Фотоконверсия окрашенных белков из коралловых полипов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Чудаков, Дмитрий Михайлович

• Чудаков, Дмитрий Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чудаков, Дмитрий Михайлович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Флуоресцентные и окрашенные GFP-подобные белки кишечнополостных

1.2. Использование GFP-подобных белков для изучения подвижности клеток, клеточных белков и органелл

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Механизм фотоактивации флуоресценции белка asulCP

2.2. Применение фотоактивируемых флуоресцентных белков в биотехнологии

2.3. Обсуждение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фотоконверсия окрашенных белков из коралловых полипов»

Клонирование гена зеленого флуоресцентного белка (green fluorescent protein - GFP) в 1992 году не только позволило осуществлять флуоресцентное мечение клеток, органелл и белков in vivo, но и положило начало целой области исследований, связанной с GFP и многими близкими к нему белками, гены которых были клонированы позднее. Сегодня можно очертить эту область перечислением следующих основных направлений:

Изучение строения GFP и GFP-подобных белков. Расшифровка хромофоров различных GFP-подобных белков и механизмов автокаталитического формирования этих хромофоров. Изучение различий в микроокружении хромофоров, определяющих спектр поглощения, коэффициент молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции белка. Исследование функции (или, что вероятнее, множества функций) GFP и GFP-подобных белков в организмах классов Hydrozoa и Anthozoa. Поиск GFP-подобных белков в других таксономических группах. Эволюционные построения на основании различий в GFP-подобных белках разных групп.

Наконец, к этой же области можно отнести и разработку биотехнологических инструментов, позволяющих осуществлять многоцветное флуоресцентное мечение, регистрировать скорость перемещения и взаимодействие белков, отслеживать перемещение органелл и клеток, измерять по изменениям флуоресцентных свойств такие параметры как рН, мембранный потенциал, концентрация ионов Са2+ и многое другое. Широкий арсенал таких инструментов уже разработан сегодня на основе свойств флуоресценции, обесцвечивания и фотоконверсии GFP-подобных белков, а также резонансного переноса энергии между GFP-подобными белками, и сегодня это направление продолжает интенсивно развиваться. Эти инструменты необходимы в различных биологических и медицинских исследованиях, и в перспективе могут также найти свои применения в практической медицине.

Целью данной работы было изучение механизмов, лежащих в основе явления обратимой фотоактивации флуоресценции GFP-подобного белка asulCP, который определяет окраску кончиков щупальцев кораллового полипа Anemonia sulcata. Этот нефлуоресцентный окрашенный белок (хромобелок) при облучении интенсивным зеленым светом претерпевает обратимую фотоконверсию, в результате которой значительно (более чем в 70 раз) возрастает яркость флуоресценции белка. В течение нескольких минут после фотоактивации, белок возвращается к нефлуоресцентному состоянию, или же может быть мгновенно фотоинактивирован облучением синим светом.

В ходе работы были изучены свойства природного белка, а также свойства полученных мутантных белков asulCP, содержащих аминокислотные замены в выбранных позициях из микроокружения хромофора.

Свойства полученных мутантов, в совокупности с анализом микроокружения хромофора в GFP-подобных белках, позволили предложить модель фотоактивации флуоресценции, согласно которой хромофор asulCP исходно цис-транс изомеризован относительно известного хромофора GFP, и претерпевает транс-цис изомеризацию в ходе фотоактивации флуоресценции, и цис-транс изомеризацию в ходе фотоинактивации или релаксации фотоактивированного белка. Для подтверждения предложенной модели была также проведена работа по переносу свойства фотоактивации на GFP-подобные нефлуоресцентные окрашенные белки (хромобелки) коралловых полипов hcriCP и cgigCP.

Большинство полученных мутантных фотоактивируемых белков проявили способность к необратимой фотоактивации при облучении фотоактивирующим светом большой интенсивности. Во второй части работы, один из наиболее контрастных фотоактивируемых мутантных вариантов asulCP был использован в экспериментах in vivo, в качестве фотоактивируемого флуоресцентного маркера для прицельного фотомечения клеток в развивающемся эмбрионе шпорцевой лягушки Xenopus laevis, и митохондрий в эукариотической клетке. В эукариотической клетке была также отслежена диффузия фотоактивированного белка.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Чудаков, Дмитрий Михайлович

выводы

1. С помощью направленного мутагенеза аминокислотных остатков в окружении хромофора белка asulCP сконструирован ряд мутантных белков, обладающих широким спектром свойств: способных и не способных к фотоактивации и фотоинактивации, исходно флуоресцентных и не флуоресцентных, интенсивно и слабо окрашенных.

2. На основании свойств полученных мутантных белков была предложена модель, объясняющая эффект обратимой фотоактивации флуоресценции asulCP транс-цис изомеризацией хромофора. Предложенная модель подтверждена переносом свойств фотоактивации и фотоинактивации флуоресценции на нефотоактивируемые, нефлуоресцентные хромобелки коралловых полипов hcriCP и cgigCP.

