenmann J. and Nar H. (2005). Structural basis for photo-induced protein cleavage and green-to-red conversion of fluorescent protein EosFP. Proc Natl Acad Sci U S A 102 (26), 9156-9159.

72. Ortega J., Heymann J. B., Kajava A. V., Ustrell V., Rechsteiner M. and Steven A. C. (2005). The axial channel of the 20S proteasome opens upon binding of the PA200 activator. J Mol Biol 346 (5), 1221-1227.

73. Ozkaynak E., Finley D., Solomon M. J. and Varshavsky A. (1987). The yeast ubiquitin genes: a family of natural gene fusions. EMBO J 6 (5), 1429-1439.

74. Passmore L. A. and Barford D. (2004). Getting into position: the catalytic mechanisms of protein ubiquitylation. Biochem J 379 (Pt 3), 513-525.

75. Patterson G., Davidson M., Manley S. and Lippincott-Schwartz J. Superresolution Imaging using Single-Molecule Localization. Annu Rev Phys Chem

76. Patterson G. H. and Lippincott-Schwartz J. (2002). A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science 297 (5588), 1873-1877.

77. Phair R. D. and Misteli T. (2001). Kinetic modelling approaches to in vivo imaging. Nat Rev Mol Cell Biol 2 (12), 898-907.

78. Pickart C. M. (2001). Mechanisms underlying ubiquitination. Annu Rev Biochem 70 503-533.

79. Pickart C. M. and Cohen R. E. (2004). Proteasomes and their kin: proteases in the machine age. Nat Rev Mol Cell Biol 5 (3), 177-187.

80. Prasher D. C., Eckenrode V. K., Ward W. W., Prendergast F. G. and Cormier M. J. (1992). Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111 (2), 229-233.

81. Quillin M. L., Anstrom D. M., Shu X., O'Leaiy S., Kallio K., Chudakov D. M. and Remington S. J. (2005). Kindling fluorescent protein from Anemonia sulcata: dark-state structure at 1.38 A resolution. Biochemistry 44 (15), 5774-5787.

82. Rechsteiner M. and Rogers S. W. (1996). PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci 21 (7), 267-271.

83. Reinstein E., Scheffner M., Oren M., Ciechanover A. and Schwartz A. (2000). Degradation of the E7 human papillomavirus oncoprotein by the ubiquitin-proteasome system: targeting via ubiquitination of the N-terminal residue. Oncogene 19 (51), 5944-5950.

84. Rivett A. J., Palmer A. and Knecht E. (1992). Electron microscopic localization of the multicatalytic proteinase complex in rat liver and in cultured cells. J Histochem Cytochem 40 (8), 11651172.

85. Rogers S., Wells R. and Rechsteiner M. (1986). Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 234 (4774), 364-368.

86. Sakaue-Sawano A., Kurokawa H., Morimura T., Hanyu A., Hama H., Osawa H., Kashiwagi S., Fukami K., Miyata T., Miyoshi H. et al. (2008). Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell 132 (3), 487-498.

87. Shah K., Gadella T. W, Jr., van Erp H., Hecht V. and de Vries S. C. (2001). Subcellular localization and oligomerization of the Arabidopsis thaliana somatic embryogenesis receptor kinase 1 protein. J Mol Biol 309 (3), 641-655.

88. Shaner N. C., Campbell R. E., Steinbach P. A., Giepmans B. N., Palmer A. E. and Tsien R. Y. (2004). Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol 22 (12), 1567-1572.

89. Shaner N. C., Lin M. Z., McKeown M. R., Steinbach P. A., Hazelwood K. L., Davidson M. W. and Tsien R. Y. (2008). Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods 5 (6), 545-551.

90. Shaner N. C., Patterson G. H. and Davidson M. W. (2007). Advances in fluorescent protein technology. J Cell Sci 120 (Pt 24), 4247-4260.

91. Shimomura O., Johnson F. H. and Saiga Y. (1962). Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol 59 223-239.

92. Sorkin A., McClure M., Huang F. and Carter R. (2000). Interaction of EGF receptor and grb2 in living cells visualized by fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy. Curr Biol 10 (21), 1395-1398.

93. Spencer M. L., Theodosiou M. and Noonan D. J. (2004). NPDC-1, a novel regulator of neuronal proliferation, is degraded by the ubiquitin/proteasome system through a PEST degradation motif. J Biol Chem 279 (35), 37069-37078.

94. Spriet C., Trinel D., Riquet F., Vandenbunder B., Usson Y. and Heliot L. (2008). Enhanced FRET contrast in lifetime imaging. Cytometry A 73 (8), 745-753.