3. Согласно полученным данным, два состояния хромофора - конфигурации * Z и Е - присущи GFP-подобным флуоресцентным белкам и хромобелкам соответственно. Таким образом, различия между двумя этими группами сводятся к микроокружению и конфигурации хромофора.

4. Было охарактеризовано новое явление необратимой фотоактивации флуоресценции мутантных фотоактивируемых белков при облучении активирующим светом высокой интенсивности.

5. Разработанные нами фотоактивируемые флуоресцентные белки открывают новые возможности для прицельного фотомечения клеток, органелл и белков in vivo. Эти возможности мы продемонстрировали в экспериментах по слежению за перемещением клеток в живых тканях, перемещением митохондрий и диффузией белка в эукариотической клетке.

2.4. Заключение

В работе были исследованы спектроскопические свойства природного фотоактивируемого белка asulCP, а также полученных мутантов этого белка, микроокружение хромофора в которых было изменено. Также был проведен сравнительный анализ микроокружения хромофора в GFP-подобных флуоресцентных белках и хромобелках.

По совокупности полученных данных, стало возможным сформулировать модель фотоактивации флуоресценции белка. Согласно предложенной модели, хромофор asulCP исходно цис-транс изомеризован относительно его состояния, известного для флуоресцентных белков GFP и DsRed. Фотоактивация связана с изомеризацией возбужденного хромофора, в результате которой хромофор восстанавливает состояние, известное для флуоресцентных белков. Основываясь на предложенной модели, мы успешно перенесли свойство фотоактивации на два нефлуоресцентных, нефотоактивируемых хромобелка, тем самым в значительной степени подтвердив её справедливость.

Обобщая полученные результаты, мы также предположили, что два состояния хромофора - изомеры Z и Е - присущи соответственно GFP-подобным флуоресцентным белкам и хромобелкам. Уже в ходе написания настоящей работы, это предположение также в значительной степени подтвердилось - впервые были опубликованы данные о трехмерной структуре хромобелка (Prescott et al., 2003) и показано, что в хромобелке хромофор действительно цис-транс изомеризован относительно его состояния в белках GFP и DsRed.

В ходе работы была получена группа фотоактивируемых маркеров, имеющих большой потенциал применения в биотехнологии. Появление этого инструмента позволяет прицельно фотоактивировать флуоресцентный сигнал в клетках живых тканей и в пределах живой клетки. Возможности ФАФБ в биотехнологических применениях мы показали на примерах слежения за перемещением клеток в развивающемся эмбрионе шпорцевой лягушки Xenopus laevis, а также на примерах слежения за перемещением митохондрий в живой клетке и за диффузией белка.

Достигнутое понимание механизмов, стоящих за явлением фотоактивации флуоресценции, позволяет в ближайшей перспективе использовать полученные данные для целенаправленной разработки ФАФБ с заданными свойствами.

В заключение хочется поблагодарить всех сотрудников лаборатории Генов регенерации ИБХ РАН, а особенно Дмитрия Староверова, Аркадия Фрадкова, Надежду Гурскую, Катю Барсову, Юрия Янушевича, Севу Белоусова, Марию Булину, заведующего лабораторией Сергея Лукьянова и, главным образом, научного руководителя Константина Лукьянова за обучение, помощь и всестороннюю поддержку во всем.

Существенную помощь в работе оказали: зав. группой Молекулярных основ эмбриогенеза Андрей Григорьевич Зарайский и его сотрудник Владимир Новоселов (ИБХ), зав. лаб. Спектрального анализа Алексей Валерьевич Феофанов и его сотрудники (ИБХ), зав. лаб. Структуры и функции митохондрий Дмитрий Борисович Зоров (Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ).

Отдельно хочется поблагодарить Михаила Матца, а также Юлия Александровича Лабаса - за консультации и полезные беседы по теме диссертации.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы и оборудование Оборудование

Центрифуга CentraMP4R (IEC, США); настольные центрифуги Micromax (IEC, США), MiniSpin (Eppendorf, Германия); водяные термостаты: Г8 (MLW, Венгрия); термостатируемый шейкер Orbit (lab-line, США); шейкер Shaker S3 (ELMI, Россия); ламинарный шкаф (FluFrance, Франция); сушильный шкаф КС-65 (СССР); лабораторный рН-метр ОР-211/1 (Radelkis, Венгрия), источники питания постоянного тока: Macrodrive 15 (LKB, Швеция), PS500X (HSI, США), EPS250 (C.B.S., США), EPS500/400 (Pharmacia, Швеция); приборы для горизонтального гель-электрофореза: GNA-200, Hoefer НЕЗЗ (Pharmacia, Швеция), Minicell ЕС370М (Е-С Apparatus Corp., США); весы: WA33 (Польша), 33/200 (Chirana, Чехословакия), JP2-300 (Anselma-Industrie, Германия); автоматические пипетки (Gilson, Франция); УФ-трансиллюминатор TF-20M (Франция); амплификаторы: DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer Cetus, США), Omnigene (Hybaid, США), PTC-100 Thermal Cycler (MJ Research, США), Mastercycler gradient (Eppendorf,

Германия); анализатор изображения Alpha Imager 2000 (Alpha Innotech Inc., США); автоматический секвенатор CEQ2000 (Beckman, США); предметные и покровные стекла Super Frost Plus (Menzel-Glaser, Германия); предметные стекла с лунками (GEM, Россия); бинокулярный стереомикроскоп SZX12 (Olympus, Япония); световой микроскоп с фотонасадкой Optiphot (Nikon, Япония).

Реактивы

Использовали следующие реактивы отечественного производства (квалификация "хч" и "осч"): мочевину, этиловый спирт, уксусную кислоту, изоамиловый спирт, перегнанный один раз фенол квалификации "чда", медицинский хлороформ, бутанол-1, парафин, ацетат натрия, ацетон.

В работе использовали следующие импортные реактивы: 2'-дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты, p-меркаптоэтанол, бычий сывороточный альбумин (Bio-Rad, США); агароза, бромфеноловый синий, трис-гидроксилметиламинометан (Трис), дитиотрейтол (ДТТ), динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), бромистый этидий, бакто-агар, бакто-триптон, дрожжевой экстракт (Difco, США);

•

В работе были использованы следующие ферментные препараты: смесь термостабильных ДНК полимераз Advantage Mix (Clontech Lab. Inc, США). Эндонуклеазы рестрикции, ДНК- лигаза фага Т4 (Boehringer Manheim, ФРГ).

Буферные растворы

Буфер "ТЕ" (для растворения и хранения препаратов ДНЮ: 10 мМ Трис-HCl (рН 8.0); 0,1 мМ EDTA.

Буфер "ТАЕ"(для электрофореза ДНК в агарозном геле): 50 мМ Трис-ацетат (рН 8.0); 20 мМ ацетат натрия;

2 мМ EDTA.

Буфер PBS (Phosphate buffered saline): 120 мМ NaCl; 7 мМ Na2HP04;

3 мМ NaH2P04; 2,7 мМ КС1

Микробиологические среды

Среда "LB" (для выращивания клеток E.coli):

1% триптон; 0.5% дрожжевой экстракт; 0,1% NaCl; 0,01 мМ Трис-HCl (рН 8.0).

Среду автоклавировали 45 мин. при 1 атм. и хранили при комнатной температуре. При необходимости добавляли ампициллин до концентрации 100 мкг/мл.

LB-arap"- перед автоклавированием в среду дополнительно добавлен агар (Difco) до концентрации 1.5 %.

3.2. Методы исследования Амплификация ДНК

На стадиях направленного мутагенеза, клонирования и тестирования полученных конструкций применяли стандартную ПЦР, с использованием смеси полимераз Advantage Mix (Clontech). Амплификацию проводили на приборе РТС-100 Thermal Cycler (MJ Reserch). Продукты амплификации анализировали в 1.5% агарозном геле, содержавшем 0.5 мкг/мл бромистого этидия.

Мутагенез

Сайт-направленный мутагенез проводили с использованием технологии «пересхлопывания» продуктов ПЦР, используя праймеры, содержащие соответствующие точечные замены, однозначные либо вырожденные, согласно методике, описанной подробно в Но et al., 1989. Также проводили случайный мутагенез с использованием набора для случайного мутагенеза (Clontech).

Клонирование, наработка и очистка белков

Для гетерологической экспрессии как дикого типа белка asulCP, так и мутантных белков, полноразмерные кодирующие участки клонировали в экспрессионный вектор pQE30 (Qiagen), содержащий 6 кодонов гистидинов в той же рамке считывания, на 5'-конце гена. Полученные конструкции трансформировали в компетентные клетки E.coli (штаммы ТОРО 10 и XL1 Blue) методом теплового шока (Sambrook et al., 1989) и экспрессировали, получая интересующие белки, содержащие N-концевой олигогистидиновый участок. Для дальнейшего исследования белки очищали с использованием металл-афинной смолы TALON (Clontech).

Трансформация компетентных клеток Е. coli

К 50 мкл компетентных клеток, предварительно размороженных на льду в течение 30 минут, добавляли 5 мкл лигазной смеси. Инкубировали на льду в течение 40 минут, затем проводили тепловой шок при +42°С в течение 45 сек., после чего помещали пробирку снова в лед на 10 минут. Добавляли 3 объема среды "LB" без антибиотика и инкубировали при 37°С в воздушном термостатируемом шейкере при 150 об/мин. в течение одного часа. Затем клетки высевали на чашку Петри с 1,5% бактоагаром на среде "LB", содержащую 100 мкг/мл ампициллина. Чашки помещали в термостат при 37°С на ночь.