95. Subach F. V., Patterson G. H., Manley S., Gillette J. M., Lippincott-Schwartz J. and Verkhusha V. V. (2009). Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nat Methods 6 (2), 153-159.

96. Toth C. and Coffino P. (1999). Regulated degradation of yeast ornithine decarboxylase. J Biol Chem 274 (36), 25921-25926.

97. Tretyakova Y. A., Pakhomov A. A. and Martynov V. I. (2007). Chromophore structure of the kindling fluorescent protein asFP595 from Anemonia sulcata. J Am Chem Soc 129 (25), 7748-7749.

98. Tsien R. Y. (1998). The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem 67 509-544.

99. Tsutsui H., Karasawa S., Shimizu H., Nukina N. and Miyawaki A. (2005). Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter. EMBO Rep 6 (3), 233-238.

100. Tsutsui H., Shimizu H., Mizuno H., Nukina N., Furuta T. and Miyawaki A. (2009). The El mechanism in photo-induced beta-elimination reactions for green-to-red conversion of fluorescent proteins. Chem Biol 16 (11), 1140-1147.

101. Ustrell V., Hoffman L., Pratt G. and Rechsteiner M. (2002). PA200, a nuclear proteasome activator involved in DNA repair. EMBO J 21 (13), 3516-3525.

102. Varshavsky A. (2003). The N-end rule and regulation of apoptosis. Nat Cell Biol 5 (5), 373-376.

103. Varshavsky A. (2005). Regulated protein degradation. Trends Biochem Sci 30 (6), 283-286.

104. Verkhusha V. V. and Sorkin A. (2005). Conversion of the monomeric red fluorescent protein into a photoactivatable probe. Chem Biol 12 (3), 279-285.

105. Wang Y., Shyy J. Y. and Chien S. (2008). Fluorescence proteins, live-cell imaging, and mechanobiology: seeing is believing. Annu Rev Biomed Eng 10 1-38.

106. Weiss M. (2004). Challenges and artifacts in quantitative photobleaching experiments. Traffic 5 (9), 662-671.

107. Weissman A. M. (2001). Themes and variations on ubiquitylation. Nat Rev Mol Cell Biol 2 (3), 169-178.

108. Willoughby D. and Cooper D. M. (2008). Live-cell imaging of cAMP dynamics. Nat Methods 5 (1), 29-36.

109. Wilmann P. G., Turcic K., Battad J. M., Wilce M. C., Devenish R. J., Prescott M. and Rossjohn J. (2006). The 1.7 A crystal structure of Dronpa: a photoswitchable green fluorescent protein. J Mol Biol 364 (2), 213-224.

110. Wolf D. H. and Hilt W. (2004). The proteasome: a proteolytic nanomachine of cell regulation and waste disposal. Biochim Biophys Acta 1695 (1-3), 19-31.

111. Yamano H., Gannon J. and Hunt T. (1996). The role of proteolysis in cell cycle progression in Schizosaccharomyces pombe. EMBO J 15 (19), 5268-5279.

112. Yamazaki T., Zaal K., Hailey D., Presley J., Lippincott-Schwartz J. and Samelson L. E. (2002). Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization. J Cell Sci 115 (Pt 9), 1791-1802.

113. Yang Y. (2003). Generation of major histocompatibility complex class I antigens. Microbes Infect 5 (1), 39-47.

114. Zaccolo M. (2004). Use of chimeric fluorescent proteins and fluorescence resonance energy transfer to monitor cellular responses. Circ Res 94 (7), 866-873.

115. Zacharias D. A., Violin J. D., Newton A. C. and Tsien R. Y. (2002). Partitioning of lipid-modifled monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science 296 (5569), 913-916.

116. Zhang M., MacDonald A. I., Hoyt M. A. and Coffino P. (2004). Proteasomes begin ornithine decarboxylase digestion at the С terminus. J Biol Chem 279 (20), 20959-20965.

117. Zhou P. (2004). Determining protein half-lives. Methods Mol Biol 284 67-77.

118. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов B.JI. (2002). Протеасома: разрушать, чтобы жить. Молекуляр. биология, т.36. № 5. с. 761-776.

119. Зубова Н.Н., Савицкий А.П (2005). Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцентных белков. Сенсоры рН, ионов СГ, Са2+, Zn2+, Cu2+. Успехи биологической химии, т.45, с. 391-454.

120. Пахомов, Н. Мартынов, Гурская, Балашов, В. Мартынов (2004). Фотопревращение хромофора флуоресцентного белка из Dendronephthya sp. Биохимия, т. 69, с. 1108-1117.

121. Феофанов А. В. (2007). Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях. Успехи биологической химии, т. 47, с. 371^110.