Аналитическое и препаративное выделение плазмидной ДНК

Клетки E.coli для аналитического выделения плазмидной ДНК выращивали в 5 мл среды LB с ампициллином до стационарной фазы при 37°С. Клетки осаждали центрифугированием, и плазмидную ДНК выделяли следующим методом. Клетки суспендировали в 200 мкл раствора, содержащего 50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис-HCl рН 8.0 и 4 мг/мл раствора лизоцима, выдерживали 5 мин. при комнатной температуре. Пробирки опускали в лед и раскапывали по 400 мкл раствора, содержащего 0,2 н. NaOH и 1% SDS, после перемешивания выдерживали во льду 5 мин. и добавляли 300 мкл раствора раствора ацетата калия и держали во льду еще 5 мин. Центрифугировали 10 мин. при 14000 об/мин. Надосадочную жидкость переносили в новые пробирки. ДНК высаживали центрифугированием в течение 10 мин. при 14000 об/мин. после добавления 180 мкл изопропанола. Осадок ДНК дважды промывали 80% этанолом, сушили и растворяли в 50-60 мкл буфера "ТЕ". Препаративное выделение осуществляли аналогично, выращивая клетки в 100-200 мл "LB".

Определение нуклеотидной последовательности ДНК

Нуклеотидные последовательности ДНК были определены с помощью автоматического секвенатора CEQ 2000 DNA Analysis (Beckman). Использовали праймеры к плазмиде pQE30, позволяющие с двух встречных направлений уверенно прочесть участок в 700 н.п., содержащий ген мутантного белка. Сиквенсы были проанализированы с использованием програмного обеспечения Blast. Множественное выравнивание было осуществлено при помощи пакета программ Clustal X с последующей оптимизацией.

Первичная оценка поведения мутантных белков

Колонии бактерий Е. coli, экспрессирующих мутантные белки, наблюдали во флуоресцентном микроскопе Nikon Optiphot и флуоресцентном стереомикроскопе Olympus US SZX12. Фотографии были сделаны с использованием фотокамеры Olympus DP50.

Спектроскопия

Спектры поглощения были сняты с использованием спектрофотометра Beckman DU520 UV/VIS. Флуоресцентный спектрофотометр Varian Сагу Eclipse использовали для измерения спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции, а также в качестве источника света для определения спектров действия света, фотоинактивирующего флуоресценцию мутанта asulCP-A148G и фотоактивирующего флуоресценцию мутанта hcriCP-N165A. Использовали также следующие внешние источники света:

-458 нм (линия Аг лазера), 430-490 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа), 460-490 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа), 514 нм (линия Аг лазера), 532 нм (линия Nd лазера), 543 нм (линия HeNe лазера), 546+/-14 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа) - в качестве источников света для определения оптимумов фотоактивации и фотоинактивации белка asulCP;

- 430-490 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа), 460-490 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа) - в качестве источников света для фотоинактивации белка asulCP и мутантных форм asulCP, а также в качестве источника света для фотоактивации мутантных белков hcriCP-N165G и hcriCP-N165A.

-532 нм (линия Nd лазера), 546+/-14 нм (фильтры флуоресцентного микроскопа) - в качестве источников света для фотоактивации белка asulCP, его мутантных форм, а также для тех мутантных белков cgigCP и hcriCP, которые оказались способны к фотоактивации при облучении зеленым светом.

Выбор оптимального фотоактивируемого мутанта

Первичную оценку спектроскопических свойств мутантных белков проводили скринированием колоний бактерий Е. coli, экспрессирующих мутантные белки, с использованием флуоресцентного микроскопа Nikon Optiphot (FITC и TRITC фильтры). Для необратимой фотоактивации и наблюдения разожженного сигнала использовали 20-кратный и 5-кратный объективы соответственно. Выбирали наиболее контрастные и яркие варианты ФАФБ.

Измерение кинетики фотоактивации и релаксации

Белки, содержащие на N-конце последовательность из шести гиситидинов, нарабатывали в бактериях Е. coli и очищали с использованием метал-афинной смолы TALON (Clontech). Кинетика релаксации (рис. 2.2.1.А,В)> так же как и спектры флуоресценции (рис. 2.2.1.С) были измерены с использованием флуоресцентного спектрофотометра Varian Сагу Eclipse. К образцу очищенного белка asulCP либо ФАФБ1 при измерениии кинетик добавляли легкоплавкую агарозу (до концентрации 0.5%), для предотвращения неравномерного перемешивания пробы во время снятия кинетики - такое перемешивание приводило к артефактным локальным скачкам в измеряемой яркости флуоресценции образца. Внешний Nd лазер (532 нм, 100 мВ) использовали в качестве источника света для обратимой фотоактивации (1% мощности — около 1 ватт/см , 2 минтуты облучения) и для необратимой фотоактивации (20% мощности - около 20 ватт/см2, 20 минут облучения) пробы белка.

Фотомечение клеток Xenopus laevis и слежение за их перемещением ФАФБ1 кДНК клонировали в плазмиду р35Т. Полученную конструкцию рестрицировали ферментом ЕсоШ. Синтетическую мРНК транскрибировали по стандартному протоколу с использованием набора SP6 Message Machine (Ambion). мРНК очищали по стандартному протоколу на колонках RNeasy (Qiagen) и микроинъецировали в эмбрионы (1 нг на бластомер). Стадии эмбриона устанавливали по таблице, опубликованной в книге Nieuwkoop and Faber, 1967. ФАФБ1 разжигали в течение 15 минут с использованием TRITC филльтров на микроскопе Polyvar (Reihert-Jung), через 40-кратный объектив с частично закрытой диафрагмой. Эмбрион фотографировали на флуоресцентном микроскопе Leica MZIII, с использованием TRITC фильтров.

Фотомечение митохондрий и отслеживание их перемещения

ФАФБ1 кДНК клонировали взамен кДНК белка ECFP в вектор pECFP-Mito (Clontech), содержащий сигнал митохондриальной локализации, полученнный из предшественника субъединицы VIII цитохром С оксидазы человека. Клеточную линию PC-12 трансфецировали по стандартному протоколу полученной конструкцией с использованием набора для кальциево-фосфатной трансфекции (Gibco). Конфокальный флуоресцентный микроскоп Carl Zeiss Confocal Laser Scanning Microscope LSM 510 (Zeiss) использовали для фотоактивации, фотоинактивации, и отслеживания флуоресценции ФАФБ1. Линия HeNe лазера (543 нм, 1 мВ) была задействована в качестве источника света для обратимой фотоактивации (5% мощности), необратимой фотоакивации (30% мощности) и в качестве возбуждающего света наблюдаемой флуоресценции (1% мощности). Линия Аг лазера (458 нм, 40 мВ, 1% мощности) была использована в качестве источника фотоинактивирующего света.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чудаков, Дмитрий Михайлович, 2003 год

1. Верхуша В.В., Аковбян Н.А., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д., и Вржещ П.В. (2001) Кинетический анализ созревания и денатурации красного флуоресцентного белка DsRed. Биохимия (Москва), 66, 13421351.

2. Янушевич Ю.Г., Булина М.Е., Гурская Н.Г., Савицкий А.П., и Лукьянов К.А. (2002) Выявление ключевых аминокислотных остатков, определяющих цвет зеленого и желтого флуоресцентных белков из кораллового полипа Zoanthus. Биоорганическая Химия, 28, 303-307.

3. Ando R., Наша Н., Yamamoto-Hino М., Mizuno Н., and Miyawaki А. (2002) An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, 12651-12656.

4. Baird G.S., Zacharias D.A., and Tsien R.Y. (1999) Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,96, 11241-11246.

5. Baird G.S., Zacharias D.A., and Tsien R.Y. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,97, 11984-11989.

6. Bulina M.E., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Chudakov D.M. and Lukyanov K.A. (2003) Heterooligomeric tagging diminishes non-specific aggregation of target proteins fused with Anthozoa fluorescent proteins. Biochem. J., 371, 109141.

7. Bulina M.E., Chudakov D.M., Mudrik N.N., and Lukyanov K.A. (2002) Interconversion of Anthozoa GFP-like fluorescent and non-fluorescent proteins by mutagenesis. BMC Biochem., 3:7 (online only).

8. Bokman S.H., and Ward W.W. (1981) Renaturation of Aequorea green-fluorescent protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 101, 1372-1380.

9. Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A., and Tsien R.Y. (2002) A monomeric red fluorescent protein. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, 7877-7882.

10. ChalfIe M. and Kain S. (1998) Preface. In Green fluorescent protein: properties, applications, and protocols, M. Chalfie, and S. Kain, eds. (New York: Wiley-Liss), vii-ix.

11. Chalfie ML, Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W., and Prasher D.C. (1994) Green fluorescent proteins as a marker for gene expression. Science, 263, 802-805.

12. Chattoraj M., King B.A., Bublitz G.U., and Boxer S.G. (1996) Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 93, 8362-8367.

13. Chudakov D.M., Feofanov A.V., Mudrik N.N., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. (2003) Chromophore environment provides clue to "kindling fluorescent protein" riddle. J. Biol. Chem., 278, 7215-7219.

14. Chudakov D.M., Belousov V.V., Zaraisky A.G., Novoselov V.V., Staroverov D.B., Zorov D.B., Lukyanov S., and Lukyanov K.A. (2003) Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. Nature Biotech. 21, 191194.

15. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G., and Ward W.W. (1993) Cheimcal structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green fluorescent protein. Biochemistry, 32, 1212-1218.

16. Condeelis J.S., Wyckoff J., Segall J.E. (2000) Imaging of cancer invasion and metastasis using green fluorescent protein. Eur. J. Cancer, 36, 1671-1680.

17. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. (1996) FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene, 173, 33-38.

18. Cormier M. J., Hori K., Karkhanis Y. D., Anderson J. M., Wampler J. E., Morin J. G., and Hastings J. W. (1973) Evidence for similar biochemical requirements for bioluminescence amoung the Coelenterates. J. Cell Physiol, 81, 291-298.

19. Cormier M.J., Hori K., and Anderson J.M. (1974) Bioluminescence in coelenterates. Biochim. Biophys. Acta, 364, 137-164.

20. Cubitt A.B., Heim R., Adams S.R., Boyd A.E., Gross L.A., Tsien R.Y. (1995) Understanding, improving and using green fluorescent proteins. Trends Biochem. Sci., 20,448-455.

21. Davenport D., Nicol J.A.C. (1955) Luminescence in hydromedusae Proc. R. Soc. London, Ser. В., 144, 399-411.

22. Delagrave S., Hawtin R.E., Silva C.M, Yang M.M., and Youvan D.C. (1995) Red-shifted Excitation Mutants of the Green Fluorescent Protein, Bio Technology, 13,151-154.

23. Dunn G.A., Dobbie I.M., Monypenny J., Holt M.R., Zicha D. (2002) Fluorescence localization after photobleaching (FLAP): a new method for studying protein dynamics in living cells. J. Microsc. Jan., 205, 109-112.

24. Dove S.G., Hoegh-Guldberg O., Ranganathan S. (2001) Major colour patterns of reef-building corals are due to a family of GFP-like proteins. Coral Reefs, 19, 197-204.

25. Dopf J., Horiagon T.M. (1996) Deletion mapping of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Gene, 173, 39-44.

26. Elowitz M.B., Surette M.G., Wolf P.E., Stock J., and Leibler S. (1997) Photoactivation turns green fluorescent protein red. Curr. Biol. Oct., 7, 809812.

27. Elowitz M.B., Surette M.G., Wolf P.E., Stock J.B., and Leibler S. (1999) Protein mobility in the cytoplasm of Escherichia coli. J. Bacteriol., 181, 197203.

28. Elsliger M.A., Wachter R.M., Hanson G.T., Kallio K., Remington S.J. (1999) Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. Biochemistry, 38, 5296-5301.

29. Fradkov A.F., Chen Y., Ding L., Barsova E.V., Matz M.V., and Lukyanov S.A. (2000) Novel fluorescent protein from Discosoma coral and its mutants possesses a unique far-red fluorescence. FEBSLett., 18, 127-130.

30. Fradkov A.F., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Bulina M.E., Yanushevich Y.G., Martynov V.I., Lukyanov S., and Lukyanov K.A. (2002) Far-red fluorescent tag for protein labelling. Biochem. J., 368, 17-21.

31. Gaietta G., Deerinck T.J., Adams S.R., Bouwer J., Tour O., Laird D.W., Sosinsky G.E., Tsien R.Y., and Ellisman M.H. (2002) Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking. Science, 19, 503-507.

32. Garcia-Parajo M.F., Koopman M., van Dijk E.M., Subramaniam V., and van Hulst N.F. (2001) The nature of fluorescence emission in the red fluorescent protein DsRed, revealed by single-molecule detection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 14392-14397.

33. Gavin P., Devenish R.J., and Prescott M. (2002) An approach for reducing unwanted oligomerisation of DsRed fusion proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun., 298,707-713.

34. Gross L.A., Baird G.S., Hoffman R.C., Baldridge K.K., and Tsien R.Y. (2000) The structure of the chromophore within DsRed, a red fluorescent protein from coral. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,11990-11995.

35. Gurskaya N.G., Fradkov A.F., Terskikh A., Matz M.V., Labas Y.A., Martynov V.I., Yanushevich Y.G., Lukyanov K.A., and Lukyanov S.A. (2001a) GFP-like chromoproteins as a source of far-red fluorescent proteins. FEBS Lett., 507, 1620.

36. Gurskaya N.G., Savitsky A.P., Yanushevich Y.G., Lukyanov S.A., and Lukyanov K.A. (2001b) Color transitions in coral's fluorescent proteins by site-directed mutagenesis. BMC Biochem., 2:6 (online only).

37. Hastings, J. W., and Morin, J. G. (1969) Comparative biochemistry of calcium-activated photoproteins from the Ctenophore, Mnemiopsis and the coelenterates Aequorea, Obelia, Pelagia and Renilla. Biol. Bull., 137, 402.

38. He X., Bell A.F., and Tonge P J. (2002) Synthesis and spectroscopic studies of model red fluorescent protein chromophores. Org. Lett., 4, 1523-1526.

39. Heikal A.A., Hess S.T., Baird S.G., Tsien R.Y., and Webb W.W. (2000) Molecular spectroscopy and dynamics of intrinsically fluorescent proteins:105coral red (dsRed) and yellow (Citrine). Proc. Natl Acad. Sci. USA, 97, 1199612001.

40. Heim R., Prasher D.C., and Tsien R.Y. (1994) Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 12501-12504.

41. Heim R., Cubitt A.B., and Tsien R.Y. (1995) Improved green fluorescence (letter). Nature, 373, 663-664.

42. Heim R., and Tsien R.Y. (1996) Engineering green fluorescent protein for improved brightness, longer wavelengths and fluorescence resonance energy transfer. Curr. Biol., 6, 178-182.

43. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K., and Pease L.R. (1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene, 11, 51-59.

44. Kahana J. and Silver P. (1996) Current Protocols in Molecular Biology, Ausabel F. et al., Editors. Green and Wiley: NY. p. 9.7.22-9.7-28.

45. Keller R., Davidson L., Edlund A., Elul Т., Ezin M., Shook D., and Skoglund P. (2000) Mechanisms of convergence and extension by cell intercalation. Philos. Trans. R. Soc. Lond. В Biol. Sci., 355, 897-922.

46. Labas Y.A., Gurskaya N.G., Yanushevich Y.G., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Lukyanov S.A. and Matz M.V. (2002) Diversity and evolution of the green fluorescent protein family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 4256-4261.

47. Lauf U, Lopez P, and Falk M.M. (2001) Expression of fluorescently tagged connexins: a novel approach to rescue function of oligomeric DsRed-tagged proteins. FEBSLett., 498, 11-15.

48. Lippincott-Schwartz, J., Snapp, E., and Kenworthy, A. (2001) Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 2, 444-456.

49. Llopis J, McCaffery J.M., Miyawaki A., Farquhar M.G., and Tsien R.Y. (1998) Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 95, 6803-6808.

50. Marchant J.S., Stutzmann G.E., Leissring M.A., LaFerla F.M., and Parker I.2001) Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19, 645-649.

51. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., and Lukyanov S.A. (1999) Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. Nature Biotech, 17, 969-973.

52. Matz M.V., Lukyanov K.A., and Lukyanov S.A. (2002) Family of the green fluorescent protein: Journey to the end of the rainbow. Bioessays, 24, 953-959.

53. McAnaney T.B., Park E.S., Hanson G.T., Remington S.J., and Boxer S.G.2002) Green Fluorescent Protein Variants as Ratiometric Dual Emission pH Sensors. 2. Excited-State Dynamics. Biochemistry, 41, 15489-15494.

54. Miesenbock G., De Angelis D.A., and Rothman J.E. (1998) Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature, 394, 192-195.

55. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M., and Tsien R.Y. (1997) Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature, 28, 882-887.

56. Mizuno H., Sawano A., Eli P., Hama H., and Miyawaki A. (2001) Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. Biochemistry, 40, 2502-2510.

57. Morin J.G., and Hastings J.W. (1971a) Energy transfer in a bioluminescent system. J. Cell. Physiol., 77, 313-318.

58. Morin J.G., and Hastings J.W. (1971b). Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol. 77, 305-311.

59. Nagai Т., Sawano A., Park E.S., and Miyawaki A. (2001) Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 3197-3202.

60. Nieuwkoop P. D., and Faber J. (1967) Normal Table of Xenopus Iaevis (Daudin). North-Holland, Amsterdam.

61. Niwa H., Inouye S., Hirano Т., Matsuno Т., Kojima S., Kubota M., Ohashi M., and Tsuji F.I. (1997) Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 13617-22.

62. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., and Remington S.J. (1996) Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science, 273, 1392-1395.

63. Parish C. R. (1999) Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies. Immunol. Cell Biol., 77, 499-508.

64. Patterson G., Day R.N., and Piston D. (2001) Fluorescent protein spectra. J. Cell Sci., 114, 837-838.

65. Patterson G.H., Knobel S.M., Sharif W.D., Kain S.R., and Piston D.W. (1997) Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J., 73, 2782-2790.

66. Patterson G.H., and Lippincott-Schwartz J. (2002) A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science, 13, 1873-1877.

67. Perozzo M.A., Ward K.B., Thompson R.B., and Ward W.W. (1988) X-ray diffraction and time-resolved fluorescence analyses of Aequorea green fluorescent protein crystals. J. Biol. Chem., 263, 7713-7716.

68. Prescott M., Ling M., Beddoe Т., Oakley A.J., Dove S., Hoegh-Guldberg O., Devenish R.J., and Rossjohn J. (2003) The 2.2 a crystal structure of a pocilloporin pigment reveals a nonplanar chromophore conformation. Structure (Camb), 11,275-284.

69. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G., and Cormier M.J. (1992) Primary structure of the Aeqourea victoria green fluorescent protein. Gene, 111, 229-233.

70. Reits E.A., and Neefjes J.J. (2001) From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat. Cell Biol., 3, 145-147.

71. Remington S.J. (2000) Structural basis for understanding spectral variations in green fluorescent protein. Meth. Enzymol., 305, 196-211.

72. Salih A., Larkum A., Cox G., Kuhl M., and Hoegh-Guldberg O. (2000) Fluorescent pigments in corals are photoprotective. Nature, 408, 850-853.

73. Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

74. Sawin K.E., and Nurse P. (1997) Photoactivation of green fluorescent protein. Curr. Biol., 1, 606-607.

75. Shimomura O., Johnson F.H., and Saiga Y. (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Сотр. Physiol., 59, 223-239.

76. Shimomura O. (1979) Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein. FEBSLett., 104, 220-222.

77. Siegel M.S., Isacoff E.Y. (1997) A genetically encoded optical probe of membrane voltage. Neuron, 19, 735-741.

78. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A.V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I., and Siebert P. (2000) "Fluorescent Timer": Protein that changes color with time. Science, 290, 15851588.

79. Tsien R.Y. (1998) The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem., 67, 509544.

80. Tsien R., and Prasher D. (1998) Molecular Biology and Mutation of Green Fluorescent Protein. In Green fluorescent protein: properties, applications, and protocols. Chalfie M., and Kain, S. Eds., Wiley-Liss, New York, 97-118.

81. Vajkoczy P., Ullrich A., and Menger M. D. (2002) Intravital fluorescence videomicroscopy to study tumor angiogenesis and microcirculation. Neoplasia, 2, 53-61.

82. Vrzheshch P.V., Akovbian N.A., Varfolomeyev S.D. and Verkhusha V.V. (2000) Denaturation and partial renaturation of a tightly tetramerized DsRed protein under mildly acidic conditions. FEBS Lett., 487, 203-208.109

83. Wall M.A., Socolich M., and Ranganathan R. (2000) The structural basis for red fluorescence in the tetrameric GFP homolog DsRed. Nat. Struct. Biol., 7, 1133-1138.

84. Wampler J.E., Hori K., Lee J.W., and Cormier M.J. (1971). Structured bioluminescence. Two emitters during both the in vitro and the in vivo bioluminescence of the sea pansy, Renilla. Biochemistry, 10, 2903-2909.

85. Wampler J.E., Karkhanis Y.D., Morin J.G., and Cormier M.J. (1973) Similarities in the bioluminescence from the Pennatulacea. Biochim. Biophys. Acta, 314, 104-109.

86. Ward W.W. (1979) Energy transfer processes in bioluminescence. Photochem. Photobiol., 4, 1-57.

87. Ward W.W. (1998) Biochemical and physical properties of green fluorescent protein. In Green fluorescent protein: properties, applications, and protocols, M. Chalfie, and S. Kain, eds. (New York: Wiley-Liss), 45-75.

88. Ward W.W., and Cormier M.J. (1979) An energy transfer protein in Coelenterate bioluminescence: characterization of the Renilla green-fluorescent protein. J. Biol. Chem., 254, 781-788.

89. Ward W.W. and Bokman S.H. (1982) Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochemistry, 21, 4535-4540.

90. Ward W., Prentice H., Roth A., Cody C. and Reeves S. (1982) Spectral perturbations of the Aequoria green fluorescent protein. Photochem. Photobiol., 35, 803-808.

91. Weber W., Helms V., McCammon J.A., and Langhoff P.W. (1999) Shedding light on the dark and weakly fluorescent states of green fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 25, 6177-6182.

92. White J., and Stelzer E. (1999) Photobleaching GFP reveals protein dynamics inside live cells. Trends. Cell. Biol., 9, 61-65.

93. Wiedenmann J., Elke C., Spindler K.D., and Funke W. (2000) Cracks in the beta-can: fluorescent proteins from Anemonia sulcata (Anthozoa, Actinaria). Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 14091-14096.

94. Wiehler J., von Hummel J., and Steipe B. (2001) Mutants of Discosoma red fluorescent protein with a GFP-like chromophore. FEBS Lett., 487, 384-389.

95. Wilson. Т., and Hastings J.W. (1998) Bioluminescence. Annu. Rev. Cell Dev. Biol, 14, 197-230.

96. Yang F., Moss L.G., and Phillips G.N. (1996) The molecular structure of green fluorescent protein. Nat. Biotechnol., 14, 1246-1251.

97. Yanushevich Y.G., Staroverov D.B., Savitsky A.P., Fradkov A.F., Gurskaya N.G., Bulina M.E., Lukyanov K.A., and Lukyanov S.A. (2002) A strategy for the generation of non-aggregating mutants of Anthozoa fluorescent proteins. FEBS Lett., 511, 11-14.

98. Yarbrough D., Wachter R.M., Kallio K., Matz M.V., and Remington S.J. (2001) Refined crystal structure of DsRed, a red fluorescent protein from coral, at 2.0 A resolution. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 98, 462-467.

99. Yokoe H., and Meyer T. (1996) Spatial dynamics of GFP-tagged proteins investigated by local fluorescence enhancement. Nat. Biotechnol, 14, 12521256.